专利名称：去甲肾上腺素完全抗原的制备方法及偶联摩尔比测定方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，具体的是说一种去甲肾上腺素(以下简称NE)完全抗原的制备方法以及测定去甲肾上腺素完全抗原中NE与载体的偶联摩尔比的方法。
背景技术：
去甲肾上腺素(Norepinephrine,也称Noradrenaline,缩写NE或NA),旧称“正肾上腺素”，学名1_(3，4-二羟苯基)-2-氨基乙醇，是肾上腺素去掉N-甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。它既是一种神经递质，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌，是后者释放的主要递质；也是一种激素，由肾上腺髓质合成和分泌，但含量较少。多巴、多巴胺、肾上腺素与去甲肾上腺素等统称为儿茶酚胺类物质，它们都是由酪 氨酸衍生而来的系列物。儿茶酚胺作为神经递质和激素，与人们的健康与疾病有密切关系，它们不仅直接参与行为活动以及参与血压、心率、呼吸和睡眠等植物神经功能的调控，而且还与一些功能性疾病如神经分裂症、忧郁症以及器质性病变的出现有关。血浆及尿中儿茶酚胺的浓度水平可用于诊断高血压、嗜铬细胞瘤及成神经细胞瘤等病症，因而准确测定人体生物样品中儿茶酚胺类物质代谢浓度的变化，在疾病的诊断和治疗中具有重要的意义。目前，人体液和组织中儿茶酚胺类物质的不同分析方法，包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱法、电化学法、化学发光法、荧光光度法等。NE的免疫学检测方法不仅方法简便，成本低廉，不需要高精密的仪器，而且检测的灵敏度都不亚于高效液相色谱法；但建立高效免疫学检测方法的关键是需要高品质的抗体，高品质抗体的前提是制备免疫原型较强的完全抗原，而众所周知，NE是小分子结构，激发不了动物机体产生抗体，因此，研究人员需要提供一种简单可靠的方法，以获得一种能够高效激发动物机体产生抗体的完全抗原。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于NE的免疫学检测方法的免疫原型强的完全抗原。技术方案包括下述步骤，(I)将NE与载体分别溶于NaAc溶液中，分别制备NE溶液及载体溶液，然后将两者混合后加入甲醛溶液并调节PH值在6. 0 — 6. 5 (优选6)之间，4°C持续搅拌下进行偶联反应20 — 28小时(优选24小时)，得到反应混合液。(2)反应混合液通过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质，缓冲液采用pH为7. 2的0. OlM磷酸盐缓冲液(PBS)，得到偶联物。(3)按照步骤(I)和步骤(2)的方法，反应体系缺失NE，维持其他各反应条件不变的条件下，制得载体mannich对照。(4)采用紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、NE标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标上进行图形比对，在偶联物与载体mannich对照蛋白浓度相同的情况下，如果偶联物比载体mannich对照多出特征吸收峰，则判定偶联成功，即得到NE完全抗原。 所述步骤(I)中，所述载体为含有游离氨基的生物大分子，具体为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述步骤(I)中，将NE与载体分别溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分别制备34mmoL/L NE溶液和3. 4mmoL/L载体溶液，按照NE与载体摩尔比10-20 :1(优选10 :1)的比例，将NE溶液缓慢加入到载体溶液 中，缓慢滴加，边滴加边搅拌，混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以后，用I. 2mol/L NaAc溶液调节PH值在6. 0-6. 5之间，4°C持续搅拌，反应20 — 28小时，得到反应混合液。所述将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，滴加速度为1-2毫升/分，边滴加边搅拌，搅拌速度为100-150转/分。