专利名称：一种抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法。
背景技术：
鸭病毒性肝炎是小鸭的一种高度致死性的病毒性传染病，本病最先在美国发现， 其后在英国、加拿大、德国等许多养鸭国家陆续发现本病。本病的特征是发病急，传播快，死 亡率高，临诊表现角弓反张，病例变化为肝炎和出血。本病唱给养鸭场造成重大的经济损 失。目前虽然已经有一些抗鸭病毒性肝炎的药品或制剂，但不能从根本上预防鸭病毒性肝 炎。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，以抑制鸭 病毒性肝炎病毒，保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎的感染，达到从根本上预防的目的。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种抗鸭病毒性肝炎转移因子 的制备方法，将鸭病毒性肝炎接种与鸡胚尿囊腔中进行增殖，从中提取病毒抗原；然后将提 取的病毒抗原在健康猪机体上进行免疫，再从免疫猪的脾脏上提取得到抗鸭病毒性肝炎转 移因子。本发明的制备方法具体步骤如下
1)鸭肝炎病毒抗原的制备将鸭病毒性肝炎接种于9日龄-10日龄的鸡胚尿囊腔中进 行增殖，33-37°C，培养72-96h，取鸡胚尿囊液，装入经灭菌消毒的离心管中内，超声波处理 后离心，弃去沉淀取上清，得到粗病毒抗原；
2)病毒抗原的提取在离心管中依次小心铺设20%-66%不同浓度梯度的蔗糖溶液，然 后在溶液液面上加粗抗原，粗抗原的加入量为每个梯度蔗糖溶液体积的20%，经离心处理， 小心吸出在蔗糖梯度层中出现的病毒带，透析除去蔗糖得到病毒抗原；
3)病毒抗原免疫猪挑选健康免疫猪，用上述提取的病毒抗原进行皮下多点注射免疫， 免疫至少4次，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后，取脾脏冷冻保存待用；
4)从免疫猪的脾脏中提取抗鸭病毒性肝炎转移因子
(I)将免疫猪的脾脏除去表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗，然后将脾脏剪
碎，加入2倍-4倍体积的生理盐水，在低于10°C的条件下用高速组织捣碎机捣碎制得猪脾 脏勻浆液；
ig)将猪脾脏勻浆液进行超声波处理，在-60°C -80°C快速冷冻，水浴30°C _37°C融化，
交替冻融4 6次，每次融化后都用组织勻浆高速勻浆粉碎；然后加入2倍体积的冰冻生理 盐水，离心取上层血红色的液体，再用砂心漏斗过滤，取滤液；
3i)将滤液用盐酸调PH值至5. 0-6. 0，上清液先用0. 2 μ m中空纤维柱过滤，滤出液再用
截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液，将所得的滤液用0. 22 μ m滤膜 进行无菌过滤，即得到抗鸭病毒性肝炎转移因子。步骤2)所述蔗糖溶液分为4个递增的蔗糖浓度梯度，分别为20-25%，30-45%， 40-55%，60-66%。步骤3)所述取免疫猪脾脏之前，取免疫猪静脉血，用ELISA方法或者免疫荧光方 法检测静脉血的病毒特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，再取免疫猪脾脏。转移因子是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽一核苷酸 复合物，它能够将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给正常受体正常的淋巴细 胞，参与机体的免疫反应，提高机体的细胞免疫功能，抵抗真菌、病毒、细菌等的感染；同时 促进B淋巴细胞的转移因子分泌作用，能够诱导细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体 的免疫功能，被誉为T细胞活性的触发剂。转移因子分子量小、无毒、无抗原性、不起过敏反 应，不产生对抗转移因子且可超越种系界限应用的优点。本发明采用鸭病毒性肝炎病毒提取特异性转移因子，该转移因子能够有效的抑制 鸭病毒性肝炎病毒，能够保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎病毒的感染，从根本上预防 鸭病毒性肝炎的发生。另外，本发明的制备方法简单易行，生产时间短，成本低，具有很好的 应用前景。
具体实施例方式实施例1
本实施例采用鸭1型病毒性肝炎为例，制备抗鸭病毒性肝炎转移因子，该方法的步骤 如下
