专利名称：一种三聚氰胺抗原、相关抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药、试剂等技术领域，具体地说是涉及ー种抗原、相关抗体及其制备方法，更具体地说是涉及ー种三聚氰胺抗原、相关抗体及其制备方法，再具体地说是涉及一种含有多醛葡聚糖连接载体蛋白的三聚氰胺抗原、相关抗体及其制备方法。
背景技术：
(一 )三聚氰胺概述I、理化性质三聚氰胺(melamine)简称三胺、蛋白精，学名三氨三嗪,别名密胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是ー种三嗪类含氮杂环有机化合物，IUPAC命名为“ 1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基”， CAS :08-78-1，分子量126. 12，分子式见左
权利要求
1.一种三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原是PAD-载体蛋白复合体与三聚氰胺用还原剂还原反应后得到的； 所述的PAD-载体蛋白复合体与三聚氰胺的质量投料比为20 : I I : I。
2.根据权利要求I所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的PAD-载体蛋白复合体与三聚氰胺的质量投料比为15 : I 2 : I
3.根据权利要求2所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的PAD-载体蛋白复合体与三聚氰胺的质量投料比10 : I 2 : I。
4.根据权利要求I所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的还原剂是包括三氢硼氰化钠或钠硼氢中的一种或多种。
5.根据权利要求I所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的PAD-载体蛋白复合体是PAD连接载体蛋白后，再用还原剂还原后得到的； 所述的PAD与载体蛋白的质量投料比为1 : 5 5 : I。
6.根据权利要求5所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的PAD与载体蛋白的质量投料比为I : 2 2 : I。
7.根据权利要求5所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的还原剂是包括可为三氢硼氰化钠或钠硼氢中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的载体蛋白是包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白、钥孔血蓝蛋白、匙孔血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种或多种；
9.根据权利要求8所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的载体蛋白是包括牛血清白蛋白、卵清蛋白或匙孔血蓝蛋白中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的载体蛋白是牛血清白蛋白。
11.根据权利要求5所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的PAD连接载体蛋白是PAD上生成的醛基同载体蛋白上的氨基连接，生成Shiff氏碱，再用还原剂还原后生成PAD-载体蛋白复合体,其中n = 100 500,具体反应如下
12.根据权利要求11所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的PAD是通过葡聚糖与高碘酸盐反应得到的； 所述的葡聚糖原料分子量优选为2 10W。
13.根据权利要求11所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的PAD是通过葡聚糖与高碘酸钠反应得到的，其中n = 100 500，具体反应如下
14.根据权利要求1、4、5、8或11任一项所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原是反应所得的复合体经透析分离后得到纯品的。
15.根据权利要求1、4、5、8或11任一项所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原是通过以下反应得到的，其中n = 100 500
16.根据权利要求1、4、5、8或11任一项所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原的制备方法包括如下步骤 (1)PAD与载体蛋白反应，生成一种醛基糖-载体蛋白的复合物； (2)利用PAD-载体蛋白复合物上的醛基，与三聚氰胺反应，生成三聚氰胺抗原； 所述的载体蛋白是包括匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一种或多种。
17.根据权利要求16所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的步骤(2)的具体操作如下 将三聚氰胺溶于20%的乙醇溶液，同PAD-载体蛋白复合体溶液混合，搅拌溶解,三氢硼氰化钠或钠硼氢还原，透析分离，得到三聚氰胺小分子抗原。
18.根据权利要求1、4、5、8或11任一项所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原相关抗体的制备方法包括如下步骤 (1)小鼠免疫； (2)细胞融合； (3)杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆； (4)单克隆抗体腹水制备及纯化。
19.根据权利要求17所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原相关抗体的制备方法中的步骤(I)是采用常规方法免疫小鼠，操作如下 用三聚氰胺-PAD-载体蛋白偶联产物作为免疫原免疫小鼠，取三聚氰胺-PAD-载体蛋白与弗氏完全佐剂混合，小鼠腹腔注射；定期进行加强免疫，前几次加强免疫时取三聚氰胺-PAD-载体蛋白与弗氏不完全佐剂，小鼠腹腔注射三聚氰胺-PAD-载体蛋白抗原，最后一次免疫采用尾静脉注射，不加佐剂，若干天后取取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。
20.根据权利要求17所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原相关抗体的制备方法中的步骤(2)是依照常规方法进行细胞融合，操作如下 无菌环境下取免疫后小鼠的脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG3000作为融合剂的情况下进行细胞融合。
21.根据权利要求17所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原相关抗体的制备方法中的步骤(3)是包括如下三个步骤 ①阳性杂交瘤细胞的筛选采用间接ELISA方法来筛选阳性杂交瘤细胞。检测出阳性孔的细胞要及时进行亚克隆；检测出阴性孔的细胞，并对细胞上清再检测一次； ②阳性杂交瘤细胞的克隆利用有限稀释法对细胞进行亚克隆，对阳性较强、生长旺盛的融合细胞进行连续稀释并混匀，直至统计上每孔只含有I个细胞，然后铺制到细胞培养板内； ③阳性杂交瘤克隆株的冻存与复苏 A、阳性杂交瘤克隆株的冻存 将杂交瘤细胞移至离心管内，离心，弃上清液，加入冻存液，混匀后移至细胞冻存管内。然后将冻存管放入塞有棉花的小盒内，置于4°C，若干时间后取出放入-20°C冰箱内，再取出放入_80°C冰箱内，最后取出放入液氮罐中冻存； B、阳性杂交瘤克隆株的复苏 于液氮罐内冻存的杂交瘤细胞冻存管取出，马上置于37 40°C的水浴中，待细胞冻存物全部溶化后，离心，将上清弃掉。打散细胞团，向冻存管中加入含培养液，混匀，吸出转移到细胞培养瓶中，置培养箱中培养。若干时间后，对细胞进行换液，再继续培养； 本发明所述的杂交瘤细胞株保藏于液氮中。
22.根据权利要求17所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原相关抗体的制备方法中的步骤(4)是包括如下二个步骤 ①体内诱生腹水 取小鼠，腹腔注射石蜡油后备用。收集处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞，注射预处理的小鼠腹腔内； 注射后每天对小鼠的姿势、活力、进食、饮水、呼吸及机体状况进行观察。发现小鼠食饮欲明显减退、腹腔明显胀大、不愿走动等状况后，立即抽取小鼠腹水，离心，弃去脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，小量分装，_20°C冻存备用； ②腹水中单抗纯化采用辛酸硫酸铵沉淀法。
23.根据权利要求1、4、5、8或11任一项所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原、相关抗体用于制备三聚氰胺免疫检测试剂。
24.根据权利要求1、4、5、8或11任一项所述的三聚氰胺抗原，其特征在于，所述的该三聚氰胺抗原、相关抗体的组合物用于制备三聚氰胺免疫检测试剂。
全文摘要
本发明涉及一种三聚氰胺抗原、相关抗体及其制备方法。三聚氰胺和载体蛋白通过PAD作为桥梁试剂进行偶联，偶联产物免疫动物，制备可以用于检测三聚氰胺的单克隆抗体。本发明提供的人工制备三聚氰胺抗原及相关抗体可用于三聚氰胺免疫检测试剂的研制开发，来满足低成本、快捷、操作简便的检测要求。
文档编号C07K14/765GK102702345SQ20121014475
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者丁自更, 唐古生, 康蔡俊, 秦阳华, 赵卫国, 陈英豪 申请人:中国人民解放军第二军医大学