专利名称：：小鼠FcγRⅢ线性配体结合表位的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学、免疫学和生物信息学领域，特别是涉及小鼠FcyRIII(FcGammaReceptorHI)线性配体结合表位。二.
背景技术：
：Fc受体(FcR)为特异亲和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的细胞表面分子，小鼠FqR有四种类型，分别为FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)、FcyRIII(CD16)和FcyRIV，其胞外区结构相似，均含有两个(FcyRn和FcYRIII)或三个(FcYRI)Ig样结构域，属Ig超基因家族，而跨膜区和胞内区则存在明显差异。FcyRIII是高度糖基化膜蛋白，为中低亲和力IgG受体，在生理条件下只能结合IgG复合物或多聚体。moFcyRin胞内区与FcRY链二聚体、T细胞受体(Tcellrec印tor，TCR);链二聚体或FcRY链-TCR;链异源二聚体相连，通过这些亚基的ITAM基序进行信号转导，FcR"/链或TCR;链为FcyRm在细胞表面表达所必需，只有通过共转染FcRY链或TCR;链，才能在细胞表面表达FeyRIII。Y-chain具有信号传导功能，通过二硫键与FcYRIII结合，介导FcyRIII的表达。Fc受体广泛表达于免疫辅助细胞和效应细胞，具有许多重要的生理功能，是体液免疫与细胞免疫的联系纽带，在机体免疫调节中起关键作用。抗体介导的炎性反应可通过激活型和抑制型FcR进行调节，因此FcR是治疗过敏和自身免疫性疾病理想的药物靶标。根据FqR功能的不同，提高或降低FcyR-IgG结合的亲和力可以达到相应的FcYR免疫治疗目的。激活型受体的胞内区(FcyRIIA)或者FcRY链(FcYRI、FcyRIII、boFcy2R、moFcyRIV、FcaRI和FcsRI)含有基于酪氨酸的受体活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，能激活免疫效应细胞，诱导吞噬作用(phagocytosis)、抗体依赖细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)、补体依赖细胞毒作用(complement-dependentcellularcytotoxicity,CDCC)、细胞裂解(cytolysis)、分泌细胞因子和其它炎性因子以及调节淋巴细胞增殖和分化等多种免疫学效应。可溶性FCYR重组蛋白在体外可阻断免疫复合物与B细胞的结合，因此在体内可与免疫细胞表面FcyR竞争结合IgG，抑制免疫复合物对细胞的激活；同理，高剂量的非特异IgG也可与体内免疫复合物竞争结合表达FcYR的免疫细胞，静脉内免疫球蛋白治疗方法(intravenousimmunoglobulintherapy,IVIG)己应用于血小板减少(immunethrombocytopenicpurpuria，ITP)、全身性红珍H良痛(systemiclupuserythematodes，SLE)和多组织硬化(multiplesclerosis,MS)等疾病的免疫治疗。IgGFc-FcyRIII晶体结构的解析以及对信号转导机制的了解为发现新的特异、高效药靶提供了更多的信息和途径，人们利用肽库筛选、组合化学(combinatorialchemistry)、生物信息学以及合成多肽等筛选和鉴定了多种IgGFc片段的抑制性多肽，其中抑制Fc-FcyR结合的TG19320三肽四聚体在小鼠体内显现对肾小球肾炎良好的抑制功效。Medgyes瞎在人IgGlFe片段中鉴定了诱导细胞信号传导的功能性多肽，来源于CH2区Pro234-Ser298的多肽与细胞表面FcyRIIB特异结合，可诱导细胞分泌细胞因子和ERK的磷酸化，并能抑制BCR介导的Ca^反应。然而，小分子多肽对受体的亲和力远远低于完整的抗体分子，多肽亲和力的提高等问题尚有待解决。三.
