核受体的可控形式的配体结合结构域以及涉及它的方法

专利名称：核受体的可控形式的配体结合结构域以及涉及它的方法
核受体的可控形式的配体结合结构域以及涉及它的方法本发明涉及包括核受体的可控形式的配体结合结构域的分离蛋白质，生产它的方 法，它在鉴定配体中的应用，包括该分离蛋白质的检测体系以及使用该检测体系来筛选用 于核受体的配体的方法。核受体代表在细胞内发现的且诱导配体如激素和维生素信号的蛋白质超家族。反 应时，激动剂活化的核受体一般在与其它蛋白质一起活化时，通常增加特异基因的表达。
因此，核受体作用为激动剂诱导的转录因子，该转录因子作为单体、同型二聚体或 异型二聚体直接与靶基因的DNA反应元件相互作用，也通过信号通路进行相互作用。与膜 受体和膜相关受体不同，核受体存在于细胞内的细胞质中或核中。因此，核受体包括一类在 真核细胞内发现的细胞间的、可溶的、配体调控因子。核受体具有直接结合DNA以及调控相 邻基因表达的能力；因此这些受体归类为转录因子。如上面详述，通过核受体的基因表达调 控是配体依赖的，其中核受体通常只在存在激动剂时才活化。结合到核受体的配体导致受 体的构象改变，这再活化受体而一般导致基因表达的上调。由于核受体与基因组DNA的直接相互作用以及控制其表达的独特能力，核受体对 于生物体发育和体内稳态起关键作用。核受体超家族成员显示出四个模块结构域的总体结构基元-可变氨基端结构域(也称作N-端调控结构域)，其含有活化功能1(AF-I)，该活 化功能1的作用不依赖于配体的存在。AF-I的转录活化通常很弱，但与AF-2协同作用以上 调基因表达。这一结构域的序列在不同核受体中是高度可变的。-高度保守的DNA-结合结构域(DBD)，含有两个锌指并且结合激素反应元件 (HRE) ο_较不保守的配体结合结构域(LBD)，尽管序列只是中度保守，但是在不同核受体 之间，结构却是高度保守的。LBD的结构称作α螺旋夹心折叠。配体结合腔在LBD内部中， 就在形成该“夹心填充”的三个反平行α螺旋之下。和DBD—起，LBD构成受体的二聚化 界面，此外，还结合辅活化子和辅抑制子蛋白。另外，它含有活化功能2 (AF-2)，该活化功能 2的活化取决于结合的配体的存在，并且AF-2与AF-I具有协同作用(见上)。-可变羧基端结构域，其序列在不同核受体之间是可变的。作为实例，RORa 1的结构如图IA所示。根据核受体(NR)在没有配体时的作用机制以及亚细胞分布，将核受体分为4类。I型NR是位于细胞溶胶中的核受体。配体与I型NR的结合导致热激蛋白的离解、 同型二聚化、向核的转运，以及与HRE的结合，该HRE是由长度可变的DNA分离的两个半位 点组成的，第二个半位点具有与第一个半位点反向的序列(反向重复)。在核受体/DNA复 合物形成后，募集其它蛋白质，所述蛋白质将HRE下游DNA转录成mRNA并且最终得到造成 细胞功能改变的蛋白质的。在配体存在和不存在下，II型NR都留在核内。它们作为异型二聚体(通常连同 RXR)结合DNA。在没有配体时，II型NR通常与辅抑制子蛋白复合。结合核受体的配体造 成辅抑制子的离解，以及辅活化子蛋白及其它蛋白(包括影响DNA翻译成mRNA的RNA聚合酶)的募集。
III型核受体与I型NR类似，只是不结合反向重复HRE，而是结合正向重复HRE。IV型NR以单体或二聚体进行结合，但只有受体的一个DNA结合结构域与半位点 HRE结合。如上面详述，在配体结合时活化并结合HRE的核受体募集大量其他蛋白质，这些 其它蛋白质改变相关靶基因向mRNA的转录。这些转录辅调控子的功能不同并且包括染色 质重塑以便使靶基因更容易或更不容易进行转录，或包括桥连功能以稳定其他辅调控蛋白 的结合。辅调控蛋白(也称作辅因子)可为辅活化子，其通常具有固有的组蛋白乙酰转移 酶(HAT)活性，该活性使得组蛋白与DNA的关联弱化并且因此促进转录。与此相反，在激动 剂结合NR时适宜(preferably)结合的辅抑制子募集组氨酸脱乙酰酶(HDAC)，这促进组氨 酸与DNA的关联，并因此抑制转录。核受体超家族成员包括诸如对于下述物质的受体，糖皮质激素(GR)、雄激素 (AR)、盐皮质激素(MR)、孕酮(PR)、雌激素(ER)、甲状腺激素(TR)、维生素D(VDR)、维甲类 (RAR和RXR)、过氧化物酶体(XPAR和PPAR)以及二十醛(IR)。由于核受体对发育和体内稳态的作用，核受体对于研究它们参与特定功能是感兴 趣的靶标。另外，也将一些仍旧不知道它们的天然配体的核受体称作“孤儿受体”。因此， 人们尤其感兴趣的是鉴定这些仍旧未知的天然配体。另外，由于它们参与机体的生理和病 理生理功能，核受体是药理科学上感兴趣的靶标。对于核受体和辅调控子之间功能性相互 作用的数据提供了开发用于大量疾病的新型药物疗法的新机会。针对与类固醇受体一起参 与细胞增殖的辅活化子和辅抑制子的作用的临床策略可能提供对于如癌症的新型治疗。此 夕卜，参与能量代谢的辅调控子和信号受体的功能重要性可提供对于具有受损能量代谢的疾 病的新机会。然而，不能分离包括核受体的可控形式的配体结合结构域的蛋白质，尤其是对于 RORa不行。出乎意料地，本发明人成功地提供了包括核受体的可控形式的配体结合结构域的 分离蛋白质。该蛋白质可通过在适当条件下培养包括编码该蛋白质的核酸的细胞并从该 细胞培养物分离该蛋白质来制备。此后，将分离蛋白质与洗涤剂，特别是十二烷基硫酸锂 (LDS)接触，这恢复分离蛋白质的可控性。因此，本发明第一方面涉及包括核受体的可控形式的配体结合结构域的分离蛋白 质。核受体的配体结合结构域(也见上)是核受体用于应答配体结合的结构域，该结 合造成核受体的构象改变以诱导反应，从而用作开启转录活性的分子开关。该配体结合结 构域是可变形(flexible)单元，其中配体的结合稳定其构象，这又有利于辅因子结合以改 变受体活性。辅活化子可在配体结合结构域的相同末端结合活化子功能2 (AF-2)。不同配 体的结合可改变配体结合结构域的构象，这最终影响核受体的DNA结合结构域的DNA-结合 特异性。多种核受体的配体结合结构域是本领域公知的并概括于，例如EMBL-EBI (www. ebi. ac. uk)或 InterPro :IPR000536(参见 http //srs. ebi. ac. uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ？ rinterpro-AccNumber IPR000536]+~e)。适合的配体结合结构域的实例包括
-视黄酸受体相关的孤儿受体α1 (R0R α 1)的第271至523位氨基酸-视黄酸受体相关的孤儿受体β(R0R β )的第267至459位氨基酸-视黄酸受体相关的孤儿受体Y(R0R γ )的第325至318位氨基酸-肝细胞核因子α1 (HNF4 α 1)的第192至464位氨基酸-肝细胞核因子α2 (HNF4 α 2)的第192至474位氨基酸-雌激素相关受体α(ERR α )的第233至423位氨基酸-雌激素相关受体β(ERR β )的第248至500位氨基酸
-雌激素相关受体Y (ERR γ )的第250至435位氨基酸核受体可为任何已知的核受体。根据核受体的序列同源性，将它们分成七个亚家族。亚家族1包括甲状腺激素受体类，包括甲状腺激素受体-α和_β，视黄酸受 体-α、- β和-γ，过氧化物酶体增生物活化受体-α、- β / δ、y , Rev-ErbA- α和-β， RAR-相关的孤儿受体α、β和γ，肝X受体类α和β，类法尼醇(farnesoid) X受体，维 生素D受体，孕烷X受体和组成型雄烷受体。亚家族2涉及视黄酸X受体类，包括例如肝细胞核受体-4 ( α和Y )，视黄酸X受 体(α、β和γ)，睾丸受体(2和4)，果蝇无尾基因的人同源物，光受体细胞特异的核受体， 鸡卵白蛋白上游启动子-转录因子(I和II)和V-erbA-相关的。亚家族3涉及雌激素受体类，包括雌激素受体(α和β )，雌激素相关受体(α、β 和Y )，肾上腺皮质激素受体，盐皮质激素受体，孕酮受体和雄激素受体，等等。亚家族4涉及神经生长因子IB类，包括受体如神经生长因子IB、核受体相关1和 神经元源性孤儿受体1。亚家族5涉及类固醇生成因子类，包括例如类固醇生成因子1和肝受体同源物-1。亚家族6涉及生殖细胞核受体类，包括生殖细胞核因子。其它亚家族，指亚家族0，包括多种多样的受体，例如剂量敏感型性逆转、肾上腺发 育不良临界区，位于染色体X，基因1 (DAXl)，小异型二聚体配偶体以及具有两个DNA结合结 构域(2DBD-NR)的核受体。根据本发明，分离蛋白质包括该核受体的配体结合结构域。本发明上下文中的分 离蛋白质涉及不在其自然环境中的蛋白质。因此，“分离蛋白质”不与蛋白质关联，它通常存 在于自然中或从其通常存在的细胞分离，或者从表达了编码它的核酸的细胞分离或者基本 上没有相同细胞来源的其它蛋白质。蛋白质可以是天然发生的蛋白质，优选天然发生的核 受体或其部分，其中该部分包括配体结合结构域。然而，该蛋白质也可以是人工的，只要它 不是天然发生或者它可包括一个或多个天然不与配体结合结构域相连的区域，例如包括核 受体的配体结合结构域以及诸如用于如纯化或检测目的的第二结构域的其它蛋白质的融 合蛋白、或由此两者组成的融合蛋白。优选地，术语“分离蛋白质”指基本上与其天然环境下的其它细胞组分分开的蛋白 质分子。然而，在分离了蛋白质后，可再次加入细胞组分，例如用于测量信号转导通路。此 夕卜，技术人员将理解应将分离蛋白质保存在允许该分离蛋白质活性的适合的条件下，例如 适合的缓冲液、PH值、离子等。在本发明包括核受体的配体结合结构域的分离蛋白质的上下文中的“可控形式”涉及一种蛋白质，它还是可改变的，以在激动剂结合配体结合结构域时活化。如上面详述， LBD在激动剂配体与其结合时被活化，这改变靶基因的基因表达。然而，直到现在，还不能 生产RORa蛋白质或许多其他包括核受体的可被控制或调控的LBD的分离蛋白质，即在各 LBD的激动剂配体存在或不存在下，活性没有显著区别或仅有很小区别。
