制备新伐他汀及中间体的方法

专利名称：制备新伐他汀及中间体的方法
制备新伐他汀及中间体的方法
本申请是分案申请，原申请的申请日是2004年10月20日，申请号为 2004800362026 (PCT/US2004/034913)，发明名称为“制备新伐他汀及中间体的方法”。
相关申请
本申请要求35U. S. C. § 119(e)下的2003年10月21日提交的美国临时申请 60/513，237和2004年2月4日提交的美国临时申请60/542，100的优先权权益。前述申请明确地以其整体在此并入作为參考，用于所有目的。技术领域
本发明一般性地涉及合成有机化学和医药化学领域。在ー个方面，本发明提供了制备新伐他汀及各种中间体以及相关化合物的合成化学方法和化学酶方法。在ー个方面， 在本发明方法中应用到酶，如水解酶，例如酯酶。
背景技术：
新伐他汀(Simvastatin)是有效的抗高胆固醇血症制剂。其销售的商品名是 ZOCOR (Merck)。新伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀和普伐他汀是六氢化萘衍生物，作为 HMG-CoA还原酶的抑制剂而应用，HMG-CoA还原酶是人体内产生胆固醇的生物合成途径中的控速酶(rate-controlling enzyme)。ロ服之后,作为无活性内酯的新伐他汀被水解为相应的￠-羟基酸形式。这是3-羟基-3-甲基戊ニ酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶的抑制剂。该酶催化HMG-CoA转变为甲羟戊酸，这是胆固醇生物合成中的ー个早期的和限速的步骤。
新伐他汀、洛伐他汀(Iovastatin)和普伐他汀是天然的发酵产物,其在它们的六氢化萘环系统的C-8位置上有2-甲基丁酸酯侧链。新伐他汀合成地来自于土曲霉 (Aspergillus terreus)的发酵产物。
带有C-82，2- ニ甲基丁酸酯侧链的化合物，包括新伐他汀，是比它们的2-甲基丁酸酷天然相对物更好的HMG-CoA还原酶抑制剂。因此，2，2- ニ甲基丁酸酯衍生物对于治疗动脉粥样硬化、高脂血症、家族性高胆固醇血症和相似疾病，具有更大的希望。然而，这些衍生物，包括新伐他汀，不是天然存在的，必须合成制备。结果是，将更有效的HMG-CoA抑制剂新伐他汀引入市场促进了对有效地、高产地制备新伐他汀的方法的需求。
发明概述
在ー个方面，本发明提供了新方法，包括(i)在温和的条件下，用本发明的酶(例如，具有SEQ ID N0:4所列出序列的示范性酶，由SEQ ID NO: 3编码)去除洛伐他汀侧链，(ii)在最后的步骤中，用相同的酶选择性去除酯保护基团，和(iii)应用新的条件引入新伐他汀侧链。
本发明提供了用于制备新伐他汀的新颖的四步法，包括下列步骤(a)酶促水解 (例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸的盐，产生三醇酸或三醇酸的盐；(b)在一个步骤中通过化学和/或酶促内酯化作用以及酰化作用产生4-酰基内酷(包括酰化内酯环上的第4位(4’-0H)，其中的环被如下所述的R-基团酰化)；(c)通过化学和/或酶促酰化作用，酰化4-乙酰基内酯的第8位(8’ -OH)，产生4-酰基新伐他汀；和(d)通过化学和/或酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)选择性地去除4’位的酰基，从而制备新伐他汀。在一个方面，制备本发明新伐他汀的四步法包括图5中列出的过程。因此，在本发明的一个方面中，提供了以四步法进行的洛伐他汀向新伐他汀的化学酶促转化，如图5所概括显示。在可选的方面中，本发明制备新伐他汀的方法(例如，图5显示的过程)中洛伐他汀转化为新伐他汀的总产率是至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%或更多。确定何处发生了产率损失以及何处实现了工艺改进的示范性方案和研究讨论于下，例如，在实施例5、6、7和8中。 在一个方面，本发明提供了四步途径，用以从洛伐他汀合成新伐他汀，如图5所示例描述，其中所述合成方案包括下列步骤步骤I :用能够水解洛伐他汀酸的酶，例如，如此处描述的水解酶或商业上可得到的水解酶，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸的盐，产生三醇酸。例如，用于酶促水解(S)-2-甲基丁酸酯侧链的示范性水解酶是酯酶SEQ ID N0:4(由例如SEQ IDNO: 3 编码)、SEQ ID NO: 6 (由例如 SEQ ID NO: 5 编码)JPSEQ ID NO: 2 (由例如 SEQ IDNO: I 编码)。SEQ ID NO:4 (由例如 SEQ ID NO: 3 编码)。步骤2 :在酰化剂存在的情况下，搅拌三醇酸，产生4-酰基内酯。步骤3 :第8位羟基的酰化，可以化学进行，或用此处描述的水解酶或商业上可得到的水解酶酶促进行。步骤4 :化学地或是酶促地(用此处描述的水解酶，例如酯酶，或商业上可得到的水解酶)选择性去除第4位的酰基保护基团，产生新伐他汀(参见，例如，图5，步骤5，指出了在可选的方面，甲基(Me)基团可以是烷基，或等价物，R-基团)。在一个方面，用例如由SEQ ID N0:3编码的SEQ ID NO:4酯酶催化内酯第4位的酰基基团的选择性水解。如果需要，或必要，在一个方面，此步骤也包括产生新伐他汀的铵盐和重结晶新伐他汀，随后对其重新内酯化。这提供了具有期望纯度的新伐他汀。选择性地，可以通过在酶(例如，水解酶或酯酶)以及合适的酰化剂存在的情况下搅拌三醇酸来实施步骤2。在一个方面，本发明提供了制备新伐他汀的方法，包括图6A中指出的方法。本发明提供了从洛伐他汀制备三醇酸的方法，包括

图15A或16A所指出的方法。本发明提供了从洛伐他汀制备洛伐他汀的方法，包括图16A所指出的方法。本发明提供了从洛伐他汀酸制备三醇酸的方法，包括图16A中指出的方法。本发明提供了从三醇酸(triol acid)制备二醇内酯(diol lactone)的方法，包括图8或图16B指出的方法。本发明提供了从二醇内酯制备酰基内酯的酶促方法，包括图16C指出的方法。本发明提供了从三醇内酯制备酰基内酯的方法，包括图16D指出的方法。本发明提供了从三醇内酯制备4-乙酰基内酯的方法，包括图9A指出的方法。本发明提供了从酰基内酯制备酰基新伐他汀的方法，包括图16E指出的方法。本发明提供了从4-乙酰基内酯制备4-乙酰基新伐他汀的方法，包括图9B指出的方法。在一个方面，本发明提供了从4-乙酰基内酯制备4-乙酰基新伐他汀的化学方法，例如，用图9B示例的条件或其变化，用三氟化硼作催化剂。
本发明提供了从4-乙酰基新伐他汀制备新伐他汀的方法，包括图9C或图11指出的方法。本发明提供了从酰基新伐他汀制备新伐他汀铵盐的方法，包括图16F指出的方法。本发明提供了从辛伐他汀铵盐制备辛伐他汀的方法，包括图16F指出的方法。本发明提供了经同二酰基化作用(homodiacylation)途径从洛伐他汀制备新伐他汀的方法，如图38所示例。可以用在一个、几个或全部这些步骤中的酶促水解中的示范性酶包括SEQIDN0:4(例如，由 SEQ ID NO: 3 编码)、SEQ ID NO: 6 (例如，由 SEQ ID NO: 5 编码)JPSEQID NO: 2 (例如，由 SEQ ID NO: I 编码)。SEQ ID NO: 4 (例如，由 SEQ ID NO: 3 编码)，或与SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 6 具有 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性的酶。本发明提供了制备新伐他汀的方法，包括五步骤的异二酰基化作用(heterodiacylation)方法,具有下列步骤(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸；(b)在存在酸的情况下加热三醇酸或搅拌，产生二醇内酯；(c)通过酶促区域选择性酰化4’-0H，保护二醇内酯的内酯环上第4位的羟基(4’ -0H)，产生4-酰基内酯；(d)通过化学和/或酶促区域选择性酰化第8位，从而酰化4-酰基内酯的8位羟基(8’-0H)，产生4-酰基新伐他汀；和(e)化学或酶促地选择性去除第4位的酰基保护基团，从而生产出新伐他汀。在可选的方面，本发明方法可以在至少2个容器中进行，即，以2罐、3罐等工艺过程。本发明方法可以在任意容器形式中实施，例如，毛细管阵列如GIGAMATRIX ，DiversaCorporation, San Diego,CA。本发明提供了制备新伐他汀的同二酰基化作用方法，包括下列步骤的方法(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸盐；(b)通过内酯化从三醇酸产生二醇内酯；(c)通过化学或酶促的酰化作用，酰化二醇内酯的内酯环上的第4位(4，-0H)和第8位(8’-011)，产生4，8-二酰内酯；和 (d)通过酶促水解，选择性去除4’位的酰基，从而制备新伐他汀。在本发明的其它方案中，通过在4位和8位加入选择性的保护基团，可以由二醇内酯合成其它组合物，例如，当R-基团选自(i) - H，甲基酸衍生物；(ii)Cl-n烷基，例如，甲基、乙基、丙基、丁基等，均为直链和支链，其中在一个方面，n是I和20之间的整数；(iii)取代的烷基，例如，氯乙酰、三氯乙酰、三氟乙酰、甲氧基乙酰、苯乙酰、4-氧戊基(乙酰丙酸)；(iv)苯基和取代的苯基例如苯基、对硝基苯基；和(v)R’O-基团，产生羧酸盐保护基团，示例但不限于tBu0C0、Ph0C0、PhCH2OCO,其中，在一个方面，R’ 0-基团产生羧酸盐保护基团，其中R’是或(iv)中的任意一个基团。在本发明的这些可供选择的合成反应中，保护基团(R-基团)可以被化学地或酶促地区域选择性去除，生成所需的终产物。这些R-基团，或等价的R-基团，可以被用作本发明任何方法的任何步骤中的“保护基团”。例如，这些R-基团，或等价的R-基团，被用作如图5、图6A、图9、图10、图11、图16C、图16D、图16E或图16F所阐释的本发明示范性方法或本发明等价工艺方法中的R-基团。在一个方面，本发明提供了从洛伐他汀合成新伐他汀的五步路线，如图6所示例，其中的合成过程包括下列步骤步骤I :用能够催化洛伐他汀酸水解的酶，例如，如此处描述的水解酶或可从商业途径得到的水解酶酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸。