专利名称：可降解梭菌毒素的制作方法
可降解梭菌毒素本申请要求2010年5月20日提交的美国临时专利申请号61/346，578的权益，所述专利申请的整个公开内容以此特别引用的方式并入本文。诸如肉毒杆菌神经毒素(Botulinumneurotoxin, BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F 和 BoNT/G 以及破伤风神经毒素(Tetanus neurotoxin, TeNT)等梭菌毒素抑制神经元传递的能力正在广泛多种治疗及美容应用中得到利用，参见例如William J.Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack
公司，2004)。可以药用组合物形式商购获得的梭菌毒素包括BoNT/A制剂，诸如BO'iOX"(Allergan 公司，Irvine, CA)、L)YSP()RT:VRLLOX丨N(Beaufour Ipsen, PortonDown, England)、NEURONOX* (Medy-Τοχ 公司，Ochang-myeon, South Korea)、BTX-A(中国兰州生物制品研究所(Lanzhou Institute Biological Products, China))和XF.0MTN (Merz Pharmaceuticals 股份有限公司，Frankfurt, Germany);以及 BoNT/B 制剂，诸如 MY0BL0CTM/NEUR0BL0CTM(Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA)。举例来说，BOIOX'当前在一个或多个国家被批准用于以下适应症:弛缓不能(achalasia)、成人疫挛(adult spasticity)、肛裂(anal fissure)、背痛、眼睑疫挛(blepharospasm)、夜间磨牙(bruxism)、颈肌张力障碍(cervical dystonia)、原发性震颤、眉间皱纹或运动过度性面部皱纹、头痛、半面痉挛、膀胱机能亢进、多汗、青少年脑性麻痹、多发性硬化症、肌阵挛病症、鼻唇皱纹、疫挛性发声困难(spasmodic dysphonia)、斜视以及VII型神经病症。梭菌毒素治疗剂通过破坏用于将神经递质分泌至突触间隙中的胞外分泌过程来抑制神经递质释放。制药工业对使梭菌毒素疗法的用途扩展超出其当前肌肉弛缓应用以治疗感觉神经型疾病(诸如各种慢性疼痛、神经性炎症和泌尿生殖病症)以及其它病症(诸如胰腺炎)存在极大需要。一种当前正用于扩展基于梭菌毒素的疗法的方法涉及修饰梭菌毒素以使经过修饰的毒素对非梭菌毒素靶细胞的细胞靶向能力改变。此再靶向能力是通过将梭菌毒素的天然存在的靶向结构域置换为对非梭菌毒素靶细胞中存在的非梭菌毒素受体显示优先结合活性的靶向结构域来达成的。对靶向结构域的所述修饰产生称为靶向囊泡胞外分泌调节蛋白(TVEMP)的梭菌毒素嵌合体，其能够选择性结合非梭菌毒素靶细胞(再靶向)上存在的非梭菌毒素受体(靶受体)。对非梭菌毒素靶细胞具有靶向活性的梭菌毒素嵌合体可结合非梭菌毒素靶细胞上存在的受体，移位至细胞质中，且对非梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物施加其蛋白水解作用。梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体疗法成功用于许多适应症。通常，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的施用良好耐受。然而，在一些应用中施用可能由于为达成有益效果需要较大剂量而具有挑战性。较大剂量可增加毒素或梭菌毒素嵌合体可能通过身体的间质液和循环系统(诸如心血管系统和 淋巴系统)移动的可能性，从而导致毒素或梭菌毒素嵌合体不当散布至不为治疗所靶向的区。所述散布可导致不当副作用，诸如抑制不为毒素治疗所靶向的神经元中的神经递质释放或麻痹不为治疗所靶向的肌肉。举例来说，针对斜颈向颈部肌肉中施用治疗有效量的BoNT/A治疗剂的患者可能由于毒素散布至口咽中而发生吞咽困难。因此，对在治疗部位处有效，但在不为毒素治疗所靶向的区中具有可忽略至最低限度作用的改进的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体仍然存在需要。在需要较大剂量的疗法中，梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体的临床、治疗和美容使用日益增长使得制药工业有必要开发在用药的靶部位处有效，但减少或防止与毒素散布至不希望的位置相关的可能副作用的修饰梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体。本说明书提供减少或防止与毒素散布至非靶向区中相关的不希望的副作用的新颖修饰梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体。这些和相关优势适用于各种临床、治疗和美容应用，诸如治疗神经肌肉病症、神经病症、眼部病症、疼痛、肌肉损伤、头痛、心血管疾病、神经精神病症、内分泌病症、癌症、耳部病症和运动过度性面部皱纹、以及向哺乳动物施用梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可以产生有益效果的其它病症。附图简述
图1示出中枢和周边神经元中神经递质释放和梭菌毒素中毒的当前范式的示意图。图1A示出中枢和周边神经元的神经递质释放机制的示意图。释放过程可描述成包括两个步骤:1)囊泡对接，其中含有神经递质分子的囊泡的囊泡结合SNARE蛋白与位于质膜处的膜结合SNARE蛋白缔合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜融合且神经递质分子分泌至胞外。图1B示出中枢和周边神经元中破伤风和肉毒杆菌毒素活性的中毒机制的示意图。此中毒过程可描述成包括四个步骤:1)受体结合，其中梭菌毒素结合梭菌受体系统且起始中毒过程；2)复合物内化，其中在毒素结合之后，含有毒素/受体系统复合物的囊泡被胞吞至细胞中；3)轻链移位，其中认为发生多个事件，包括例如囊泡的内部pH改变，形成包含梭菌毒素重链的HN结构域的通道孔，梭菌毒素轻链与重链分离，和释放活性轻链，以及4)酶促靶标修饰，其中梭菌毒素的活化轻链对其靶SNARE底物进行蛋白水解裂解，诸如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白(Syntaxin)，由此阻止囊泡对接和神经递质释放。图2示出天然存在的梭菌毒素的结构域组构。单链形式描绘包含酶促结构域、移位结构域和结合结构域的氨基至羧基线性组构。位于移位结构域与酶促结构域之间的双链环区由双SS方括号描绘。此 区包含内源性双链环蛋白酶裂解位点，其在被天然存在的蛋白酶(诸如内源性梭菌毒素蛋白酶)或在环境中产生的天然存在的蛋白酶蛋白水解裂解后使毒素的单链形式转化成双链形式。在单链形式上方，描绘梭菌毒素结合结构域的H。。区。此区包含β三叶形结构域，其以氨基至羧基线性组构包含α折叠、β4/β5发夹转角、β折叠、β 8/ β 9发夹转角和Y折叠。图3示出结合结构域位于毒素的氨基端上的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。