发明内容本发明要解决的主要技术问题是提供一种小鼠FcyRIII线性配体结合表位，为鉴定本发明的多肽在体外的抑制活性，分别进行了多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制和小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制，表明线性表位多肽对小鼠FcyRIII亲和小鼠IgG显现出良好的抑制功效。本发明的技术方案是利用DNASIS软件将mFcyRIII与boFcyRIII和huFcYRIII的氨基酸序列进行比对分析，并参照huFcYRIII的晶体结构，在EC2结构域设计合成小鼠FcyRIII多肽6条，Dot-blot分析表明，小鼠Fc/RIII的119-130位多肽为CSFFHNEKSVRYH，该多肽是特异结合小鼠IgG的有效多肽，为小鼠Fc7RIII的线性配体结合表位，位于受体EC2结构域CC'环。本发明的小鼠FcyRin受体线性配体结合表位的氨基酸序列为H-Cys-Ser-Phe-Phe-His-Asn-Glu-Lys-Ser-Val-Arg-Tyr-His-OH。所述的线性配体结合表位为合成多肽。所述的线性配体结合表位多肽链N端氨基化或乙酰化，或C端羧基化或酰胺化。编码所述的小鼠FcyRIII受体线性配体结合表位的核苷酸序列。为鉴定本发明的多肽在体外的抑制活性，分别进行了多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制和小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制。在进行本发明多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制中，将小鼠FcYRIII胞外区cDNA亚克隆到原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌中高效表达了小鼠mFcyRIII胞外区，以快速稀释复性方法从包涵体变性蛋白中回收了具有良好结合活性的小鼠FcrRIII胞外区重组蛋白，用ELISA方法测定了本发明多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制效率。为进行多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制，将小鼠FcyRIII受体分子表达在细胞表面，将小鼠FcyRIII编码区cDNA及小鼠y-chain编码区cDNA亚克隆到表达载体pcDNA3，共转染COS-7细胞，通过G418抗性筛选和连续克隆化，获得了在COS-7细胞表面稳定表达受体分子的小鼠FcYRIII转染细胞株，其IgG-RBC玫瑰花环形成率可达95%，用玫瑰花环抑制试验检测本发明多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制效果。本发明的积极有益效果1.本项发明利用生物信息学、多肽合成、细胞免疫学和分子生物学等技术，以化学合成多肽分析鉴定小鼠FcyRIII的线性配体结合表位，进行了多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制，表明线性表位多肽对小鼠FcyRIH亲和小鼠IgG显现出良好的抑制功效，参见图6;还进行了多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制，用玫瑰花环抑制试验检测本发明多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制效果，其IgG-RBC玫瑰花环形成率可达95%，参见图10、图11。2.本发明是首次开展对小鼠FcR线性配体结合表位的探索研究，用合成肽的方法精确定位了小鼠FcvRin配体结合表位，构建了小鼠FcYRIII、Y-chain共转染稳定表达细胞系，对深入了解FcyR-IgG相互作用的分子基础有重要意义，为小鼠FcR耙标药物的分子设计提供新的思路。3.小鼠FcyRIII线性配体结合表位多肽的发明，为寻找疗效高而副作用小、治疗自身免疫病的药物提供了新思路，对解决目前困扰人类身体健康的自身免疫性疾病具有重要意义。四.图1.是显示FeYRIIIEC2结构域氨基酸序列比对结果图2.是显示重组质粒pETmRIIIPCR、酶切鉴定结果图中，1:PCR产物；2:酶切产物；Ml:DL2000DNAmarker;M2:i-EcoT14IDNAmarker。图3.是显示mFcYRlII诱导表达及Westernblot鉴定结果图中，M:蛋白marker;1:pET-28a，诱导后；2:pETmRlII，诱导前；3:pETmRlII，诱导后；4:pETmRIII，诱导后；5:pETmRIII，诱导前。图4.是显示mFcYRlII蛋白可溶性分析及纯化结果图中，M:蛋白marker;1:裂解液上清；2:包涵体；3:纯化后蛋白图5.是显示ELISA检测复性蛋白mRIII的活性曲线图6.