例如，可用于酶促水解(S)-2-甲基丁酸酯侧链的示范性水解酶是酯酶SEQID N0:4(由例如SEQ ID NO: 3 编码)、SEQ ID NO: 6 (由例如 SEQ ID NO: 5 编码)和 SEQ ID NO: 2 (由例如 SEQID NO: I 编码)。SEQ ID NO:4 (由例如 SEQ ID NO: 3 编码)。步骤2 :在存在酸的情况下加热三醇酸或搅拌，产生二醇内酯。步骤3 :应用如此处描述的水解酶或可从商业途径得到的水解酶，通过酶促区域选择性酰化作用，保护内酯环上的4’-0H。参见，例如，图6，步骤3，注意在可供选择的步骤中，甲基(Me)可以是任意烧基或等价的(例如，甲氧基、烧氧基、苯基等)R-基团。 步骤4 :酰化8位的羟基；可以用如此处描述的水解酶或可从商业途径得到的水解酶，化学地或酶促地进行。步骤5 :化学或酶促地选择性去除4’位的酰基保护基团(如此处描述的水解酶例如酯酶，或可从商业途径得到的水解酶)，生成新伐他汀(参见例如图6，步骤5，注意在可选的步骤中，甲基(Me)可以是任意烷基或等价的R基团)。在一个方面，例如由SEQ ID NO:3编码的SEQ ID N0:4被用来催化内酯4’位酰基的选择性水解。如果需要或必须，在一个方面，此步骤也包括产生新伐他汀的铵盐和重结晶新伐他汀，随后重新酯化。这提供了所需纯度的新伐他汀。本发明也提供了方法，用能够水解洛伐他汀酸的酶，例如此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶(参见下面的实施例6，步骤I)，从洛伐他汀产生新伐他汀酸。本发明也提供了产生三醇酸的方法，包括用能够催化洛伐他汀酸水解的酶，例如此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸。本发明提供了方法，用此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶，通过区域选择性酰化，保护内酯的羟基，例如，内酯环上的4’ -OH (例如，二醇内酯上的，如图6所示)。本发明提供了酰化4-酰基内酯8位羟基的方法(如图6所示)，这可以用化学方法实施，或者用此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶用酶促方法实施。本发明提供了方法，用于选择性去除内酯上的酰基，例如，内酯上的保护酰基，如图6所示的内酯上第4’位的保护性酰基，用化学方法或酶促方法进行。本发明也提供了方法，包括这些方法中的两种或更多种或全部，例如，化学酶促地从洛伐他汀、三醇酸、二醇内酯、4-酰基内酯或4-酰基新伐他汀产生新伐他汀。关于实施这些方法的本发明示范性方案，参见例如，下面的实施例5、6、7和8。在一个方面,用二甲基丁酸衍生物和路易斯酸催化剂(Lewis acid catalyst),区域选择性地酰化二醇内酯的第8位。在一个方面，本发明方法生成了带有< 1%的洛伐他汀的新伐他汀，原因是，在一些情况下，将洛伐他汀与新伐他汀分离开来可能是低效率的。在可选的方面，本发明方法生成了新伐他汀，其中所述方法的总产率大于或等于(=)50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90% 或更多。在一个方面，本发明方法生成新伐他汀，其中对洛伐他汀的起始酶促水解以大约20% w/v进行。
在一个方面，本发明提供了产生新伐他汀的方法，包括图5示例出的方案(“方案I”)或其变化，这是合成新伐他汀的异二酰基化作用途径。在方案1(图5)的可选方面，步骤I可以包括化学或酶促水解；步骤2可以包括化学或酶促内酯化及酰化；步骤3可以包括化学或酶促酰化，步骤4可以包括化学或酶促水解，或其任何结合。在一个方面，这些水解反应中的至少一个是区域专一的(regiospecific)。在本发明任何方法的可选方面，至少一个步骤是在反应容器中进行的。在本发明任何方法的可选方面，至少一个步骤是用细胞提取物进行的。在本发明的任何一个方法的可选方面，至少一个步骤是在完整的细胞中进行的。细胞可以是任何来源，例如，植物细胞、细菌细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或酵母细胞。在本发明任何方法的一个方面，产生新伐他汀的铵盐。在一个方面，所述方法进一 步包括新伐他汀的重结晶。在一个方面，所述方法包括重内酯化，以提供所需纯度的新伐他汀。在本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶进行的(例如，酯酶或脂酶)，所述水解酶是由与SEQ ID NO: I有至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所编码的，或者是其酶学上的活性片段。在本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶进行的，所述水解酶是由与 SEQ ID N0:3 有至少 53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所编码的，或者是其酶学上的活性片段。在本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶进行的，所述水解酶是由与 SEQ ID NO:5 有至少 56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性，或具有完全(100% )的序列同一性的核酸所编码的，或者是其酶学上的活性片段。本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶(例如，酯酶)进行的，所述水解酶和 SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4 或 SEQ ID N0:6 有至少约 50%、51%、52%、53 %,54 %、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性，或具有完全(100% )的序列同一性，或者是其酶学上的活性片段。本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括用于实施本发明的试剂和水解酶。在一个方面，所述试剂盒包括至少一种水解酶，该水解酶和SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ IDNO: 6 有至少约 51 %、52 %、53 %、54 %、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性，或者是其酶学上的活性片段。在一个方面，所述试剂盒包括实施本发明方法的说明书。本发 明的一种或多种实施方案的细节在下面的附图和描述中说明。根据说明书和附图以及从权利要求书，本发明的其它特征、目的和优势将是显然的。此处引用的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物,特别地在此并入作为参考，用于所有用途。附图简述图I是对三氟甲基磺酸盐(triflate)和醚合BF3-催化的4_乙酰基内酯的酰化作用的示范性方案的说明，如下面的实施例5中详述。图2是对几种BF3. 0Et2催化的酰化作用的结果的说明，如表3，如下面的实施例5所详述。图3是对表4的说明，显示了沉淀之前和沉淀之后，12g酰化反应产物的杂质分布，如下面的实施例5中所详述。图4是对表8的说明，显示了分离新伐他汀的数据，如下面的实施例5中所详述。图5说明了本发明的示范性过程，四步异二酰基化途径，用以从洛伐他汀合成新伐他汀。图6A和图6B说明了本发明的示范性过程，五步途径，用以从洛伐他汀合成新伐他汀(图6A)，和对洛伐他汀向新伐他汀转化的总结(图6B)。图7说明了对酶促水解乙酰基新伐他汀的示范性方案的结果的HPLC分析，如下面的实施例6中所详述。图8说明了本发明的示范性内酯化/酰化反应及其产物，如下面的实施例7中所详述。图9A说明了本发明的示范性内酯化/酰化方案，包括从三醇酸产生4-乙酰基内酯，如下面的实施例7中所详述。图9B说明了本发明的示范性方法，包括从4-乙酰基内酯产生4-乙酰基新伐他汀，如下面的实施例5中所详述。图9C说明了本发明的示范性方法，包括乙酰基新伐他汀向新伐他汀的转化，如下面的实施例5中所详述。图10说明了化学酰化第8位的示范性方案，如下面的实施例7中所详述。图11说明了本发明的示范性反应，4-乙酰基新伐他汀的酶促脱乙酰作用，如下面的实施例7中所详述。图12说明了用本发明示范性方案产生的两批新伐他汀的HPLC曲线，如下面的实施例7中所详述。图13说明了 HPLC分析，显示了本发明示范性方案产生的新伐他汀样品的杂质曲线图，如下面的实施例7中所详述。图14说明了一张表格，显示了对本发明示范性方案的比较，所述方案是以三醇酸作为原料的一步内酯化/乙酰化作用，如下面的实施例7中所详述。图15说明了本发明的示范性反应，包括用酯酶水解洛伐他汀为三醇酸，如下面的实施例5和7中所详述。图16A说明了从洛伐他汀制备洛伐他汀酸、以及从洛伐他汀酸制备三醇酸的示范性方法，如下面的实施例6中所详述。图16B说明了从三醇酸制备二醇内酯的示范性方法，如下面的实施例6中所详述。图16C说明了从二醇内酯制备酰基内酯的示范性方法，如下面的实施例6中所详述。图16D说明了本发明的示范性方案，包括对内酯的4位进行内酯化和酰化，如下面的实施例6中所详述。图16E说明了本发明的示范性方案，包括从酰基内酯制备酰基新伐他汀，如下面的实施例6中所详述。图16F说明了本发明的示范性方案，包括从酰基新伐他汀制备新伐他汀铵盐，和从新伐他汀铵盐制备新伐他汀，如下面的实施例6中所详述。图17A说明了本发明的示范性反应，包括用路易斯酸从二醇内酯制备新伐他汀、4’ -酰基内酯(也称作异新伐他汀)和同新伐他汀(也称作二新伐他汀)的过程，如下面所详述。图17B说明了本发明的示范性反应，包括经酶促水解，从新伐他汀、4’ -酰基内酯(异新伐他汀)和同新伐他汀(也称作二新伐他汀)制备新伐他汀和二醇内酯，如下所详述。图18A说明了本发明的示范性方案，包括合成4-乙酰基二醇内酯的方法，如下面的实施例3所详述。图18B说明了 4-乙酰基内酯的结构、相应的二乙酸酯的结构以及消除产物，如下面的实施例3所详述。图18C说明了本发明的示范性反应，包括4-乙酰基新伐他汀的合成，如下面的实施例4所详述。图18D说明了本发明的示范性反应，包括经水解酶 水解4-乙酰基新伐他汀，如下面的实施例4所详述。图18E说明了本发明的示范性反应，包括将洛伐他汀酶促水解为三醇酸，如下面的实施例2所详述。图19说明了制备4-乙酰基内酯的示范性过程，如下面的实施例13所详述。图20说明了 4-乙酰基新伐他汀向新伐他汀的水解，和相应的消除产物以及酸，如下面的实施例5所详述。图21说明了一张表格，显示了选出的新伐他汀样品的杂质曲线图数据、HPLC分析数据和组分分析结果，如下面的实施例8所详述。图22是对本发明示范性反应的说明，例如，三醇酸向相应二醇内酯、3-乙酰基三醇酸和5-乙酰基三醇酸的转化，和随后向3，5-二乙酰基三醇酸、4-乙酰基内酯和消除产物的转化，如下面的实施例9所详述。图23是对用SEQ ID NO: 4的酯酶酶促水解洛伐他汀的研究的说明，如下面的实施例7所详述。图24是对应用DESIGN EXPERT 软件，经部分析因设计对洛伐他汀的酶促水解进行最佳化的说明，如下面的实施例10所详述。图25是总结影响洛伐他汀酸水解的四个因子的说明，如下面的实施例10所详述。图26说明了应用DESIGN EXPERT 软件，用中心复合设计对水解洛伐他汀进行的反应表面分析(Response Surface Analysis) (RSA)的结果,如下面的实施例10所详述。图27说明了用SEQ ID NO:4原位水解洛伐他汀的最佳化结果，如下面的实施例10所详述。图28说明了本发明的示范性反应，所述反应是大规模地水解洛伐他汀的方案，如下面的实施例10所详述。图29说明了经SEQ ID N0:4水解的新伐他汀的4_酰基衍生物，如下面的实施例10所详述。图30说明了本发明的应用SEQ ID N0:4的示范性洛伐他汀水解方案，如下面的实施例11所详述。
