专利名称：一种抗三聚氰胺的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗三聚氰胺的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
三聚氰胺(英文名Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，性状为纯白 色单斜棱晶体，无味。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3， 5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，分子式见式(I);
<formula>formula see original document page 3</formula> 三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三 聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。但是它 被禁止用于食品和宠物饲料中，长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾 部结石，并可进一步诱发膀胱癌。 2007年，美国爆发宠物食品受污染事件。事后调查表明掺杂了《6.6%三聚氰胺 的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染 事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。
目前，三聚氰胺检测已经被列入我国新食品检测标准，并制定三聚氰胺在乳与乳 制品中的管理限量值。婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为lmg/kg;液态奶(包括原料 乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2. 5mg/kg ;含乳15%以上的其他食品中三 聚氰胺的限量值为2. 5mg/kg。现有的检测方法有主要为高效液相色谱法、气相色谱_质谱 联用法、液相色谱_质谱/质谱法，这些检测方法涉及到使用大型精密仪器，需要专业人员 操作，耗时较长，检测费用高昂。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗三聚氰胺的单克隆抗体及其应用。 本发明保护保藏编号为CGMCC NO. 3237的杂交瘤细胞株3B11。 杂交瘤细胞株3B11已于2009年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员
会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC
No.3237。本发明还保护一种抗三聚氰胺的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC NO. 3237的
杂交瘤细胞株3B11分泌产生的。 所述单克隆抗体可应用于检测三聚氰胺。 本发明还提供了一种应用所述单克隆抗体检测三聚氰胺的方法，是通过竞争 ELISA检测待测样品中的三聚氰胺。
所述方法中，所述单克隆抗体的稀释度具体可为i : io。 所述方法中，包被抗原可为式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物； 所述式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物中，式(II)所示化合物和载体蛋白
的物质的量的比值具体可为20 : i。 所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白。 所述方法中，所述包被抗原的浓度具体可为0. 2 ii g/mL。 本发明基于免疫学中抗原与抗体特异性反应的原理，制备出了抗三聚氰胺的单克 隆抗体，并应用其建立了一种特异性、快速、简单的检测三聚氰胺的方法。单克隆抗体通过 偶联剂1_(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐介导的縮合反应把三聚氰胺的类 似物SM(用一个碳原子取代三聚氰胺的含氮杂环中的一个氮原子，并在此碳原子上连接一 个带有羧基的侧链)偶联到载体蛋白(匙孔血蓝蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA);用SM-KLH 作为免疫抗原，取免疫小鼠的脾脏，分离出淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合，HAT选 择性培养基初步筛选出融合的杂交瘤细胞，间接竞争酶联免疫法筛选出阳性杂交瘤细胞 3B11，有限稀释法对3B11细胞进行亚克隆化，获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株；采用单 层细胞培养法培养细胞株，获得培养上清中的单克隆抗体；也可采用体内诱导法制备细胞 株分泌的腹水抗体，然后用Protein A蛋白亲和层析法纯化腹水，得到单克隆个抗体。