是显示mRlII3多肽对小鼠IgG与可溶性mFcYRlII结合的抑制曲线图中，1:BSA曲线，2:controlpeptide曲线，3:mRlH3曲线图7.是显示真核表达质粒pc3mY、pc3mRI11的PCR和酶切鉴定结果图中，Ml:DL2000Marker(2000,1000,750,500,250);1:mR-YPCR扩增产物；2:pc3my被HindIII和XhoI酶切的产物；3.mRIIIPCR扩增产物；4.pc3mRIH被HindIII和EcoRI酶切的产物；M2:人-EcoT14IDNAmarker100bp。图8.是显示mFcYRIH、nry-chain共转染细胞的免疫荧光检测结果图中，A:转染pc3huRI1的COS-7细胞(200x);B:未转染的COS-7细胞(200".图9.是显示mFcyRin、my-chain共转染细胞的PCR检测结果图中，Ml:DL2000Marker(2000,1000,750，500,250);1:mRyyPCR扩增产物；2:mRIIIPCR扩增产物.图lO.是显示稳定表达mFcYRIII细胞株玫瑰花环检测结果A:转染pc3mRIH的COS-7细胞(200x);B:未转染的COS-7细胞(200x)。图ll.是显示mRIH3多肽抑制小鼠IgG与稳定表达在COS-7细胞上mFcYRIII的结合五.具体实施例方式实施例一mFcYRIII多肽设计利用DNASIS(Ver.2.5，Hitachi)软件将boF(7RIIIA(X99695)与huFcyRIIIA(NP—000560)、huFcyRinB(NP—000561)和moFc7RI11(NPJ)34318)的氨基酸序列进行比对(参见图l)，参照huFcYRIIIB(Sondermannetal.，2000;Radaevetal.，2001)的晶体结构，设计合成mFcyRIII多肽6条，分别覆盖其EC2结构域的A-B、B-C、C-C，、D-E、E-F和F-G环，除moRIIK和moRin6多肽N端含有Cys外，其余4条多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联。实施例二n1Fc7Rin多肽的合成程序及筛选程序利用Symphony12通道多肽合成仪(ProteinTechnologiesInc.)在Fmoc-氨基酸-王树脂(Fmoc-AminoAcidsattachedtoWangResin,上海吉尔)上以固相多肽合成方法(solid-phasepeptidesynthesis)合成多肽，多肽合成按标准操作规程进行。具体流程如下设计合成多肽序列—p印tide程序分析—设计合成程序—按树脂的取代值计算并称取Fmoc-AA-Wang-resin或Rinkresin—DMF溶涨树脂—*加20%piperidine脱Fmoc保护，搅动6min—^q下一位氨基酸和HBTU进行酰化反应，N2搅动反应30min"^用Kaiser法或TNBS法测试反应的完成情况—*DMF洗5次，每次lmin—重复带有*的步骤，在树脂上连接下一位氨基酸，直到该多肽序列合成完成—用TFA法裂解肽链与树脂的连接—冷乙醚沉淀TFA多肽—SephadexG-25脱盐纯化—HPLC和LC-MS分析鉴定和纯化多肽—多肽与载体的偶联—Dot-ELISA测试小鼠lgG与多肽的结合—测试多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制—测试多肽对lgG-细胞表面受体结合的抑制。小鼠FcYRIII多肽按5-20nmol/条合成，在其N端均含有Cys残基，可与SMCC双功能试剂形成二硫键，偶联于载体蛋白。合成多肽经HPLC和LC-MS鉴定，其结构正确，纯度均可达到80%以上。实施例三小鼠FcYRIII多肽的偶联应用异型双功能试齐USulfo-SMCC(MW:436.37,SpacerArmLength:11.6A，Pierce)通过将载体蛋白BSA上的-NH2和多肽N端Cys的-SH相连，形成人工结合抗原多肽BSA-Pep。偶联歩骤为(1)称取4mg无IgG的牛血清白蛋白(IgG-freeBSA，Sigma-Aldrich)溶于0.5ml偶联缓冲液(O.lMPBpH7.2,0.15MNaCl,1|iMEDTA);(2)在50plDMSO中溶解lmgSulfo-SMCC(MW:436.37，Spacerarmlength:11.6A，Pierce),加入BSA溶液，充分混匀，室温反应lh或37'C30min，并不时混匀；(3)4'C对偶联缓冲液过夜透析，换液3次，去除多余偶联剂。