一种检测三聚氰胺的试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：：一种检测三聚氰胺的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测三聚氰胺的试剂盒及其应用。
背景技术：
：三聚氰胺(英文名Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，性状为纯白色单斜棱晶体，无味。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，分子式见式(I);三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。但是它被禁止用于食品和宠物饲料中，长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。2007年，美国爆发宠物食品受污染事件。事后调查表明掺杂了《6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。目前，三聚氰胺检测已经被列入我国新食品检测标准，并制定三聚氰胺在乳与乳制品中的管理限量值。婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为lmg/kg;液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。现有的检测方法有主要为高效液相色谱法、气相色谱_质谱联用法、液相色谱_质谱/质谱法，这些检测方法涉及到使用大型精密仪器，需要专业人员操作，耗时较长，检测费用高昂。
发明内容本发明的目的是提供一种检测三聚氰胺的试剂盒及其应用。本发明提供了一种三聚氰胺抗原，是式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物；所述式(ii)所示化合物和所述载体蛋白的物质的量的比值具体可为20:i。所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白。应用所述三聚氰胺抗原制备得到的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种检测三聚氰胺的试剂盒，它包括包被有包被抗原的酶标板；所(I)c3述包被抗原为任一所述的三聚氰胺抗原。所述试剂盒还可包括抗体工作液；所述抗体工作液为所述单克隆抗体或其稀释液。所述单克隆抗体具体可为由保藏编号为CGMCCNO.3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生的。杂交瘤细胞株3B11已于2009年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCCNo.3237。所述抗体工作液具体可为所述单克隆抗体的10倍稀释液。所述包被抗原的浓度具体可为0.2iig/mL。所述试剂盒还可包括系列浓度的三聚氰胺标准品。所述试剂盒还可包括其它ELISA常用试剂，如酶标二抗(如HRP标记的山羊抗小鼠的IgG)、洗涤缓冲液、样品稀释液、底物显色液、终止液等。所述三聚氰胺抗原、所述单克隆抗体或所述试剂盒均可应用于检测三聚氰胺。本发明按照通过偶联剂1_(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐介导的縮合反应把三聚氰胺的类似物SM(用一个碳原子取代三聚氰胺的含氮杂环中的一个氮原子，并在此碳原子上连接一个带有羧基的侧链)偶联到载体蛋白(匙孔血蓝蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA);用SM-KLH作为免疫抗原，取免疫小鼠的脾脏，分离出淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，HAT选择性培养基初步筛选出融合的杂交瘤细胞，间接竞争酶联免疫法筛选出阳性杂交瘤细胞3B11，有限稀释法对3B11细胞进行亚克隆化，获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株；采用单层细胞培养法培养细胞株，获得培养上清中的单克隆抗体；也可采用体内诱导法制备细胞株分泌的腹水抗体，然后用ProteinA蛋白亲和层析法纯化腹水，得到单克隆个抗体。检测三聚氰胺的方法(间接竞争ELISA):SM-BSA作为包被抗原被固定在酶标板上；用含10%小牛血清的磷酸盐缓冲液371:封闭1小时；每孔分别加入系列浓度的三聚氰胺标准品和抗三聚氰胺抗体的工作液各50L，37t:孵育0.5小时；每孔加入100iiL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体工作液，37t:孵育0.5小时；OPD显色系统显色；酶标仪在吸收波长490nm，读出A49。值；以三聚氰胺标准品浓度为x轴，抑制率(B/B。