检测 三聚氰胺的方法(间接竞争ELISA) :SM-BSA作为包被抗原被固定在酶标板上；用含10%小 牛血清的磷酸盐缓冲液37t:封闭1小时；每孔分别加入系列浓度的三聚氰胺标准品和抗三 聚氰胺抗体的工作液各50 ii L， 37t:孵育0. 5小时；每孔加入100 y L辣根过氧化物酶标记 的羊抗鼠抗体工作液，37t:孵育0. 5小时；OPD显色系统显色；酶标仪在吸收波长490nm，读 出A49。值；以三聚氰胺标准品浓度为x轴，抑制率(B/B。值)y轴，绘制标准曲线；同样，用待 测样品液代替三聚氰胺标准品溶液，进行间接竞争ELISA，根据标准曲线计算出样品中的三 聚氰胺浓度。 应用本发明提供的单克隆抗体和方法，可以快速地检测乳制品中三聚氰胺，具有 特异性强、灵敏度高、操作简单、检测样品量大等优点。此外，与同类检测方法相比，本发明 的方法中被检测的液态样品无需前处理，固态样品只需使用磷酸盐缓冲液做适量浓度溶解 即可上样检测，操作简单，节省时间。本发明的单克隆抗体既可用于三聚氰胺的检测，也可 用于制备检测三聚氰胺的试剂盒，具有重大的价值。
图1为SM-KLH/BSA的结构图。 图2为质谱分析SM与BSA的偶联结果。 图3为SDS-PAGE分析Protein A亲和层析纯化腹水。 图4为单克隆抗体稀释滴度对A49。值的影响。 图5为SM-BSA浓度对三聚氰胺抑制率的影响。 图6为单克隆抗体与三聚氰胺类似物的交叉反应曲线。
图7为三聚氰胺抑制标准曲线。
图8为化合物SM的核磁共振氢谱图。
图9为化合物SM的核磁共振碳谱图。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
三聚氰胺、三聚氰胺一酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸、l-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(l-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl，EDC)、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)、匙孑L血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、完全弗 氏佐剂(complete Freund' s adjuvant, CFA))、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund' s adjuvant, IFA)、石蜡油、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase， HRP)标记的羊抗鼠的 IgG均购自sigma公司；HAT、HT、RPMI-1640培养液、胎牛血清(FBS) 、L_谷氨酰胺、青霉素、 链霉素均购自Gibco公司；Hitraprprotein A FF column柱购自Amersham公司；6 8周 龄的BALB/c纯系鼠购自北京兴隆实验动物中心；鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自ATCC，货号为 CRL-1581。其它常规化学试剂均为国产分析纯。液态纯牛奶购自伊利实业集团股份有限公 司；脱脂奶粉购自完达山乳业股份有限公司。 酶标仪680 (BIO-RED) ， 二氧化碳培养箱371 (themo)，生物安全柜(LABC0NC0)倒 置生物显微镜XDS-IB (重光)，电泳仪(BIO-RED)，垂直电泳槽(BIO-RED)，台式离心机 5810R(印pendorf) ， Autoflex II T0F/T0F质谱仪(Bruker Daltonics，北京生命科学研究 所蛋白质中心)。 抑制率(B/B0) = [(A柳(x「A柳(o))/(A柳(ctD-A柳(o))]X100X ;A490(X)-有三聚氰胺 (或有三聚氰胺类似物，或有待测样品)抑制的A49。值，A49。(etl)_无三聚氰胺(或无三聚氰 胺类似物，或无待测样品)抑制的A49。值，A49。(。)_无抗体的空白对照的A49。值。
实施例1、三聚氰胺结构类似物(SM)的制备 SM的分子式如下
<formula>formula see original document page 5</formula>