该溶液即为SMCC活化BSA载体蛋白(SMCC-BSA)，用偶联缓冲液调整蛋白浓度为5mg/ml;(4)称取2mg多肽/条，以50nl二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，加入150nl含5mMEDTA的0.01MPB(pH7.2),制备多肽储存液，浓度为IOmg/ml;(5)偶联时，取10pl多肽储存液(100照)，加入等体积含5mMEDTA的0.01MPB(pH7.2);与20piSMCC-BSA溶液(IOO吗)充分混合，室温反应4h，4。C过夜孵育；(6)以0.01MPB(pH7.2)调整偶联多肽浓度至lmg/ml，用于小鼠IgG结合试验。实施例四小鼠FcyRIII受体线性配体结合表位的初步鉴定Dot-blot:在硝酸纤维素膜(Millipore)上点印BSA偶联多肽(lpg/dot)，以小鼠FcyRIII重组蛋白(moRIlI)和载体蛋白BSA作阳性和阴性对照；自然干燥后，将印迹膜放入含0.2%明胶中37'C封闭1h;加入10pg/mlHRP标记小鼠IgG(HRP-IgG)溶液37'C孵育1h，以PBST充分洗涤；用AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)显色试剂盒(中杉金桥公司)，参照操作说明进行显色。结果判定时，以包被小鼠FcYRIII重组蛋白点呈现棕红色颜色反应，BSA对照点不出现颜色反应进行判定(见表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中a:为了后续的连接多肽序列的N端括号内是另外加上的半胱氨酸残基;b:Dot-blot检测各条肽与小鼠IgG的结合."+"表明小鼠IgG与该肽特异结合，"-"表明小鼠IgG与该肽不结合；C:根据huFcYRIII的晶体结构预测的部位。实施例五线性配体结合表位多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制1.mFc/RIII与mFcY-cliaiii基因的克隆取小鼠外周血白细胞，用UNIQ-lO柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA，将分离的总RNA按照TAKARA3'FULLRACE试剂盒说明合成cDNA。反转录体系为30nl:TotalRNA(约1.5fig)4^L，OHgod(T)18(50pmol/fiL)3pL，5xM-MLVBuffer6pL,dNTPMixture(10mMeach)3fiL,RNaseInhibitor(40u/pL)0.75pL，ReverseTranscriptaseM曙MLV(RNaseH)(200u/ftL)0.75fiL，RNasefreeWater12.5jiL。将上述反应液混合后在PCR仪中按下面程序进行反转录反应42X:60min,72°C15min。以mFcRIII-F5'CAGGAATTCGCAGCTCTTCCGAAGGCT3'，mFcRIII-R5,GGCCTCGAGTTAGATGGAGGATGTAGTTG3'为引物，扩增全长mFcyRin基因序列，PCR反应体系为25uL:cDNA4jiL，TAKARALATaq0.25jiL，10xLAbuffer2.5jiL，200910065039.0说明书第7/14页dNTP(2.5mMeach)2jiL，moFcRIII隱F(上游引物)(20pmol/fiL)1moFcRIII-R(下游引物)(20pmoI/nL)1nL，Water14.25jiL。PCR条件为94。C3min1个循环；94°C30sec，55'C邻sec，72°C2min,共35个循环；72°C10min。将？01产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段。将目的片段与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌，构建克隆载体mRIII-T。以myF:5'-CCAGCGCACCCAGGATGAT-3'，myR:5'-AGCACAGAGGTGACCAAGAGG-3'为引物，扩增小鼠Y链(迈Y-chain)并构建克隆载体nry-T。2.mFcyRin在大肠杆菌中的表达2.1mFcyRIII胞外区原核表达载体pETmRIII的构建以mRIII-T质粒为模板，以引物mRIU28a-F:5'-CAGGAATTCGCAGCTCTTCCGAAGGCT-3'，mRIII28a-R:5'-GGCCTCGAGTTAGATGGAGGATGTAGTTG-3'扩增mFc/RIII胞外区基因，在PCR产物两端分别引入EcoRI和XAoI酶切位点。