值)y轴，绘制标准曲线；同样，用待测样品液代替三聚氰胺标准品溶液，进行间接竞争ELISA，根据标准曲线计算出样品中的三聚氰胺浓度。本发明的试剂盒的检测原理(参见图8):以SM-BSA作为包被抗原吸附在固相载体酶标板上，加入样品或三聚氰胺标准品，然后加入抗三聚氰胺的单克隆抗体，游离的三聚氰胺与固定包被抗原SM-BSA竞争性结合抗体，游离的三聚氰胺量愈多，结合在固相上SM-BSA的抗体就愈少，继而结合的HRP标记山羊抗小鼠抗体也愈少。显色后终止，测定样品A490值，该值与样品中三聚氰胺的含量呈负相关，与标准曲线比较可计算出样品中三聚氰胺的含量。本发明提供的试剂盒最低检测量可达30ppb，远低于国家规定的食品中三聚氰胺含量的限定值，而且勿需对待测样品进行复杂的前处理，适当稀释后直接检测，简化程序，縮短时间，适用于大量样品的快速检测，故可作为检测食品中三聚氰胺含量的一种非常实用的检测工具。本发明的试剂盒具有特异性强，灵敏度高，操作简单，检测样品量大等特点，此外，与同类检测方法相比，被检测的液态乳制品无需样品前处理，固态检测样品只需使用磷酸盐缓冲液做适量浓度溶解即可上样检测，操作简单，节省时间。因此，本发明对解决大批量待检三聚氰胺含量的样品监控有重要的现实意义。图1为SM-KLH/BSA的结构图。图2为质谱分析SM与BSA的偶联结果。图3为SDS-PAGE分析ProteinA亲和层析纯化腹水。图4为单克隆抗体稀释滴度对A，值的影响。图5为SM-BSA浓度对三聚氰胺抑制率的影响。图6为单克隆抗体与三聚氰胺类似物的交叉反应曲线。图7为标准曲线及回归方程。图8为试剂盒的反应原理。图9为化合物SM的核磁共振氢谱图。图10为化合物SM的核磁共振碳谱图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。三聚氰胺、三聚氰胺一酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸、l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(l-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl，EDC)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、匙孑L血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、完全弗氏佐剂(completeFreund'sadjuvant,CFA))、不完全弗氏佐剂(incompleteFreund'sadjuvant,IFA)、石蜡油、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的羊抗鼠的IgG均购自sigma公司；HAT、HT、RPMI-1640培养液、胎牛血清(FBS)、L_谷氨酰胺、青霉素、链霉素均购自Gibco公司；HitraprproteinAFFcolumn柱购自Amersham公司；68周龄的BALB/c纯系鼠购自北京兴隆实验动物中心；鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自ATCC，货号为CRL-1581。其它常规化学试剂均为国产分析纯。液态纯牛奶购自伊利实业集团股份有限公司；脱脂奶粉购自完达山乳业股份有限公司；固体猫粮NutroChoice购自Nutro公司。酶标仪680(BIO-RED)，二氧化碳培养箱371(themo)，生物安全柜(LABC0NC0)倒置生物显微镜XDS-1B(重光)，电泳仪(BIO-RED)，垂直电泳槽(BIO-RED)，台式离心机5810R(印pendorf)，AutoflexIIT0F/T0F质谱仪(BrukerDaltonics，北京生命科学研究所蛋白质中心)。抑制率(B/B0)=[(A柳(x「A柳(o))/(A柳(ctD-A柳(o))]X100X;A柳(x)-有三聚氰胺(或有三聚氰胺类似物，或有待测样品)抑制的A49。值，A49。(etl)_无三聚氰胺(或无三聚氰胺类似物，或无待测样品)抑制的A49。值，A49。(。)_无抗体的空白对照的A49。值。实施例1、三聚氰胺结构类似物(SM)的制备SM的分子式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>把2，3-二氢妣喃(化合物1)(0.56g，6.63mmol)，6--1-己醇(lg，5.52,1)和吡啶对甲基苯磺酸盐(0.28g，l.lmmol)溶解在15mL二氯甲烷(DCM)中，反应液在室温下搅拌23小时。用饱和NaHC03溶液和饱和食盐水洗涤反应液，无水Na2S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到无色油状液体化合物3(1.4g，收率为96%)。