一、化合物3的制备和表征 1、化合物3的制备
<formula>formula see original document page 5</formula>
把2，3-二氢妣喃(化合物1) (0. 56g，6. 63mmol) ，6-溴-1-己醇(lg，5.52翻l)和吡啶对甲基苯磺酸盐(0. 28g，l. lmmol)溶解在15mL二氯甲烷(DCM)中，反应液在室温下 搅拌23小时。用饱和NaHC03溶液和饱和食盐水洗涤反应液，无水Na2S04干燥。过滤除去 干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到无色油状液体化合物3(1. 4g，收率为96% )。
2、化合物3的表征 4画R (CDC13， 400MHz) S 4. 57 (m， 1H) ， 3. 86 (m， 1H) ， 3. 74 (m， 1H) ， 3. 50 (m， 1H)， 3. 36-3. 43 (m， 3H) ， 1. 82—1. 91 (m， 3H) ，1.71 (m， 1H) ， 1. 38—1. 64 (m， 10H)。
二、化合物4的制备和表征
1、化合物4的制备 把NaH(规格活性氢含量95%，银灰色颗粒含量60% ) (0. 18g， 4. 52mmol)和二 甲醚(DME) (5mL)加入25mL的两口瓶中，然后依次滴加丙二腈(Malononitrile) (0. 5g， 7. 45mmol)的DME(8mL)溶液和化合物3 (lg， 3. 77mmol)的DME(2mL)溶液，然后反应混合液 在室温和氮气保护下搅拌过夜。用5% NH4C1溶液中止反应，调pH至8，向反应液中加入乙 酸乙酯，依次用水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏 除去溶剂，柱层层析得到无色油状液体化合物4(0. 6g，收率为63. 8% )。
NaH,malononitrile nc、/\ ^\力、乂o、
cn
dme,63.8°/。
3
4 2、化合物4的表征"匪R(CDCl3， 400MHz) S 4. 56 (m， 1H) ，3. 71-3. 86 (m， 3H) ，3. 37-3. 52 (m，2H)， 2. 01-2. 07 (m， 2H) ， 1. 43—1. 82 (m， 14H)。
三、化合物5的制备和表征
1、化合物5的制备 把胍的盐酸盐(0. 19g， 1. 98,1)，甲醇钠(0. 38mL， 1. 98mmol，含量28% )和5mL 无水甲醇加入25mL圆底烧瓶中，反应混合液在氮气保护下搅拌0. 5小时。过滤除去反应产 生的氯化钠，滤液在减压条件下浓縮，然后逐滴加入化合物4(0. 45g， 1. 8mmo1)的二甲基甲 酰胺(DMF) (5mL)溶液，把反应液加热到8(TC在氮气保护下搅拌过夜。把反应液冷却至室 温，用lM的盐酸溶液调pH至8，用乙酸乙酯萃取，无水Na^04干燥。过滤除去干燥剂，减压 蒸馏除去溶剂得到黄色固体化合物5(0. 54g，97% )。
NH
义'HCI
h2nAnh2
CH3ONa DMF,97%
H7N
4
5 2、化合物5的表征 ^画R (CDC13， 400MHz) S 4. 56 (m， 1H) ， 3. 87 (m， 1H) ， 3. 73 (m， 1H) ， 3. 50 (m， 1H)， 3. 38 (m， 1H) ， 2. 19-2. 31 (m， 2H) ， 1. 36-1. 71 (m， 14H)。
四、化合物6的制备和表征
6
1、化合物6的制备 向化合物5(0. 33g，0. 363mmol)的四氢呋喃(THF) (20mL)溶液中依次加入二碳酸 二叔丁酉旨(Boc)20(l. 55g，7. 12mmol)，三乙胺(TEA) (1.09mL，7. 83,1)和4-二甲氨基吡啶 (DMAP) (87mg，0. 712mmol)。反应液在室温和氮气保护下搅拌过夜。用质量含量5% NaHC03 溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5% NaHC(^溶液，水和饱 和食盐水洗涤有机相，无水Na2S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，柱层析得到 化合物6(0. 38g，58. 5% )。
2、化合物6的表征 丄HNMR(CDCl3， 400MHz) S4.57(t， J = 4Hz， 1H) ， 3. 86 (m， 1H) ， 3. 73 (m， 1H) ， 3. 50 (m， 1H) ， 3. 38 (m， 1H) ， 2. 29-2. 46 (m， 2H) ， 1. 22-1. 59 (m， 68H)。
五、化合物7的制备和表征