PCR反应体系为50uL:PremixTaq25jiL，模板DNA2nL，迈RIII28a-F(上游引物)2jiL，迈RIII28a-R(下游引物)2jiL，Water19pL。PCR条件为94°C3min1个循环；94"30sec，55°C30sec，72"Clmin，共35个循环；72'C10min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段经五coRI和XAoI双酶切，获得的目的片断插入表达载体pET28a相应酶切位点，重组pET28a转化表达菌BL21(DE3),挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，并命名为pETmRIII。2.2mRIII蛋白的表达将阳性重组质粒转化到BL21(DE3)表达宿主菌中，挑取单菌落，接种到5mlLB(含IOOpg/mL卡那霉素)培养基中37'C振荡培养过夜，次日以10y。的接种量转入5迈l的LB培养基(含100jxg/mL卡那霉素)中，培养至OD600nm约0.6时，加IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导，再于37。C培养3-7h，离心(4000r/minx20min)收集菌体，用含400pg/ml溶菌酶的PBS重悬菌体，30'C水浴30min裂解细菌，超声波处理裂解菌体溶液(工作3s间歇8s，重复99次)，4'C12000r/min离心20min，分离细胞裂解液上清和沉淀，以SDS-PAGE鉴定表达结果。2.3Westernblot检测IPTG诱导的pETmRIII全菌和未诱导全菌进行12%SDS-PAGE后，将电泳分离的蛋白带电转到PVDF膜，0.2%明胶封闭过夜，将膜放入PBST中洗6次，每次3min，加1:600倍稀释的辣根过氧化物酶标记的小鼠IgG37'C孵育1h,PBST洗膜6次，每次3min,AEC(3-Amino-9-e也ylcarbazole)显色检测目的蛋白。2.4包涵体纯化诱导表达250ml细菌培养物，离心收集表达菌体。在20ml裂解缓冲液(10mMTrisPH8.0，150mMNaCl,10mMEDTA,10%甘油，2mMDTT，0.5mMPMSF,400ng/ml溶菌酶)中超声破碎后，离心收集包涵体沉淀。用洗涤缓冲液(l%Triton-100,50mMTrisPH8.0,100mMNaCl,lOmMEDTA,2mMDTT)洗涤包涵体5次，每次25ml;然后用重悬缓冲液(50mMTrisPH8.0，100mMNaCl,10mMEDTA，2mMDTT)洗涤1次，最后离心沉淀即为纯化后的包涵体。2.5mRIII蛋白的复性稀释复性法将洗漆纯化后的包涵体用2ml变性液(6mol/L盐酸胍，50mmol/LTris誦ClpH8.0，10mmol/LEDTA,10mmol/LDTT,100mMNaCl，10%甘油)于4。C搅拌约10h溶解变性，离心去除不溶物，再用变性液将其稀释至5ml，室温放置0.5-1h;将变性液分四批逐滴加入250ml复性缓冲液(100mMTrispH8.0,400mML-精氨酸盐酸盐，2mMEDTA，5mM还原型谷光苷肽，0.5mM氧化型谷光苷肽，0.1mMPMSF，0.1mM叠氮化钠)中，终浓度为0.1mg/mL，每次间隔12h，使复性时间达到60h。将250ml复性液8000r/min4'C离心25迈in，取上清，用5kDa浓缩管把上清复性液浓缩至所需浓度。2.6ELISA鉴定复性蛋白活性分别以10pg/mLmRIII复性前和复性后蛋白包被酶标板，0.2%明胶封闭。分别将不同浓度的辣根过氧化物酶标记的小鼠IgG(HRP-mlgG)(0.01-25ng/ml)溶液加入包被板中，检测HRP-mlgG与酶标板上mRIII复性前和复性后蛋白的结合，比较复性前后蛋白的活性。以不结合小鼠IgG的BSA为阴性对照蛋白。2.7多肽抑制小鼠IgG与可溶性重组蛋白的结合以10ng/mlmFcyRIII重组蛋白包被酶标板，0.2%明胶封闭。分别将不同浓度的多肽(0.1-70pM)与等体积10jig/mlHRP-IgG溶液混合，置4"C反应2h;将多肽-IgG混合物加入mRIII重组蛋白包被板中，检测小鼠IgG与酶标板上mRIII重组蛋白的结合，测定多肽对mRIII蛋白结合小鼠IgG的抑制效率。不结合小鼠IgG的多肽和无关蛋白BSA为阴性对照。3.