图31说明了放大方案(scaled-up protocol)中的洛伐他汀向三醇酸的示范性酶促水解，如下面的实施例11所详述。图32说明了将洛伐他汀酶促水解为三醇酸的放大方案，如下面的实施例11所详述。图33说明了在放大方案中应用的洛伐他汀向三醇酸的示范性酶促水解，和对反应参数的总结，如下面的实施例11所详述。图34说明了对数据的图解总结 ，所述数据来自40g反应(a)在内酯化和浓缩之后(图34A)以及(b)粗产物(图34B)。图35说明了对数据的图解总结，所述数据来自100g反应(a)三醇酸(图35A)以及(b)内酯化作用之后(图35B)。图36说明了对数据的图解总结，所述数据来自IOg放大酶促水解反应，其中4-乙酰基内酯被酰化为4-乙酰基新伐他汀，如下面的实施例11所详述。图37说明了在本发明方法中应用的示范性化学酰化作用，其为应用酰基三氟甲基磺酸盐的路易斯酸催化的酰化作用，如下面的实施例11所详述。图38和图39说明了通过同二酰基化作用从洛伐他汀制备新伐他汀的示范性方法和条件，如下面的实施例12所详述。图40A和40B图形说明了用本发明方法用SEQ ID NO:4对同新伐他汀进行的水解，以及得到的反应产物，反应的条件是ImM同新伐他汀和IOmM同新伐他汀,如下面的实施例12所详述。发明详述本发明提供了新颖的化学和生物化学方法，用于产生新伐他汀(例如，Z0C0R )及其中间产物。这些方法可以是高效的和在成本上有效的。在本发明的各种实施方案中，本发明用各种酶生物催化地催化反应，所述酶包括水解酶，例如酰基转移酶和酯酶。在一个方面，本发明提供了用水解酶将洛伐他汀酶促水解为洛伐他汀酸的方法。在一个方面，本发明提供了将洛伐他汀酸或其盐酶促水解为三醇酸或其盐的方法。在一个方面，本发明提供了用水解酶将二醇内酯酶促酰化为酰基内酯的方法。在一个方面，本发明提供了用水解酶将酰基内酯酶促酰化为酰基新伐他汀的方法。在一个方面，本发明提供了用水解酶水解内酯环的方法。本发明包括经体外或体内技术产生新伐他汀和各种中间产物的方法，所述技术例如，全细胞方案，如发酵或其它生物催化过程。在可选的方面，本发明提供了将洛伐他汀转化为新伐他汀的新颖的方法，如图5或图6A和6B所图示说明。在一个方面，应用二甲基丁酸衍生物和路易斯酸催化剂，经水解从洛伐他汀制备的二醇内酯在8位上被区域选择性地酰化。二醇内酯可以应用此处描述的化学酶方法从洛伐他汀而制备。在一个方面，本发明提供了方法，包括用路易斯酸从二醇内酯制备新伐他汀、4’_酰基新伐他汀和同新伐他汀，如图17A所说明。本发明的发明人发现，在路易斯酸存在的情况下，用羧酸衍生物处理二醇内酯，导致位置8处的优势酰化。在三氟甲基磺酸金属盐存在的情况下应用过量的乙烯基乙酸盐(酯)时，8-乙酰基衍生物几乎独有地以低的转化而产生。到此为止的结果显示了，用二甲基丁酸酐和溶于二氯甲烷的Bi (OTf) 3或Cu (OTf) 2的联合在室温下处理二醇内酯，导致了快速反应，其中新伐他汀4’ -酰基内酯的比率>4: I。 在一个方面，新伐他汀的分离和纯化是通过结晶进行的。在一个方面，本发明提供了筛选Lewis酸催化剂和/或酰化试剂的方法，用以提供选择性反应条件，以最大化新伐他汀的产量和最小化副产物。最大化新伐他汀的产量和最小化副产物有助于结晶方案。采用结晶分离/纯化新伐他汀导致了从洛伐他汀到新伐他汀的2步方法。在一个方面，本发明提供了方法，包括经酶促水解从新伐他汀、4’ -酰基内酯新伐他汀和同新伐他汀制备新伐他汀和二醇内酯，如图17B所说明。在一个方面，如果异新伐他汀和同新伐他汀不能通过结晶降低为可以被净化的水平，则采用最终的酶促水解步骤协助回收产物。在一个方面，用酯酶(例如，具有SEQ IDN0:4列出的序列的酶，由SEQ ID N0:3编码的)处理新伐他汀、异新伐他汀和同新伐他汀的混合物，导致4’位置处的酰基的区域选择性水解，这产生了新伐他汀和二醇内酯的混合物。在一个方面，新伐他汀是通过结晶而分离的。选择性地，应用过量的酐将反应向产生新伐他汀和同新伐他汀的反向推进。这可以最小化异新伐他汀的量。酶促水解这样的混合物导致了新伐他汀的产生和迅速分离。在路易斯酸存在的情况下经区域选择性地酰化二醇内酯对新伐他汀进行制备的一个方面，用二氯甲烷中的二甲基丁酸酐(0.5当量(eq))在室温(RT)下处理二醇内酯，5mol%的Cu(OTf)2作为催化剂而存在。HPLC分析表明，在10分钟内二醇内酯的50%发生转化。新伐他汀(在8位处酰化)和异新伐他汀(在4位处酰化)的比值是4:1，产生了 4%的同新伐他汀。在一个方面，本发明提供了方法，包括在图5的新颖的4步法或图6A的5步法中指明的步骤或其联合。在选择性的方面，本发明提供了方法，包括下列步骤中的至少一种、几种或全部步骤I :酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸盐，其中采用水解酶，例如此处描述的酶，例如，SEQ ID N0:4，其由例如SEQID N0:3编码，或商业上可得到的水解酶。步骤2 :将三醇酸转化为4-乙酰基内酯，例如，在一个步骤中，例如在图5的步骤2中，或在两个步骤中，例如在图6A的步骤2和3中(在一个方面，在酸存在的情况下加热或搅拌三醇酸，产生二醇内酯)。步骤3 :保护二醇内酯内酯环上的4’ -0H，产生4-乙酰基内酯，用例如此处描述的酶或商业上可得到的水解酶经区域选择性酰化而实施。步骤4 :酰化8位上的羟基；这可以化学地进行，或用例如此处描述的酶或商业上可得到的水解酶而酶促进行。步骤5 :或是化学地或是酶促地，选择性去除4’位的酰基保护基团，产生新伐他汀。如果需要，产生新伐他汀的铵盐并对新伐他汀重结晶，随后重新内酯化，提供具有所需纯度的新伐他汀。在一个方面，参照如上所述的步骤1，本发明提供了包括经酶促水解或化学水解从洛伐他汀制备出洛伐他汀酸的方法，如图16A所描述。本发明提供了经酶促水解或化学水解从洛伐他汀酸制备出三醇酸或三醇酸盐的方法，如图16A所描述。
完全地或基本完全地(在可选择的方面，>99%、>98%、>97%或>96%)去除甲基丁酸酯侧链，对一种方法来说可能是必须的，原因是分离洛伐他汀和新伐他汀有难度，以及在新伐他汀API中洛伐他汀的允许水平低。已报道的水解洛伐他汀的方法需要应用高温和长的反应时间，以完全反应。在一个方面，洛伐他汀在温和的条件下被水解，其中采用水解酶(例如，具有SEQID N0:2、SEQ ID N0:4、或 SEQ ID N0:6 列出序列的酶，上述酶分别由 SEQID NO: I、SEQ IDN0:3或SEQ ID N0:5编码)。这导致内酯环的水解和完全去除第8位的侧链。具有SEQ IDNO: I、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5中列出序列的酶已经被证明对甲基丁酸酯侧链酶促水解特别有效SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4、或 SEQ ID N0:6。具有 SEQ ID N0:4 所列出序列的酶已被亚克隆并在宿主如大肠杆菌(E. coli)中表达。
洛伐他汀在酶促活性所需的水性条件下可以显示出差的溶解性。因此，在一个选择性方面，洛伐他汀在水中的悬浮液的PH值被升高至pH>12，以实现内酯环的快速水解。这导致原位产生更加可溶的洛伐他汀酸盐。在一个方面，随后将反应混合物的pH值重新下调为适合水解反应的范围；并且加入酶。酶促水解条件也可以被施用于从发酵肉汤直接提取出的洛伐他汀和洛伐他汀酸的混合物。选择性地，可以将酶加入发酵肉汤并直接分离三醇酸。在一个方面，在水解之后，酸化反应混合物。三醇酸可以通过萃取和/或过滤被分离出来，并且直接在下一步骤中应用。选择性地，三醇酸在合适的结晶/沉淀步骤之后被分离出来。在一个方面，参照上述步骤2，本发明提供了包括图16B所说明的步骤的方法。在一个方面，通过在合适的溶剂中加热并用常规方法去除水而将平衡向内酯形式驱动，使三醇酸重新内酯化。选择性地，在合适的酸存在的情况下，搅拌将导致内酯环的闭合。在一个方面，参照上述的步骤3，本发明提供了方法，包括用具有所需活性和选择性的酶，例如水解酶如酯酶，酰化4’位羟基。在一个方面，用水解酶(例如，酯酶)酰化二醇内酯。可以变化酰基的性质，用以赋予其合适的特征，例如，变为乙酸酯以便容易去除，苯甲酸酯以增强结晶性，甲酸酯以增强水溶解性。在此处描述的示范性方法(例如，图5和6A，图38)的可选方面，包括步骤3 (上)、4和5(下)中描述的反应物和试剂的可选方面，酰基可以被替代为任意合适的R-基团(即，“保护”基团可以是任何R-基团)，其中“R”可以是⑴-H，甲酰衍生物；(ii)Cl-n烷基，直链的和支链的；(iii)取代的烷基基团，例如，氯乙酰、三氯乙酰、三氟乙酰、甲氧乙酰、苯乙酰、4-氧代苯基(乙酰丙酸酯)；(iv)苯基和取代的苯基例如，苯基、对-硝基苯基；(v)R’ 0基团，产生碳酸酯保护基团，示例但不限于tBu0C0、PhOCO、PhCH2OCO15在一个方面，R’ 0基团产生碳酸酯保护基团，R’是⑴、(ii)、(iii)或(iv)中的任何基团。在一个方面，当R是长链烷基基团时，应用对长链烷基酯有增强反应活性的酶。当R是长链烷基时，溶解性可能是一个问题。在一个方面，R是乙酸酯，这可以是有利的，原因是(i)容易加入，(ii)良好的水解酶活性，(iii)溶解性，(iv)试剂的成本。