1、化合物7的制备 把化合物6(0. 33g，0. 363mmol)，甲醇(10mL)和对甲苯磺酸(pTsOH) (0. 013g， 0. 0726mmol)加入25mL单口圆底烧瓶中，在室温和氮气保护下搅拌2小时。用质量含量5% NaHC03溶液中止反应，减压除去溶剂，用乙醚溶解剩余物，依次用质量含量5 % NaHC03溶液， 水和饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂得到化 合物7(0. 25g，83% )。
<formula>formula see original document page 7</formula> 2、化合物7的表征 丄匪R (CDC13， 400MHz) S 3. 65 (m， 2H) ， 2. 33-2. 45 (m， 2H) ， 1. 22-1. 60 (m， 62H)。
六、化合物8的制备和表征
1、化合物8的制备 向化合物7(140mg，0. 17mmol)的二氯甲烷(DCM) (8mL)溶液中依次加入N-甲基吗 啉-N-氧化物(腦)(34. 4mg，0. 255,1)和过钌酸四内胺(TPAP) (6. lmg，O. 017,1)，反应 液在室温下搅拌2小时。用一根短硅胶柱过滤反应液得到无色油状液体化合物8(0. 12g， 83. 5% )。
<formula>formula see original document page 8</formula>
2、化合物8的表征
工HNMR(CDCl3， 400MHz) S 9. 77 (s， 1H) ， 2. 43-2. 45(m，4H) ， 1. 39-1. 63(m，60H)。 七、化合物9的制备和表征 1、化合物9的制备
把NaC102(19. 6mg，纯度80 %，0. 174mmo1)和NaH2P04(20 . 9mg，0. 174mmo1)力口入 0. 14mL水中，然后把这种配制好的溶液逐滴加入盛有化合物8(0. llg，O. 134mmo1) ，93 y L 2-甲基-2- 丁烯和2mL叔丁醇的圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜。向反应体系中加 入水中止反应，用乙酸乙酯萃取反应液，无水N S04干燥。过滤除去干燥剂，减压蒸馏除去
溶剂，所得粗品不经纯化直接用于下一步反应。
<formula>formula see original document page 8</formula> 2、化合物9的表征
"誦R(CDCl3，400MHz) S2.44(t， J 1. 24-1. 66(m，60H)。
八、化合物10的制备和表征
1、化合物10的制备把化合物9(0. llg，O. 131mmo1)，9. 4mL三氟乙酸(TFA)和0. 6mL苯甲醚加入50mL 单口圆底烧瓶中，反应液在室温下搅拌过夜。在减压条件下除去三氟乙酸和苯甲醚得到粗 品，向粗品中加入乙醚，离心，抽去乙醚得到白色固体，向这种白色固体中重新加入乙醚，离 心，重复三次得到化合物10(0.021g，66% (两步总产率))。
<formula>formula see original document page 8</formula>
2、化合物10的表征 "HNMR^O, 400MHz) S2. 38(t， J = 7. 6Hz ， 2H) ， 2. 35 (t ， J = 6.8Hz，2H)， 1. 47-1. 63(m，2H)，1. 34-1. 47(m，4H)。化合物10的氢谱图见图8。 13CNMR(D20， 100MHz) S 179. 5， 157. 8， 153. 0，86. 2，34. 1，28. 2，26. 5，24. 7，22. 3ppm。化合物10的碳谱图见图9。 化合物10即三聚氰胺结构类似物(SM)。 实施例2、抗原的制备 抗原SM-BSA(SM-KLH)偶联反应物的示意图见图1。
—、 SM-BSA (包被抗原)的制备 称取5mg SM和20mg BSA，充分溶解于5ml盐酸酸化的去离子水(pH4. 7)中，向混 合溶液中加入46mg EDC，4t:搅拌下反应过夜；反应产物4t:透析过夜，外透液为0.01M PBS 缓冲溶液(PH7.0);分别取相同浓度(2mg/mL)的BSA和SM-BSA进行质谱分析，鉴定偶联结 果。质谱检测结果见图2。 BSA分子量为66. 32KD。 SM-BSA的平均分子量为70. 57KD， 与BSA相比增加了 4. 25KD。 SM的分子量为221D， SM-BSA的形成是通过EDC将SM侧链上的 羧基与BSA表面的赖氨酸上游离的氨基脱水形成酰胺健，所以BSA分子每偶联上一个SM分 子，分子量就增加203D (221D (SM) -18D (H20))。质谱分析结果表明，平均每个BSA分子偶联 20个SM分子(4. 25KD/203D = 20)。
二、 SM-KLH (免疫抗原)的制备
用KLH代替BSA，其它方法同步骤一。