因此，可以通过比较在存在各LBD的激动剂配体以及该配体不存在时的活性来检 测本发明的可控形式的分离蛋白质。LBD的活性可以任何适合的事件测定，例如，通过测定 对于各信号转导通路的下游元件的影响，例如对各信号转导通路的任何下游元件的结合， 例如辅调控物和/或靶DNA。此工作的实例描述于实施例2并示出于

图1C。优选地，如果将存在对于各LBD的激动剂配体下的活性与不存在该激动剂配体 下的活性相比，包括NR的可控形式的LBD的分离蛋白质的活性达到至少1. 2，更优选至少 1. 5，还更优选至少2、3、4或5，并且最优选至少10。本发明的分离蛋白质尤其涉及包括NR的可控形式的配体结合结构域的分离蛋白 质，其中该蛋白质不是组成型活化的，这意味着在没有各LBD的激动剂配体存在下，该蛋白 质是非活化的。本发明的一个实施方式中，分离蛋白质可包括天然发生的核受体的全长氨基酸序 列或由该序列组成。或者，分离蛋白质可包括天然发生的核受体的一部分或由该部分组成， 只要LBD仍旧存在于该核受体的那部分中。分离蛋白质可包括如上所定义的任何核受体或由该核受体组成。核受体可为分离 蛋白质或者它可与其它结构域融合，例如从而易于蛋白质的纯化或易于检测蛋白质或测量 蛋白质的活性。如上面详述，分离蛋白质也可包括核受体的一部分或由该部分组成，只要核受体 的LBD是该蛋白质的一部分。因此，分离蛋白质也可包括核受体的氨基端调控结构域、DNA 结合结构域、连接DNA结合结构域和配体结合结构域的铰链区、和/或羧基端结构域。其它 结构域和区域可相互独立地源自与LBD相同的核受体或源自一种或多种其它核受体。在本发明优选的实施方式中，核受体是视黄酸受体相关的孤儿受体(ROR)，特别是 ROR α、ROR β 或 ROR γ ,尤其是 ROR α。孤儿受体R0R(也称作RZR)构成最初没有鉴定出配体的核受体的亚家族。目前， 已经鉴定出三种ROR受体亚型，即RORa、R0Ri3和ROR γ。ROR受体以单体或二聚体形式各 结合由在PuGGTCA型序列之前的富含Α/Τ的序列组成的特异反应元件，并调控靶基因的转录。在选择性地剪接后，ROR α基因导致四种同工型a 1、a 2、a 3和a 4RZRA，它们的 N端结构域不同并且显示DNA识别以及不同的反式活化特性。对于核受体，优选任何哺乳动物ROR受体，并且甚至更优选人ROR受体。已将 ROR a (也称作 RAR-相关孤儿受体 A、RZRA, RORl、R0R2、R0R3、NR1F1)测序， 并且其序列可以登录号U04897获自NCBI数据库(NationalCenter for Biotechnology Information)，其提供人mRNA和蛋白质序列。已知的RORa的激动剂配体包括胆固醇、其 衍生物，并可能包括褪黑素。已将R0Ri3 (也称作RAR-相关孤儿受体B、RZRB, NR1F2)测序，并且其序列可以登 录号 Y08639 获自 NCBI 数据库(National Center forBiotechnology Information，其提供人mRNA和蛋白质序列)。已知的RORii的激动剂配体是视黄酸。已将ROR γ (也称作RAR-相关孤儿受体C、RZRG, RORG, NR1F3、TOR)测序，并 且其序列可以登录号U16997获自NCBI数据库(National Centerfor Biotechnology Information,其提供人mRNA和蛋白质序列)。三种ROR形式履行一些至关重要的作用，包括-RORa 小脑发育、骨维持、淋巴结发育、免疫应答、骨骼肌发育、平滑肌细胞分 化、脂代谢(疾病如小脑变性、骨质疏松症、局部缺血引发的血管生成、动脉粥样硬化 (artherosclerosis)、炎性疾病)。ROR^ 中枢神经系统RORy 免疫应答、骨骼肌、脂肪细胞分化尤其优选包括RORa的可控形式的配体结合结构域的分离蛋白质。全长RORa蛋白质由523个氨基酸组成，其中第271-523位氨基酸编码配体结合结构域。尤其优选的蛋 白质示于SEQ ID NO. 1 AELEHLAQNI SKSHLETCQY LREELQQITff QTFLQEEIEN YQNKQREVMW QLCAIKITEA 60IQYVVEFAKR IDGFMELCQN DQIVLLKAGS LEVVFIRMCR AFDSQNNTVY FDGKYASPDV 120FKSLGCEDFI SFVFEFGKSL CSMHLTEDEI ALFSAFVLMS ADRSffLQEKV KIEKLQQKIQ 180LALQHVLQKN HREDGILTKL ICKVSTLRAL CGRHTEKLMA FKAIYPDIVR LHFPPLYKEL 240FTSEFEPAMQ IDG(SEQ ID NO 1)包括上述结构域以及标签和切割位点的示例序列如下面所示按下面阅读MGSSHHHHHH LEVLFQGPAE LEHLAQNISK SHLETCQYLR EELQQITffQT FLQEEIENYQ 60NKQREVMWQL CAIKITEAIQ YVVEFAKRID GFMELCQNDQ IVLLKAGSLE VVFIRMCRAF 120DSQNNTVYFD GKYASPDVFK SLGCEDFISF VFEFGKSLCS MHLTEDEIAL FSAFVLMSAD 180RSffLQEKVKI EKLQQKIQLA LQHVLQKNHR EDGILTKLIC KVSTLRALCG RHTEKLMAFK 240AIYPDIVRLH FPPLYKELFT SEFEPAMQID G271(SEQ ID NO 2)分离蛋白质包括具有插入ROR α 1的第270位氨基酸处的His-标签(HHHHHH ；SEQ ID NO 3)和 PreScission 切割位点(LEVLFQGP ；SEQ ID NO 4)的 SEQ ID NO 1 的结构域。 然而，His-标签可被另一适合的标签(例如本文描述的)以及另一适合的切割位点(例如 下面所描述)所代替。它们的实例示于图1B。本发明的一个实施方式中，本发明的分离蛋白质包括标记，尤其是标签。本发明上下文中的标记可为任何类型的可以易于检测的分子。在本发明中，该分 子结合分离蛋白，因此，标记的存在指示分离蛋白的存在。标记(也称标签)是熟练技术人 员已知的并且包括如放射标记(例如3h、32p、35s或14c)、荧光标记(如荧光素、绿色荧光蛋白 或DyLight 488)、酶(如辣根过氧化物酶、β _内酰胺酶、碱性磷酸酶或β _葡糖苷酶)或 可由适合的抗体或抗体片段检测的抗原。优选地，标记是标签。标签通常是用做生化指示剂的蛋白质。它们可包括在诸如 重组的、表达的蛋白的蛋白质中并且可以用作若干目的。优选地，它们用于使用适于特定标 签的标准条件来纯化它们所附着的蛋白质。然而，标签也可用作指示剂以检测特定蛋白质的存在。目前已知若干(亲和)标签。这些通常根据它们的大小分成3类小标签具有最大 12个氨基酸，中型大小的标签具有最大60个氨基酸而大标签具有大于60个氨基酸。小标签 包括Arg-标签、His-标签、Strep-标签、Flag-标签、T7-标签、V5-肽-标签和c-Myc-标 签，中型大小的标签包括S-标签、HAT-标签、钙调蛋白结合肽、几丁质结合肽和一些纤维素 结合结构域。后者可以含有高达189个氨基酸并且然后被当作大亲和标签，像GST-(谷胱 甘肽-S-转移酶_)和MBP-标签(麦芽糖结合蛋白-标签)。