图3Α描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单链多肽形式，所述线性组构包含结合元件、移位元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、和治疗元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图3Β描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含结合元件、治疗元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区和移位元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图4示出结合结构域位于毒素的氨基端上的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。图4Α描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含治疗元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、结合元件和移位元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图4Β描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含移位元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、结合元件和治疗元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图4C描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含治疗元件、结合元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区和移位元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图4D描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含移位元件、结合元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区和治疗元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图5示出结合结构域位于毒素的氨基端上的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。图5A描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含治疗元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、移位元件和结合元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素的单链形式转化成双链形式。图5B描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含移位元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、治疗元件和结合元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。详细描述本说明书公开可通过利用存在于间质液和循环系统(诸如心血管系统和淋巴系统)中的蛋白酶的存在而自不希望的位置快速失活的修饰梭菌毒素和修饰梭菌毒素嵌合体。这是因为本说明书中公开的修饰梭菌毒素和修饰梭菌毒素嵌合体包含存在于间质液和/或循环系统中的蛋白酶的蛋白酶裂解位点。所述蛋白酶裂解位点的存在使修饰梭菌毒素或修饰梭菌毒素嵌合体易受其同源蛋白酶进行蛋白水解裂解，这会使所述修饰毒素失活。举例来说，在经过修饰以包含细胞外基质蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体已扩散至间质液中的情形下， 此修饰毒素或修饰梭菌毒素嵌合体可由同源细胞外基质蛋白酶有效裂解。作为另一实例，在经过修饰以包含血液蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体已扩散至心血管系统中的情形下，此修饰毒素或修饰梭菌毒素嵌合体可由同源血液蛋白酶有效裂解。作为另一实例，在经过修饰以包含淋巴蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体已扩散至淋巴系统中的情形下，此修饰毒素或修饰梭菌毒素嵌合体可由同源淋巴蛋白酶有效裂解。因此，利用包含存在于间质液和/或循环系统中的蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体将自不希望的位置减少或移除所述梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，由此减少或防止与梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体扩散至不希望的位置相关的不当副作用。因此，本说明书的多个方面提供一种包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点的梭菌毒素，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域或Hcn结合亚结构域中。所述公开的毒素可包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、梭菌毒素结合结构域、包含外源性蛋白酶裂解位点的双链环区、和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点。失活裂解位点的非限制性实例包括凝血酶(Thrombin)裂解位点、纤溶酶(Plasmin)裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血衆激肽释放酶(plasma kallikrein)裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1 (PARl)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase) _2 (MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶(Furin)裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(urokinase-typePlasminogen activator, uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tissue-type Plasminogen activator, tPA)裂解位点、类胰蛋白酶(Tryptase)-ε 裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位点、内皮素(endothelin)转化酶-1 (ECE-1)裂解位点、凯尔血型(Kell b10dgroup)裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白(thrombospondin) I型基序的ADAM金属肽酶-13 (ADAMTS13)裂解位点、和组织蛋白酶L (Cathepsin L)裂解位点。