实施例3、单克隆抗体的制备
—、小鼠免疫 1、取5只6 8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠皮下注射20 y g弗氏完全佐剂乳化 的SM-KLH(初次免疫)。 2、每隔15天皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的同剂量的SM-KLH(加强免疫)。
3、第4次免疫10天后眼眶采血，间接ELISA检测抗血清效价，间接竞争ELISA检 测抗体相对三聚氰胺的特异性。 5只小鼠抗血清效价均为1 : 72000。 1#、2#、3#小鼠的抗血清较其它2只小鼠的抗 血清更能特异地识别三聚氰胺；加入同等剂量三聚氰胺的情况下，3#小鼠的抗血清的B/B。 值更小，即抑制现象更明显。 4、取抗血清效价较高并且特异性较好的小鼠(3#小鼠)在细胞融合前3天进行最 后一次加强免疫(腹腔注射20 ii g SM-KLH)。
二、细胞融合
1、准备工作 ①于细胞融合前1天取6 8周龄的BALB/c小鼠拉颈处死，分离腹腔细胞作为饲 养细胞，制成HAT的细胞悬液(细胞密度2X10s个/mL)加入96孔板，37°C C02培养箱培 养，备用。 ②于细胞融合前两周复苏SP2/0细胞，调整细胞状态至最佳，备用。 ③步骤一的4中的3#小鼠，最后一次加强免疫3天后取脾脏，制备脾细胞悬液，使
用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，计数，备用。 2、细胞融合 淋巴细胞与SP2/0细胞按10 : 1的数量比混合，滴加lmL 50% PEG融合，离心后 加入50mL HAT培养液，接种到含有饲养细胞的96孔培养板内，37。C C02培养箱培养；观察
9细胞的生长情况，确认非杂交细胞死亡后，改用完全RPMI-1640培养液培养。 融合后的细胞共接种6块96孔细胞培养板，HAT选择培养基筛选后，进行显微镜
观察，细胞融合率为100%。 三、杂交瘤细胞筛选 1、间接ELISA 用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4°C过夜；洗板4次；含10 % FBS的封闭液封 闭，37t:温育2h ;洗板4次；加入待测杂交瘤细胞培养上清液(以SP2/0细胞的上清液作为 阴性对照；以含10% FBS封闭液作为空白对照；37t:温育0. 5h ;洗板4次；加入HRP标记的 羊抗鼠的IgG， 37t:温育lh ;洗板4次；加入OPD显色液，酶标仪测A49。值。检测结果以A49。； (A样品-A空白)/ (A阴性对照-A空白)> 2. 1为阳性。 间接ELISA检测结果表明，能够识别SM-BSA的杂交瘤细胞株共10株1B11、2E10、
3A2、3B1、3B3、3B11、4F9、5F3、5H7、6D3。 2、间接竞争ELISA 将步骤1中10株阳性细胞进行如下检测用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4°C 过夜；洗板4次；用含10% FBS的封闭液封闭，37t:温育2h ;洗板4次；每孔加入待测杂交 瘤细胞培养上清液和浓度为1 P g/ml的游离三聚氰胺各50 P L(对照孔用等体积的PBS代 替三聚氰胺溶液)，37"温育0. 5h ;洗板4次；加入HRP标记的羊抗鼠的IgG， 37"温育lh ; 洗板4次；加入OPD显色液，酶标仪测A49。值。如果试验孔的A49。值比对照孔的A49。值小，表 明加入到该孔内的杂交瘤细胞培养上清液中含有抗三聚氰胺的特异性抗体。
间接竞争ELISA结果表明，只有3B11细胞株分泌的单克隆抗体在加入游离的三聚 氰胺时有抑制反应，即能够特异性识别三聚氰胺。
四、杂交瘤细胞的克隆化和冻存 将3B11杂交瘤细胞吹散，取0. lmL的细胞悬液加入含0. 9mL HAT培养液的24孔 板的第1个 L混匀后加入第2 L同法稀释第3、4孔；对第1孔进行记数，计算后从相应的 孔中取100个细胞，加入10mL的完全RPMI-1640培养液；接种含小鼠巨噬细胞的96孔板， 0. lmL/孔，37t: (A培养箱培养；第8 9d时，应用间接ELISA进行抗体检测，克隆化后阳 性率达100%的细胞扩增培养。 最后获得稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11，该细胞株已于2009年08 月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中 国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC No. 3237。 稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11扩大培养后离心收集，用冻存液 (70%小牛血清，20%不完全培养液，10% DMSO)将细胞悬浮，移入冻存管内，-7(TC保存。