在一个方面，参照上述的步骤4，本发明提供了方法，包括图16E描述的步骤，并且在可选的实施方案中，包括图16E描述的试剂。在一个方面，用二甲基丁酸衍生物和合适的酰化催化剂(通过活性酰化或酶促酰化)的组合，加入所需的新伐他汀侧链。二甲基丁酸酐/路易斯酸的组合(例如，三氟甲基磺酸铋Bi (triflate) 3，三氟甲基磺酸铜Cu (triflate) 2)，导致在室温下(RT)的快速反应。在一个方面，本发明提供了筛选合适的路易斯酸和反应条件的方法，包括温度、溶剂等等。可选方案中此酰化的最适条件或试剂可以用常规的筛选方法确定。
在一个方面，在十分温和的条件下(例如，在一方面，在室温(RT)下，例如，约40°C，用有机溶剂)，用催化酰基内酯酰化的酶在第8位加入二甲基丁酸酯基团，而不产生副产物。本发明提供了筛选在本发明方法中具有所需活性的可选酶的方法。可以通过用常规方法筛选酶在本发明各种方案中的有效性，对酶进行筛选。在一个方面，参照上述步骤5，本发明提供了方法，包括图16F描述的步骤，并且在可选的实施方案中，包括图16F描述的试剂。在一个方面，最终步骤需要选择性地去除4’位上的酰基。4’位上的酰基可以对碱催化的消除高度敏感，甚至仅在强度碱性条件下也敏感。因此，酶促水解曾是区域选择性去除此酰基的最方便的方法。已经证明，水解洛伐他汀的相同的酶(SEQID N0:4(由SEQ IDN0:3编码)，在上面的步骤I中)也是选择性水解内酯4’位酰基的有效催化剂。当在pH值为7时实施时，此酶促水解产生内酯环基本上完整的新伐他汀。一般方法本发明提供了生产新伐他汀和各种中间体的新颖的化学方法。金属人员将认识到，可以利用各种过程和方法学合成本发明方法中应用的起始化合物以及中间化合物，所述过程和方法学在科技文献和专利文献中详细描述，例如，OrganicSynthesesCollective Volumes, Gilman et al. (Eds)John ffiley&Sons, Inc. , NY;Venuti (1989)PharM Res. 6:867-873。可以结合科技文献和专利文献中详细描述的本领域中的任何方法或方案，来实践本发明。此处给出的对一般方法的讨论仅意图于示例性的目的。本领域的技术人员阅读本公开内容之后，其它的可选方法和实施方案将是显而易见的。酶在本发明任意方法的一方面，至少一个酶反应是由具有水解酶活性(例如，酯酶活性)的多肽进行的，例如，和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO 6至少有约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性、或完全(100%)相同序列的序列的水解酶，或其酶学上的活性片段。具有水解酶活性的多肽也可以是包括催化位点的肽、催化抗体和类似多肽。具有SEQ ID NO:4列出序列的多肽是家族VII酯酶，和P -内酰胺酶有同源性，并且与其共享SXXK基序。因此，可以在本发明的一个、几个或所有步骤中应用的酶，可以具有酯酶活性，并且具有和 SEQ ID N0:4 至少约 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性、或完全(100%)相同序列的序列以及SXXF基序。具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6列出序列的多肽是阿魏酸酯酶(feruloylesterases)。因此,可以在本发明的一个、几个或所有步骤中应用的酶,可以具有阿魏酸酯酶活性。本发明的方法中应用的酶可以通过任何合成或重组方法产生，或者，可以从天然来源或其组合分离出来。用来实践本发明方法的、编码酶的，不论是RNA、cDNA、载体、病毒或其杂化物(hybrids)，可以从多种来源分离出来、进行遗传工程、扩增、和/或重组表达/产生。从这些核酸产生的重组多肽可以被单独的分离或克隆并检测所需活性。可以用重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。将用于实施本发明的核酸可以用扩增方法产生，所述方法在本领域是熟知的，包括例如，聚合酶链式反应、PCR(参见，例 如，PCRPR0T0C0LS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, AcademicPress, N.Y. (1990)和 PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc. , N. Y. , ligasechain reaction (LGR)(参见，例如，Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science241:1077;Barringer (1990)Gene 89:117);转录扩增(参见，例如，Kwoh(1989)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:1173);和，自动维持序列扩增(参见，例如，Guatelli (1990)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:1874) ；Q^ 复制酶扩增(Q-betareplicase amplification)(参见，例如 Smith(1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491),自动03 复制酶扩增分析(automatedQ-beta replicase amplification assay)(参见，例如，Burg(1996)Mol. Cell. Probes10:257-271)和其它 RNA 聚合酶介导的技术(例如，NASBA, Cangene, Mississauga, Ontari
0) O可选地，可以经公知的化学合成技术体外合成这些核酸，所述技术如，例如，在 Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105 : 661; Belousov (1997) Nucleic AcidsRes. 25:34403444 ;FrenkeI(1995)Free Radic.Biol. Med. 19:373380 ;Blommers(1994)Biochemistry 33:78867896 ；Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90 ；Brown (1979)Meth.EnzymoI. 68:109;Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859 ;美国专利 4，458，066 号中有所描述。修饰核酸的技术如，例如亚克隆、标记探针(例如，用Klenow聚合酶进行随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交以及类似技术，在科技文献和专利文献中详细描述，参见，例如，Sambrook, ed.，MOLECULAR CLONING: ALAB0RAT0RY MANUAL (2NDED.),Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) ；CURRENT PROTO⑶LS INMOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. Johnffiley&Sons, Inc. , New York(1997) ；LABORATORYTECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITHNUCLEICACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y(1993)。获得和操作用于本发明的方法的实践中的核酸的另一有用方法是对基因组样品进行克隆，并且在需要的情况下，对从例如基因组克隆或cDNA克隆分离或扩增出来的插入物进行筛选和再克隆。用于本发明方法的核酸的来源包括基因组文库或cDNA文库，所述文库包含在，例如，哺乳动物人工染色体(MACs)，参见，例如，美国专利5，721，118、6,025，155 ;人类人工染色体，参见，例如，Rosenfeld(1997)Nat. Genet. 15:333-335 ;酵母人工染色体(YAC);细菌人工染色体(BAC) ;P1人工染色体，参见，例如，Woon(1998)Genomics 50:306-316 ;P1_ 衍生载体(PACs),参见，例如，Kern (1997) Biotechniques23:120-124 ;粘粒；重组病毒；噬菌体或质粒中。本发明的核酸和蛋白质可以用本领域技术人员熟知的许多方法中的任意一种进行检测、确认和定量。检测核酸和相应蛋白质的一般方法包括分析生物化学方法，如分光光度法、放射显影术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、高扩散色谱(hyperdiffusion chromatography)、和类似方法，以及多种免疫学方法如液体或凝胶沉淀反应(fluid or gel precipitin reactions)、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫分析(RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析、和类似方法。对核酸和多肽的检测可以通过公知方法如Southern分析、northern分析、凝胶电泳、PCR、放射标记、闪烁计数、和亲和色谱。在本发明示范性方法的各个方面，使用具有酯酶活性的多肽，例如酯酶。可以应用酯酶或酶(例如水解酶)或具有相似活性的其它多肽(例如，催化抗体或包括活性位点的 肽)。筛选用于本发明的酶的任何方法均可以应用，并且这些方法在本领域中是公知的，所述酶用于例如水解洛伐他汀、洛伐他汀酸、4-乙酰基新伐他汀或新伐他汀。例如，用来确定欲在本发明方法中应用的酶的(多种酶)的一个示范性筛选条件组中，包括应用2. 5mM的底物、IOOmM的磷酸盐缓冲液/共溶剂，pH 7至pH 8，30°C，48h，和下列组分(i)洛伐他汀或新伐他汀，溶于MTBE/缓冲液，(ii)洛伐他汀或新伐他汀，溶于甲苯/缓冲液，(iii)洛伐他汀酸或新伐他汀酸，溶于10%甲醇/缓冲液。