结果3.1pETmRIII表达载体的构建以重组质粒mRIII-T为模板，以引物mRIII28a-F和mRIII28a-R扩增mFcyRni胞外区基因，通过五coRI和XAoI双酶切将mFcYRIIl胞外区基因定向插入表达载体pET-28a中。经过PCR鉴定和酶切鉴定，结果表明mFcYRIII胞外区基因已定向插入到表达载体中，获得重组表达质粒pETmRin(参见图2)。3.2mFcYRin蛋白的诱导表达、可溶性分析及Westernblot鉴定分别取IPTG诱导1h、2h、3h、4h后的表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),在25.7)左右处均出现一条明显的特征蛋白质表达带，并且IPTG诱导3h后蛋白质表达量趋于稳定。将菌体经超声破碎，离心后得上清液和沉淀，上清未见到表达产物，表明体外重组表达蛋白主要以包涵体形式存在(参见图2)。表达蛋白在PVDF膜上显示一大小为25.7kD的蛋白印迹，而重组质粒诱导前细菌裂解液则没有，表明表达蛋白能与小鼠IgG特异结合(参见图3)。3.3mFcYRin蛋白的纯化根据文献报道，pH值偏碱的变性液有利于复性，我们采用了pH8.0缓冲液对mFcyRIII包涵体进行六次超声洗涤纯化，SDS-PAGE分析显示，洗涤后包涵体纯度90%以上(参见图4)，表明洗涤效果较好，为以后的复性奠定了基础。3.4ELISA检测复性蛋白的活性纯化后的蛋白进一步经稀释复性以获得适当空间结构。为了检测复性蛋白mFcyRIII与配体的结合活性，我们将复性后和复性前蛋白(包涵体)均以10pg/ml包被酶标板，用不同浓度的HRP-mlgG(0.01-25pg/ml)进行检测，如图5所示，随着配体浓度的升高二者ELISA的OD值区别显著变大，表明经稀释复性后已获得具有活性的蛋白(图5结果为三次重复实验的平均值)。3.5多肽抑制小鼠IgG与可溶性受体的结合用mRIH3多肽与HRP-mlgG相作用，测定其对可溶性1nFc7Rm结合小鼠IgG的抑制作用。在竞争ELISA中，mRIII3多肽能够抑制小鼠lgG与可溶性mFcyRin的结合，抑制能力随着mRIII3多肽浓度的增加而增强，但并不能完全抑制，而不结合小鼠IgG的对照多肽及BSA对HRP-IgG与可溶性受体的结合未产生明显影响(参见图6，图6为三次重复实验结果的平均值)。实施例六多肽抑制IgG与细胞表面受体的结合l.真核重组表达载体的构建和鉴定以RIII-T质粒为模板，以引物moRHI-pc+:5'-CGAAAGCTTAGAATGGCTTTGGACACCCA誦3'，moRIII-pc-:5'-TATCTCGAGGATGGGGTGTCACTTG-3'扩增mFcYRIII编码区(ORF)全长cDNA(含信号肽序列)，PCR反应体系为50uL:PremixTaq25jiL，模板DNA2fiL，moRIII-pc+2fiL，moRIII-pc-2jiL，Water19pL。PCR条件为94。C3minl个循环；94。C30sec，55。C30sec，72°C1min,共35个循环；72。Cl0min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段经历'"dlII和^oI双酶切，获得的目的片断插入表达载体pcDNA3相应酶切位点，重组pcDNA3转化感受态大肠杆菌(JM109)，并以含50ng/mL氨苄青霉素的营养琼脂平板培养。挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，并命名为pc3mRHI。以RIII-T质粒为模板，以引物my-pc+:5'-CCAAAGCTTCCAGGATGATCTCAGC-3'，my-pc-:5'-TGAGAATTCTGCAGCCAAGCACGTC-3'构建并鉴定mv-chain真核表达载体pc3nty。2.细胞转染2.1质粒制备用Qiagen质粒提取试剂盒提取纯化真核表达质粒pc3mRI11。以户FCH单酶切质粒pc3mRHI、pc3mY,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段用无菌水溶解，以核酸蛋白分析仪(Beckman公司)测定DNA含量。线性化表达质粒pc3mRI11、pc3mY用于pc3mRIII的稳定表达。2.2细胞共转染与筛选利用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂以线性化pc3mRIH、pc3my质粒共转染COS-7细胞。