五、单克隆抗体的制备
1、体外直接培养 将三聚氰胺单克隆抗体细胞株3B11进行扩大培养，所用的培养基为RPMI-1640培 养基添加10%的胎牛血清，置于37t:和5% C02孵箱中培养，待细胞浓度大于105/ml时停 止换液，持续孵育至细胞全部死亡。收集培养上清液，1500-2000Xg，离心IO分钟，上清液 含有高水平的单克隆抗体(体外培养单克隆抗体)，_201:保存备用。
2、体内诱导
每只小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，1周后每只小鼠腹腔注射1Xl(f个3B11杂交 瘤细胞；待小鼠腹部明显膨大到一定程度时，用9号针头抽取腹水，反复收集数次；腹水经 13， OOOr/min离心15min后，取上清分装，置-2(TC冰箱保存备用。 用20mm的PBS (pH7. 0)对腹水进行2倍稀释，再用0. 45 y m孔径的过滤器过滤，滤 出液逐滴加入已经平衡的Hitr即rprotein A FF柱内，5倍柱体积的20Mm的PBS (pH7. 0) 洗涤后，用0. 1M的柠檬酸钠(pH3. 0)溶液进行洗脱，分管收集洗脱液并用碳酸盐缓冲液 (pH9. 0)调节pH至中性，得到纯化的单克隆抗体(体内培养单克隆抗体)。
纯化单克隆抗体的纯度用SDS-PAGE进行鉴定。SDS-PAGE结果(见图3)表明，纯 化后的抗体已经达到电泳纯。 实施例4、间接ELISA测定单克隆抗体的效价
—、体外培养单克隆抗体的效价测定 1、用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4。C放置过夜；每孔用含0. 05% Tween20的 磷酸盐洗涤缓冲液(PBST)注满，放置5min，连续洗涤4次； 2、每孔加入100iiL封闭液(含有10X小牛血清的PBST)，37t:温育2h ;洗涤4次；
3、用抗体稀释液将体外培养单克隆抗体进行梯度稀释，分别加入酶标板的不同孔 (每孔加入100 ii L)，以细胞培养液为阴性对照，抗体稀释液为空白对照，每个处理设置两 个复孔；37t:放置lh ;洗涤4次； 4、加入按1 : 5000比例稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100 iiL，37t:放置lh;
洗涤4次； 5、每孔加入OPD显色液100 ii L，室温闭光放置显色(可根据每孔的颜色变化决定 显色时间)； 6、每孔加入100 ii L 2mol/L硫酸终止反应； 7、酶标仪在吸收波长490nm，读出A49。值；取2孔的平均值。效价以抗血清的稀释 度表示，检测结果以A柳；(A样品-A空白)/(A阴性对照-A空白)> 2. 1为阳性，以阳性孔相应的最高 稀释倍数为效价。 体外培养单克隆抗体的效价为1 : 250。
二、体内培养单克隆抗体的效价测定 用体内培养单克隆抗体代替体外培养单克隆抗体，阴性对照为同种方法制备的 Sp2/0细胞的BALB/c小鼠腹水，空白对照为抗体稀释液。其它同步骤一。
体外培养单克隆抗体的效价为1 : 80,000。
实施例5、最佳抗原抗体反应浓度的确定
—、试剂配制 包被液15. 9g无水碳酸钠(Na2C03) ， 2. 93g碳酸氢钠(NaHC03)，调整pH至9. 6，加 双蒸水定容至lOOOmL ; 洗涤缓冲液(PBST) :0. 2g磷酸二氢钾(KH2P04) ， 2. 9g磷酸氢二钠 (Na2HP04 12H20) ， 8g氯化钠(NaCL) ， 0. 2g氯化钾(KCL) ， 500mL Tween20，调整pH至7. 2，加 双蒸水定容至lOOOmL ; 封闭液含有10%小牛血清的洗涤缓冲液；
样品稀释液(PBST):同洗涤缓冲液；
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显色液:A液19. 2g柠檬酸(C6H807 *H20)，加双蒸水定容至lOOOmL ;B液71. 7g磷 酸氢二钠(Na2HP04 12H20)，加双蒸水定容至lOOOmL ;使用前取4. 86mL A液，5. 14mL B液， 4. OOmg邻苯二胺(0PD)，15mL 30%过氧化氢(H202);
终止液2mol/L硫酸(H2S04)。 二 、应用棋盘滴定法进行最佳抗原抗体反应浓度的确定 1、包被抗原为SM-BSA，包被浓度分别为0. 2、0. 5、1. 0、2. 0、5. 0 y g/mL/100 y L/
孔，4t:过夜；洗板4次； 2、用含10% FBS的封闭液封闭，37。C温育2h ;洗板4次； 3、用样品稀释液将体外培养单克隆抗体分别进行10、20、100、200倍稀释，每孔加 入50iiL，同时每孔再加入50iiL三聚氰胺溶液(liig/iiL)或PBST，37。C温育0. 5h，洗涤；