所述在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，搅拌速度为100-150转/分，滴加速度为1-2毫升/分。通过摩尔消光系数法计算NE完全抗原中NE与蛋白载体的偶联摩尔比，首先，采用紫外分光光度扫描得到NE完全抗原在200-500nm之间两个特征吸收峰为入I和X 2，其中入I为载体的特征吸收峰，X 2为NE完全抗原特有的吸收峰，公式如下[Ane完全抗原入i/ NE入2]/[( Ane完全抗原入「Ane完全抗原入2 X NEA l/ NE入2)/ 载体入J其中，Ane完全_ A2 NE完全抗原在\ 2的吸光度；Ane完全_ A1 NE完全抗原在\ I的吸光度；NEA2 :NE在入2处的摩尔消光系数；NEA1 :NE在入I处的摩尔消光系数；载体A2 :载体在入2处的摩尔消光系数；S#A1 :载体在入I处的摩尔消光系数。mannich法的原理是含有a -活泼氢的醛、酮与甲醛及胺(伯胺、仲胺或氨)反应，结果一个a -活泼氢被胺甲基取代，此反应又称为胺甲基化反应，所得产物称为Mannich碱(见图I)。发明人依据mannich法的原理和NE的结构特征,运用mannich法将NE与载体偶联，制备完全抗原(图2)。基于上述原理，进一步的，为了达到高效偶联，发明人对NE与载体的偶联工艺进行了设计，NE与载体摩尔比控制在10-20:1为好，过高则干扰偶联反应的动态平衡，后期去除也比较困难，过低则影响偶联效果和偶联的摩尔比；并且NE溶液和载体溶液的混合过程以缓慢滴加并配合搅拌的方式为好，这样可以避免反应物聚集沉淀问题的发生，同理，在NE溶液和载体溶液混合后，再在搅拌下缓慢滴加甲醛溶液，是为了防止三者同时混合而出现的局部反应不均匀的，造成反应产物聚集沉淀的问题。所述偶联反应应该在低温下进行，优选为4°C，且应该保持搅拌速度在100-150转/分。通过控制上述偶联反应的工艺条件，并且再经过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质(如未偶联上的NE、甲醛、NaAc等小分子物质)，从而达到纯化偶联物的目的，可以得到高纯度、高品质完全抗原，从而达到高效激发动物机体产生抗体的目的。所述超滤、透析或者脱盐柱法均为现有技术，具体方法可参见所使用具体产品的操作手册。紫外分光光度计能够快速准确的判定偶联是否成功，但出于希望制备高品质的完全抗原考虑，希望NE与载体的偶联比尽可能的高，此时就需要一种能够测定偶联物中NE与载体的偶联比的方法，发明人特别采用摩尔消光系数法计算NE与蛋白载体的偶联摩尔比，通过预先获得X I和X 2，再带入公式计算，即可得到偶联摩尔比。有益效果(I)本发明方法制备完全抗原步骤简单、方法易于操作，解决了小分子结构的NE难以制备完全抗原，无法激发动物机体产生抗体的问题。(2)由本发明方法制备得到的完全抗原品质高(偶联物的偶联尔摩尔比可达4:1以上),免疫动物后从而激发动物产生高品质的抗体。(3)可以明确鉴定完全抗原合成是否成功，并精确计算小分子与载体的偶联比，便于制备高品质抗体过程中的质量控制。
图l.Mannich反应原理示意图；图2.载体与去甲肾上腺素(NE)偶联示意图；图3.分光光度计连续波长扫描载体牛血清白蛋白(以下简称BSA)、BSA mannich对照、NE和NE完全抗原I (BSA — NE)在200_500nm之间吸收峰图；图4.分光光度计连续波长扫描载体卵清蛋白(以下简称OVA)、OVA mannich对 照、NE和NE完全抗原2 (0VA — NE)在200_500nm之间吸收峰图。
具体实施例方式实施例I :I NE与载体BSA偶联将NE与载体BSA分别溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分别制备34mmoL/L去NE溶液和3. 4mmol/L载体溶液，按照NE与载体摩尔比10-20 I的比例，将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，缓慢滴加，边滴加边搅拌(滴加速度1-2毫升/分，100-150转/分)，混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下缓慢滴加(滴加速度1-2毫升/分，100-150转/分)与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以后，用I. 2mol/L NaAc溶液调节pH值在6. 0-6. 5之间，4°C持续搅拌，反应20 - 28小时，得到反应混合液。