2、化合物3的表征4画R(CDC13，400MHz)S4.57(m，1H)，3.86(m，1H)，3.74(m，1H)，3.50(m，1H)，3.36-3.43(m，3H)，1.82—1.91(m，3H)，1.71(m，1H)，1.381.64(m，10H)。二、化合物4的制备和表征1、化合物4的制备把NaH(规格活性氢含量95%，银灰色颗粒含量60%)(0.18g，4.52mmol)和二甲醚(DME)(5mL)加入25mL的两口瓶中，然后依次滴加丙二腈(Malononitrile)(0.5g，7.45mmol)的DME(8mL)溶液和化合物3(lg，3.77mmol)的DME(2mL)溶液，然后反应混合液在室温和氮气保护下搅拌过夜。用5%NH4C1溶液中止反应，调pH至8，向反应液中加入乙酸乙酯，依次用水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，柱层层析得到无色油状液体化合物4(0.6g，收率为63.8%)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2、化合物4的表征"匪R(CDCl3，400MHz)S4.56(m，1H)，3.71-3.86(m，3H)，3.37-3.52(m，2H)，2.01-2.07(m，2H)，1.43—1.82(m，14H)。三、化合物5的制备和表征1、化合物5的制备把胍的盐酸盐(0.19g，1.98,1)，甲醇钠(0.38mL，1.98mmol，含量28%)和5mL无水甲醇加入25mL圆底烧瓶中，反应混合液在氮气保护下搅拌0.5小时。过滤除去反应产生的氯化钠，滤液在减压条件下浓縮，然后逐滴加入化合物4(0.45g，1.8mmo1)的二甲基甲酰胺(DMF)(5mL)溶液，把反应液加热到8(TC在氮气保护下搅拌过夜。把反应液冷却至室温，用lM的盐酸溶液调pH至8，用乙酸乙酯萃取，无水Na^04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到黄色固体化合物5(0.54g，97%)。2、化合物5的表征4画R(CDC13，400MHz)S4.56(m，1H)，3.87(m，1H)，3.73(m，1H)，3.50(m，1H)，3.38(m，1H)，2.19-2.31(m，2H)，1.36-1.71(m，14H)。四、化合物6的制备和表征1、化合物6的制备向化合物5(0.33g，0.363mmol)的四氢呋喃(THF)(20mL)溶液中依次加入二碳酸二叔丁酉旨(Boc)20(l.55g，7.12mmol)，三乙胺(TEA)(1.09mL，7.83,1)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(87mg，0.712mmol)。反应液在室温和氮气保护下搅拌过夜。用质量含量5%NaHC03溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5%NaHC(^溶液，水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，柱层析得到化合物6(0.38g，58.5%)。2、化合物6的表征^NMR(CDCl3，400MHz)S4.57(t，J=4Hz，1H)，3.86(m，1H)，3.73(m，1H)，3.50(m，1H)，3.38(m，1H)，2.29-2.46(m，2H)，1.22-1.59(m，68H)。五、化合物7的制备和表征1、化合物7的制备把化合物6(0.33g，0.363mmol)，甲醇(10mL)和对甲苯磺酸(pTsOH)(0.013g，0.0726mmol)加入25mL单口圆底烧瓶中，在室温和氮气保护下搅拌2小时。用质量含量5%NaHC03溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5%NaHC03溶液，水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到化合物7(0.25g，83%)。7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>672、化合物7的表征丄匪R(CDC13，400MHz)S3.65(m，2H)，2.33-2.45(m，2H)，1.22-1.60(m，62H)。六、化合物8的制备和表征1、化合物8的制备向化合物7(140mg，0.17mmol)的二氯甲烷(DCM)(8mL)溶液中依次加入N-甲基吗啉-N-氧化物(腦)(34.4mg，0.255,1)和过钌酸四内胺(TPAP)(6.lmg，O.017,1)，反应液在室温下搅拌2小时。用一根短硅胶柱过滤反应液得到无色油状液体化合物8(0.12g，83.5%)。(Boc)2NvN(Boc)2(Boc)2N、^N(Boc)2TTPAP'NM0I丫N、^\a■-N、aa工HODCM,83.5%N(Boc)2782、化合物8的表征^NMR(CDCl3，400MHz)S9.77(s，1H)，2.43-2.45(m，4H)，1.39-1.63(m，60H)。