4、加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1 : 5000) ，37。C温育lh，洗涤；
5、加OPD底物显色，加终止液终止反应后，读取A49。值；以上操作同时做两块酶标 板的平行实验，A49。值取两板相对应的平行孔的平均值。 ①以包被抗原的浓度为横坐标，以无三聚氰胺竞争情况下孵育不同稀释度抗体时 的A49。值为纵坐标，绘制标准曲线，分析最适的抗体工作量，结果见图4和表1。
表1抗体滴度对A49。值的影响
包被抗原浓度 A49。值
(u g/mUraAb 1:10mAb 1:20mAb 1:100mAbl:200
0. 20. 98340. 66350. 3150. 2505
0. 51. 0120. 7090. 34350. 283
1. 00. 9980. 6850. 3250. 262
2. 01, 0680. 67950. 3160. 2605
5. 01. 12340. 71250. 3540. 354 结果表明，当包被抗原浓度从O. 2iig/mL变化到5iig/mL，单克隆抗体按l : 10倍
稀释时所得到的A，值始终接近i.o，故单克隆抗体的最适稀释滴度(稀释度)为i : io。 ②计算B/B。值，以包被抗原浓度为横坐标，以B/B。值为纵坐标，绘制标准曲线，分
析包被抗原的最适工作浓度，结果见图5和表2。 表2SM-BSA包被抗原浓度对三聚氰胺抑制率的影响
包被抗原浓度B/B。
(ti g/mL)mAb 1:10raAb 1:20mAb 1:100raAbl:200
0. 20. 20350. 20830. 1420. 391
0. 50, 3050. 4290. 290. 386
1. 00. 3760. 3050. 3050. 424
2. 00. 43560. 45590. 3410. 397
5. 00. 4550. 4390. 3360. 385
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结果表明，无论对抗体进行多少倍稀释，包被抗原SM-BSA的浓度为0. 2ii g/mL， B/B。值始终最小，即游离三聚氰胺的抑制现象最明显，故包被抗原SM-BSA的最适浓度是 0. 2 li g/mL。 实施例6、单克隆抗体的交叉反应试验 1 、用SM-BSA包被酶标板(20ng/孔)，4 °C过夜；洗板4次； 2、用含10% FBS的封闭液封闭，37t:温育2h ;洗板4次； 3、每孔分别加入不同浓度梯度的三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺或三聚氰 胺二酰胺50i!L(对照孔加入等量的PBS)，再加入最适抗体工作液50iiL(稀释度为l : 10 的体外培养单克隆抗体)，37t:温育0. 5h ;洗板4次； 4、加入HRP标记的羊抗鼠的IgG(稀释度1 : 5000)，37t:温育lh ;用洗涤缓冲液 连续洗涤4次； 5、加入OPD显色液(根据每孔的颜色变化决定显色时间)；
6、每孔加入50ii L 2mol/L硫酸，终止反应；
了、酶标仪测A柳值。 计算IC5。和交叉反应率(CR% ) 。 IC5。为最大A49。值降低到50%时对应的竞争反 应物的浓度；CR% =(三聚氰胺的IC5。/类似物IC5。) X 100% 。结果见表3。
表33B11单克隆抗体与不同竞争反应物的ICs。和CR^
竞争反应物ICs。值(Ug/ml) 交叉反应率(CR%)
3.0 100
/ 无 / 无 _^_无 B/B。值见图6。三聚氰酸、三聚氰胺一酰胺和三聚氰胺二酰胺作为竞争反应物，B/ B。值基本接近1. O，表明单克隆抗体对这三种结构类似物不识别。
实施例7、应用单克隆抗体通过竞争ELISA检测三聚氰胺
—、试剂配制 包被液15. 9g无水碳酸钠(Na2C03) ， 2. 93g碳酸氢钠(NaHC03)，调整pH至9. 6，加 双蒸水定容至lOOOmL ; 洗涤缓冲液(PBST) :0. 2g磷酸二氢钾(KH2P04) ， 2. 9g磷酸氢二钠 (Na2HP04 12H20) ， 8g氯化钠(NaCL) ， 0. 2g氯化钾(KCL) ， 500mL Tween20，调整pH至7. 2，加 双蒸水定容至lOOOmL ; 封闭液含有10%小牛血清的洗涤缓冲液；
样品稀释液(PBST):同洗涤缓冲液； 显色液:A液19. 2g柠檬酸(C6H807 *H20)，加双蒸水定容至lOOOmL ;B液71. 7g磷 酸氢二钠(Na2HP04 12H20)，加双蒸水定容至lOOOmL ;使用前取4. 86mL A液，5. 14mL B液， 4.00mg 0PD，15mL 30%过氧化氢(H202);
终止液2mol/L硫酸(H2S04)。
二、通过竞争ELISA检测三聚氰胺