筛选结果在ImM底物中中证实。应用此示范性的分析确定出，具有SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6列出序列的三种酶，对于水解洛伐他汀或洛伐他汀酸是有活性的。仅具有SEQ IDN0:4列出序列的酶显示出水解新伐他汀的活性。在pH为9的10% MeOH/缓冲液中的25、50和IOOmM洛伐他汀酸中，进一步评价SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:2 ;为了方便，用更多的可溶洛伐他汀酸作为底物。在许多情形下，SEQ ID N0:4显示出对底物的高度转化，溶液产量是12-60%的三醇酸。在标准条件下(相同的总蛋白浓度，或相同的酶活性，用荧光底物甲基伞形酮丁酸盐(MUB)进行标准化)，比较包括酶编码序列的基因组克隆，比较它们对洛伐他汀酸的水解作用，所述酶具有SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:6列出的序列(例如，分别由示范性的SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:5编码)。在反应条件下，具有包括SEQID NO: 4的序列的酶修饰出了最佳活性。对包括酶编码序列的基因组克隆进行亚克隆，所述酶具有SEQ ID N0:4和SEQ IDN0:2列出的序列(例如，分别由示范性的SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:1编码^SEQ ID NO: 2具有先导序列，认为其对分泌/定位是必须的，对SEQ ID NO: 2进行带有和不带有先导序列的亚克隆。对亚克隆进行MUB和洛伐他汀酸分析；仅带有先导序列的编码SEQ ID NO: 2的亚克隆显示出了对MUB的活性。并且，亚克隆均没有对洛伐他汀酸显示出活性。用包括编码SEQ ID N0:4的核酸的基因组克隆进行的转座子插入试验鉴定出了对洛伐他汀酯酶活性负责的基因。此基因编码预测分子量是43KD的酯酶，通过从天然凝胶分离出该43KD条带和证实对洛伐他汀酸的活性以及通过MS分析，进一步证实其身份(identity)。包括编码SEQ ID NO: 4的核酸的大肠杆菌构建物能够水解洛伐他汀，得到向三醇酸的93-98%的转化，所述反应在21小时、在35°C、在350mM底物的条件下发生。毛细管阵列本发明的 方法，和/或欲在本发明方法中应用的确定酶(多种酶)的筛选方案，可以全部或部分通过毛细管阵列来实施，如GIGAMATRIX , Diversa Corporation, SanDiego, CA。参见，例如W00138583。可以将试剂或多肽(例如酶)固定化或施加在阵列上，包括毛细管阵列。毛细管阵列提供了保持并筛选试剂、催化剂(例如酶)和产物的另一系统。该装置可以进一步包括排列在阵列中的相邻毛细管之间的间隙物质，和在间隙物质中形成的一个或多个参照标记。也可以将高通量筛选装置进行适应性修改并用其实施本发明方法，参见，例如，美国专利申请20020001809号。基于全细胞的方法本发明方法可以全部或部分地在全细胞环境中实施。本发明也提供了对细胞进行的全细胞进化或全细胞工程，以开发出具有新的表型的新细胞株，用于本发明方法，例如，包括本发明方法中应用的一种、几种或全部酶的新的细胞系。这可以通过修饰细胞的遗传组分来进行，其中所述遗传组分是通过将核酸加入细胞而被修饰的，所述核酸例如本发明方法中应用的酶的编码序列。参见，例如，W00229032、W00196551。“全细胞方法”中的宿主细胞可以是本领域技术人员已知的任何细胞，包括原核细胞、真核细胞，如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。为了检测本发明方法的中间产物或产物、或新表型的产量，通过代谢通量分析(Metabolic Flux Analysis (MFA))，在细胞中以“实时”或“在线”时间范围监测细胞(或遗传上修饰的细胞)中的至少一个代谢参数。在一个方面，许多细胞，如细胞培养物，被“实时”或“在线”监测。在一个方面，许多代谢参数被“实时”或“在线”监测。代谢通量分析(Metabolic Flux Analysis) (MFA)是基于已知的生物化学构架。根据质量守恒定律和对细胞内代谢物的准稳态假设(pseudo-steady statehypothesis (PSSH))，构建了线性非依赖性代谢矩阵。在实施本发明方法中，确立了代谢网络，包括 对所有通路底物、产物和中间代谢物的鉴定 对所有的使通路代谢物互变的化学反应的鉴定，通路反应的化学计量， 对催化反应的所有酶的鉴定,酶反应动力学， 通路成分之间的调节性相互作用，例如，变构作用、酶-酶相互作用等等， 酶或酶的任何其它超分子组分的细胞内区室化，和 任何浓度梯度的代谢物、酶或效应分子或它们移动的扩散屏障的存在情况。一旦对特定细胞株确立了代谢网络，可以导入经矩阵概念进行的数学表示(mathematic presentation),用以在可得到在线代谢物组(metalolome)数据时,估计细胞内代谢通量。代谢表型取决于细胞内整体代谢网络的变化。代谢表型取决于针对环境条件、遗传调节、发育状态和基因型等产生的通路使用上的变化。在本发明方法的一方面，在线MFA计算之后，通过研究通路使用，分析细胞的动态行为、它们的表型和其它性质。在通路分析之后，对细胞培养物的生理状态的调控将变得可能。本发明方法可以帮助确定如何调节发酵，这是通过确定如何改变底物供应、温度、诱导物的使用等，来控制细胞的生理状态，以沿着所需方向进行来实现的。在实施本发明方法中，MFA的结果也可以和转录物组(transcriptome)以及蛋白质组(proteome)数据相比较,用以设计试验和方案，用于进行代谢工程或基因改组等。代谢或生长的任何一个方面都可以被监测。监测mRNA转录物的表达在本发明的一方面，基因工程的表型包括增加或减少细胞中mRNA转录物的表达或在细胞中产生新的转录物。此增加或减少的表达可以通过应用荧光多肽来追踪，例如，包括本发明方法中应用的酶的 合蛋白质。mRMA转录物或信息(messages)也可以通过本领域的已知方法来检测和定量，包括，例如，Northern印迹、定量扩增反应、杂交于阵列、和类似方法。定量扩增反应包括，例如定量PCR，包括，例如定量反转录聚合酶链式反应或RT-PCR ;定量实时 RT-PCR，或“实时动力 RT-PCR”(real-time kinetic RT-PCR)(参见，例如Kreuzer(2001)Br. J. Haematol. 114:313-318;Xia(2001)Transplantation 72:907-914)。在本发明的一方面，基因工程的表型是通过敲除表达同源基因产生的。基因的编码序列或一个或多个转录控制元件可以被敲除，例如，启动子增强子。因此，转录物的表达可以被完全去除或仅仅被降低。在本发明的一方面，基因工程的表型包括增加同源基因的表达。这可以通过敲除负向调控元件，包括顺式或反式起作用的转录调节元件，或通过诱变正向调控元件来实现。可以通过与阵列上的固定化核酸进行杂交的方法，将包括细胞转录物或代表一个细胞的转录物的核酸样品或互补于一个细胞的转录物的核酸样品进行杂交，测定细胞中的一种或多种或所有转录物。监测多肽、肽和氨基酸的表达情况在本发明的一方面，基因工程的表型包括在细胞中增加或降低多肽的表达或产生新的多肽。此增加或减少的表达可以通过应用荧光多肽来追踪，例如，包括本发明方法中应用的酶的嵌合蛋白质。多肽、试剂和终产物(例如，新伐他汀)也可以通过本领域的已知方法来检测和定量，包括，例如，核磁共振(NMR)、分光光度法、放射显影术(蛋白质放射标记)、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、高扩散色谱(hyperdiffusion chromatography)、多种免疫学方法例如免疫沉淀、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫分析(RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析、凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)、用抗体染色、荧光激活细胞分选(FACS)、热解质谱法、傅里叶变换红外光谱、拉曼光谱、GC-MS和LC-电雾化以及加帽-LC-串联-电雾化质谱(cap-LC-tandem-electrospray massspectrometries)和类似方法。也可以用美国专利6，057，103描述的方法或其变化来筛选新的生物活性。使用蛋白质阵列，可以测量一个细胞的多肽。确定序列同一性的程度在本发明任意一个方法的一方面，所述过程的至少一个步骤包括由水解酶(例如酯酶或酰基转移酶)进行的酶促反应(例如，酰化作用)，所述水解酶是由与SEQ IDNOiUSEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:5具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，或序列完全(100%)相同的核酸编码的，或其酶学上的活性片段(或可选地，可商业得到的水解酶)。在本发明任意一个方法的一方面，至少一个酶促反应是由水解酶进行的，例如酯酶或酰基转移酶，具有和SEQ ID NO: 2,SEQ ID N0:4或SEQID NO:6 具有至少约 50 %、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性，或序列完全(100%)相同的序列，或其酶学上的活性片段(或可选地，可商业得到的水解酶)。可以用已知方案或此处描述的本发明方法，经常规筛选，确定酶活性。例如，可以通过检测多肽或肽是否能够水解内酯环或酶促地酰化二醇内酯，来确定酶活性，如此处所述。
可以用本领域中已知的许多序列比对算法和程序中的任一个来评价蛋白质和/核酸序列同源性。这种算法和程序包括但决不限于TBLASTN、BLASTP,FASTA、TFASTA、和 CLUSTALW (参见，例如，Pearson (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 (8):2444-2448;Altschul(1990)J. Mol. Biol. 215(3):403-410;Thompson(1994)NucleicAcids Res. 22(2):4673-4680 ;Higgins et al. , Methods Enzymol. 266:383-402，1996;Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990 ；Altschul et al. , Nature Genetics3:266-272， 1993)。通常用序列分析软件测定同源性或同--丨生(例如，Sequence Analysis