七、化合物9的制备和表征1、化合物9的制备把NaC102(19.6mg，纯度80%，0.174,1)和NaH2P04(20.9mg，0.174,1)力口入0.14mL水中，然后把这种配制好的溶液逐滴加入盛有化合物8(0.llg，O.134mmo1)，93yL2-甲基2-丁烯和2mL叔丁醇的圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜。向反应体系中加入水中止反应，用乙酸乙酯萃取反应液，无水NS04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，所得粗品不经纯化直接用于下一步反应。(Boc)2N/UBoc)2"ifY(Boc)2NvnvN(Boc)2N、^/CHONaCI02,NaH2P04I1TVVv-^N^^^/^/^/COOHN(Boc^2-methyl-2-butene,t-BuOH丁N(Boc)2892、化合物9的表征"誦R(CDCl3，400MHz)S2.44(t，J=8Hz，2H)，2.35(t，J=7.6Hz，2H)，1.24-1.66(m，60H)。八、化合物10的制备和表征1、化合物10的制备8把化合物9(0.llg，O.131,1)，9.4mL三氟乙酸(TFA)和0.6mL苯甲醚加入50mL单口圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜。在减压条件下除去三氟乙酸和苯甲醚得到粗品，向粗品中加入乙醚，离心，抽去乙醚得到白色固体，向这种白色固体中重新加入乙醚，离心，重复三次得到化合物10(0.021g，66%(两步总产率))。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>2、化合物10的表征"HNMR(D2()，400MHz)S2.38(t，J=7.6Hz，2H)，2.35(t，J=6.8Hz，2H)，1.47-1.63(m，2H)，1.34-1.47(m，4H)。化合物10的氢谱图见图9。13CNMR(D20，100MHz)S179.5，157.8，153.0，86.2，34.1，28.2，26.5，24.7，22.3ppm。化合物10的碳谱图见图10。化合物10即三聚氰胺结构类似物(SM)。实施例2、抗原的制备抗原SM-BSA(SM-KLH)偶联反应物的示意图见图1。—、SM-BSA(包被抗原)的制备称取5mgSM和20mgBSA，充分溶解于5ml盐酸酸化的去离子水(pH4.7)中，向混合溶液中加入46mgEDC，4t:搅拌下反应过夜；反应产物4t:透析过夜，外透液为0.01MPBS缓冲溶液(PH7.0);分别取相同浓度(2mg/mL)的BSA和SM-BSA进行质谱分析，鉴定偶联结果。质谱检测结果见图2。BSA分子量为66.32KD。SM-BSA的平均分子量为70.57KD，与BSA相比增加了4.25KD。SM的分子量为221D，SM-BSA的形成是通过EDC将SM侧链上的羧基与BSA表面的赖氨酸上游离的氨基脱水形成酰胺健，所以BSA分子每偶联上一个SM分子，分子量就增加203D(221D(SM)-18D(H20))。质谱分析结果表明，平均每个BSA分子偶联20个SM分子(4.25KD/203D=20)。二、SM-KLH(免疫抗原)的制备用KLH代替BSA，其它方法同步骤一。实施例3、单克隆抗体的制备—、小鼠免疫1、取5只68周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠皮下注射20yg弗氏完全佐剂乳化的SM-KLH(初次免疫)。2、每隔15天皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的同剂量的SM-KLH(加强免疫)。3、第4次免疫10天后眼眶采血，间接ELISA检测抗血清效价，间接竞争ELISA检测抗体相对三聚氰胺的特异性。5只小鼠抗血清效价均为1:72000。1#、2#、3#小鼠的抗血清较其它2只小鼠的抗血清更能特异地识别三聚氰胺；加入同等剂量三聚氰胺的情况下，3#小鼠的抗血清的B/B。值更小，即抑制现象更明显。4、取抗血清效价较高并且特异性较好的小鼠(3#小鼠)在细胞融合前3天进行最后一次加强免疫(腹腔注射20gSM-KLH)。二、细胞融合1、准备工作①于细胞融合前1天取68周龄的BALB/c小鼠拉颈处死，分离腹腔细胞作为饲养细胞，制成HAT的细胞悬液(细胞密度2X10s个/mL)加入96孔板，37°CC02培养箱培养，备用。②于细胞融合前两周复苏SP2/0细胞，调整细胞状态至最佳，备用。③步骤一的4中的3#小鼠，最后一次加强免疫3天后取脾脏，制备脾细胞悬液，使用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，计数，备用。2、细胞融合淋巴细胞与SP2/0细胞按10:1的数量比混合，滴加lmL50%PEG融合，离心后加入50mLHAT培养液，接种到含有饲养细胞的96孔培养板内，37。