2反应混合液的超滤纯化过程将反应混合液置于Amicon Ultra-4超滤管，以7500g离心力离心lOmin，离心完毕后补加0. OlM PBS (pH7. 2)至原体积对截留物进行稀释洗涤，重复以上步骤7次，最后对所得溶液稀释分装，经冷冻干燥，即得到偶联物I。3 BSA mannich 对照的制备按照步骤I和2的方法，反应体系缺失NE，维持其他各反应条件不变的条件下，制备载体mannich对照，即BSA mannich对照。4偶联物I通过分光光度计扫描鉴定将偶联物I、NE、BSA mannich对照和载体BSA调整到相同的浓度(lmg/mL)，通过200-500nm波长扫描，并在同一坐标绘制曲线图(如图3)NE在343nm处有最高吸收峰，载体BSA最高吸收峰在278nm。偶联后的偶联物I在250nm-450nm范围内有两个紫外特征峰，即入l=279nm, A 2=402nm。其中入l=279nm为蛋白质的紫外特征吸收峰，即BSA的特征吸收峰；在偶联物I上没有NE的343nm吸收峰，由于反应过程中NE偶联上蛋白质后导致其结构的变化使其最大吸收峰偏移至402nm。由以上分析可知，合成后的溶液体系并不是载体BSA和NE的简单叠加。通过BSA mannich对照和BSA峰形的比较，表明在缺失NE的情况下，BSA mannich对照与BSA吸收峰没有差别，而偶联物I与BSA的峰形差异较大，从而确证了 NE完全抗原I (BSA-NE)制备成功。NE完全抗原I中NE与BSA偶联比的计算参见图3，结果显示，NE完全抗原I在可见光区有明显两个吸收峰(279nm和402nm)出现，其中279nm为载体BSA的特征吸收峰，与NE的最大吸收峰(343nm)相比，NE 完全抗原I特有的一个最大吸收峰为402nm。根据可见分光光度法，按以下公式，可以计算出NE完全抗原I中NE与BSA蛋白的偶联比。公式[Ane 完全抗原 I 402nm/ NE 402nm]/[( A NE 完全抗原 I 279nm_ A NE 完全抗原 I 402nm X NE 279nm/ NE402nm) / BSA 279nm]A !^完全抗原! 402 NE完全抗原I在402nm的吸光度；Ane完全_! 279nm NE完全抗原I在279nm的吸光度；NE 402nm NE在402nm处的摩尔消光系数；NE 279nm NE在279nm处的摩尔消光系数；BSA 402nm :载体BSA在402nm处的摩尔消光系数；BSA 279nm :载体BSA在279nm处的摩尔消光系数。经过计算，NE完全抗原I中NE与载体BSA的偶联比为4. 35:1。实施例2与实施例I不同的是，所述载体采用卵清蛋白(以下简称0VA);所述步骤(2)中采用对反应混合液进行透析纯化，其方法为将反应混合液装入截留为14，OOODa的透析袋，封闭袋口，放入0. OlM PBS (pH7. 2)溶液中在磁力搅拌器上4°C搅拌，100转/分，每隔3小时，更换0. OlM PBS (pH7. 2)溶液一次，更换5次以后取出透析袋中溶液得到偶联物2。其余同实施例I。经分光光度计扫描鉴定同样确证了 NE完全抗原2 (OVA-NE)制备成功。NE完全抗原2中NE与OVA偶联比的计算参见图4，结果显示，NE完全抗原2在可见光区有明显的两个吸收峰(279nm和402nm)出现，其中279nm为载体的特征吸收峰，NE的最大吸收峰(343nm)偶联后有偏移现象，偏移至最大吸收峰个(402nm)。根据可见分光光度法，按以下公式，可以计算出NE完全抗原2中NE与OVA蛋白的偶联比。公式[AflE 完全抗原 2 402nm/ NE 402mJ / [ ( Ane 完全抗原 2 279nm_ A NE 完全抗原 2 402nm ^ NE 279nm/ NE402nm) / OVA 279nm]Ane完全抗原2 402nm NE完全抗原2在402nm的吸光度；
Ane完全抗原2 279 : NE完全抗原2在279nm的吸光度；NE 402nm NE在402nm处的摩尔消光系数；
NE 279nm NE在279nm处的摩尔消光系数；0VA 402nm :载体OVA在402nm处的摩尔消光系数；0VA 279nm :载体OVA在279nm处的摩尔消光系数。经过计算，NE完全抗原2中NE与载体QVA的偶联比为4. 85:1。
权利要求
1.一种去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，包括下述步骤， (1)将去甲肾上腺素与载体分别溶于NaAc溶液中，分别制备NE溶液及载体溶液，然后将两者混合后加入甲醛溶液并调节PH值为6. O — 6. 5后，4°C持续搅拌下进行偶联反应20 - 28小时，得到反应混合液。