为了尤其产生纯蛋白，开发了所谓的双标签或串联标签。这一情形下，以两步分离 色谱步骤来纯化蛋白质，每种情形下，利用第一标签的亲和性然后用第二标签的亲和性。此 双标签或串联标签的实例是GST-His-标签(与聚组氨酸-标签融合的谷胱甘肽-S-转移 酶)、6xHis-Str印-标签(与Str印-标签融合的6个组氨酸残基)、6xHis_标签100-标签 (与哺乳动物MAP-激酶2的12个氨基酸蛋白质融合的6个组氨酸残基),SxHis-HA-标签 (与血凝素(haemagglutinin)-表位-标签融合的8个组氨酸残基)、His-MBP (与麦芽糖 结合蛋白融合的His-标签)、FLAG-HA-标签(与血凝素(hemagglutinin)-表位-标签融 合的FLAG-标签)、以及FLAG-Str印-标签。优选地，本发明的分离蛋白质包括选自下组的标签His-标签、Arg-标签、 Strep-标签、Flag-标签、T7-标签、V5-肽-标签、c-Myc-标签、S-标签、HAT-标签、钙调 蛋白结合肽-标签、几丁质结合肽_标签、GST-标签和MBP-标签。然而，也可使用任何其 它标签，但是优选一些标签如His-标签、Arg-标签、Str印-标签、Flag-标签或GST-标签。本发明实施方式中，分离蛋白质包括标记或标签，其中可通过在特异切割位点处、 如对于酶的切割位点处的蛋白水解切割从蛋白质除去该标记或标签。这可位于LBD和标 记或标签之间。切割位点例如可为蛋白酶切割位点。蛋白酶的实例是胰凝乳蛋白酶、胰 蛋白酶、弹性酶和纤溶酶；相应的切割位点是本领域技术人员已知的。由于待纯化的分 子是蛋白质，优选特异的蛋白酶，尤其是来自通常攻击植物的病毒的蛋白酶。适合的特异 蛋白酶的实例是凝血酶、因子Xa、Igase、来自"烟草蚀刻病毒"的TEV-蛋白酶，蛋白酶 PreScission (人鼻病毒3C蛋白酶)、肠激酶或Kex2。尤其优选TEV-蛋白酶和PreScission。SEQ ID NO. 2公开了包括LBD，His_标签和精确切割位点的蛋白质的实例。SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6分别给出编码该蛋白质的适合的核酸和载体。另外，图IB示出本发 明示例性的分离蛋白质。SEQ ID NO 6的载体的第4021至5040位核苷酸-上面的核酸序列编码链(SEQID NO 5)-下面的核酸序列模板链-氨基酸序列具有His-标签和PreScission切割位点(SEQID NO 2)的LBD (如 SEQ ID NO 1 所限定)— II:克隆位点(按照说明)ATG和TAA 起始/终止(两者都与克隆位点相邻)CATCATCATCATCATCATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC =His-标签和 PreScission 切割 位点GATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAA
4021---------+---------+---------+---------+---------+---------+4080CTATTGGTAGAGCGTTTATTTATTCATAAAATGACAAAAGCATTGTCAAAACATTATTTTBamHIaaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgc 1ggatc4 atggga4081---------+---------+---------+---------+---------+---------+4140TTTGGATATTTATAAGGCCTAATAAGTATGGCAGGGTGGTAGCCCGCGCCTAGGTACCCTaMG-AGTAGCCATCATCATCATCATCATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGCAGAATTAGAA4141---------+---------+---------+---------+---------+---------+4200TCATCGGTAGTAGTAGTAGTAGTAGACCTTCAAGACAAGGTCCCCGGGCGTCTTAATCTTaS S HHHHHH LEVLFQGP AELE-CACCTTGCACAGAATATATCTAAATCGCATCTGGAAACCTGCCAATACTTGAGAGAAGAG4201---------+---------+---------+---------+---------+---------+4260GTGGAACGTGTCTTATATAGATTTAGCGTAGACCTTTGGACGGTTATGAACTCTCTTCTCaHLAQNISKSHLETCQYLREE-CTCCAGCAGATAACGTGGCAGACCTTTTTACAGGAAGAAATTGAGAACTATCAAAACAAG4261---------+---------+---------+---------+---------+---------+4320GAGGTCGTCTATTGCACCGTCTGGAAAAATGTCCTTCTTTAACTCTTGATAGTTTTGTTCaLQQITffQTFLQEEIENYQNK-CAGCGGGAGGTGATGTGGCAATTGTGTGCCATCAAAATTACAGAAGCTATACAGTATGTG4321---------+------+---------+---------+---------+---------+4380GTCGCCCTCCACTACACCGTTAACACACGGTAGTTTTAATGTCTTCGATATGTCATACACaQREVMffQLCAIKITEAIQYV-GTGGAGTTTGCCAAACGCATTGATGGATTTATGGAACTGTGTCAAAATGATCAAATTGTG4381---------+---------+---------+---------+---------+---------+4440CACCTCAAACGGTTTGCGTAACTACCTAAATACCTTGACACAGTTTTACTAGTTTAACACaVEFAKRIDGFMELCQNDQIV-CTTCTAAAAGCAGGTTCTCTAGAGGTGGTGTTTATCAGAATGTGCCGTGCCTTTGACTCT4441---------+---------+---------+---------+---------+---------+4500GAAGATTTTCGTCCAAGAGATCTCCACCACAAATAGTCTTACACGGCACGGAAACTGAGAaLLKAGSLEVVFIRMCRAFDS-CAGAACAACACCGTGTACTTTGATGGGAAGTATGCCAGCCCCGACGTCTTCAAATCCTTA4501---------+---------+---------+---------+---------+---------+4560GTCTTGTTGTGGCACATGAAACTACCCTTCATACGGTCGGGGCTGCAGAAGTTTAGGAATaQNNTVYFDGKYASPDVFKSL-GGTTGTGAAGACTTTATTAGCTTTGTGTTTGAATTTGGAAAGAGTTTATGTTCTATGCAC4561---------+---------+---------+---------+---------+---------+4620CCAACACTTCTGAAATAATCGAAACACAAACTTAAACCTTTCTCAAATACAAGATACGTG
