专利名称：雷莫拉宁发酵液预处理的方法
技术领域：
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种雷莫拉宁发酵液的预处理的方法。
背景技术：
随着抗生素在抗感染治疗上的大量应用，临床耐药问题日益突出。雷莫拉宁 (RAM0PLANIN)作为一类新型广谱抗革兰氏阳性菌抗生素，目前主要是作为外用和治疗胃肠 道粘膜表面感染性疾病药物进行研究开发。雷莫拉宁由一种游动放线菌属菌种(美国标准菌库保存，代码ATCC33076)制得。 其传统的预处理方法是将ATCC33076发酵菌株发酵出来的发酵液先调pH到3. 5，离心得 到菌丝体和发酵液，其中菌丝体用有机溶剂进行提取，提取后真空浓缩，再用正丁醇萃取多 次，合并萃取液后再反复用石油醚对其进行沉淀并分离出来，真空干燥得到粗品，而发酵液 用正丁醇萃取，同样方法制得粗品。USP4328316中报道的雷莫拉宁的预处理方法是通过高速离心，使发酵液和菌丝体 分开，再分别处理发酵液和菌丝体。此法的缺点是必须使用价格昂贵的大型离心设备，且由 于雷莫拉宁发酵液的黏度很大，固液分离的效果不好，另外，由于必须对发酵液和菌丝体分 别处理，操作步骤繁琐，溶剂使用量大，非常不利于工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种步骤简单、操作时间短，并同时保持高收 率的预处理雷莫拉宁发酵液的方法。本发明基于将絮凝作用应用到雷莫拉宁发酵液的预处理中，通过筛选各种絮凝 齐U、摸索其加入发酵液的比例而完成。絮凝作用的原理是在絮凝剂存在的条件下，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使发 酵液中的胶粒物质形成粗大的絮凝团，从而使得发酵液易于过滤。对于雷莫拉宁发酵液，由 于其菌丝形态的特异性，粘度非常大，无论是抽滤还是离心都难以取得很好的效果，加入本 发明的絮凝剂后，由于产生的架桥作用，使得发酵液中粘度较大的蛋白质胶体物质聚集成 块，因而能够大大增加了过滤的速度。本发明通过筛选各种絮凝剂，找到两种絮凝效果非常好的絮凝剂，并优选出最佳 的添加量。加入本发明絮凝剂后，原来非常粘稠的发酵液变得非常的容易过滤，直接通过布 氏漏斗即可快速的将固液分离开，从而避免了大型离心机处理过程烦琐，离心时间长的问题。另外，本发明通过对发酵液pH的考察，发现将发酵液的pH调到8 10后，再加入絮凝剂，过滤后雷莫拉宁将完全在菌丝体中，滤液中几乎没有单位。对于菌丝体可以用有机 溶剂将雷莫拉宁提取出来。和已有专利相比，此工艺免去了从菌丝体和滤液分别提取雷莫 拉宁，只需对菌丝体进行处理，从而简化了工艺。因此，本发明提供一种雷莫拉宁发酵液预处理的方法，该方法包括如下步骤
a)将雷莫拉宁发酵液的pH调节到8-10 ；b)向发酵液中加入絮凝剂；C)过滤；
d)提取滤饼中的雷莫拉宁。其中，a)步骤中雷莫拉宁发酵液的pH可用NaOH溶液进行调节；b)步骤中所述的 絮凝剂优选为亚铁氰化钾和硫酸锌，所述亚铁氰化钾和硫酸锌加入的量优选为所述雷莫拉 宁发酵液体积的0. 2 1%，这里絮凝剂的加入量最少要0. 2%，但并不限定最大用量，选择
为上限是出于成本的考虑，已经完全能够很好的过滤雷莫拉宁发酵液；c)步骤中的 过滤方式优选为抽滤；d)步骤中滤饼中的雷莫拉宁可用一定体积的有机溶剂例如甲醇、乙 醇或丙酮等提取。本发明的雷莫拉宁发酵液预处理的方法具体根据如下步骤进行操作1)将雷莫拉宁的发酵液放罐后用NaOH溶液调其pH到8-10，搅拌后静置Ih左右；2)向发酵液中加入絮凝剂(优选亚铁氰化钾和硫酸锌)，加入的量可以为0. 2 1% (体积百分比)，搅拌后静置0. 5h ；3)用布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间视发酵液的体积而定，对于几升的发酵液来说， 二十分钟内完全能够抽滤好；4)抽滤完后弃去滤出液，将滤饼用一定体积的有机溶剂(优选甲醇、乙醇、丙酮 等)将其提取出来。本发明的雷莫拉宁发酵液预处理的方法具有步骤简单、操作时间短以及收率高的 优点。
具体实施例方式本发明所述的雷莫拉宁发酵液由以下方法制得将保藏号为ATCC33076的发酵菌 株进行发酵，其中斜面培养条件斜面及平板培养基(g/L):牛肉膏3.0，酪蛋白10.0，可溶淀粉 24. 0，葡萄糖1.0，琼脂22.0，灭菌前pH 7. 0，121°C灭菌30min。菌种接种于斜面培养基，于 30°C培养5-9天。种子培养条件二级发酵种子培养条件为牛肉膏3. 0，酪蛋白5. 0，酵母粉5. 0，燕 麦粉30.0，碳酸钙4.0，自来水配制，用2mol/L的NaOH(或者HCl)调pH至7. 0，121°C灭菌 30min。种子培养基装量为100ml/750ml，于28°C，250rpm的旋转式摇床培养72h。发酵培养条件为淀粉50.0，葡萄糖20.0，黄豆粉30.0，碳酸钙10.0，L-Leu5.0，自 来水配制，用2mol/L的NaOH(或者HCl)调pH至7. 0，121°C灭菌30min。接种量6%，装量 100ml/750ml，于25°C，旋转式摇床250rpm培养5天。本发明所用絮凝剂1亚铁氰化钾国药集团化学试剂有限公司分析纯2硫酸锌(七水合硫酸锌)国药集团化学试剂有限公司分析纯实施例1 3考察加入絮凝剂的比例对本发明方法的影响
实施例1雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为1062ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到
8.5，搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 2%，搅拌后静置0. 5h，静置 后用布氏漏斗进行抽滤，抽率时间约为18min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中没有 单位，弃去滤出液，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位为882ug/ml。
实施例2雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为967ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到8. 5， 搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各1%，搅拌后静置0. 5h，静置后用布 氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为12min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中没有单位， 弃去滤出液，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位为891ug/ml。实施例31雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为1096ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到
