专利名称：一种抗疟活性异香豆素化合物及其组合物、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种异香豆素化合物，具体来说涉及一种新的含多羟基取代碳链的异香豆素 化合物，另外还涉及这种异香豆素化合物的制备方法及其在预防和治疗疟疾方面的应用。
背景技术：
疟疾是冊O定义的全球三大传染病之一，也是全球最普遍、对人类健康危害最严重的原 生动物传染病。据世界卫生组织《2008年世界疟疾报告》显示，目前世界上有近半数人口 (约 为33亿)面临感染疟疾的危险，每年全世界死于疟疾的人数约为100万人。虽然我国的疟疾 防治工作已取得较显著的成就，但由于疟疾传播快，易反复，传播因素复杂，加大了其防治 的难度，再加上入口频繁流动和周边一些国家疟疾疫情不稳定对我国边境地区的影响，2000 年以来我国的疟疾疫情出现了回升的迹象，部分地区更出现暴发流行，云南、海南两省的抗 药性恶性疟有不断扩散的趋势，目前全国有21个省(市、自治区)的907个县(市、区)存在 疟疾传播，300多个县尚未控制疟疾流行，防治工作形势依然十分严峻。
疙疾是由红细胞中原生动物疟原虫寄生引起，并通过感染蚊虫的叮咬在动物之间和人类 之间进行传播。危害人类的疟疾主要有四种类型恶性疟原虫，间日疟原虫，三日疟原虫和 卵形疟原虫。最常见的是恶性疟原虫和间日疟原虫，其中恶性疟原虫是到目前为止最致命一 种疟疾感染，如果不及时用有效药物进行治疗，就会对患者的身体造成非常严重甚至致命的 后果。
药物的及时介入治疗是縮短疟疾感染期，防止产生并发症，避免造成大多数病患死亡的 主要手段，早期的常规化学抗疟药如奎宁、氯喹等曾在疟疾的治疗中发挥了相当重要的作用， 但随着抗疟药的广泛应用，疟原虫几乎对所有化学抗疟药物都产生了不同程度的抗药性。20 世纪50年代后期在泰缅边境和哥伦比亚发现氯喹抗性病例之后，氯喹抗性几乎遍布恶性疟流 行区，哌喹、甲氟喹、乙胺嘧啶和磺胺类药物抗性株也相继出现。青蒿素是目前世界上最有 效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，具有快速、高效、无抗药性、低毒副作用的特 征，被世界卫生组织称为"治疗疟疾的最大希望"，但已有报道指出疟原虫对青蒿素类药物的 敏感性也开始下降。我国也同样存在严重的恶性疟原虫抗药性问题。因此对恶性疟原虫抗药 性机理的研究和新型抗疟药物的研发已成为全球抗疟工作的热点和难点。不断加入新型结构、 新作用机理或新的药用靶点的抗疟活性化合物，并积极采用联合用药，根据不同地区疟原虫 耐药性不同采用不同组合用药的策略，才能更有效防治疟疾，尤其是耐药疟原虫疾病的蔓延 和泛滥。1^2-苯并吡喃-l-酮又称异香豆素，其种类繁多，并具有多种生物活性，根据目前的专 利文献记载，异香豆素可预防和治疗高脂血症(中国专利CN101367840 (A), Feb. 18, 2009)， 糖尿病并发症(日本专利JP3240785 (A) , Oct. 28, 1991),阿尔茨海默病(W00248102 (A2)， Jun. 20， 2002)，抗肿瘤和抗炎症(中国专利CN101029047 (A), Sept. 5， 2007，美国专利 US2006252823 (Al)， Nov. 9, 2006),抗过敏(美国专利US3975535 (A), Aug. 17, 1976)等。 此夕卜Palangpon Kongsaeree等人在野茼蒿(Crass0c印/7aJwH crepidioj'cfes)的地霉属内生真 菌Geotrichum sp.代谢物中分离得到的7-butyl-6, 8-dihydroxy-3(必-pent-11-enyliso chroman-l-one禾口 7-butyl-6， 8-dihydroxy-3("-pentylisochroman-l-one就具有显著的体 外抗疟活性，其ICs。为15. 5 |amol/L和8. 5 nmol/L (Kongsaeree P. et al. > J Nat Prod， 2003, 66, 709-711)。
本发明的目的在于开发出一种新的异香豆素类化合物，本发明的另一目的是提供这种异 香豆素类化合物的制备方法，本发明的再一目的是开发出这种异香豆素类化合物在预防和治 疗疟疾方面的应用，最后一个目的是提供含有该化合物的组合物。