SoftwarePackage of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin BiotechnologyCenter, 1710University Avenue, Madison, WI 53705)。这种软件通过对各种删除、取代和其它修饰指定同源性程度来匹配相似序列。术语“同源性”和“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽序列的语境中，是指两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在比较窗(comparision window)或指定的区域上进行比较和比对得到最大对应性时,两个或更多个序列或子序列具有相同的氨基酸或核苷酸的具体百分数，正如使用任何数目的序列比对算法或通过人工比对和肉眼观察所测定。为了进行序列比较，一个序列通常作为参照序列，检测序列和所述参照序列相比较。当应用序列比对算法时，使检测序列和参照序列进入计算机，指定子序列的坐标(subsequence coordinates),如果需要,指定序列算法程序参数。可以采用默认的程序参数，或可以指定备选参数。随后，根据程序参数，序列比对算法计算出检测序列相对于参照序列的序列同一性百分数。如此处所用，“比较窗”包括参照由连续残基数目中的任一数目构成的片段。例如，在本发明的可选方面，在两个序列被最佳联配之后，将在本发明的示范性多肽或核酸序列的从约20个至全长范围内任一处的连续残基，和相同数目连续位置的参照序列相比较。如果参照序列和本发明的示范性多肽或核酸序列有必要的序列同一性，例如，与SEQ ID NO: I、与 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6有 50 %、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性，并且序列是水解酶或编码水解酶，则可以将该序列用于本发明方法的至少一个步骤。在可选的实施方案中，在两个序列被最佳联配之后，将约20至600、约50至200和约100至150范围的子序列和相同数目连续位点的参照序列相比较。用于比较的序列联配方法是本领域公知的。可以通过下列算法进行用于比较的序列最佳联配，例如Smith&Waterman, Adv.Appl. Math. 2:482, 1981 的局部同源性算法，Needleman&ffunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970的同源性联配算法，person&Lipman, Proc. Nat’ I. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988 的相似性方法搜索，这些算法的计算机执行(WisconsinGenetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575Science Dr.，564462012840Madis on, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA),或通过人工比对和肉眼观察。除了 BLAST程序(Basic Local Alignment SearchTool at the National Center forBiological Information),确定同源性或同一性的其它算法包括，例如，ALIGN、AMAS(多重比对序列分析(Analysis of Multiply AlignedSequences))、AMPS (蛋白质多重序列比对(Protein Multiple Sequence Alignment))、ASSET(比对片段统计评价工具(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool))、BANDS、BESTSC0R、BI0SCAN(生物学序列比较分析终端(Biological Sequence ComparativeAnalysis Node)) > BLIMPS (BLocks IMProved Searcher)> FASTA, Intervals&Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS,WCONSENSUS、Smith-ffaterman 算法、DARWIN、Las Vegas 算法、FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool) > Framealign> Framesearch>DYNAMIC、FILTER、FSAP (Fristensky Sequence AnalysisPackage)、GAP (Global AlignmentProgram)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(Sensitive Sequence Comparison)>LALIGN(LocalSequence Alignment)> LCP(LocalContent Program) > MACAW(Multiple AlignmentConstruction & Analysisfforkbench)>MAP(Multiple Alignment Program)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、SAGA (Sequence Alignment byGeneticAlgorithm)和WHAT-IF。这些比对程序也可以用来筛选基因组数据库,用以鉴定具有基本上相同序列的多核苷酸序列。注释有一些功能信息的含基因组信息的数据库由不同的组织所维护，可以经因特网得到。BLAST、BLAST 2. 0和BLAST 2. 2. 2算法也用来实施本发明。它们在例如Altschul (1977)Nuc. Acids Res. 25:3389-3402、Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中有所描述。进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开得到。此算法首先涉及，通过鉴定待询序列中W长度的短字符，鉴定出高度得分序列对(HSPs);其在与数据库序列中相同长度的字符串比对时，或是匹配于或是满足了一些正值的阈分值T。T是指相邻字符串得分阈值(neighborhood word score threshold) (Altschul (1990)见上文)。以这些起始的相邻字符串命中(neighborhood word hits)作为根据，开始搜索，以发现含有它们的更长的HSPs0字符串命中沿着每一序列在两个方向上延伸，直到累积的联配分数增加。对于核苷酸序列，累积分数是用参数M来计算的(M为对一对匹配残基的奖励分数；通常>0)。对于氨基酸序列，用得分矩阵计算累积分数。在下列情况下，字符串命中(word hits)在每一方向上的延伸被停止累积联配分数从其最大获得值降低数量X ;由于累积了一个或多个负记分残基联配，累积分数达到0或更低；或到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)应用的默认值是，字符串长(W)为11、期望值(E)是10、M=5、N=-4以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序应用的默认值是，字符串长为3、和期望值(E)为10，和BL0SUM62记分矩阵(参见Henikoff&Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比对(B)是50、期望值(E)为10、M=5、N=-4和比对两条链。BLAST算法也对两条序列的相似性进行统计学分析(参见，例如，Karlin&Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873)。BLAST 算法提供的一种相似性测定方法是最低总概率(smallestsumprobability) (P(N)),这表明了两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率。例如，如果在检测核酸和参照核酸的比较中，最低总概率小于约0. 2，更优选地小于约0. 01，最优选地小于约0. 001，则认为该核酸和参照序列相似。在一方面，蛋白质和核酸序列的同源性是用Basic Local AlignmentSearch Tool(" BLAST")来评价的。例如，可以用5个特定的BLAST程序实施下列任务(I)BLASTP和BLAST3将氨基酸待询序列和蛋白质序列数据库相比较；(2) BLASTN将核苷酸待询序列和核苷酸序列数据库相比较；(3) BLASTX将待询核苷酸序列(两条链)的六框架概念上的翻译产物与蛋白质序列数据库相比较；(4) TBLASTN将待询蛋白质序列和在所有六个阅读框(两条链)中翻译的核苷酸序列数据库相比较；和(5)TBLASTX将核苷酸待询序 列的六框架翻译产物和核苷酸序列数据库的六框架翻译产物相比较。BLAST程序通过鉴定相似片段来鉴定同源序列，这被称作在待询氨基酸或核酸序列与检测序列之间的“高度匹配的片段对(high-scoring segmentpairs)”,所述检测序列优选地得自蛋白质或核酸序列数据库。高得分片段对(high-scoring segment pairs)优选地通过记分矩阵方法被鉴定出来(即被比对出来)，许多记分矩阵方法是已知的。优选地，应用的记分矩阵是BL0SUM62矩阵(Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992 ；Henilsoff and Henilcoff,Proteins 17:49-61，1993)。较不优选地，也应用PAM或PAM250矩阵(参见，例如，SchwartzandDayhoff, eds. , 1978,Matrices for Detecting Distance Relationships : Atlasof ProteinSequence and Structure, Washington: National Biomedical ResearchFoundation)。在本发明的一方面，应用NCBI BLAST 2. 2. 2程序，这是blastp的默认选项。BLAST2. 2. 2程序中有约38个设置选项。在本发明的此示范性方面，除了默认滤过设置之外，应用所有的默认值(即，除了将滤过设置为关闭之外，将所有参数设置为默认值)；在其位置上，应用“-F F”设置，这使得不能滤过。应用默认的滤过通常导致Karlin-Altschul干扰，其原因是序列的短长度。用于本发明的此示范性方面的默认值包括“对低复杂性滤过(Filter for low complexity) :ON字符串长度(WordSize) :3矩阵Blosum62空位罚分(GapCosts):(空位存在)existence: 11空位延伸(extension):]/’其它的默认设置可以是对低复杂性滤过OFF，对蛋白质的字符串长度为3，BL0SUM62矩阵，空位存在罚分为-11和空位延伸罚分为-I。示范性NCBI BLAST2. 2. 2程序设置的“-W”选项默认为O。这意味着，如果未加设置，蛋白质的字符串长度默认为3，核苷酸的字符串长度默认为U。