aGCEDFISFVFEFGKSLCSMH-CTGACTGAAGATGAAATTGCATTATTTTCTGCATTTGTACTGATGTCAGCAGATCGCTCA4621---------+---------+---------+---------+---------+---------+4680GACTGACTTCTACTTTAACGTAATAAAAGACGTAAACATGACTACAGTCGTCTAGCGAGTaLTEDEIALFSAFVLMSADRS-TGGCTGCAAGAAAAGGTAAAAATTGAAAAACTGCAACAGAAAATTCAGCTAGCTCTTCAA4681---------+---------+---------+---------+---------+---------+4740ACCGACGTTCTTTTCCATTTTTAACTTTTTGACGTTGTCTTTTAAGTCGATCGAGAAGTTaWLQEKVKIEKLQQKIQLALQ-CACGTCCTACAGAAGAATCACCGAGAAGATGGAATACTAACAAAGTTAATATGCAAGGTG4741---------+---------+---------+---------+---------+---------+4800GTGCAGGATGTCTTCTTAGTGGCTCTTCTACCTTATGATTGTTTCAATTATACGTTCCACaHVLQKNHREDGILTKLICKV-TCTACATTAAGAGCCTTATGTGGACGACATACAGAAAAGCTAATGGCATTTAAAGCAATA4801---------+---------+---------+---------+---------+---------+4860AGATGTAATTCTCGGAATACACCTGCTGTATGTCTTTTCGATTACCGTAAATTTCGTTATaSTLRALCGRHTEKLMAFKAI-TACCCAGACATTGTGCGACTTCATTTTCCTCCATTATACAAGGAGTTGTTCACTTCAGAA4861---------+---------+---------+---------+---------+---------+4920ATGGGTCTGTAACACGCTGAAGTAAAAGGAGGTAATATGTTCCTCAACAAGTGAAGTCTTaYPDIVRLHFPPLYKELFTSE-EcoRITTTGAGCCAGCAATGCAAATTGATGGGTAA ^aattcI CGGAGCGGCCGCTGCAGATCTGAT4921---------+---------+---------+---------+---------+---------+4980AAACTCGGTCGTTACGTTTAACTACCCATTCTTAAGGCCTCGCCGGCGACGTCTAGACTAaFEPAMQIDG* -CCTTTCCTGGGACCCGGCAAGAACCAAAAACTCACTCTCTTCAAGGAAATCCGTAATGTT4981---------+---------+---------+---------+---------+---------+5040GGAAAGGACCCTGGGCCGTTCTTGGTTTTTGAGTGAGAGAAGTTCCTTTAGGCATTACAA载体(详见上面)(SEQID NO :6)_载体插入物AAGCTTTACTCGTAAAGCGAGTTGAAGGATCATATTTAGTTGCGTTTATGAGATAAGATTGAAAGCACG TGTAAAATGTTTCCCGCGCGTTGGCACAACTATTTACAATGCGGCCAAGTTATAAAAGATTCTAATCTGATATGTTTTAA AACACCTTTGCGGCCCGAGTTGTTTGCGTACGTGACTAGCGAAGAAGATGTGTGGACCGCAGAACAGATAGTAAAACAAA ACCCTAGTATT
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或碳酸酯的碱性盐或者与异戊二烯基(isoprenyl)盐相接触。通常，本发明方法的步骤a)和b)是熟练技术人员公知的。然而，在下面，将简要 概述它们并以实例示出。熟练技术人员将理解所述方法可根据待分离的本发明各蛋白质， 用于细胞培养的细胞等来改变。对于重组蛋白质的生产，即用于在活细胞中合成外源基因基因产物，可使用多种表达体系。这些包括一系列公知的生物体和细胞系(细菌、昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞 等)以及多种具有不同启动子、筛选标记和任选地融合配偶体的表达载体。重组蛋白质的 生产通常包括将编码基因导入质粒或任何其它适合的载体中。通常，适合载体或质粒的选 择取决于想要的宿主细胞。然后将这一载体导入所选靶细胞(转化或转染)并培养该靶细 胞。根据启动子，基因表达可在培养的整个期间发生或可由外源信号所诱导。 如上面详述，可能需要生产适合的编码本发明蛋白质的核酸或含有它的载体。编码本发明蛋白质的核酸可为编码核受体的天然发生的基因或者它可为该基因 编码上面限定的核受体一部分的那部分。编码天然发生的蛋白质或其部分的核酸的分离是 熟练技术人员公知的并且可包括使用适合的探针和分离方法来分离，或者该核酸可源自商 品化供应商。如果使用天然发生的基因所不包含的核酸(例如编码包括全长或部分NR和 标签的融合蛋白质的核酸)，可根据包括遗传工程公知方法的标准方法来生产编码该融合 蛋白的各核酸。通常，使用适合的限制性内切酶在特异位点切开DNA。可用连接酶将通过 限制性酶而形成的片段连接在一起。此后，可将DNA导入适于将遗传物质转移到细胞中的 载体中。载体可为病毒载体或质粒载体。适合的载体包括腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒 等。市售可得的载体的实例是pBR322、pUC系列、pBluescript、pTZ、pSP和pGEM。或者，也 可将裸露DNA导入细胞。如果核酸(即DNA或RNA)不与载体一起使用，可通过将该核酸与 阳离子脂混合而生产脂质体来进行转染，该脂质体与细胞膜融合并且将核酸置入细胞内。 也可通过磷酸钙进行转染，其中，例如含有磷酸根离子的HEPES-缓冲盐溶液与含有待转染 的DNA的氯化钙溶液组合。当两种溶液组合时，形成良好的氯化钙沉淀，该沉淀将待转染 的DNA结合到其表面上。然后将沉淀的悬液加入待转染的细胞(通常是以单层生长的细胞 培养物)。用于转染的其它方法包括电穿孔、热激、磁转染、核转染和诸如Lipofectamine、 Fugene等的转染试剂的使用。其它方法是“基因枪”，其中DNA与惰性固体(通常是金)的 纳米颗粒耦合，这随后直接射击到靶细胞中。细胞转染可为瞬时的或稳定的。在转染过程期间导入细胞中的核酸并没有插入核 基因组的情形下，当细胞经历有丝分裂时，可能在后期丢失外源核酸。这被称作瞬时转染。 更优选地，转染为稳定转染，其中核酸留在细胞的基因组中。为了实现稳定转染，通常使用 筛选技术，其中核酸与另一基因共转染，用于选择性筛选。其它基因可向某些条件或物质赋 予抗性，例如抗生素或代谢缺乏。适合基因的实例包括新霉素抗性基因，潮霉素磷酸转移酶 基因等。在将编码本发明蛋白质的核酸导入宿主后，细胞在适当条件下生长。用于细胞生 产的一系列不同宿主细胞是熟练技术人员已知的，包括细菌、昆虫细胞、酵母和哺乳动物细 胞。此种细胞的实例为Sf9、Sf21、HEK 293细胞、CHO细胞、HeLa细胞、CaCo细胞或NIH 3T3 细胞。宿主可为原代细胞或它可为细胞系，其中优选细胞系。包括本发明核酸的细胞在有助于细胞生产的条件下生长并维持。这包括适当的温 度和气体混合物(通常是37°C，5%C02)，任选地在细胞培养箱中。对于每一细胞类型，培 养条件可大范围改变并且是熟练技术人员已知的。在用适合的杆状病毒载体体系转化后， 表达可在例如昆虫细胞中发生。此种情形下，温度保持在26°C但不需要控制C02。除了温度和气体混合物，细胞培养体系中最常见的变化因素是生长培养基。可以改变生长培养基配方的pH、葡萄糖浓度、生长因子和其它营养成分的存在等。用于补充培养 基的生长因子通常源自动物血液如小牛血清。本领域熟练技术人员考虑到遗传密码，知道如何从蛋白质序列推导核酸序列(可 为DNA或RNA)。技术人员也知道如何使用分子生物学标准技术来生产此种核酸序列。这可 以例如通过利用限制性酶来使用和组合现有序列而实现。核酸也适当地含有其它元件，例 如启动子和转录起始和终止信号和翻译起始和终止信号。步骤a)后，通过熟练技术人员已知的任何适合的分离或纯化方法从细胞培养物 分离蛋白质。如果足够量的靶蛋白质分泌到培养基中，可用它继续进行分离。或者，可能需 要破裂细胞。这可以例如通过超声或高渗介质或通过剪切的手段而通过例如细胞裂解实 现。为了除去不溶组分，样品可以例如尤其在10，OOOxg至15，OOOxg下离心并且所获得的 上清可以用于步骤c)或可进一步进行纯化或浓缩。步骤b)的分离可替代地或另外包括公知的纯化浓缩步骤例如提取、沉淀、电泳方法、色谱方法等。那些的实例包括细胞电泳、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、SDS-PAGE色谱、 或亲和色谱，特别是固定化金属离子亲和色谱(IMAC)。