我们用小麦固体培养基对拟青霉尸aeci7側7cas sp. SC0924 CGMCC No. 2900进行发酵得到 固体发酵培养物，然后将固体发酵培养物用有机溶剂提取得到提取物，再将提取物用柱层析 等方法分离纯化得到一种异香豆素类化合物，通过体外抗疟活性评价试验证明其对恶性疟原 虫有显著的抑制活性，从而实现了本发明的目的。
本发明的异香豆素类化合物的结构由以下式(l)表示
本发明的异香豆素类化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤 (1) 将拟青霉尸sec^側/ca sp. SC0924 CGMCC No. 2900菌株接种到YMG液体培养基中， 黑暗中于24 28'C摇床培养3 6d得到种子液，然后将种子液接种到小麦固体培养基上，黑 暗中于24 28'C静置培养，得到固体发酵培养物，所述的小麦固体培养基按质量份数计，含 有小麦1份，YMG液体培养基1. 8份；
发明目的
式(l)(2) 将步骤(l)得到的固体发酵培养物用乙醉浸提，过滤浓縮得到浸膏，将浸膏用乙醇 溶解，将乙醇溶解物用石油醚萃取，丢弃石油醚萃取物，将剩下的乙醇水溶液除去乙醇并用 水补回原体积后，将水溶液依次用氯仿和乙酸乙酯萃取，丢弃氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物， 将剩余的水溶液用正丁醇萃取，分离得到正丁醇萃取物，浓縮得到正丁醇提取物；
(3) 将步骤(2)得到的正丁醇提取物进行硅胶柱层析，以体积比95:5 80:20的氯仿-甲 醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析检测合并相似的流份，收集薄层板上氯仿-甲醇体积比 80:20展开时比移值0.4 0.6的流份，合并后分次上S印hadex LH - 20柱，用甲醇洗脱，收 集薄层板上氯仿-甲醇体积比80:20展开时比移值0. 4 0. 5的流份，浓缩后重结晶得到上述 式(1)表示的异香豆素类化合物。
步骤(l)所述的拟青霉尸seci2cM Fces sp. SC0924 CGMCC No. 2900原名为绿僵菌 胞tw力i&腿sp. SC0924 CGMCC No. 2900，于2009年2月12日保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号园中国科学院 微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2900，已公开在中国专利申请200910037638.1和 200910037639. 6中。该菌种于2009年5月27日经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心核准改名为拟青霉尸sec/Jo/57ce5 sp. SC0924 CGMCC No. 2900。
步骤(1)所述的YMG液体培养基为通用的培养基，其中pH5.3 5.7，每升培养基中含有 葡萄糖4g,麦芽提取物10g，酵母提取物4g，其余是水，所述的静置培养时间可以是6 20 天。
步骤(2)所述的浸提最好是3次，每次48h，所述的萃取的次数均最好为3次。
通过结构分析，证实以上制备方法得到的产物是结构由式(l)表示的异香豆素化合物，命 名为拟青霉内酯A (paecilolactoneA)，数据如下分子式C19H2609，叩192 194。C， [oc]24D —27.0° (c0.27， Me0H); UV (Me0H) X_ (log O 214 (3.99)， 266 (3.73)， 303 (3.43) nm;正离子ESIMS觅/z 399 [M + H]+， 421 [M + Na]+， 381， 363， 345， 327， 319， 301, 283， 253， 235， 207， 205， 189, 179， 135， 121， 95;负离子ESIMS w/z 397 [M—H] —， 433 [M + Cl] —， 247， 205， 190, 179， 164， 151， 113, 95。 'H NMR和13C醒R (溶剂:氘代二甲基亚 砜)的数据见表l。表1式(1)化合物的'H和"C NMR数据
位置
H (/ in Hz)
13C
位置
^ (/ in Hz)
13C
1