相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，添加失活裂解位点会增加梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限。本说明书的其它方面提供一种包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点的梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域或H。,结合亚结构域中。所述公开的毒素可包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、包含外源性蛋白酶裂解位点的双链环区、和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点。失活裂解位点的非限制性实例包括凝血酶裂解位点、纤 溶酶裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血浆激肽释放酶裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1 (PARl)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶_9 (MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tPA)裂解位点、类胰蛋白酶-ε裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶_7(mMCP-7)裂解位点、内皮素转化酶-1 (ECE-1)裂解位点、凯尔血型裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白I型基序的ADAM金属肽酶-13 (ADAMTS13)裂解位点、和组织蛋白酶L裂解位点。相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，添加失活裂解位点会增加梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限。本说明书的其它方面提供编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子。编码所述梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子可更包含表达载体。本说明书的其它方面提供一种包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的组合物。包含所述梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的组合物可为药用组合物。除本说明书中公开的修饰梭菌毒素之外，所述药用组合物还可以包含药用载剂、药用组分或两者。本说明书的其它方面提供一种产生本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的方法，所述方法包括在细胞中表达编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子的步骤，其中所述多核苷酸分子的表达产生所编码的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。在其它方面，方法包括将编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子引入细胞中，和表达所述多核苷酸分子的步骤，其中所述多核苷酸分子的表达产生所编码的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)产生的梭菌毒素在人和其它哺乳动物的治疗性和美容性治疗中使用最广泛。肉毒梭菌菌株产生七种抗原类型不同的肉毒杆菌毒素(BoNT)，其已通过研究肉毒杆菌毒素中毒暴发而在人(BoNT/A、/B、/E和/F)、动物(BoNT/Cl和/D)中鉴定出来，或自土壤分离(BoNT/G)。BoNT彼此具有约35%的氨基酸一致性且共享相同的功能性结构域组构和总体结构构造。本领域技术人员应认识到在梭菌毒素的各类型内，可存在亚型，所述亚型在它们的氨基酸序列方面以及在编码这些蛋白质的核酸方面多少有些不同。举例来说，目前存在五种BoNT/A亚型BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其中当与BoNT/A亚型SEQ ID NO:1相比较时，特定亚型显示约84%至93%的氨基酸一致性。作为另一实例，目前存在五种BoNT/B亚型ΒοΝΤ/Β1、ΒοΝΤ/B2、BoNT/B3、BoNT/Bnp 和 BoNT/Bbv，其中当与 BoNT/B 亚型 SEQ ID NO:6 相比较时，特定亚型显示约93%至96%的氨基酸一致性。作为另一实例，目前存在三种BoNT/E亚型BoNT/El、BoNT/E2和BoNT/E3，其中当与BoNT/E亚型SEQ ID NO: 15相比较时，特定亚型显示约95%至99%的氨基酸一致性。尽管所有七种BoNT血清型皆具有类似的结构和药理学性质，但各自也显示异质细菌学特征。相反，破伤风毒素(TeNT)由一组统一的破伤风梭菌产生。两个其它梭菌物种巴氏梭菌和丁酸梭菌产生分别类似于BoNT/F和BoNT/E的毒素BaNT和BuNT。梭菌毒素各自翻译成约150kDa的单链多肽，其随后在二硫环内通过由天然存在的蛋白酶进行蛋白水解剪切而裂解(图1)。此裂解发生在于形成二硫桥键的两个半胱氨酸残基之间产生的离散双链环区内。此翻译后加工产生双链分子，所述双链分子包含通过单一二硫键和两条链之间的非共价相互作用保持在一起的约50kDa轻链(LC)和约IOOkDa重链(HC)。用于将单链分子转化成双链的天然存在的蛋白酶当前未知。在诸如BoNT/A等一些血清型中，天然存在的蛋白酶由细菌血清型内源性产生且裂解在毒素释放至环境中之前在细胞内发生。然而，在诸如BoNT/E等其它血清型中，细菌菌株似乎不产生能够将毒素的单链形式转化成双链形式的内源性蛋白酶。在这些情形下，毒素以单链毒素形式自细胞释放，其随后由存在于环境中的天然存在的蛋白酶转化成双链形式。各成熟双链分子包含三个功能上不同的结构域:1)位于LC中的包括含有锌依赖性肽链内切酶活性的金属蛋白酶区的酶促结构域，其特异性靶向神经递质释放机构的核心组分；2)含于HC的氨基端半部(Hn)内的促进LC自细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中的移位结构域；和3)存在于HC的羧基端半部(Hc)内的决定毒素对位于靶细胞的表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性的结合结构域。D.B.Lacy和R.C.Stevens, SequenceHomology and Structural Analysis of theClostridial Neurotoxins, J.Mol.Biol.291:1091-1104(1999)。H。结构域包含大小大致相等 的由α螺旋分开的两个不同结构特征，称为Hcm和H。。亚结构域。表I给出存在于示例性梭菌毒素中的各结构域和亚结构域的大致边界区。