1)鸭肝炎病毒抗原的制备将鸭1型病毒性肝炎接种于9日龄的鸡胚尿囊腔中进行 增殖，33 V，培养72h，取鸡胚尿囊液，装入经灭菌消毒的离心管中内，用超声波超声IOmin (50Hz),5000rpm/min离心20min，弃去沉淀取上清，得到粗病毒抗原；
2)病毒抗原的提取在离心管中依次小心铺设20%、30%、40%、66%4个梯度的蔗糖溶 液，每一个梯度蔗糖溶液为1ml，最后在溶液液面上加粗抗原0. 2ml,经40000r/min离心 2. 5h，在第二层有一病毒带，小心吸出，透析去蔗糖得到病毒抗原；
3)鸭1型病毒性肝炎抗原免疫猪挑选健康免疫猪，用上述提取的病毒抗原进行皮下 多点注射免疫，共免疫4次，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取猪静脉血，用ELISA 方法或者免疫荧光方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后宰杀 动物，取脾脏置于-20°C保存待用；
4)从免疫猪中提取抗鸭瘟转移因子
(D将免疫猪的脾脏除去表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗，然后将脾脏剪
碎，加入2倍体积的生理盐水，采用生理盐水能够防止转移因子的活性被破坏，在4°C的条 件下用高速组织捣碎机捣碎，1500rpm捣碎3次，每次3min，制得猪脾脏勻浆液；@丨将猪脾脏勻浆液进行超声波(4KW、3KHz)处理5min，在-60°C快速冷冻，水浴30°C融
化，交替冻融4次，每次融化后都用组织勻浆高速勻浆粉碎；然后加入2倍体积的冰冻生理 盐水，5000r/min 4°C离心20min，取上层血红色的液体，再用G2的砂心漏斗过滤，取滤液；
f)将滤液用0. 1%盐酸调pH值至5. 0，能够有效的去除杂蛋白，使离心后的上清液更
纯；上清液先用0. 2μπι中空纤维柱过滤，能够有效的保障转移因子的纯净性和活性，同时 缩短了制备时间；滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液， 将所得的滤液用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤，即得到抗鸭1型病毒性肝炎转移因子提取液。实施例2
本实施例采用鸭1型病毒性肝炎为例，制备抗鸭病毒性肝炎转移因子，该方法的步骤 如下
1)鸭肝炎病毒抗原的制备将鸭1型病毒性肝炎接种于9日龄的鸡胚尿囊腔中进行 增殖，35 V，培养84h，取鸡胚尿囊液，装入经灭菌消毒的离心管中内，用超声波超声IOmin (50Hz),5000rpm/min离心20min，弃去沉淀取上清，得到粗病毒抗原；
2)病毒抗原的提取在离心管中依次小心铺设20%、30%、45%、60%4个梯度的蔗糖溶 液，每一个梯度蔗糖溶液为1ml，最后在溶液液面上加粗抗原0. 2ml,经40000r/min离心 2. 5h，在第二层有一病毒带，小心吸出，透析去蔗糖得到病毒抗原；
3)鸭1型病毒性肝炎抗原免疫猪挑选健康免疫猪，用上述提取的病毒抗原进行皮下 多点注射免疫，共免疫4次，每次免疫间隔一周，最后一次免疫8天后取猪静脉血，用ELISA 方法或者免疫荧光方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后宰杀 动物，取脾脏置于-20°C保存待用；
4)从免疫猪中提取抗鸭瘟转移因子
①:+将免疫猪的脾脏除去表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗，然后将脾脏剪
碎，加入3倍体积的生理盐水，采用生理盐水能够防止转移因子的活性被破坏，在6°C的条 件下用高速组织捣碎机捣碎，2500rpm捣碎4次，每次4min，制得猪脾脏勻浆液；
将猪脾脏勻浆液进行超声波(4KW、3KHz)处理7min，在-70°C快速冷冻，水浴35°C融
化，交替冻融5次，每次融化后都用组织勻浆高速勻浆粉碎；然后加入2倍体积的冰冻生理 盐水，5000r/min 4°C离心20min，取上层血红色的液体，再用G2的砂心漏斗过滤，取滤液； 将滤液用0. 1%盐酸调pH值至5. 5，能够有效的去除杂蛋白，使离心后的上清液更
纯；上清液先用0. 2μπι中空纤维柱过滤，能够有效的保障转移因子的纯净性和活性，同时 缩短了制备时间；滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液， 将所得的滤液用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤，即得到抗鸭1型病毒性肝炎转移因子提取液。实施例3