CC02培养箱培养；观察细胞的生长情况，确认非杂交细胞死亡后，改用完全RPMI-1640培养液培养。融合后的细胞共接种6块96孔细胞培养板，HAT选择培养基筛选后，进行显微镜观察，细胞融合率为100%。三、杂交瘤细胞筛选1、间接ELISA用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4。C过夜；洗板4次；含10%FBS的封闭液封闭，37t:温育2h;洗板4次；加入待测杂交瘤细胞培养上清液(以SP2/0细胞的上清液作为阴性对照；以含10%FBS封闭液作为空白对照；37t:温育0.5h;洗板4次；加入HRP标记的羊抗鼠的IgG，37t:温育lh;洗板4次；加入OPD显色液，酶标仪测A49。值。检测结果以A49。；(A样品-A空白)/(A阴性对照-A空白)>2.1为阳性。间接ELISA检测结果表明，能够识别SM-BSA的杂交瘤细胞株共10株1B11、2E10、3A2、3B1、3B3、3B11、4F9、5F3、5H7、6D3。2、间接竞争ELISA将步骤1中10株阳性细胞进行如下检测用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4°C过夜；洗板4次；用含10%FBS的封闭液封闭，37t:温育2h;洗板4次；每孔加入待测杂交瘤细胞培养上清液和浓度为1Pg/ml的游离三聚氰胺各50PL(对照孔用等体积的PBS代替三聚氰胺溶液)，37"温育0.5h;洗板4次；加入HRP标记的羊抗鼠的IgG，37"温育lh;洗板4次；加入OPD显色液，酶标仪测A49。值。如果试验孔的A49。值比对照孔的A49。值小，表明加入到该孔内的杂交瘤细胞培养上清液中含有抗三聚氰胺的特异性抗体。间接竞争ELISA结果表明，只有3B11细胞株分泌的单克隆抗体在加入游离的三聚氰胺时有抑制反应，即能够特异性识别三聚氰胺。四、杂交瘤细胞的克隆化和冻存将3B11杂交瘤细胞吹散，取0.lmL的细胞悬液加入含0.9mLHAT培养液的24孔板的第1个L混匀后加入第2L同法稀释第3、4孔；对第1孔进行记数，计算后从相应的孔中取100个细胞，加入10mL的完全RPMI-1640培养液；接种含小鼠巨噬细胞的96孔板，0.lmL/孔，37t:C02培养箱培养；第89d时，应用间接ELISA进行抗体检测，克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养。最后获得稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11，该细胞株已于2009年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCCNo.3237。稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11扩大培养后离心收集，用冻存液(70%小牛血清，20%不完全培养液，10%DMS0)将细胞悬浮，移入冻存管内，-7(TC保存。五、单克隆抗体的制备1、体外直接培养将三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11进行扩大培养，所用的培养基为RPMI-1640培养基添加10%的胎牛血清，置于37t:和5%C02孵箱中培养，待细胞浓度大于105/ml时停止换液，持续孵育至细胞全部死亡。收集培养上清液，1500-2000Xg，离心IO分钟，上清液含有高水平的单克隆抗体(体外培养单克隆抗体)，_201:保存备用。2、体内诱导每只小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，1周后每只小鼠腹腔注射1Xl(f个3B11杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显膨大到一定程度时，用9号针头抽取腹水，反复收集数次；腹水经13，000r/min离心15min后，取上清分装，置-2(TC冰箱保存备用。用20mm的PBS(pH7.0)对腹水进行2倍稀释，再用0.45ym孔径的过滤器过滤，滤出液逐滴加入已经平衡的Hitr即rproteinAFF柱内，5倍柱体积的20Mm的PBS(pH7.0)洗涤后，用0.1M的柠檬酸钠(pH3.0)溶液进行洗脱，分管收集洗脱液并用碳酸盐缓冲液(pH9.0)调节pH至中性，得到纯化的单克隆抗体(体内培养单克隆抗体)。纯化单克隆抗体的纯度用SDS-PAGE进行鉴定。SDS-PAGE结果(见图3)表明，纯化后的抗体已经达到电泳纯。实施例4、间接ELISA测定单克隆抗体的效价—、体外培养单克隆抗体的效价测定1、用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4。