如果本发明的分离蛋白质包括适当的标记或标签，如上所限定，特别提出亲和纯 化。亲和纯化是吸附纯化的特殊形式，其中在载体上存在具有对于两个结构域之一有高亲 和性并且因此有高结合强度的基团(结合配偶体)，以致它们可以优选地被吸附并因此从 其它物质分离。可以使用第一和第二标签(例如His标签和GST标签)进行纯化。纯化通 过特异结合到适合的结合配偶体来发生。结合配偶体优选结合于固相。固相可以是通常的 载体物质，例如S印harose、Superflow、Macropr印、POROS 20或P0R0S50。然后例如通过重 力、HPLC或FPLC来以例如色谱进行分离。可通过改变条件从而改变了的条件不再允许亲和 标记或标签与结合配偶体的结合(例如改变PH值或离子强度)，或通过令分子与结合到该 结合配偶体的结构域分离而从固相洗脱目的蛋白质。可以通过切割分子和结合配偶体之间 的键来实现分离，例如通过化学手段或使用特异酶，如上面详述。或者，也可能使用过量添 加的特异的竞争物。或者也可以将结合配偶体结合到珠，尤其是磁珠。在将该珠加入样品 后，在特定结构域和相应结合配偶体之间发生结合。然后可以例如离心悬浮液从而使标记 的分子与珠一起沉淀，而其它成分留在可以上清中，可以将它们从上清除去。或者，利用珠 的磁特性将悬浮液分离。在一个实施方式中，将悬浮液施上样至位于磁场中的柱中。由于磁 珠和与它们结合的分子保留在磁场中，可以在若干冲洗操作中将样品的其它组分洗掉。然 后例如可以使用适合的洗脱缓冲液从珠中洗出目的分子，或可以通过例如在LBD和标签或 标记之间的切割位点处进行酶切而从珠分离目的分子。步骤b)后，分离蛋白质与洗涤剂接触以便提供可控形式的LBD。洗涤剂在生物学 意义上是通常用于破坏细胞的双极脂膜以便使膜结合蛋白游离并可溶的膜活性物质。洗涤 剂的价值源自它们的双嗜性的性质。每个洗涤剂分子由亲水“头”区和疏水“尾”区所表征。 这一特征的结果是形成在水性介质中具有疏水过程的热动力学上稳定的微团。疏水核提供 允许溶解疏水分子或蛋白质结构域的环境。洗涤剂可以是阴离子、阳离子、两性离子或非离 子的。阴离子和阳离子洗涤剂通常比另外两类更大程度地改变蛋白质结构。改变程度随着 单个蛋白质和特定洗涤剂而改变。离子洗涤剂也对于PH、离子强度和反荷离子的性质更加 敏感，并且可以干扰基于电荷的分析方法。或者，多数非离子洗涤剂是非变性的，但是在破坏蛋白质聚集时效率较差。在一些应用中，两性洗涤剂特有地提供一些比其它三种洗涤剂 类型更好的中间类型的性质，即提供非离子洗涤剂的低变性和净零电荷特性。两性离子也 有效地破坏蛋白质聚集。优选地，洗涤剂是饱和未分支C6-C20烷基硫酸酯或碳酸酯的碱性盐或者是异戊 二烯基盐。对于碱性盐，优选锂、钠和钾盐，尤其是锂盐。
饱和的未分支C6-C20烷基硫酸酯可为η-己基、η-庚基、η-辛基、η-壬基、η-癸基、 n- i^一烷基、η-十二烷基、η-十三烷基、η-十四烷基、η-十五烷基、η-十六烷基、η-十七 烷基、η-十八烷基、η-十九烷基、η- 二十烷基硫酸酯。饱和的未分支C6-C20烷基碳酸酯可 为η-己基，η-庚基、η-辛基、η-壬基、η-癸基、n- ^^一烷基、η-十二烷基、η-十三烷基、 η-十四烷基、η-十五烷基、η-十六烷基、η-十七烷基、η-十八烷基、η-十九烷基、η- 二十 烷基碳酸酯。本发明进一步优选的实施方式中，碱性盐为锂盐，优选η-己基、η-庚基、η_辛 基、η-壬基、η-癸基、n- i^一烷基、η-十二烷基、η-十三烷基、η-十四烷基、η-十五烷基、 η-十六烷基、η-十七烷基、η-十八烷基、η_十九烷基、η_ 二十烷基硫酸酯的锂盐或者η_己 基、η-庚基、η-辛基、η-壬基、η-癸基、n- i^一烷基、η-十二烷基、η-十三烷基、η-十四烷 基、η-十五烷基、η-十六烷基、η-十七烷基、η_十八烷基、η_十九烷基、η_ 二十烷基碳酸酯 的锂盐。本发明优选的实施方式中，生产本发明分离蛋白质的方法还包括在步骤b)或步 骤C)后除去标记或标签。例如可通过切割掉该标记来进行标记的去除。可通过在特定切 割位点特异地切割蛋白质的适合的酶将标记切掉。切割位点可为位于标记或标签与LBD之 间的间隔区的蛋白酶切割位点。蛋白酶的实例是胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性酶和质粒； 相应的切割位点是本领域技术人员已知的。由于待纯化的分子是蛋白质，优选特异的蛋白 酶，尤其是来自通常攻击植物的病毒的蛋白酶。适合的特异蛋白酶的实例是凝血酶、因子 Xa, Igase、来自〃烟草蚀刻病毒〃的TEV-蛋白酶，蛋白酶PreScission (人鼻病毒3C蛋白 酶)、肠激酶或Kex2。尤其优选TEV-蛋白酶和PreScission。本发明其他优选的实施方式中，饱和的未分支C6-C20烷基硫酸酯或碳酸酯的碱 性盐是饱和的未分支C9-C15烷基硫酸酯的碱性盐，优选十二烷基硫酸酯的碱性盐，更优选 十二烷基硫酸锂(LDS)。据此，饱和的未分支C9-C15烷基硫酸酯可为η-壬基硫酸酯、η-癸 基硫酸酯、η-十一烷硫酸酯、η-十二烷基硫酸酯、η-十三烷硫酸酯、η-十四烷硫酸酯、或 η-十五烷硫酸酯的锂、钠或钾盐，特别是η-壬基硫酸锂、η-癸基硫酸锂、η_十一烷硫酸锂、 η-十二烷基硫酸锂、η-十三烷硫酸锂、η-十四烷硫酸锂或η_十五烷硫酸锂，更特别是十二 烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钾，特别是十二烷基硫酸锂。本发明另一实施方式中，洗涤剂是异戊二烯基盐。异戊二烯基盐可为异戊二烯的 任何盐，例如异戊二烯基醋酸盐、异戊二烯基二磷酸盐、异戊二烯基焦磷酸盐。本发明的另 一实施方式中，洗涤剂是由1-4个异戊二烯基单元和羟基组成的萜烯，或是相应的碳酸酯、 硫酸酯、磷酸酯或焦磷酸酯的碱性盐或铵盐，特别是香叶醇、法尼醇、焦磷酸香叶酯、焦磷酸 法尼酯或香叶基焦磷酸香叶酯的碱性盐或铵盐。本发明的其他实施方式中，可在LBD的激动剂存在下进行步骤b)和/或C)。激 动剂可为天然发生的激动剂或其功能活性衍生物或者它可以是与天然发生的激动剂不同的激动剂。结合并活化核受体的天然发生的激动剂配体包括亲脂物质例如内源性激素、维生素A和B以及异生素内分泌干扰物(xenobiotic endocrine disrupter)。例如，甲状腺 激素受体通过结合甲状腺激素，特别是甲状腺素(T4)而活化。视黄酸受体的天然发生的配 体是全反式视黄酸和9-顺式视黄酸。过氧化物酶体增生物活化受体的配体是游离脂肪酸 和类花生酸(eicosanoid) ；PPAR γ被PGJ2 (—种前列腺素)活化而PPAR α被白三烯B4活 化。肝X受体α和β与专性配偶体RXR形成异型二聚体。该异型二聚体也可以由LXR激 动剂(例如氧化固醇(oxysterols))或RXR激动剂(如9-顺式视黄酸)所活化。氧化固 醇是胆固醇的氧化衍生物，如22 (R)-羟基胆固醇，24 (S)-羟基固醇，27-羟基固醇和胆汁酸 (cholestenoic acid)。其它激动剂可为维生素D (维生素D受体)、类固醇(雌激素受体、 孕酮受体、雄激素受体)、皮质醇(糖皮质激素受体)，醛固酮(盐皮质激素受体)或脂肪酸 (肝细胞核因子4)。非天然发生的激动剂配体包括用于糖皮质激素受体的地塞米松和用于 雌激素受体的己烯雌酚(DES)。对于ROR家族成员，适合的激动剂配体包括胆固醇及其衍生 物，例如胆固醇硫酸盐(酯)，或褪黑素。如上面详述，通过在有助于生产本发明分离蛋白质的适当条件下，培养包括编码 该蛋白的核酸的细胞来生产该分离蛋白质。在本发明的一个实施方式中，细胞选自动物细 胞、植物细胞、酵母细胞。适合的动物细胞包括哺乳动物细胞，特别是人细胞。上面提及了 那些细胞的实例。或者细胞可为酵母细胞，例如大肠杆菌细胞，或者昆虫细胞。实施例1描述了生产本发明分离蛋白质的示例方法。本发明的又一方面涉及分离一种蛋白质，其包括由根据本发明方法生产的核受体 的可控形式的配体结构域。熟练技术人员将理解该分离蛋白质可以如上面任何的本发明实施方式所限定，特 别是本发明优选的实施方式。本发明的又一方面涉及分离蛋白质在鉴定用于核受体的配体结合结构域的配体 上的应用，特别是激动剂或拮抗剂，尤其是激动剂。根据本发明，本发明的分离蛋白质可用 于例如通过开启或关闭下游信号转导来鉴定用于核受体的LBD的配体，特别是激动剂或拮 抗剂。据此，可检测或评估任何下游信号以检测配体的结合。如果是用于寻找激动剂，可通 过下游信号通路的活化来鉴定激动剂。另一方面，可通过关掉下游信号转导来鉴定拮抗剂。 在拮抗剂的情形下，可能需要使用激动剂和潜在拮抗剂的组合来检测激动剂诱导的信号转 导通过拮抗剂的失活。如上面详述，核受体的信号转导一般包括多聚体的形成，特别是二聚 体，辅活化子和/或辅抑制子的结合，或者基因转录的改变，通常是基因转录的诱导，从而 生产mRNA和蛋白质以及因此，细胞功能的改变。根据上述信号转导，可在信号转导的每一水平来评估信号转导的改变，这些水平 包括将目的蛋白质与第二蛋白(例如辅活化子或辅抑制子)结合，与靶基因结合，测定mRNA 或蛋白质的量，或改变的细胞功能。测定蛋白质与其它蛋白质，或靶基因结合的方法是熟练 技术人员公知的并且包括本文限定的那些。测定mRNA或蛋白质的量的方法也是熟练技术 人员公知的。观察细胞功能改变的方法极大地取决于细胞功能的类型并且也是熟练技术人 员公知的。本发明的再又一方面涉及检测体系，包括-本发明的分离蛋白质，