转染48h后消化转染细胞，以20迈L含400jig/mLG418的DMEM/10完全培养基重悬细胞，然后转至96孔培养板，每孔200fiL，置37°C50mL/LC02培养箱中培养，每34d换液1次。转染后710d，待细胞克隆长至l/4l/2孔时，消化细胞克隆，将细胞转至另一96孔培养板扩大培养，待长成细胞单层后，以免疫荧光检观iJmFcYRIII的表达，保留原96孔板细胞继续培养。2.3转染细胞的克隆以有限稀释法对阳性转染细胞克隆进行连续3次克隆化，建立稳定表达mFcYRIII的细胞株。将免疫荧光检测阳性细胞克隆转入24孔培养板中扩大培养，用含200jig/inLG418的DMEM/10选择培养基稀释细胞至510celIs/mL，接种96孔细胞培养板，每孔200^L，37°C50mL/LC02培养箱中培养1015d，以免疫荧光检测mFcYRIII的表达。对mFcyRIII阳性细胞克隆进行2次和3次克隆化，使其克隆孔玫瑰花环形成率达95%以上，并在液氮中冻存克隆细胞。3.免疫荧光检测将共转染pe3mRin、pc3mY的COS-7细胞以lxl()5密度种植在96孔板中，同时以未转染pc3mRHI、pc3my的COS-7细胞作为对照，24h细胞贴壁后用PBS缓冲液冲洗3次，封闭液(0.002g/mL明胶)封闭30min,以FITC标记的小鼠IgG闭光孵育1h，PBS缓冲液冲洗后用激光扫描共聚焦显微镜观察mFcyRIII在细胞上的表达情况。4.共转然细胞株PCR鉴定将共转染pc3mRIH、pc3mY的COS-7细胞种植于细胞培养瓶中，待长至单层消化，提取细胞RNA，反转录成cDNA，用moRIII-pc+和moRIII-pc-，my-pc+和m，pc-为引物，分别扩增mFcyRIII与my-chain。5.玫瑰花环试验参照张改平研究员论文中的玫瑰花环形成方法(该论文出处为ZhangG.1994.BovinelgGFcReceptors(PhDThesis),UniversityofHertfordshire,Hatfield.，p54-58)，以玫瑰花环试验检测mFcyRm在COS-7转染细胞表面与其配体小鼠IgG的结合。采集健康鸡抗凝外周血，1000r/min离心5min，分离鸡RBC，用PBS洗涤3次，制备0.5%的RBC悬液；在96孔血凝板中，用PBS倍比稀释小鼠IgG，50jiL/孔；加入0.5°/。的拙<:悬液，振荡混匀；室温静置lh，观察血凝结果，测定小鼠IgG的效价。在新鲜鸡RBC悬液中加入半数凝集量的小鼠IgG溶液，混匀后，4'C孵育2h;1000r/min离心5min，弃上清，用PBS洗涤3次，去除未结合IgG;以无血清的DMEM/0培养基重悬小鼠lgG致敏的RBC，制备0.5。/。IgG-RBC悬液。在96孔板中培养pc3mRin、pc3mY共转染细胞，待细胞长成单层，以预温的无血清培养基DMEM/0培养基(37'C)漂洗细胞，加入DMEM/0培养基，每孔200fiL，37'C孵育2h，以洗脱结合在细胞表面的牛IgG;将10mL/L小鼠IgG-RBC悬液缓慢加到细胞单层，每孔50fiL;37'C孵育10min,室温静置35min:用PBS轻柔漂洗6次；用甲醇(含3mL/LH202)室温固定细胞10min,PBS漂洗3次；每？L加PBS100(iL，在显微镜下观察细胞表面形成的玫瑰花环。在细胞单层加入10ng/mLHRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，每孔50nL，37'C孵育30min;用PBST充分洗涤，以AEC染色试剂盒染色；用显微镜观察玫瑰花环中RBC的显色。6.线性配体结合表位多肽对IgG-细胞表面受体结合的抑制在半数凝集量的基础上用DMEM/0培养基倍比稀释小鼠IgG，分别致敏鸡RBC;将不同致敏量的IgG-RBC加到稳定表达mFcYRIII的转染细胞单层，进行玫瑰花环试验，测定形成明显玫瑰花环的IgG临界致敏量。以临界致敏量小鼠IgG致敏鸡RBC，制备1%IgG-RBC悬液。用DMEM/0培养基倍比稀释mFcYRIII多肽，分别与等体积1%IgG-RBC悬液混合，置4'C反应2h，以不同浓度的多肽(10-1280nM)结合小鼠IgG:将多肽-IgG-RBC混合物加到稳定表达mFcyRIII的转染细胞单层，进行玫瑰花环试验，分别计数3个视野(100x)内形成的玫瑰花环数。设定不含多肽的DMEM/0培养基对照形成的IgG-RBC玫瑰花环数为100%,计算mFcyRIII多肽对IgG-RBC玫瑰花环形成的抑制效率。不结合小鼠IgG的mR3'多肽为阴性对照多肽。7.