权利要求
1.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含至少一个位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或Hcn结合亚结构域中，其中所述至少一个失活裂解位点包含双重凝血酶-凝血酶位点、因子Xa位点、双重因子Xa-凝血酶位点和/或MMP-9位点。
2.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、梭菌毒素结合结构域、双链环区、外源性蛋白酶裂解位点和至少两个位于失活裂解位点区内的失活裂解位点；其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内。
3.如权利要求2所述的梭菌毒素，其中所述失活裂解位点包含双重凝血酶-凝血酶位点和/或双重因子Xa-凝血酶位点。
4.一种梭菌毒素嵌合体，所述梭菌毒素嵌合体包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
5.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:5 的氨基酸462-496 ;SEQID NO:3 的氨基酸 458-492 ;SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9 和 / 或SEQ ID NO: 10 的氨基酸 464-487 ；SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 463-496 ；SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 458-491 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 434-467 ;SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19 和 / 或 SEQ ID NO: 20 的氨基酸 453-486 ;SEQ ID NO: 21 的氨基酸 458-491 ;SEQ ID NO: 23 的氨基酸 443-476 ;和 /或 SEQ ID NO: 24 和 / 或 SE Q ID NO: 25 的氨基酸 434-467。
6.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID N0:USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:5 的氨基酸618-634 ;SEQID NO:3 的氨基酸 614-630 ;SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9 和 / 或SEQ ID NO: 10 的氨基酸 605-621 ;SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 613-629 ;SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 609-625 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 587-603 ;SEQ ID NO: 18 的氨基酸 604-620 ;SEQ ID NO: 19 和 /或 SEQ ID NO: 20 的氨基酸 605-621 ；SEQ ID NO: 21 的氨基酸 610-626 ；SEQ ID NO: 23 的氨基酸 596-612 ;和 / 或 SEQ ID NO:24 和 / 或 SEQ ID NO:25 的氨基酸 587-603。
7.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4 和 / 或 SEQ ID NO:5 的氨基酸 638-651 ;SEQ ID NO:3 的氨基酸634-647 ;SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9和/或 SEQ ID NO: 10 的氨基酸 625-638 ;SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ IDNO: 12 的氨基酸 633-646 ;SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 629-642 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 607-620 ；SEQ ID NO: 18 的氨基酸 624-637 ；SEQ ID NO: 19 和 /或 SEQ ID NO: 20 的氨基酸 625-638 ；SEQ ID NO: 21 的氨基酸 630-643 ；SEQ ID NO: 23 的氨基酸 616-629 ;和/或 SEQ ID NO: 24 和 / 或 SEQ ID NO: 25 的氨基酸 607-620。
8.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID N0:USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:5 的氨基酸665-687 ;SEQID NO:3 的氨基酸 661-683 ;SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9 和 / 或SEQ ID NO: 10 的氨基酸 652-674 ;SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 660-682 ;SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 656-678 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 634-659 ;SEQ ID NO: 18 的氨基酸 651-676 ;SEQ ID NO: 19 和 /或 SEQ ID NO: 20 的氨基酸 652-677 ；SEQ ID NO: 21 的氨基酸 657-679 ；SEQ ID NO: 23 的氨基酸 643-668 ;和 / 或 SEQ ID NO: 24 和 / 或 SEQ ID NO: 25 的氨基酸 634-659。