-辅因子，和-在配体，尤其是激动剂与核受体的配体结合结构域结合时，检测该蛋白质和辅因子相互作用的工具。根据本发明，本发明的分离蛋白质可为如上面方面和实施方式，特别是优选的实 施方式所说明的任何蛋白质。此外，辅因子(也称作辅调控物，辅调控蛋白，或转录辅调控 物(也包括辅活化子或辅抑制子)；也见上)被核受体结合，该核受体通过结合激动剂配体 而活化，而辅抑制子在结合拮抗剂配体时被核受体结合。核受体辅活化子的共同特征是它 们含有一个或多个被称作NR(核受体)框的LXXLL结合基序(5个氨基酸的连续序列，其中 L =亮氨酸而X =任何氨基酸)。显示出LXXLL结合基序与在核受体的LBD表面上的结构 相结合。实例包括-NC0A-1 (核受体辅活化子1) /SRC-I (类固醇受体辅活化子_1)-NC0A-2 (核受体辅活化子2) /GRIP-I (糖皮质激素受体相互作用区1)-NC0A-3 (核受体辅活化子3) /AIB-I (在乳腺中扩增)-NC0A-4 (核受体辅活化子4) /ARA 70 (雄激素受体相关蛋白70)-NC0A-5 (核受体辅活化子5)-NC0A-6 (核受体辅活化子6)-NC0A-7 (核受体辅活化子7)-PGC-I (增生物活化受体Y辅活化子1) -CBP (cAMP效应元件-结合(CREB)蛋白-结合蛋白)-PCAF (p300/CBP 相关因子)-ARA 54 (雄激素受体相关蛋白54)-ARA 55 (雄激素受体相关蛋白55)辅抑制子蛋白也与核受体的配体结合结构域的表面结合，只是通过LXXXIXXX(I/ L)氨基酸基序(其中L=亮氨酸，I =异亮氨酸以及X=任何氨基酸)。此外，辅抑制子优 选地结合非活化形式的、没有激动剂、或者可能地为结合了拮抗剂的形式的核受体。辅受体 的实例包括-NC0R-1 (核受体辅抑制子)-NC0R-2 (核受体辅抑制子)/SMRT (用于视黄酸或甲状腺激素受体的沉默介体(辅 抑制子))-LCoR (配体依赖型辅抑制子)-RCOR (REST 辅抑制子)-CtBP 602618-Rb (视网膜母细胞瘤蛋白)-SIN3(SIN3a, SIN3b)具有双功能活化子/抑制子的辅因子包括-PELP-I (富含脯氨酸、谷氨酸和亮氨酸的蛋白1)-NSD-I-RIP_14(RXR-相互作用蛋白 14)可根据本发明分离蛋白质所包含的LBD来选择辅活化子。熟练技术人员将理解辅因子取决于LBD所源自的核受体的信号转导，并且将能够选择用于本发明检测体系的适合 的辅因子来检测辅因子和包括LBD的分离蛋白质在结合配体时的相互作用。在本发明优选的实施方式中，辅因子是糖皮质激素受体灭活蛋白-I(GRIP-I)或 类固醇受体辅活化子-1 (SRC-I)，任选地，以标记，优选标签来进行标记。
GRIP-I是含有若干个核受体相互作用结构域和固有的组氨酸乙酰基转移酶活性 的转录辅调控蛋白。通过配体活化的核受体，如R0R，特别是ROR α将GRIP-I募集到DNA促 进位点。GRIP-I再使得组氨酸乙酰化来促进DNA转录。GRIP-I也称作SRC-2 (类固醇受体 辅活化子-2)或转录介体/中间因子2(TIF-2)或核受体辅活化子2(NC0A2)。SCR-I也是转录辅调控蛋白，其也含有若干个核受体相互作用结构域和固有的组 氨酸乙酰基转移酶活性。通过配体活化的核受体将SRC-I募集到DNA促进位点。SRC-I再 使得组氨酸乙酰化来促进下游DNA转录。SRC-I也称作核受体辅活化子-1 (NC0A-1)。在本发明的一个实施方式中，辅因子可由标记，优选标签来进行标记。标记或标签 如上所限定。标记可用于纯化辅因子或者它可用来检测分离蛋白质和辅因子之间的相互作 用。适合的标记包括抗体、抗原、酶、放射标记等。然而，应理解需以仍旧允许辅因子与检测 系统的其它组分相互作用的方式来标记该辅因子以检测指示分离蛋白质与辅因子之间相 互作用的信号。在本发明优选的实施方式中，这样设计检测体系，即其中蛋白质与辅因子的邻近 诱导可检测的信号。可通过将分离蛋白质与辅因子结合来达到该分离蛋白质与辅因子的 邻近。可通过标记每一组分来实现信号的诱导，其中标记的邻近诱导可检测的信号。被 诱导的可检测信号可为化学发光信号、颜色改变、荧光信号、放射或任何其它适合的信 号。可通过两标记的相互作用来诱导信号，其中每一标记结合检测体系的一种组分，即 分离蛋白质和辅因子。此信号一方面包括放射标记，如1251，而另一方面适合的猝灭剂， 以便检测闪烁计数器的邻近(闪烁邻近检测法)。组分可包括抗原可接近的抗体，该抗 体以能检测FRET(荧光共振能量转移，见下)的形式标记。另一替代方案，一种蛋白质 的表面结合有能够被激酶磷酸化的生物分子而另一组分的表面复合有三价金属离子，例 如通过适当的接头如次氮基三乙酸、亚氨基二乙酸或适当取代的含N杂环，例如叠氮杂 环，例如triazocyclononaneononane，例如丙氛基乙酸一1，4，7-三氣杂环壬烧 (l-propylamino-4-acetato-l, 4, 7-triazacyclononane)。当##禾口立紧 f^lii 时，产生化学发光信号，这在蛋白质与辅因子结合时发生(发光邻近检测法)。在本发明的一个优选实施方式中，检测蛋白质与辅因子相互作用的方法包括对于 蛋白质或辅因子特异的至少一种抗体。如上面详述，分离蛋白质可包括用于特异抗体以及 用于该抗体检测的抗原。在本发明甚至更优选的实施方式中，检测体系包括两种抗体，其中 第一种抗体是蛋白质特异的而第二种抗体是辅因子特异的。可用指示各组分存在的适当的 标记来标记抗体。或者，上述一抗可由针对该一抗的适当的二抗来检测。可使用二抗以便 检测一抗的存在，例如当一抗结合到二抗时。可用上面限定的标记，例如酶、放射标记、荧光 标记、化学发光标记等来对一抗或二抗进行标记。或者，该组分(蛋白质和/或辅因子)可 包括能被适当抗体检测到的标签。可以以这样的方式使用检测体系，即使用用于分离蛋白质和辅因子复合物的至少 一种组分的纯化体系，并且检测该复合物的存在或者复合物的每一组分的存在。例如，可通过凝胶电泳、柱色谱、亲和纯化等来纯化复合物并且可由指示复合物的一种组分或复合物 的两种组分的一种信号或两种信号的存在来检测该复合物。例如，如果使用对于一种复合 物组分特异的分离技术，那么检测方法可限于另一组分。或者，纯化方法可以不是对于一种 组分特异的，例如凝胶电泳，并且可通过两种信号来检测复合物的形成，例如由可区别的荧 光标记所标记的两种抗体，其中例如，在凝胶的同一区域处存在两种荧光标记则指示该复 合物。本发明的再又一实施方式中，本发明的检测体系的特征在于a)用荧光共振能量转移(FRET)的供体部分来标记第一抗体，而用FRET的受体部 分来标记第二抗体，或反之亦然；或者b)用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的供体部分来标记第一抗体，而用 TR-FRET的受体部分来标记第二抗体，或反之亦然；或者c) ffi^^^jfe^ii^M^IlJ (Amplified Luminescence ProximityHomogeneous Assay) (ALPHA)的供体部分来标记第一抗体，而用ALPHA的受体部分来标记第二抗体，或反 之亦然。荧光共振能量转移(FRET)描述了在两生色团之间的无辐射能量转移。处于激发 态的供体生色团可以通过非放射性远程偶极子_偶极子偶联机制将能量转移到紧密邻近 (通常<10nm)的受体荧光团。由于两种分子都是荧光的，通常将能量转移称作“荧光共振 能量转移”，尽管能量实际上不是通过荧光转移。FRET是检测和量化蛋白质-蛋白质相互作 用、蛋白质-DNA相互作用以及蛋白质构象改变的有用工具。对于监控一种蛋白质与另一蛋 白质或者一种蛋白质与DNA的结合，一种分子用供体标记而另一种用受体标记并且将这些 荧光团标记的分子混合。当它们以未结合态存在时，在供体激发时检测供体发射。