3 4.59 (线10.2, 6.8， 2.0)
4 4.50 (dd, 6.8, 6.2)
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
6.59 (d, 2.2) 6.47 (d, 2.2)
L 70 (ddd, 14.0, 10.8， 2.0) 1.83 (ddd, 14.0, 10.2' 2.0) 3. 72 (m)
3.06 (td， 6.8， 6.8， 3.2) 4.06 (ddd, 6.0， 5.6' 3.2)
168. 1
80.3 66. 7
145. 1
100. 0 165. 7 100.0 163.0 104. 8
35.4
65.8 77. 1 71.0
13 5. 50 (dd， 16. 0，
14 5.54 (dd, 16.0,
15 1.99 (td， 12.6， 6.0)
2. 10 (td， 12. 6, 5. 6)
16 3.60 (ra)
17 1.02 (d, 6.0) 6-0CH3 3. 82 (s)
4-OH 6. 04 (d' 6. 2)
8-OH 11.14 (br s)
10-OH 4,80 (d' 6.2) U-OH 4. 37 (d， 6. 8) 12-OH 4.45 (d, 6.0) 16-OH4.40 (d， 4.5)
5.6) 133.4 6.0) 127.4 6. 0，42. 2
5,6,
65.9 23, 1 55.8
将本发明式(1)表示的异香豆素类化合物进行体外抗人恶性疟原虫3D7药物敏感株活 性试验，证明具有很强的抗疟活性，其半数抑制浓度(IC5。)为20mnol/L，活性与阳性对照 品氯喹(chloroquine， IC50=23. 4翻1/L )禾口青蒿素(artemisinin， IC50 = 10.9 nmol/L ) 相当。
本发明式(1)化合物的药物组合物含有治疗有效量的上述式(1)的化合物为活性成分, 以及含有一种或一种以上药学上可以接受的载体。
上文所述药学上可以接受的载体是指药学领域常规的药物载体。本发明的药物组合物可 以采用通常的药物剂型，各种剂型可以按照药物领域的常规方法制备。
本发明式(1)表示的异香豆素类化合物及其组合物可用于制备预防和治疗疟疾的药物。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。 实施例l:本发明式(1)表示的化合物的制备
将葡萄糖4g，麦芽提取物10g,酵母提取物4g混合用水定容到lOOOmL，得到pH 5. 3的YMG液体培养基。
将拟青霉Paec77ao7/ces sp. SC0924 CGMCC No. 2900菌株的菌种块接种到lOOmL上述YMG 液体培养基中，黑暗条件中于26'C摇床(130r/min)培养3d得到种子液，然后将种子液100raL 接种到含小麦550g, YMG液体培养基1000mL的小麦固体培养基上，黑暗中于26"C静置培养 12d，得到固体发酵培养物。
将固体发酵培养物25L用等体积的质量分数为95%的乙醇浸提三次，每次48h，过滤后 减压浓缩得到浸膏630g，将浸膏用4L质量分数为80%的乙醇水溶液溶解，将乙醇溶解物用 等体积的石油醚萃取3次，丢弃石油醚萃取物，将剩下的乙醇水溶液合并除去乙醇，然后用 水补回原体积，将此水溶液依次用等量的氯仿和乙酸乙酯分别萃取3次，丢弃氯仿萃取物和 乙酸乙酯萃取物，将剩余的水溶液用等量正丁醇萃取3次，将得到的正丁醇萃取物合并并浓 缩得到正丁醇提取物67. 44g。
将上述的正丁醇萃取物上硅胶柱(硅胶为100 200目，800g)，以体积比95:5 80:20 的氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析(TLC)检测合并相似的流份，收集薄层板 上氯仿-甲醇体积比80:20展开时比移值0. 4 0. 6的流份，合并后分次上S印hadex LH - 20柱， 甲醇洗脱，收集薄层板上氯仿-甲醇体积比80:20展开时比移值0. 4 0. 5的流份，浓缩后以甲 醇为溶剂重结晶得无色针状结晶0. 048g，通过上述结构分析证明该结晶即为本发明的异香豆 素类化合物，结构由式(l)表示，命名为拟青霉内酯A (paecilolactone A)。
实施例2:实施例1化合物的抗疟原虫活性