9.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5 的氨基酸752-765 ;SEQID NO:3 的氨基酸 748-761 ；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 / 或SEQ ID NO: 10 的氨基酸 739-752 ；SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 747-760 ；SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 743-756 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 724-739 ;SEQ ID NO: 18 的氨基酸 741-756 ;SEQ ID NO: 19 和 /或 SEQ ID NO:20 的氨基酸 742-757 ；SEQ ID NO:21 的氨基酸 744-757 ；SEQ ID NO:23 的氨基酸 733-748 ;和 / 或 SEQ ID NO:24 和 / 或 SEQ ID NO:25 的氨基酸 724-739。
10.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:5 的氨基酸826-835 ;SEQID NO:3 的氨基酸 824-831 ；SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9 和 / 或SEQ ID NO: 10 的氨基酸 813-824 ;SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 821-830 ;SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 817-826 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 800-809 ;SEQ ID NO: 18 的氨基酸 817-826 ;SEQ ID NO: 19 和 /或 SEQ ID NO: 20 的氨基酸 818-827 ；SEQ ID NO: 21 的氨基酸 818-827 ；SEQ ID NO: 23 的氨基酸 809-819 ;和 / 或 SEQ ID NO: 24 和 / 或 SEQ ID NO: 25 的氨基酸 800-809。
11.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID N0:USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:5 的氨基酸844-863 ;SEQID NO:3 的氨基酸 840-859 ;SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9 和 / 或SEQ ID NO: 10 的氨基酸 831-850 ;SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 839-858 ;SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 835-854 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 818-837 ;SEQ ID NO: 18 的氨基酸 835-854 ;SEQ ID NO: 19 和 /或 SEQ ID NO: 20 的氨基酸 836-855 ；SEQ ID NO: 21 的氨基酸 836-855 ；SEQ ID NO: 23 的氨基酸 828-847 ;和/或 SEQ ID NO: 24 和 / 或 SEQ ID NO: 25 的氨基酸 818-837。
12.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID N0:USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:5 的氨基酸871-895 ;SEQID NO:3 的氨基酸 867-891 ；SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9 和 / 或SEQ ID NO: 10 的氨基酸 858-882 ;SEQ ID NO: 11 和 / 或 SEQ ID NO: 12 的氨基酸 866-890 ;SEQ ID NO: 13 和 / 或 SEQ ID NO: 14 的氨基酸 862-886 ;SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 /或 SEQ ID NO: 17 的氨基酸 845-869 ；SEQ ID NO: 18 的氨基酸 862-886 ；SEQ ID NO: 19 和 /或 SEQ ID NO: 20 的氨基酸 863-887 ；SEQ ID NO: 21 的氨基酸 863-887 ；SEQ ID NO: 23 的氨基酸 855-879 ;和/或 SEQ ID NO: 24 和 / 或 SEQ ID NO: 25 的氨基酸 845-869。
13.如权利要求1至12所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/Cl酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、BaNT酶促结构域和/或BuNT酶促结构域。
14.如权利要求1至13所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点包含凝血酶裂解位点、纤溶酶裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血浆激肽释放酶裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1 (PARl)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶_2 (MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶_9 (MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tPA)裂解位点、类胰蛋白酶-ε裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶_7(mMCP-7)裂解位点、内皮素转化酶-1 (ECE-1)裂解位点、凯尔血型裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白I型基序的ADAM金属肽酶-13 (ADAMTS13)裂解位点和/或组织蛋白酶L裂解位点。
15.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含SEQ ID N0:531、SEQ ID NO:533,SEQ ID NO:535和 / 或 SEQ I D NO:537。
全文摘要
本发明公开包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体、编码所述毒素或嵌合体的多核苷酸分子、包含所述毒素或嵌合体的组合物和产生所述毒素或嵌合体的方法。
文档编号C07K14/33GK103228286SQ201180035613
公开日2013年7月31日 申请日期2011年5月19日 优先权日2010年5月20日
发明者L·E·斯图尔德, S·甘沙尼, E·费尔南德斯-萨拉斯, M·A·吉尔摩, J·弗朗西斯, K·R·青木 申请人:阿勒根公司