C放置过夜；每孔用含0.05%Tween20的磷酸盐洗涤缓冲液(PBST)注满，放置5min，连续洗涤4次；2、每孔加入100iiL封闭液(含有10X小牛血清的PBST)，37t:温育2h;洗涤4次；3、用抗体稀释液将体外培养单克隆抗体进行梯度稀释，分别加入酶标板的不同孔(每孔加入100iiL)，以细胞培养液为阴性对照，抗体稀释液为空白对照，每个处理设置两个复孔；37t:放置lh;洗涤4次；4、加入按1:5000比例稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100iiL，37t:放置lh;洗涤4次；5、每孔加入OPD显色液100iiL，室温闭光放置显色(可根据每孔的颜色变化决定显色时间)；6、每孔加入100iiL2mol/L硫酸终止反应；7、酶标仪在吸收波长490nm，读出A49。值；取2孔的平均值。效价以抗血清的稀释度表示，检测结果以A柳；(A样品-A空白)/(A阴性对照-A空白)>2.1为阳性，以阳性孔相应的最高稀释倍数为效价。体外培养单克隆抗体的效价为1:250。二、体内培养单克隆抗体的效价测定用体内培养单克隆抗体代替体外培养单克隆抗体，阴性对照为同种方法制备的Sp2/0细胞的BALB/c小鼠腹水，空白对照为抗体稀释液。其它同步骤一。体外培养单克隆抗体的效价为1:80,000。实施例5、最佳抗原抗体反应浓度的确定[OH5]—、试剂配制包被液15.9g无水碳酸钠(Na2C03)，2.93g碳酸氢钠(NaHC03)，调整pH至9.6，加双蒸水定容至lOOOmL;洗涤缓冲液(PBST):0.2g磷酸二氢钾(KH2P04)，2.9g磷酸氢二钠(Na2HP0412H20)，8g氯化钠(NaCL)，0.2g氯化钾(KCL)，500mLTween20，调整pH至7.2，加双蒸水定容至lOOOmL;封闭液含有10%小牛血清的洗涤缓冲液；样品稀释液(PBST):同洗涤缓冲液；显色液:A液19.2g柠檬酸(C6H807*H20)，加双蒸水定容至lOOOmL;B液71.7g磷酸氢二钠(Na2HP0412H20)，加双蒸水定容至lOOOmL;使用前取4.86mLA液，5.14mLB液，4.OOmg邻苯二胺(0PD)，15mL30%过氧化氢(H202);终止液2mol/L硫酸(H2S04)。二、应用棋盘滴定法进行最佳抗原抗体反应浓度的确定1、包被抗原为SM-BSA，包被浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0yg/mL，100yL/孔，4t:过夜；洗板4次；2、用含10%FBS的封闭液封闭，37。C温育2h;洗板4次；3、用样品稀释液将体外培养单克隆抗体分别进行10、20、100、200倍稀释，每孔加入50iiL，同时每孔再加入50iiL三聚氰胺溶液(liig/iiL)或PBST，37。C温育0.5h，洗涤；4、加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1:5000)，37。C温育lh，洗涤；5、加OPD底物显色，加终止液终止反应后，读取A49。值；以上操作同时做两块酶标板的平行实验，A49。值取两板相对应的平行孔的平均值。①以包被抗原的浓度为横坐标，以无三聚氰胺竞争情况下孵育不同稀释度抗体时的A49。值为纵坐标，绘制标准曲线，分析最适的抗体工作量，结果见图4和表1。表l抗体滴度对A，值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果表明，当包被抗原浓度从O.2iig/mL变化到5iig/mL，单克隆抗体按l:10倍稀释时所得到的A，值始终接近i.o，故单克隆抗体的最适稀释滴度(稀释度)为i:io。②计算B/B。值，以包被抗原浓度为横坐标，以B/B。值为纵坐标，绘制标准曲线，分析包被抗原的最适工作浓度，结果见图5和表2。表2SM-BSA包被抗原浓度对三聚氰胺抑制率的影响包被抗原浓度B/B。(yg/mUmAb1:10mAb1:20mAb1:100mAbl:2000.20.20350.20830.1420.3910.50.3050.4290.290.3861.00.3760.3050.3050,4242.00.43560,45590.3410.3975.00,4550.4390.3360.385结果表明，无论对抗体进行多少倍稀释，包被抗原SM-BSA的浓度为0.2yg/mL，B/B。值始终最小，即游离三聚氰胺的抑制现象最明显，故包被抗原SM-BSA的最适浓度是0.2iig/mL。实施例6、试剂盒的制备—、试剂盒组件的制备1、溶液的配置包被液15.9g无水碳酸钠(Na2C03)，2.93g碳酸氢钠(NaHC03)，调整pH至9.6，加双蒸水定容至lOOOmL;洗涤缓冲液(PBST):0.2g磷酸二氢钾(KH2P04)，2.9g磷酸氢二钠(Na2HP0412H20)，8g氯化钠(NaCL)，0.2g氯化钾(KCL)，500mLTween20，调整pH至7.2，加双蒸水定容至1000mL;封闭液含有10%小牛血清的洗涤缓冲液；样品稀释液(PBST):同洗涤缓冲液；显色液:A液19.2g柠檬酸(C6H807*H20)，加双蒸水定容至lOOOmL;B液71.7g磷酸氢二钠(Na2HP0412H20)，加双蒸水定容至lOOOmL;使用前取4.86mLA液，5.14mLB液，4.OOmg邻苯二胺(0PD)，15mL30%过氧化氢(H202);终止液2mol/L硫酸(H2S04)。