在体外用RMPI 1640培养基和体积分数10%人血清培养人恶性疟原虫3D7药物敏感株， 红细胞压积为5%左右。用质量分数5% ^山梨醇将疟原虫同步化到环状体时期，然后铺板， 初始感染率为1%，红细胞压积为51将实施例1化合物用DMS0溶解配制成母液，再用培养 基稀释，活性检测时，浓度梯度采取三倍梯度稀释，药液占培养体系的体积分数10% (DMSO 的浓度小于体积分数0.5%)。培养48h后涂片，Gimsa染色，镜检，计数感染率。抑制率=(空
白对照组感染率-药物组感染率)/空白对照组感染率xiooy。。将抑制率和药物浓度进行非线
性回归(Graphpad Prism 3.0)，计算IC5。。同时以同样方法制备的氯喹药液和青蒿素药液作 为阳性对照。结果是，本发明式(1)表示的异香豆素类化合物的半数抑制浓度(IC5。)为20 nmol/L，氯喹的1(:5。=23. 4 nmol/L，青蒿素的1(:5。= 10.9 nmol/L。
权利要求
1.式(1)表示的化合物式(1)
2. 权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤(1) 将拟青霉化eciJoffl/c" sp. SC0924 CGMCC No. 2900菌株接种到YMG液体培养基中， 黑暗中于24 28r摇床培养3 6d得到种子液，然后将种子液在小麦固体培养基上，黑暗中 于24 28'C静置培养，得到固体发酵培养物，所述的小麦固体培养基按质量份数计，含有小 麦1份，YMG液体培养基1.8份；(2) 将步骤(l)得到的固体发酵培养物用乙醇浸提，过滤浓縮得到浸膏，将浸膏用乙醇 溶解，将乙醇溶解物用石油醚萃取，丢弃石油醚萃取物，将剩下的乙醇水溶液除去乙醇并用 水补回原体积后，将水溶液依次用氯仿和乙酸乙酯萃取，丢弃氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物， 将剩余的水溶液用正丁醇萃取，分离得到正丁醇萃取物，浓縮得到正丁醇提取物；(3) 将步骤(2)得到的正丁醇提取物进行硅胶柱层析，以体积比95:5 80:20的氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析检测合并相似的流份，收集薄层板上氯仿-甲醇体积 比80:20展开时比移值0. 4 0. 6的流份，合并后分次上S印hadex LH - 20柱，用甲醇洗脱， 收集薄层板上氯仿-甲醇体积比80:20展开时比移值0. 4 0. 5的流份，浓縮后重结晶得到权 利要求1所述的化合物。
3. 根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征是步骤(l)所述的静置培养时间是 6 20天，步骤(2)所述的浸提是3次，每次48小时，所述的萃取的次数为3次。
4. 权利要求1所述的化合物在制备预防和治疗疟疾的药物方面的应用。
5. 用于预防和治疗疟疾的权利要求1化合物的药物组合物，其特征在于，其中含有治疗 有效量的权利要求1的化合物和药学上可以接受的载体。
全文摘要
本发明涉及一种式(1)表示的新的异香豆素化合物及其组合物、制备方法和应用。其特征是将拟青霉Paecilomyces sp.SC0924 CGMCC No.2900接种到YMG液体培养基中，黑暗中于24～28℃摇床培养得到种子液，种子液再在小麦固体培养基上，黑暗中于24～28℃静置培养得到固体发酵培养物；将固体发酵培养物用正丁醇等有机溶剂萃取，得到正丁醇提取物；将正丁醇提取物进行硅胶柱层析，收集薄层板上氯仿-甲醇体积比80∶20展开时比移值0.4～0.6的流份，上Sephadex LH-20柱，收集薄层板上氯仿-甲醇体积比80∶20展开时比移值0.4～0.5的流份，浓缩后重结晶得到本发明式(1)化合物。该化合物有很强的抗疟活性，其半数抑制浓度为20nmol/L，可用于预防和治疗疟疾。
文档编号C07D311/76GK101575327SQ20091004021
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月12日 优先权日2009年6月12日
发明者何正祥, 萍 吴, 徐良雄, 李亚勇, 游剑岚, 薛璟花, 陈小平, 魏孝义 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院;中国科学院华南植物园