本实施例采用鸭1型病毒性肝炎为例，制备抗鸭病毒性肝炎转移因子，该方法的步骤 如下1)鸭肝炎病毒抗原的制备将鸭1型病毒性肝炎接种于10日龄的鸡胚尿囊腔中进行 增殖，370C，培养96h，取鸡胚尿囊液，装入经灭菌消毒的离心管中内，用超声波超声IOmin (50Hz),5000rpm/min离心20min，弃去沉淀取上清，得到粗病毒抗原；
2)病毒抗原的提取在离心管中依次小心铺设25%、45%、55%、65%4个梯度的蔗糖溶 液，每一个梯度蔗糖溶液为1ml，最后在溶液液面上加粗抗原0. 2ml，经40000r/min离心 2. 5h，在第二层有一病毒带，小心吸出，透析去蔗糖得到病毒抗原；
3)鸭1型病毒性肝炎抗原免疫猪挑选健康免疫猪，用上述提取的病毒抗原进行皮下 多点注射免疫，共免疫4次，每次免疫间隔一周，最后一次免疫10天后取猪静脉血，用ELISA 方法或者免疫荧光方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后宰杀 动物，取脾脏置于-20°C保存待用；
4)从免疫猪中提取抗鸭瘟转移因子
(!)将免疫猪的脾脏除去表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗，然后将脾脏剪
碎，加入4倍体积的生理盐水，采用生理盐水能够防止转移因子的活性被破坏，在2°C的条 件下用高速组织捣碎机捣碎，3000rpm捣碎5次，每次5min，制得猪脾脏勻浆液；
②将猪脾脏勻浆液进行超声波(4KW、3KHz)处理lOmin，在-80°C快速冷冻，水浴37°C
融化，交替冻融6次，每次融化后都用组织勻浆高速勻浆粉碎；然后加入2倍体积的冰冻生 理盐水，5000r/min 4°C离心20min，取上层血红色的液体，再用G2的砂心漏斗过滤，取滤 液；
i)将滤液用0. 1%盐酸调PH值至6. 0，能够有效的去除杂蛋白，使离心后的上清液更
纯；上清液先用0. 2μπι中空纤维柱过滤，能够有效的保障转移因子的纯净性和活性，同时 缩短了制备时间；滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液， 将所得的滤液用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤，即得到抗鸭1型病毒性肝炎转移因子提取液。实验例1 动物保护试验
实施1动物保护实验取2000只7日龄的雏鸭，分为实验组和对照组，每组各1000只。 攻毒剂量为1. OX IO7CFU/只，攻毒后第3天实验组注射抗鸭病毒性肝炎转移因子，每只肌 肉注射0. Iml每日1次，对照组注射等量蒸馏水，观察雏鸭的的症状，连续观察5天，以精神 状况和死亡率为指标来反映抗鸭病毒性肝炎转移因子的治疗效果。结果显示对照组注射 等量蒸馏水的雏鸭100%死亡，注射抗鸭病毒性肝炎转移因子死亡率在8. 1%。实施2动物保护实验取200只7日龄的雏鸭，分为实验组和对照组，每组各100 只。攻毒剂量为LOXIO7CFU/只，攻毒后第3天实验组注射抗鸭病毒性肝炎转移因子，每 只肌肉注射0. Iml每日1次，对照组注射等量蒸馏水，观察雏鸭的的症状，连续观察5天，以 精神状况和死亡率为指标来反映抗鸭病毒性肝炎转移因子的治疗效果。结果显示对照组 注射等量蒸馏水的雏鸭100%死亡，注射抗鸭病毒性肝炎转移因子死亡在率8. 0%。实施2动物保护实验取200只7日龄的雏鸭，分为实验组和对照组，每组各100 只。攻毒剂量为LOXIO7CFU/只，攻毒后第3天实验组注射抗鸭病毒性肝炎转移因子，每 只肌肉注射0. Iml每日1次，对照组注射等量蒸馏水，观察雏鸭的的症状，连续观察5天，以精神状况和死亡率为指标来反映抗鸭病毒性肝炎转移因子的治疗效果。结果显示对照组 注射等量蒸馏水的雏鸭100%死亡，注射抗鸭病毒性肝炎转移因子死亡在8. 0%。实验例2
本实验例采用各种常规方法对本发明的抗鸭病毒性肝炎转移因子进行检测 1、紫外线分光光度测定本品在250. 0-252. Onm处有一高吸收峰，且ABS260/ABS280>