参照下面的实施例进一步描述本发明；然而，应该理解，本发明不限于这些实施例。
实施例实施例I :化学酶促地生产新伐他汀下面的实施例描述了本发明的示范性方案，例如，用于化学酶促地生产新伐他汀。洛伐他汀的酶促水解在7_10%Me0H/缓冲液中的浓度是0. I至0. 5M的洛伐他汀或洛伐他汀酸中，评价具有SEQ ID N0:4(由SEQ ID NO:3编码)序列的酶，通过自动加入碱，将反应维持在pH9-9. 5进行。例如，在500ml规模上，在0. 5M洛伐他汀中，用含有14mg/ml总蛋白的酶SEQID N0:4(来自裂解细胞的离心上清液)冻干制备物，在48小时之后观察到底物的完全转 化。使反应混合物酸化(pH 2)，离心收集沉淀并使之干燥。用iPrOAc萃取滤液，将有机相萃取物加入干燥滤饼。加热得到的悬浮液，在Dean-Stark仪器中回流，直至内酯化作用完成。将得到的溶液滤过硅藻土垫(Celite pad)，用饱和(satd. ) NaHCO3洗涤滤液。浓缩得到的iPrOAc溶液直至(X 0.5)，用已烷稀释并冷却至0°C。过滤沉淀出的固体并空气干燥，产生二醇内酯^3g，79. 5%分离产率；其它10. 3g产物在各种洗涤液和母液中得到鉴定)。产物含有〈1%的洛伐他汀。二醇内酯的酶促酰化在室温下振荡二醇内酯(25mM)、乙酸乙烯酯(250mM)和南极洲假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶B(33mg)在TBME(Iml)中的混合物。44小时之后，HPLC表明形成了单乙酸酯，转化率是60%。制备乙酿基新伐他汀在室温中，真空下，过夜干燥4-乙酰基内酯，在氮下储存，然后在氮下室温中溶解于无水二氯甲烷中(lg/2.5-3ml的比值)。同时，在最小量的乙腈中室温下溶解Cu (OTf)2(5mol%)，随后向溶液中加入I. 05-1. 2当量的二甲基丁酸酐，室温下搅拌30分钟至I小时。在氮气氛下，在室温下，将此Cu (OTf)2/酸酐溶液通过注射器转移到4-乙酰基内酯溶液中，同时搅拌。当完成时(HPLC监测)，通过加入水淬灭(quench)反应，用饱和NaHCO3洗涤。分离的有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到粗产物4-乙酰基新伐他汀(>99)。乙酿基新伐他汀的酶促水解3. 22g乙酰基新伐他汀(终浓度为350mM)；2ml MeOH ； 100 u I 4M Tris ；9. 9ml 水；8ml酯酶(SEQ ID N0:4，由例如SEQ ID NO:3编码)，水中的125mg/ml冻干裂解物。反应在带有顶部搅拌和磁力搅棒的25ml容器中进行。pH稳态条件(pH-statconditions)是由 DasGip ST丨RRER-PRO 系统维持的；pH 值 7 是通过加入 10%NH4OH维持的。转化率接近 75%时，加入4ml的甲苯使物质溶解。使反应过夜进行，此时加入另外的溶剂(甲苯或二氯甲烷)以确保所有的不溶性物质被溶解。反应的最终组分是新伐他汀酸4. 7%，新伐他汀90. 9%，乙酰基新伐他汀0. 9%，推断的新伐他汀消除产物是3.5%。最终的转化率是95. 6%。实施例2 :洛伐他汀酯酶分析在一方面，本发明提供了方法，包括用水解酶，例如，本发明的酶，例如SEQID N0:3编码的SEQ ID NO: 4,酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸。在一方面，本发明提供了方法，包括酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生新伐他汀。下列例子描述了示范性的洛伐他汀酯酶分析，可以用其来实施本发明方法。例如，该示范性分析可以用来确定是否可以用水解酶例如酯酶来实施本发明方法。(a)细胞裂解(分析级)从B-PER(4. 5L) (Pierce, #78248)、溶菌酶(200 y L) (Sigma，L-6876 ;贮存液 IOmg/ml)和DNase I (40 u L) (Sigma, DN-25 ;贮存液5mg/mL)，制备冰冷裂解液(足够用于9个样品)°同时，通过在950 ii L水中漩涡振荡并以16，OOOg在4°C离心15分钟，重悬浮50 y L的培养物。通过移液管吹打，将得到的细胞沉淀重悬浮在500 UL裂解液中。在进行活性分析之前，将样品在冰上温育45分钟。(b)总蛋白定量蛋白质定量可以通过基于考马斯染料的任何分析，用Bradford法进行；此时应用的试剂盒是 Coomassie Plus Protein Assay Kit (Pierce, #23236)。按制造商的指南使用(可以从 Pierce, Doc#0229 得到)。将感兴趣的蛋白质溶液稀释到同时测定的已知蛋白质浓度的标准品(白蛋白)的线性范围内。得知蛋白质的浓度后，计算合适的稀释度，以允许合理地吸取0. I微克的总蛋白(即，在2至20ii L范围)。(c)酶活性甲基伞形酮丁酸盐(MUB)水解使0. I ii g总蛋白成为25 u L，带有50mM Tris-HCl pH9缓冲液(缓冲型/pH是可变的)，置于96孔板中。同时制备4mM MUB (9. 8mg,在IOmL DMSO中)储液并分配在400 u L的等分试样中，在_20°C存储。将贮存液稀释至200 ii M的工作浓度400iiL，溶于pH 7. 0的7. 6mL IOmM HEPES缓冲液。在动态地在300秒期间阅读荧光板读数器(SPECTRAMAX GEMINIXS: ex=360nm; em=465nm)之前即刻，向25 y L样品中加入工作MUB液。工作液可以在4°C存储几天，而后发生降解。优选地，在每次分析之前，使等份DMSO贮存液解冻，并制备新鲜的工作液。SEQ ID NO:4 (IOOg水平)对洛伐他汀的水解包括将洛伐他汀酶促水解为三醇酸的本发明示范性反应示例于图18E中。I.将洛伐他汀(10X10g，0. 25mol)和水(13X10mL)按交替的部分缓慢加入快速搅拌的MeOH (35mL，终体积是7%)和6M Na0H(43mL,0. 26mol)的混合物中，混合物在配备有顶部搅棒搅拌器(overhead paddle stirrer)的IL的3_颈烧瓶中。2.当得到均相混合物时，在35°C下搅拌该混合物，直至pH值降至8 (大约2小时)，洛伐他汀因而转化为洛伐他汀酸。3.同时将冻干的酶(22. 64g)和水重新结合(终体积是180mL)。将4M Tris (4mL)和重新结合的酶溶液加入洛伐他汀酸溶液。加入水(108mL)使体积成为500mL，随后进行、pH调控。4.用DASGIP AG-PRO 生物反应器，用30%的NH4OH维持pH为9. 5，来控制反应。搅拌反应物48小时(备注1，如下)并维持在35°C，定期移去等分试样(10 ii L，在990 ii LMeOH中淬灭)，经HPLC监测反应进程(备注2，如下)。5.转移至4L烧杯中并用水稀释(IL)，使反应终止。用6M HCL调节混合物的pH值。在pHl. 4时，混合物变得非常粘，同时沉淀出白色固体，使搅拌速度增加以防止混合物“凝胶化”。用总量120mL的6M HCL将混合物调节为pH 2. 5并再搅拌0. 5小时。6.将得到的衆液通过21cm Buchner漏斗上的Whatman#l滤纸而过滤,用水(0. 5L)洗涤潮湿的滤饼。使潮湿的滤饼在空气中干燥 I小时；随后将其转移到4x600mL的冻干瓶中，并在冻干机上干燥48小时，产生浅白色的粉末(98. 6g)(备注3，如下)。7.将滤液分为三等份，用单份EtOAc (500mL)萃取。尽管第一次萃取分离得容易，但第二和第三份形成乳液，所述乳液甚至在用饱和NaCl (IOOmL)处理后，也没有完全分离。用饱和(“satd”)NaCl (IOOmL)洗涤EtOAc萃取物，干燥(Na2SO4)并过滤。在N2下搅拌滤液，在 5分钟期间滴加溶于EtOAc (5mL)中的MeSO3H溶液(0. 2mL, 3. Immol ;终浓度是 7mM)。4. 5小时之后，用饱和NaHCO3 (200mL)、水(IOOmL)和饱和NaCl (IOOmL)洗涤反应液。在旋转蒸发仪上将EtOAc层浓缩至飞OmL，缓慢滴加已烷(200mL)，沉淀出二醇内酯。经过滤和干燥收集沉淀的固体(3. 36g，纯度是81. 3%);另外0. 26g残留在母液中。8.确定总产率是94. 9% (参见备注4，如下)。备注I. HPLC表明，IOOg水平的反应在22小时之后完成了、7%，但常常搅拌反应较长时间，以确保完全水解，2.样品是在配备有 DAD 的 Waters IlOOSeries HPLC 上，用 ZORBAX SB-苯基柱(4. 6x 75mm) (45%MeCN/0. 1%H3P04 等度(isocratic) ；lml/min ；30°C ；238nm)分析的。洗脱的顺序是三醇酸1. 4分钟，二醇内酯1. 9分钟，洛伐他汀酸3. 8分钟，洛伐他汀7. 3分钟。3.此阶段的滤饼由粗三醇酸和沉淀出的蛋白质组成。4.计算出的产物的总产量显示在表中5.