结果7.1真核表达质粒pc3mRin与pc3mY的构建以克隆到T载体上的阳性质粒为模板，用引物moRin-pc+和moRIII-pc-，扩增到mFcyRIII编码区(ORF)全长830bpcDNA(含信号肽)序列。将mFcyRIII全长cDNA亚克隆到pcDNA3的巨细胞病毒启动子(Pcmv)下游，经PCR鉴定及五coRl和J^oI双酶切鉴定，成功构建了真核表达质粒pc3mRHI，以同样方法构建真核表达质粒pc3mY，鉴定结果参见图7。7.2mFcyRIII在COS-7细胞表面的表达及其与配体的结合共转然细胞表达mFcYMII受体分子的共转染细胞，以小鼠IgG-FITC进行免疫荧光检领lj，在转染细胞周围明显看到的绿色荧光，而未转染的COS-7对照细胞不结合IgG-FITC没有看到绿色荧光(参见图8)，表明表达于转染细胞表面的mFcyRIII受体分子能与小鼠IgG特异结合。7.3PCR鉴定mFcYRIII、nry-chain共转染细胞株提取共转染细胞RNA，反转录成cDNA，以moRIII-pc+、moRIII-pc-、m"pc+、my-pc-为引物，分别扩增得到mFcyRIII与mY-chain。表明基因mFcyRIII与my-chain巳成功整合到COS-7细胞中(参见图9)。7.4稳定表达mFcyRIII转染细胞株的建立以线性化表达质粒pc3迈RIH、pc3mY共转染COS-7细胞，经G418选择性培养、玫瑰花环检测和连续克隆化，建立了稳定表达mFcyRIII的转染细胞株，95V。以上的转染细胞看到玫瑰花环，参见图10A;而未转染的COS-7对照细胞未看到荧光，参见图10B，表明mFcyRIII受体分子有效表达于转染细胞表面。7.5线性配体结合表位多肽对IgG-细胞表面受体结合的抑制以临界致敏量小鼠IgG致敏鸡RBC，制备1%IgG-RBC悬液。用DMEM/0培养基倍比稀释mRIII3多肽，分别与等体积"/。IgG-RBC悬液混合，置4iC反应2h，以不同浓度的多肽(10-1280jiM)结合小鼠IgG;将多肽-IgG-RBC混合物加到稳定表达mFcYRIII的转染细胞单层，进行玫瑰花环试验，分别计数3个视野内形成的玫瑰花环数。设定不含多肽的DMEM/0培养基对照形成的IgG-RBC玫瑰花环数为100%,计算mRIH3多肽对IgG-RBC玫瑰花环形成的抑制效率。不结合小鼠IgG的多肽为阴性对照多肽(参见图ll)。序列表<110>河南省农业科学院<120>小鼠FcYRIII线性配体结合表位<130>分子生物学、免疫学和生物信息学技术<160>1<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>13<212>PRT<213>人工序列<400>1CysSerPhePheHisAsnGluLysSerValArgTyrHis1510权利要求1.小鼠FcγRIII受体线性配体结合表位，其氨基酸序列为CysSerPhePheHisAsnGluLysSerValArgTyrHis。2.根据权利要求1中所述的小鼠FCYRIII受体线性配体结合表位，其特征是:所述的线性配体结合表位为合成多肽。3.根据权利要求l中所述的小鼠Fc7RIII受体线性配体结合表位，其特征是:所述的线性配体结合表位多肽链N端氨基化或乙酰化，或C端羧基化或酰胺化。4.编码权利要求1所述的小鼠F(7RIII受体线性配体结合表位的核苷酸序列。全文摘要本发明涉及小鼠mFcγRIII线性配体结合表位，该表位的氨基酸序列为CysSerPhePheHisAsnGluLysSerValArgTyrHis。本发明以化学合成多肽分析鉴定小鼠FcγRIII的线性配体结合表位，进行了多肽对小鼠IgG-可溶性受体结合的抑制，表明线性表位多肽对小鼠FcγRIII亲和小鼠IgG显现出良好的抑制功效；通过多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制，用玫瑰花环抑制试验检测本发明多肽对小鼠IgG-细胞表面受体结合的抑制效果，其IgG-RBC玫瑰花环形成率可达95％。本发明首次开展的小鼠FcR线性配体结合表位的探索研究，用合成肽方法精确定位了小鼠FcγRIII配体结合表位，构建了小鼠FcγRIII、γ-chain共转染稳定表达细胞系，对深入了解FcγR-IgG相互作用的分子基础有重要意义，为小鼠FcR靶标药物的分子设计提供新的思路。文档编号C07K7/00GK101565456SQ200910065039公开日2009年10月28日申请日期2009年5月27日优先权日2009年5月27日发明者乔松林,刘运超,俊席,张利娜,张改平,杨艳艳,丽王,王方雨,苗现伟,东赵,邓瑞广,郅玉宝,郭军庆申请人:河南省农业科学院