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三聚氰胺 三聚氰酸 三聚氰胺一酰胺 三聚氰胺二酰胺
1、包被 SM-BSA包被酶标板(包被抗原浓度为0. 2 ii g/mL) ， 100 ii L/孔，4。C过夜；
2、洗涤 每孔注入200 ii L洗涤缓冲液，放置5min，连续洗涤4次；
3、封闭 每孔加入100iiL封闭液，37t:温育2h，连续洗涤4次；
4、竞争反应 取三聚氰胺标准品，添加到液态奶中，得到三聚氰胺浓度为240 ii g/mL的溶液Al ; 用样品稀释液梯度稀释溶液A1。用样品稀释液溶解奶粉得到奶粉质量百分含量为20%的 溶液BO，取三聚氰胺标准品，添加到溶液BO中，得到三聚氰胺浓度为240 ii g/mL的溶液Bl ; 用样品稀释液梯度稀释溶液Bl 。取三聚氰胺标准品，添加到样品稀释液中，得到三聚氰胺浓 度为240 g/mL的溶液CI ;用样品稀释液梯度稀释溶液Cl。 分别以三种样本(A1、B1和Cl)及其梯度稀释液中的三聚氰胺与包被抗原SM-BSA 去竞争抗体，50 L/孔，每个样本的每个体系中三聚氰胺的终浓度分别为120、30、3、0. 3、 0. 03、0. 003、0 ii g/mL，同时每孔再加入50 y L最佳稀释滴度的抗体工作液(稀释度为 1 : 10的体外培养单克隆抗体)，每个样品做2个重复孔，37t:温育0.5h，连续洗涤4次；
5、加入II抗 HRP标记的羊抗鼠的IgG(l : 5000) ，37"温育lh，温育lh，连续洗涤4次；
6、显色 显色前3 5min内配制好显色液，每孔100 y L，室温闭光放置显色(可根据每孔
的颜色变化决定显色时间)；
7、终止 每孔加入100 ii L 2mol/L硫酸;
8、读值 酶标仪在吸收波长MOnm,读出A49。值。
9、绘制标准曲线 计算B/B。值，以包被抗原浓度为横坐标，以B/B。值为纵坐标，绘制标准曲线。
检测结果如图7所示，液态奶、奶粉和标准样品稀释液三个体系中的三聚氰胺对 包被抗原SM-BSA与抗体的结合都产生抑制作用，并且三个体系中三聚氰胺的最低检测量 均在0. 3 ii g/mL 0. 03 ii g/mL之间。 结果表明，本发明的方法可灵敏地检测到三聚氰胺。
1权利要求
保藏编号为CGMCC NO.3237的杂交瘤细胞株3B11。
2. —种单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC NO. 3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生的。
3. 权利要求2所述单克隆抗体在检测三聚氰胺中的应用。
4. 一种检测待测样品中的三聚氰胺的方法，是用权利要求2所述单克隆抗体，通过竞争ELISA检测待测样品中的三聚氰胺。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，所述单克隆抗体的稀释度为1 ! 10。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法中，包被抗原为式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物；
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于所述式(II)所示化合物和载体蛋白的偶联物中，式(II)所示化合物和载体蛋白的物质的量的比值为20 : 1。
8. 如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，所述包被抗原的浓度为
全文摘要
本发明公开了一种抗三聚氰胺的单克隆抗体及其应用。本发明提供了保藏编号为CGMCC NO.3237的杂交瘤细胞株3B11。本发明提供的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC NO.3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生的。应用本发明提供的单克隆抗体，通过间接竞争ELISA方法，可以快速地检测乳制品中三聚氰胺，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测样品量大等优点。此外，与同类检测方法相比，本发明的方法中被检测的液态样品无需前处理，固态样品只需使用磷酸盐缓冲液做适量浓度溶解即可上样检测，操作简单，节省时间。本发明的单克隆抗体既可应用于三聚氰胺的检测，也可应用于制备检测三聚氰胺的试剂盒，具有重大的价值。
文档编号C07K16/44GK101705210SQ200910241309
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者智刚, 石晓娟 申请人:北京生命科学研究所