(2)反应混合液通过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质，缓冲液采用pH为7. 2的0. OlM磷酸盐缓冲液，得到偶联物。
(3)按照步骤I和步骤2的方法，反应体系缺失去甲肾上腺素，维持其他各反应条件不变的条件下，制得载体mannich对照。
(4)采用紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、去甲肾上腺素标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标上进行图形比对，在偶联物与载体mannich对照浓度相同的情况下，如果偶联物比载体mannich对照多出特征吸收峰，则判定偶联成功，即得到去甲肾上腺素完全抗原。
2.如权利要求I所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，所述载体为含有游离氨基的生物大分子，具体为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。
3.如权利要求I或2所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，将去甲肾上腺素与载体分别溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分别制备34mmoL/L去甲肾上腺素溶液和3. 4mmol/L载体溶液，按照去甲肾上腺素与载体摩尔比10-20 1的比例，将去甲肾上腺素溶液缓慢加入到载体溶液中，缓慢滴加，边滴加边搅拌，混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以后，用I.2mol/L NaAc溶液调节pH值在6. 0-6. 5之间，4°C持续搅拌，反应20 — 28小时，得到反应混合液。
4.如权利要求3所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，滴加速度为1-2毫升/分，边滴加边搅拌，搅拌速度为100-150转/分。
5.如权利要求3所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，搅拌速度为100-150转/分，滴加速度为_1_2晕升/分。
6.一种测定去甲肾上腺素完全抗原中去甲肾上腺素与载体的偶联摩尔比的方法，其特征在于，通过摩尔消光系数法计算去甲肾上腺素完全抗原中去甲肾上腺素与载体的偶联摩尔比，首先，采用紫外分光光度扫描得到去甲肾上腺素完全抗原在200-500nm之间两个特征吸收峰为X I和X 2，其中X I为载体的特征吸收峰，X 2为去甲肾上腺素完全抗原特有的吸收峰，公式如下 [A去甲肾上腺素完全抗原Al/ 去甲肾上腺素A2]/[( A去甲肾上腺素完全抗原Al— A去甲肾上腺素完全抗原A2 X 去甲肾上腺素Al/ 去甲肾上腺素A2)/ 载体A I] 其中， A去甲肾上腺素完全抗原A2 :去甲肾上腺素元全抗原在\ 2的吸光度； A去甲iJtJ1Jia完全抗原a I :去甲肾上腺素元全抗原在X I的吸光度； 去甲肾上腺素A2 :去甲肾上腺素在、2处的摩尔消光系数；4￥MKA1 :去甲肾上腺素在\ I处的摩尔消光系数；载体A2 :载体在\ 2处的摩尔消光系数； S#A1 :载体在、I处的摩尔消光系数。
全文摘要
本发明公开了一种去甲肾上腺素(NE)完全抗原的制备方法及偶联摩尔比测定方法，解决了现有去甲肾上腺素是小分子结构，激发不了动物机体产生抗体的问题，技术方案包括将NE与载体偶联、纯化、同时制备载体mannich对照，并通过紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、NE标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，并进行图形化比对，判定偶联是否成功，并进一步通过摩尔消光系数法计算NE与载体载体的偶联摩尔比。本发明方法能生产出高品质的完全抗原，具有方法简单、生产周期短，生产成本低的优点，适用于NE的免疫学检测方法。
文档编号C07K1/113GK102718860SQ20121015145
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者周琪, 李学斌, 费小战, 鲁亮 申请人:武汉伊艾博科技有限公司