当分子 结合时，供体和受体接近并且由于来自供体到受体的分子间FRET而主要观察到受体发射。 FRET的适合的邻近物是本领域已知的并且熟练技术人员将能够选择用于两抗体的标记的 适当组合。如本文对于供体和相应的受体所使用，“相应”指受体荧光部分具有与供体的激 发谱相重叠的发射谱。然而，两种信号应可彼此分离。因此，受体的发射谱的最大波长应优 选比供体的激发谱的最大波长大至少30nm，更优选至少50nm，例如至少80nm，至少IOOnm或 至少150nm。在FRET技术中可以与多种受体荧光部分一起使用的代表性的供体荧光部分包 括荧光素、荧光黄(Lucifer Yellow)、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸盐(酯)、荧光黄VS、 4_乙酰氨基-4'-异硫氰酸均二苯乙烯_2，2' -二磺酸、7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰 酸苯基)-4_甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸、和4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸均二苯乙 烯-2，2' -二磺酸衍生物。根据所用供体荧光部分，代表性的受体荧光部分包括LC-Red 610、LC-Red640、LC-Red 670,LC-Red 705、Cy5、Cy5. 5、丽丝胺罗丹明 B 磺酰氯、四甲基罗丹 明异硫氰酸酯、罗丹明χ异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二乙撑三胺五乙酸盐或 镧系离子(例如铕或铽)的其它螯合物。供体和受体荧光部分可以获自，例如Molecular Probes (Junction City, OR)或 Sigma Chemical Co. (St.Louis，M0)。或者，本发明的检测体系可使用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)。TR-FRET联合了 TRF(时间分辨荧光)和FRET原理。这一组合将TRF的低背景益处与FRET的均质 检测形式相组合。上面已经描述了 FRET，而TRF利用镧系元素或任何其他具有长半衰期的供体的特有特性的优点。对于TR-FRET的适当供体包括镧系螯合物(穴状化合物)和一些 其他金属配体复合物等，这些物质可以在微秒至毫秒时间范围内具有荧光半衰期并且因此 也允许在微秒至毫秒量度发生能量转移。荧光镧系螯合物在70年代末期被用作能量供体。 通常使用的镧系包括钐(Sm)、铕(Eu)、铽(Tb)和镝(Dy)。由于它们特异的光物理和光谱特 性，镧系复合物在生物学中对于荧光应用是主要的兴趣点。具体地，当与更加传统的荧光团 相比时，它们具有大的斯托克斯位移以及极长的发射半衰期(从微秒到毫秒)。通常，使用有机生色团作为受体。这些包括别藻蓝蛋白(APC)。对于TR-FRET以及 受体的适当的详述描述于WO 98/15830。在本发明的其他实施方式中，本发明的检测体系适于放大发光邻近均质检测 (ALPHA)。ALPHA是最初由Packard Bioscience研发的基于溶液的检测。ALPHA是基于发 光的邻近检测，其中一种相互作用配偶体附着供体珠，而另一种连接受体珠，两者直径都仅 约250nm。光敏剂化合物嵌入供体珠。以此化合物，在波长约680nm的激光发光时，环境氧 转变成富含能量的短寿命单态氧。当没有受体珠邻近时，该单态氧衰变而不产生信号。如 果供体和受体通过所附着的生物分子的生物相互作用带至一起(ca. 250nm)，由供体珠释放 的单态氧起始附近受体珠的发光/荧光级联反应，导致在520-620nm范围的高度放大信号。 在适合的读数器中检测发光信号。对于ALPHA技术的更加细述，参见Ullman等人，1994， Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 91,5426-5430。示例性检测体系及其应用描述于实施例2并示出于图1C。本发明的再又一方面涉及筛选用于核受体的配体结合结构域的配体的方法，包括 步骤a)将根据本发明的检测体系与一种物质相接触，和b)在该物质与配体结合结构域结合时，检测可测量的信号，从而将该物质鉴定为 用于配体结合结构域的配体。根据本发明，可按照本发明现有说明书的详述，特别是优选实施方式中的详述来 说明检测体系。检测体系可包括在细胞中或者它可以是无细胞体系。优选无细胞体系。检测 体系可与检测物质在适于检测可测信号的条件下接触。这包括适合的温度、化学环境(缓 冲液、PH值等)以及适合的物质浓度和适当的接触时间。在接触后或在接触同时，观察到信号，其中对信号的检测指示用于LBD的配体。信 号可为如上面详述的在本发明检测体系和本发明分离蛋白质及其应用的上下文中的任何信号。在本发明优选的实施方式中，检测体系包括用用于FRET或TR-FRET的供体标记的 第一抗体以及用用于FRET或T-FRET的受体部分标记的第二抗体，或反之亦然。另外，FRET 的存在指示激动剂。在本发明优选的实施方式中，使用筛选方法来筛选用于预防和/或治疗冠状动脉 疾病(CAD)、动脉硬化、血脂异常、神经变性疾病、睡眠障碍、昼夜节律疾病或骨质疏松症的 药物。前述疾病涉及R0R，特别是ROR α。因此，假设R0R，尤其是ROR α LBD的激动剂或拮 抗剂将对于这些疾病具有有益的影响并且可能因此被用来预防或治疗这些疾病。在下面，通过附图和实例来说明本发明，而附图和实例不旨在限制本发明的范围。
附IA示出RORα 1的示意说明，指示这一核受体的多种结构域。图IB示出本发明的多种构建体，其中RORa 1的LBD与切割位点(TEV或 PreScission (PreSci) )、His-标签(His)以及任选的谷胱甘肽_S_转移酶-标签(GST)相连。图IC示出根据本发明的FRET检测的示例说明。在这一检测中，ROR α被结合FRET 供体铕(Eu)的特异抗体所检测。辅活化子(CA)是生物素标记的。该生物素标记被链亲和 素所检测，其包括FRET受体别藻蓝蛋白(APC)标记。如果激动剂与RORa结合，NR活化， CB结合该NR。因此，APC被带至邻近Eu，导致检测到FRET信号(左图)。在拮抗剂存在下， CA不结合RORa，因此不产生FRET信号(右图)。图2示出实施例2的检测结果。如由在荧光共振能量转移检测中荧光强度率的增 加所测量，胆固醇和胆固醇硫酸酯(盐)以剂量依赖的方式诱导辅活化子肽SRC1-NR1+2与 RORa的结合。上面的线(+)表示在存在渐增浓度的胆固醇硫酸酯(盐)时进行检测，而中 间的线(〇)示出在存在渐增浓度的胆固醇时进行的检测。下面的线(□和Δ)表示只存 在溶剂时进行的实验。
实施例实施例1 ROR a -表达、纯化和AD根据Kallen等人，2002，Structure, 10(1697)进行RORa蛋白质的表达和纯化。对于表达和纯化，将包括配体结合结构域(LBD，第271-523位氨基酸)的RORa 1 的DNA与6个连续组氨酸残基的N端片段以及用于HRV 3C蛋白酶的识别序列一起克隆到 PVL1393载体。按照标准方法在Sf9昆虫细胞中进行病毒产生和表达。在感染后72hr收获 感染的细胞并将细胞沉淀团存储在-80°C。将冷冻细胞沉淀团在500mM NaCl，50mM Tris，pH 8.0，5mM β-巯基乙醇中重悬 浮。加入蛋白酶抑制物(完全无EDTA，Roche Diagnostics)和Benzonase (Novagen)。在冰 上搅拌裂解物30分钟并且最后用超声破裂细胞。离心后，将澄清的裂解物上样到用500mM NaCl, 50mM Tris, pH 8. O 平衡的充满 Ni2+的 HisTrap FF(GE Healthcare)柱。用超过 30 柱体积(CV)至500mM NaCl，500mM咪唑，pH 8. O的线性梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分 析级分并且合并相应的级分并对30mM Hepes, pH 7. 0,20mM NaCl,2mM DTT，5%甘油透析。对于进一步纯化，将蛋白质上样到用30mM Hepes, pH 7. 0,20mM NaCl,2mM DTT 平衡的HiTrap Q FF阴离子交换柱(GE Healthcare)。用超过20柱体积至30mM Hepes, pH 7.0, IM NaCl, 2mM DTT的梯度洗脱蛋白质。合并相应的级分并在用150mM NaCl, 5mM DTT,50mM Tris, pH 7· 5 平衡的 Superdex 20026/60 凝胶过滤柱(GE Healthcare) 上进一步纯化。合并含有RORaLBD的级分并且浓缩。通过SDS-PAGE和毛细管电泳 (Agilent2100Bioanalyzer)判断，蛋白级分至少为95%纯。将蛋白质(2. 3mg/ml)等分并存储在-80°C。在体外检测使用之前，在室温下对 20mM Tris，pH 7. 5透析蛋白质8hr。加入十二烷基硫酸锂(LDS)至终浓度为3mM并且进一 步在室温轻微振荡过夜孵育混合物。将蛋白质等分并存储在-80°C。在辅因子募集荧光共振能量转移检测(FRET)中显示出纯化的以及LDS-处理的RORaLBD蛋白与糖皮质激素受体相互作用蛋白I(GRIPl)和类固醇受体辅活化子1 (SRCl) 相互作用。具体地，发现源自两辅因子的不同核受体框(NR)的肽GRIP1-NR1、GRIP1-NR2和 SRC1-NR1+2与RORa相互作用。