2. 0。2、标注液为淡黄色，pH值在6. 0-6. 5之间。3、细菌学检测本品种无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。4、20%磺基水杨酸检测本品无浑浊鸡沉淀现象，说明蛋白反应均为阴性，其不含 大蛋白分子。5、多肽含量的测定本品经双缩脲法测定多肽含量为1. 530mg/ml。6、核酸含量的测定本品经地衣酚法测定核酸含量为596. 89 μ g/ml。7、E-玫瑰花结形成率比较鸭外周血淋巴细胞表面有鼠红细胞受体，并能与之结 合形成E-玫瑰花结。而转移因子对淋巴细胞和大鼠红细胞的结合有一定的促进作用。本 品的E-玫瑰花结形成率平均为30. 1%，比对照组的增加24. 6% (P ( 0. 01)。8、安全检验取健康小白鼠200只，分为正常组和免疫组2组，正常组让其口服蒸 馏水，免疫组让其口服本品浓缩液(相当于正常口服剂量的50倍)，观察小鼠的变化，结果 免疫组100%的存活，且无任何毒、过敏反应，死亡情况，说明本品是安全的，无任何毒性和 副作用。9、用鸭病毒性肝炎抗原做皮试实验检测，有微弱的阳性反应，说明本品具有良好 的转移活性和特异性。通过以上实验例，我们可以看到所提取的抗鸭病毒性肝炎病转移因子可以安全有 效的抑制鸭病毒性肝炎病毒，能够保护正常的机体细胞免受鸭病毒性肝炎的感染。使用本 发明的转移因子可以预防鸭病毒性肝炎的发生。
权利要求
一种抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，其特征在于将鸭病毒性肝炎接种与鸡胚尿囊腔中进行增殖，从中提取病毒抗原；然后将提取的病毒抗原在健康猪机体上进行免疫，再从免疫猪的脾脏上提取得到抗鸭病毒性肝炎转移因子。
2.根据权利要求1所述的抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，其特征在于其具体 步骤如下1)鸭肝炎病毒抗原的制备将鸭病毒性肝炎接种于9日龄-10日龄的鸡胚尿囊腔中进 行增殖，33-370C，培养72-96h，取鸡胚尿囊液，装入经灭菌消毒的离心管中内，超声波处理 后离心，弃去沉淀取上清，得到粗病毒抗原；2)病毒抗原的提取在离心管中依次小心铺设20%-66%不同浓度梯度的蔗糖溶液，然 后在溶液液面上加粗抗原，粗抗原的加入量为每个梯度蔗糖溶液体积的20%，经离心处理， 小心吸出在蔗糖梯度层中出现的病毒带，透析除去蔗糖得到病毒抗原；3)病毒抗原免疫猪挑选健康免疫猪，用上述提取的病毒抗原进行皮下多点注射免疫， 免疫至少4次，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后，取脾脏冷冻保存待用；4)从免疫猪的脾脏中提取抗鸭病毒性肝炎转移因子++ :将免疫猪的脾脏除去表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗，然后将脾脏剪 碎，加入2倍-4倍体积的生理盐水，在低于10°C的条件下用高速组织捣碎机捣碎制得猪脾 脏勻浆液；艺将猪脾脏勻浆液进行超声波处理，在-60°C -80°C快速冷冻，水浴30°C _37°C融化，交 替冻融4 6次，每次融化后都用组织勻浆高速勻浆粉碎；然后加入2倍体积的冰冻生理盐 水，离心取上层血红色的液体，再用砂心漏斗过滤，取滤液；S将滤液用盐酸调PH值至5. 0-6. 0，上清液先用0. 2 μ m中空纤维柱过滤，滤出液再用 截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液，将所得的滤液用0. 22 μ m滤膜 进行无菌过滤，即得到抗鸭病毒性肝炎转移因子。
3.根据权利要求2所述的抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，其特征在于步骤2) 所述蔗糖溶液分为4个递增的蔗糖浓度梯度，分别为20-25%，30-45%，40-55%，60-66%。
4.根据权利要求2所述的抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，其特征在于步骤3) 所述取免疫猪脾脏之前，取免疫猪静脉血，用ELISA方法或者免疫荧光方法检测静脉血的 病毒特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，再取免疫猪脾脏。
全文摘要
本发明公开了一种抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，将鸭病毒性肝炎接种与鸡胚尿囊腔中进行增殖，从中提取病毒抗原；然后将提取的病毒抗原在健康猪机体上进行免疫，再从免疫猪的脾脏上提取得到抗鸭病毒性肝炎转移因子。本发明采用鸭病毒性肝炎病毒提取特异性转移因子，该转移因子能够有效的抑制鸭病毒性肝炎病毒，能够保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎病毒的感染，从根本上预防鸭病毒性肝炎的发生。另外，本发明的制备方法简单易行，生产时间短，成本低，具有很好的应用前景。
文档编号C07K16/08GK101953849SQ20101051166
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者吴红云, 李建正, 韩改会 申请人:郑州后羿制药有限公司