ri纯度％~毫摩尔
原料洛伐他汀100 100247
产物三醇酸98 6 77.8*225
分离的二醇内酯3 36 81. 5* 8 5
母液中的二醇内酯 02608~~234. 3 ~94. 9%~#由1HNMR分析，与内标甲基甲酸比较。*由HPLC分析，与工作标样比较。SEQ ID NO: 4 (150g水平)对洛伐他饤的水解I.将洛伐他汀(150g，0. 37mol)和水(300mL)按交替的部分缓慢加入快速搅拌的MeOH(52. 5mL)和50% w/wNa0H(30mL, 0. 57mol)的混合物中，混合物在配备有顶部搅棒搅拌器的IL的3-颈烧瓶中。室温下搅拌反应物过夜，然后用浓缩HCl r25mL)将澄清的混合物酸化至pH 7-8(备注1，如下)。
2.将SEQ ID N0:4(17g)和水重新结合(50mL水)并将其加入反应。再加入一份水水(300mL)，使反应总体积为750mL。3.用 DASGIP AG FEDBATCH-pro 生物反应器，用 30% 的 NH4OH 维持 pH 为 9. 5，来控制反应。搅拌反应物并维持在35°C，定期移去等分试样(10iiL，在990iiLMe0H中淬灭)，由HPLC监测反应进程(备注2，如下)。4. 86. 3小时之后，HPLC表明，残留%的洛伐他汀酸并且反应被终止。将反应混合物转移至4L烧杯中，用水(IL)稀释并剧烈搅拌。用6M HCL(160mL)使混合物酸化至pH值2. 5，室温下再搅拌I. 5小时。5.将得到的衆液通过19cm Buchner漏斗上的Whatman#l滤纸而过滤,用水(0. 5L)洗涤潮湿的滤饼。混合物容易地滤过，得到奶白色的滤饼和金黄色的滤液。使潮湿的滤饼在空气中干燥 I小时；随后将其转移到4x600mL的冻干瓶中，并在冻干机上干燥，产生浅白色的粉末(154. 8g)(备注3，如下)。6.将滤液分为三等份，用单份的EtOAc (600mL)萃取。用饱和NaCl (IOOmL)洗涤EtOAc萃取物、干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩为 250mL。在N2下搅拌滤液，在飞分钟期间滴加溶于EtOAc (4mL)中的MeSO3H溶液(0. 2mL, 3. Immol ;终浓度是 15mM)。70分钟之后，用饱和NaHCO3 (200mL)和饱和NaCl (50mL)洗涤反应液。使EtOAc溶液保持过夜、轻轻倒出并在旋转蒸发仪上浓缩至 120mL。缓慢滴加已烧(200mL),沉淀出二醇内酯。过滤和干燥沉淀的固体(3. 22g，纯度是92. 3%);另外0.47g残留在母液中。7.确定总产率是98. 9%(参见备注4，如下)。计算出的产物的总产量显示在下面的表中
ri纯度％ 毫摩尔
原料洛伐他汀150 100371
产物三醇酸154.8 77.8* 356
分离的二醇内酯3 22 92. 3* 9 3
母液中的二醇内酯 047L权利要求
1.用于制备新伐他汀的方法，其包括 (i)包括以下步骤的方法 (a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸盐； (b)内酯化和酰化三醇酸，产生4-乙酰基内酯，其中所述酰化包括通过区域选择性酰化4’ -0H，保护内酯环上的4位羟基(4’ -OH)； (c)酶促酰化4-乙酰基内酯的8位羟基(8’-0H)，产生4-乙酰基新伐他汀；和 (d)化学地或是酶促地选择性去除4’位的酰基保护基团，从而产生新伐他汀； (ii)(i)所述的方法，其中所述步骤(b)中的酰化包括，通过酶促区域选择性酰化4’ -0H，保护内酯环上的4位羟基(4’ -0H)； (iii)⑴或(ii)所述的方法，其中所述步骤(c)中的酶促酰化4-乙酰基内酯8位羟基(8’ -0H)，酶促地区域选择性酰化第8位，产生4-乙酰基新伐他汀； (iv)同型二酰基化方法，包括以下步骤 (a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸； (b)通过内酯化，从三醇酸产生二醇内酯； (c)通过化学酰化，酰化二醇内酯的内酯环上的第4位(4’-0H)和第8位(8’-0H)，产生4，8-二乙酰基内酯；和 (d)通过酶促水解，选择性去除4’位的酰基，从而产生新伐他汀； (v)(i)至(iv)中任一项所述的方法，其中至少一个步骤是在单独的反应容器中进行的； (vi)(i)至(V)中任一项所述的方法，其中至少两个步骤是在单独的反应容器中进行的； (vii)(i)至(vi)中任一项所述的方法，其中至少一个步骤是用细胞提取物进行的； (viii)(i)至(vii)中任一项所述的方法,其中至少一个步骤是在全细胞中进行的； (ix)(i)至(viii)中任一项所述的方法，进一步包括新伐他汀的结晶； (x)(ix)所述的方法，进一步包括新伐他汀的重结晶； (xi)(i)至(X)中任一项所述的方法，进一步包括重新内酯化，用以提供具有所需纯度的新伐他汀； (xii)(i)至(xi)中任一项所述的方法，其中至少一个酶促反应是用水解酶进行的，所述水解酶是由与 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 5 有至少 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)的核酸所编码的，或者是其酶促活性片段； (xiii)(i)至(xii)中任一项所述的方法，其中至少一个酶促反应是通过水解酶进行的，所述水解酶具有的序列和SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6有至少约50%、、51 %、52 %、53 %、54 %、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性，或序列完全相同(100% )，或者是其酶促活性片段；(XiV) (i)至(Xiii)中任一项所述的方法，其中所述方法包括酶促水解洛伐他汀，产生三醇酸或三醇酸盐，随后通过内酯化三醇酸和酶促酰化内酯环的第4位(4’-0H)，产生4-酰基内酯，之后酶促酰化4-酰基内酯，产生4-乙酰基新伐他汀，然后通过区域选择性酶促水解4-乙酰基新伐他汀，产生新伐他汀。
2.制备4-乙酰基内酯的方法，包括酶促水解洛伐他汀，产生三醇酸或三醇酸盐，随后通过内酯化三醇酸，产生二醇内酯，然后通过区域选择性酰化二醇内酯中内酯环上的第4位(4’ -OH)，产生4-乙酰基内酯。
3.制备4-乙酰基新伐他汀的方法，包括酶促水解洛伐他汀，产生三醇酸或三醇酸盐，随后通过内酯化三醇酸，产生二醇内酯，之后通过区域选择性酶促酰化二醇内酯中内酯环上的第4位(4’-0H)，产生4-乙酰基内酯，然后通过区域选择性酶促酰化4-乙酰基内酯中内酯的第8位(8’ -0H)，产生4-乙酰基新伐他汀。
4.从洛伐他汀制备三醇酸或三醇酸盐的方法，包括 (a)提供洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀盐，以及水解酶； (b)在酯酶催化洛伐他汀水解为三醇酸或三醇酸盐的条件下，用酯酶接触洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀盐。
5.权利要求4所述的方法，其中所述水解酶的序列和SEQID NO: 2,SEQ IDN0:4或SEQID NO:6 有至少约 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一'I"生，或序列完全相同(ιοο%)。
6.从洛伐他汀、三醇酸、4-酰基内酯或4-酰基新伐他汀制备新伐他汀或相关化合物的方法，包括权利要求I列出的方法，其中在步骤3中加入的4位保护基团是R基团，所述R基团选自 (i)_H，甲基或甲酰衍生物； (ii)Cl-n烷基，直链和支链的，其中η是I和20之间的整数； (iii)取代的烧基； (iv)苯基和取代的苯基例如苯基、对硝基苯基；和 (v)R'O-基团，其形成碳酸酯保护基团，其中所述R'是(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任何一个基团。
7.权利要求6所述的方法，其中所述取代的烷基包括氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯乙酰基、4-氧戊基(乙酰丙酸)或其等价物。
8.权利要求6所述的方法，其中所述碳酸酯保护基团包括tBuOCO、PhOCO,PhCH2OCO或其等价物。
9.试剂盒，包括试剂和至少一种水解酶，用于实施权利要求1、2、3、4、6、7、8或11的方法中至少一个。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中所述至少一种水解酶的序列和SEQID NO: 2, SEQID N0:4或SEQ ID N0:6有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、.99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100% )，或者是其酶促活性片段。
11.制备新伐他汀的方法，包括 (i)5步异二酰基化过程，所述过程包括下列步骤 (a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸盐； (b)内酯化三醇酸，产生二醇内酯； (c)通过酶促地区域选择性酰化4’-OH，保护二醇内酯的内酯环上的第4位羟基(4’ -OH)，产生4-酰基内酯； (d)通过酶促地区域选择性酰化第8位，酰化4-酰基内酯的第8位羟基(8’-0H)，产生.4-酰基新伐他汀；和 (e)化学地或是酶促地选择性去除4’位的酰基保护基团，从而产生新伐他汀； (ii)(i)所述的方法，其中在步骤(b)中的内酯化三醇酸产生二醇内酯包括，加热三醇酸或在酸存在下进行搅拌，产生二醇内酯。
全文摘要
本发明提供了制备新伐他汀及各种中间体的合成化学和化学酶方法。在一个方面，在本发明方法中应用酶，如水解酶，例如酯酶。
文档编号C07DGK102703539SQ20121015103
公开日2012年10月3日 申请日期2004年10月20日 优先权日2003年10月21日
发明者B·摩根, J·查普林, K·库什特德约, M·伯克, M·莱温, W·格林伯林, 朱作霖, 黄子林 申请人:维莱尼姆公司