9.0，搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 5%，搅拌后静置0. 5h，静置 后用布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为15min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中几乎 没有单位，弃去滤出液，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位为877ug/ml。实施例4 6考察pH值范围对本发明方法的影响实施例4雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为957ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到8. 0， 搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 5%，搅拌后静置0. 5h，静置后用 布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为15min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中有少量的 雷莫拉宁，单位为12ug/ml，弃去滤出液，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位 为 882ug/ml。实施例5雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为855ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到
10.0，搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 5%，搅拌后静置0. 5h，静 置后用布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为15min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中几 乎没有单位，弃去滤出液，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位为796ug/ml。实施例6雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到9. 0， 搅拌后静lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 5%，搅拌后静置0. 5h，静置后用布 氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为15min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中几乎没有单 位，弃去滤出液，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位为844ug/ml。实施例7 8考察不同溶剂对本发明方法的影响实施例71雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为1120ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到 9. 0，搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 5%，搅拌后静置0. 5h，静置 后用布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为15min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中几乎 没有单位，弃去滤出液，将滤饼用1500ml的乙醇将其提取出来，测其单位为921ug/ml。实施例8
雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为1120ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到 9. 0，搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 5%，搅拌后静置0. 5h，静置 后用布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为15min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中几乎 没有单位，弃去滤出液，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位为1033ug/ml。对比例1雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为1096ug/ml，放罐后，用盐酸溶液调其pH到3. 5， 搅拌后静置lh，用BECKMAN离心机高速离心，转速为4000转/分钟，离心0. 5h后，将上清液 用HPLC进行检测，其单位为233ug/ml，将固体收集好用1500ml甲醇提取出来，测其单位为 564ug/ml。由对比例1可以看出，雷莫拉宁在上清液和沉淀中都有单位，必须分别进行进一 步的处理，因此增加了分离的步骤。
对比例2雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为896ug/ml，放罐后，用盐酸溶液调其pH到4. 0， 搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾和硫酸锌各0. 5%，搅拌后静置0. 5h，静置后用 布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间约为15min，抽滤完后用HPLC进行检测，发现滤液中雷莫拉宁 单位为426ug/ml，将滤饼用1500ml的甲醇将其提取出来，测其单位为451ug/ml。由对比例2可以看出，滤液和菌丝体中都含有雷莫拉宁，必须分别进行进一步的 处理，因此增加了分离的步骤。对比例3雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到9. 0， 搅拌后静置lh，向发酵液中加入亚铁氰化钾1%，搅拌后静置0. 5h，发现发酵液仍然呈胶 状，用布氏漏斗过滤时难以过滤，2h后滤液收集约400ml。对比例4雷莫拉宁的发酵液3000ml，单位为952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液调其pH到9. 0， 搅拌后静置lh，向发酵液中加入硫酸锌1%，搅拌后静置0. 5h，发现发酵液呈胶状，用布氏 漏斗过滤时难以过滤，2h后滤液收集约350ml。由对比例3和4可以看出，只加一种絮凝剂获得的分离效果不佳。
权利要求
雷莫拉宁发酵液预处理的方法，其特征在于，包括如下步骤a)将雷莫拉宁发酵液的pH调节到8-10；b)向发酵液中加入絮凝剂；c)过滤；d)提取滤饼中的雷莫拉宁。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用NaOH溶液调节雷莫拉宁发酵液的pH。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b)步骤中所述的絮凝剂为亚铁氰化钾和 硫酸锌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述亚铁氰化钾和硫酸锌加入的量为所 述雷莫拉宁发酵液体积的0. 2 1%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，c)步骤中所述的过滤为抽滤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用有机溶剂提取滤饼中的雷莫拉宁。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。
全文摘要
本发明提供一种雷莫拉宁发酵液预处理的方法，其特征在于，包括如下步骤a)将雷莫拉宁发酵液的pH调节到8-10；b)向发酵液中加入絮凝剂；c)过滤；d)提取滤饼中的雷莫拉宁。本发明的雷莫拉宁发酵液预处理的方法具有步骤简单、操作时间短以及收率高的优点。
文档编号C07K9/00GK101838316SQ20091004772
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者卢亮, 尹培军, 张宏宇, 李继安 申请人:上海医药工业研究院