2、包被抗原(SM-BSA)包被的酶标板的制备使用包被液将SM-BSA稀释至O.2iig/mL，100yL/孔，4。C过夜；洗涤缓冲液连续洗涤4次，每孔注入200iiL，放置5min，甩干；每孔加入100yL封闭液，37。C温育2h，连续洗涤4次；放置_201:保存备用。经过性能测定，该酶标板具有良好的稳定性，且抗原具有良好的特异性。二、间接竞争ELISA试剂盒的组装检测三聚氰胺的间接竞争ELISA试剂盒，由以下组件组成①包被SM-BSA的酶标板；13②5瓶三聚氰胺标准品(浓度分别为300ppb、200卯b、150ppb、100卯b、50卯b)和1瓶不含三聚氰胺的空白对照液。③抗体工作液稀释度为1:10的体外培养单克隆抗体；HRP标记的羊抗鼠的IgG;⑤洗涤缓冲液；⑥样品稀释液；⑦显色液；⑧终止液。实施例7、试剂盒的性能采用实施例6制备的试剂盒进行性能测定。—、最低检测量和线性范围①分别取50iiL不同浓度的三聚氰胺标准品(300ppb、200卯b、150ppb、100卯b、50卯b、30卯b)加入酶标板的不同孔内，每孔再加入抗体工作液50iiL，每个样品做2个重复孔，37t:温育0.5h，连续洗涤4次；②加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1:5000)，37t:温育lh，用洗涤缓冲液连续洗涤4次；③取显色液，每孔100iiL，室温闭光放置显色(310min，可根据每孔的颜色变化决定显色时间)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，终止反应；⑤酶标仪在吸收波长490nm，读出A49。值。结果表明，本试剂盒的最低检测量(90%抑制率对应的浓度)为30ppb，线性范围为50300ppb。二、特异性①分别取50iiL不同浓度的三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺或三聚氰胺二酰胺加入酶标板的不同孔内，再加入抗体工作液50iiL，每个样品做2个重复孔，37t:温育0.5h，连续洗涤4次；②加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1:5000)，37t:温育lh;用洗涤缓冲液连续洗涤4次；③加入显色液(根据每孔的颜色变化决定显色时间)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，终止反应；⑤酶标仪测A，值。计算IC5。和交叉反应率(CR%)。IC5。为最大A49。值降低到50%时对应的竞争反应物的浓度；CR%=(三聚氰胺的IC5。/类似物IC5。)X100%。结果见表3。表33B11单克隆抗体与不同竞争反应物的IC5。和CR%14竞争反应物IC5。值(yg/ml)交叉反应率(CR%)B/B。值见图6。三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺和三聚氰胺二酰胺作为竞争反应物，B/B。值基本接近1.O，表明单克隆抗体对这三种结构类似物不识别。三、精密度和准确度取三聚氰胺标准品，添加到不同样品(液态奶；奶粉，用样品稀释液溶解；猫粮用样品稀释液溶解)中，每种样品设置3个三聚氰胺浓度，应用试剂盒检测样品中三聚氰胺的浓度，计算变异系数和回收率(取3个重复数据的平均值)。1、标准曲线的制作①分别取50iiL不同浓度的三聚氰胺标准品加入酶标板的不同孔内，每孔再加入抗体工作液50iiL，每个样品做2个重复孔，37t:温育0.5h，连续洗涤4次；②加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度l:5000)，37t:温育lh，用洗涤缓冲液连续洗涤4次；③取显色液，每孔100iiL，室温闭光放置显色(310min，可根据每孔的颜色变化决定显色时间)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，终止反应；⑤酶标仪在吸收波长490nm，读出A49。值。根据A49。值计算B/B。值，以B/B。值为纵坐标、标准品的浓度为横坐标制作标准曲线，得到曲线的回归方程(见图7)。2、用待测样品代替标准品溶液，其它步骤同上，进行间接竞争ELISA检测。根据回归方程计算得到待测样品中三聚氰胺的浓度。3、计算变异系数和回收率变异系数=(标准方差/平均数)X100%，由OriginPro8.0科学绘图和数据分析软件计算求得。回收率=(三聚氰胺的实验测定量/三聚氰胺加入量)X100X。