在所有三种情形下，胆固醇硫酸酯(盐)能够以22μ M的EC5tl剂量依赖地诱导辅 因子结合。将20ηΜ用等摩尔量的荧光抗-6xHis抗体标记的RORa LBD蛋白质与400nM各 生物素标记的肽、和等摩尔量的链亲和素标记的荧光团在含有50mM Tris, IOOmM NaCl, ImM DTT和0. 1 % BSA的缓冲液中孵育2hr。在665nm和612nm处对荧光比的时间分辨测量显示 出由已知激动剂像胆固醇硫酸酯(盐)和胆固醇的剂量依赖型辅因子募集。实施例2 测量ROR α LBD与LXXLL肽(SRC1-NR1+2)相互作用的TR-FRET检测对于TR-FTET检测，使用下面的材料蛋白质-6xHis-R0Ra 来源Protein Production (Lab. Thomas Langer)，用 3mM LDS 处理，母液为 1. 5mg/ ml，储存在-20 V，室温吸取，对应于47，5 μ M (具丽31，6kD)，检测中浓度=20nM-SRC1-NR1+2 来源JPT Peptide Technologies，母液为 250 μ M，储存在-20°C，检测中浓度= 400nM荧光团/标记-抗_6xHis 抗体来源Perkin Elmer # ADOl 10，母液为每批次浓度不同，储存在_20°C，检测中浓 度=20nM-链亲和素-APC来源Perkin Elmer # AD0201，母液为每批次浓度不同，重建后储存在+4°C，检测 中浓度=200nM(基于链亲和素)激动剂_胆固醇硫酸盐(酯)来源SIGMA #C9523，母液处于DMSO中(30mM)，存储在_20°C缓冲液-50mM Tris, IOOmM NaCl, ImM DTT，0，牛血清白蛋白(每天新加入 BSA)，将 pH 调至7，4板-检测板CORNING Costar # 3639 (96 孔半量板)按照下面进行检测就在进行检测步骤前在检测缓冲液中稀释所有蛋白质、标记和化合物。这一检测 在96孔半量板上实现。最终检测体积为20 μ 1。将它分成2步吸取步骤首先，以下面的浓度在冰上制备含有6xHis_R0Ra LBD蛋白质，生物素SRC1-NR1+2 肽，抗-6xHis抗体和链亲和素-APC的混合物检测浓度(终)6xHis-R0Ra LBD27nM 20nM生物素SRC1-NR1+2 533nM 400nM
抗_6xHis 抗体27nM 20nM链亲和素-APC267nM 200nM岭将15 μ 1这一混合物吸入白色96孔板在第二步，将5μ 1的激动剂化合物以4倍浓缩溶液加入。胆固醇硫酸盐(酯)通 常在2倍稀释步骤中从300 μ M最终化合物浓度稀释下来并得到EC5tl为约10 μ Μ。封闭板 以避免蒸发。室温下将板在暗光下孵育2h并于室温下，以340nm激发和612nm作为铕参照、 665nm作为APC FRET信号在Tecan ULTRA上读数。这一检测结果如图2所示。
权利要求
一种分离蛋白质，包括核受体的可控形式的配体结合结构域。
2.权利要求1的分离蛋白质，其中该核受体是视黄酸受体相关的孤儿受体(ROR)，特别 是 ROR α、ROR β 或 ROR γ，尤其是 ROR α。
3.权利要求1或2的分离蛋白质，其中在激动剂与该配体结合结构域结合时，该配体结 合结构域是可活化的。
4.权利要求1至3任一项的分离蛋白质，其中该蛋白质还包括标记，特别是标签。
5.权利要求4的分离蛋白质，其中该标签选自His-标签、Arg-标签、链亲和素-标签、 Flag-标签、T7-标签、V5-肽-标签、c-Myc-标签、S-标签、HAT-标签、钙调蛋白结合肽-标 签、几丁质结合肽_标签、GST-标签和MBP-标签。
6.权利要求4或5的分离蛋白质，其中通过在特异切割位点的蛋白水解切割，该标记或 标签是可从该蛋白质除去的。
7.权利要求1-6中任一项的分离蛋白质，包括SEQID NO :1或2的序列或由该序列组成。
8.—种生产权利要求1-7中任一项的分离蛋白质的方法，包括步骤a)在有助于蛋白质生产的适当条件下，培养包括编码权利要求1-7中任一项的蛋白质 的核酸的细胞，b)从细胞培养物分离该蛋白质，和c)将步骤b)分离的蛋白质与洗涤剂，特别是与饱和的未分支C6-C20烷基硫酸酯或碳 酸酯的碱性盐或者与异戊二烯基盐相接触。
9.权利要求8的方法，其中该方法还包括在步骤b)后除去标记或标签。
10.权利要求9或10的方法，其中饱和的未分支C6-C20烷基硫酸酯或碳酸酯的碱性 盐是饱和的未分支C9至C15烷基硫酸酯的碱性盐，优选十二烷基硫酸酯的碱性盐，更优选 十二烷基硫酸锂(LDS)。
11.权利要求8至10中任一项的方法，其中在存在用于配体结合结构域的激动剂时，进 行步骤b)和/或C)。
12.权利要求8至11中任一项的方法，其中该细胞选自动物细胞、植物细胞和酵母细 胞，特别地，其中该细胞是昆虫细胞或大肠杆菌细胞。
13.一种分离蛋白质，包括由根据权利要求8-12中任一项的方法所生产的核受体的可 控形式的配体结合结构域。
14.根据权利要求1-7和/或13中任一项的分离蛋白质在鉴定用于核受体的配体结合 结构域的配体、特别是激动剂或拮抗剂、尤其是激动剂中的应用。
15.一种检测体系，包括-根据权利要求1-7和/或13中任一项的分离蛋白质，-辅因子，和-检测在配体、尤其是激动剂结合核受体的配体结合结构域时该蛋白质和该辅因子之 间的相互作用的方法。
16.权利要求15的检测体系，其中该辅因子是糖皮质激素受体灭活蛋白I(GRIP-I)或 类固醇受体辅活化子1 (SRCl)，其任选地以标记、优选标签来进行标记。
17.权利要求15或16的检测体系，其中该蛋白质和该辅活化子的邻近诱导可检测的信号。
18.权利要求15-17中任一项的检测体系，其中检测该蛋白质和该辅因子之间相互作 用的方法包括对于该蛋白质或该辅因子特异的至少一种抗体。
19.权利要求18的检测体系，其中该检测体系包括两种抗体，其中第一抗体对于该蛋 白质是特异的，而第二抗体对于该辅因子是特异的。
20.权利要求19的检测体系，其中(a)用荧光共振能量转移(FRET)的供体部分来标记第一抗体，而用FRET的受体部分来 标记第二抗体，或反之亦然；或者(b)用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的供体部分来标记第一抗体，而用 TR-FRET的受体部分来标记第二抗体，或反之亦然；或者(c)用放大发光邻近均质检测 (ALPHA)的供体部分来标记第一抗体，而用ALPHA的受体部分来标记第二抗体，或反之亦 然。
21.—种筛选用于核受体的配体结合结构域的配体的方法，包括步骤a)将根据权利要求15-20中任一项的检测体系与一种物质相接触，和b)在该物质与该配体结合结构域相结合时，检测可测量的信号，从而将该物质鉴定为 用于配体结合结构域的配体。
22.权利要求21的方法，其中该检测体系如权利要求20所定义并且其中FRET的存在 指示激动剂。
23.权利要求21和22的方法，其中该方法用于筛选用来预防和/或治疗冠状动脉疾 病(CAD)、动脉粥样硬化、血脂异常、神经变性疾病、睡眠障碍、昼夜节律疾病或骨质疏松症 的药物。
全文摘要
本发明涉及一种包括核受体的可控形式的配体结合结构域的分离蛋白质，生产它的方法，它在鉴定配体中的应用，包括该分离蛋白质的检测体系以及使用该检测体系来筛选用于核受体的配体的方法。
文档编号C07K14/435GK101809031SQ200880108831
公开日2010年8月18日 申请日期2008年9月13日 优先权日2007年9月27日
发明者T·朗格, U·施万 申请人:塞诺菲-安万特股份有限公司