表4变异系数与回收率的检测结果1003100.498.5110.0100.498.5110.03.064.750.91503171.8160.4175.1114.5106.9116.71.942.922.322003208.7195.5210.1104.497.8105.15.594.631.55<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结果显示，变异系数符合低于20%的规定，液态牛奶中添加三聚氰胺的回收率为97.7114.0%之间，表明本试剂盒有良好重复性和准确性。实施例8、实施例6制备的试剂盒的应用—、样品前处理(1)液态奶取三聚氰胺标准品，添加到液态奶中，得到三聚氰胺浓度为400iig/mL的溶液Al;用样品稀释液梯度稀释溶液Al。溶液Al及其梯度稀释液各取50iiL用于分析。(2)奶粉用样品稀释液溶解奶粉得到奶粉质量百分含量为20X的溶液B0;取三聚氰胺标准品，添加到溶液BO中，得到三聚氰胺浓度为400iig/mL的溶液Bl;用样品稀释液梯度稀释溶液Bl。溶液Bl及其梯度稀释液各取50iiL用于分析。(3)干猫粮称取干猫粮lg，加10mL样品稀释液，旋涡振荡器使其充分溶解，静止10min后，离心10min、10000rpm/min，取上清液(溶液CO)。取三聚氰胺标准品，添加到溶液CO中，得到三聚氰胺浓度为400i！g/mL的溶液Cl;用样品稀释液梯度稀释溶液用样品稀释液梯度稀释溶液Cl。溶液Cl及其梯度稀释液各取50iiL用于分析。二、样品中三聚氰胺的检测1、标准曲线的制作①分别取50iiL不同浓度的三聚氰胺标准品加入酶标板的不同孔内，每孔再加入抗体工作液50iiL，每个样品做2个重复孔，37t:温育0.5h，连续洗涤4次；②加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1:5000)，37t:温育lh，用洗涤缓冲液连续洗涤4次；③取显色液，每孔100iiL，室温闭光放置显色(310min，可根据每孔的颜色变化决定显色时间)；每孔加入50iiL2mol/L硫酸，终止反应；⑤酶标仪在吸收波长490nm，读出A49。值。根据A49。值计算B/B。值，以B/B。值为纵坐标、标准品的浓度为横坐标制作标准曲线，得到曲线的回归方程。2、用待测样品代替标准品溶液，其它步骤同上，进行间接竞争ELISA检测。根据回归方程计算得到待测样品中三聚氰胺的浓度。也可根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列标准三聚氰胺溶液颜色的比较，粗略地判断样本中三聚氰胺的浓度范围。权利要求一种三聚氰胺抗原，是式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物；式(II)。F2009102413101C0000011.tif2.如权利要求1所述的三聚氰胺抗原，其特征在于所述式(II)所示化合物和所述载体蛋白的物质的量的比值为20:i。3.如权利要求1或2所述的三聚氰胺抗原，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白。4.应用权利要求1至3中任一所述三聚氰胺抗原制备得到的单克隆抗体。5.—种检测三聚氰胺的试剂盒，它包括包被有包被抗原的酶标板；所述包被抗原为权利要求1至3中任一所述的三聚氰胺抗原。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于它还包括抗体工作液；所述抗体工作液为权利要求4所述单克隆抗体或其稀释液。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNO.3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生的。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述抗体工作液为稀释度为1:10的所述单克隆抗体。9.如权利5至8中任一所述的试剂盒，其特征在于所述包被抗原的浓度为0.2iig/mL。10.权利要求1所述三聚氰胺抗原、权利要求4所述单克隆抗体或权利要求5至9中任一所述试剂盒在检测三聚氰胺中的应用。全文摘要本发明公开了一种检测三聚氰胺的试剂盒及其应用。本发明提供了一种三聚氰胺抗原，是式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物。本发明提供的试剂盒包括包被有所述三聚氰胺抗原的酶标板。所述试剂盒还可包括所述三聚氰胺抗原制备得到的单克隆抗体或其稀释液。本发明的试剂盒最低检测量可达30ppb，远低于国家规定的食品中三聚氰胺含量的限定值，而且勿需对待测样品进行复杂的前处理，适当稀释后直接检测，简化程序，缩短时间，适用于大量样品的快速检测，故可作为检测食品中三聚氰胺含量的一种非常实用的检测工具。因此，本发明对解决大批量待检三聚氰胺含量的样品监控有重要的现实意义。式(II)。文档编号C07K14/435GK101717444SQ200910241310公开日2010年6月2日申请日期2009年11月27日优先权日2009年11月27日发明者丁亚芳,智刚,王校楠,石晓娟申请人:北京生命科学研究所