酶催化不对称转氨基反应制备沙格列汀手性中间体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于沙格列汀金刚烷类中间体的制备领域，具体涉及一种酶催化不对称转 氨基反应制备沙格列汀中间体的方法。 技术背景
[0002] 糖尿病（diabetes)是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒 素、精神因素等各种致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、 蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。糖尿病已成为当今世界上导致死亡的 第四大疾病，并且中国将有可能超过印度，成为世界糖尿病第一大国。
[0003] 沙格列汀是一种高效二肽基肽酶IV(DipeptidylPeptidase4,DPP-4)抑制 剂，通过选择性抑制DPP-4,可以升高内源性胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)和葡萄糖依赖 性促胰岛素释放多肽水平，从而调节血糖。沙格列汀的化学合成中，手性中间化合物：
I勺合成是沙格列汀最关键的步骤之一。利用氨基酸脱氢酶对羰基进行 转氨反应是合成手性中间化合物的有效手段，但是该过程需要连续添加持续消耗的烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸（NADH)作为辅酶，辅酶NADH的价格昂贵，而且生成的氧化型辅酶NAD+是 NADH的竞争性抑制剂，因此酶催化合成生产沙格列汀手性中间产物很难实现产业化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对酶催化合成生产沙格列汀手性中间产物很难实现产业化 的不足，提供一种酶催化不对称转氨基反应制备沙格列汀中间体的方法。通过采用甘油脱 氢酶和L-苯丙酸脱氢酶偶联反应生产手性沙格列汀中间体，构建包括辅酶NAD+循环再生 的多酶反应系统，在添加少量辅酶NADH的条件下，实现沙格列汀手性中间产物的高效合 成。
[0005] -种酶催化不对称转氨基反应制备沙格列汀手性中间体的方法，以沙格列汀中间 体1和甘油为底物，以NADH为起始辅酶，在含氨基的水相体系中，将苯丙氨酸脱氢酶和甘油 脱氢酶偶联，制得沙格列汀手性中间体2和1，3-二羟基丙酮，并实现还原型辅酶NADH和氧 化性型辅酶NAD+的循环再生；具体合成路线为：
[0006] 式 1 本发明采用苯丙氨酸脱氢酶（phenylalaninedehydrogenase，F>DH)在水溶液中制 备沙格列汀手性中间体，同时利用甘油脱氢酶（GDH)催化甘油生产1，3_二羟基丙酮（1， 3-Dihydroxyacetone，DHA)的反应作为偶联酶再生体系，构建包括辅酶NAD+循环再生的 多酶反应系统，在添加少量辅酶NADH的条件下，实现沙格列汀手性中间体（（（2S) - (3-羟 基-1-金刚烷基）-2-氨基甲酸)）的高效合成。
[0007] 以NADH为起始辅酶，以相应浓度的沙格列汀中间体1 ((3-羟基-1-金刚烷 基）-2-羰基甲酸）和甘油进行偶联反应。
[0008] NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，为还原态的还原型辅酶I。本发明中采用的NADH 起始浓度（〇. 1ymol/L)是基于NADH得电子反应，中间体1的用量综合考量后确定的。
[0009] 式二 中间体1(3-羟基-1-金刚烷基）-2_羰基甲酸的浓度为10mm〇l/L~30mm〇l/L，主要考 虑了中间体在含氨基的水相体系为NH4C1 -NH40H缓冲体系中的溶解度，以使中间体在缓冲 体系中较好的分散，利于反应的进行。
[0010] 甘油的浓度为50mm〇l/L~300mm〇l/L，以使甘油脱氢酶（GDH)催化甘油产生1，3_二 羟基丙酮（1，3-Dihydroxyacetone，DHA)的反应能够提供足够的e供NAD+转化为NADH。
[0011] ⑶H和苯丙氨酸脱氢酶的用量分别为l-100U/mL和l-100U/mL，两种酶的用量是 基于催化速率以及经济效益综合考量确定的；最佳用量为：苯丙氨酸脱氢酶的用量为50U/ mL，甘油脱氢酶的用量为50U/mL。
[0012] 反应条件为：pH8. 5，1.0mol/LNH4C1-NH40H的缓冲体系，反应总体积控制在 1. 5mL，反应温度控制在苯丙氨酸脱氢酶及甘油脱氢酶催化的最适温度30°C，转速为140r/ min，因酶催化反应速率较快，反应进行5min后即取出反应样品，分别检测产物DHA和沙格 列汀手性中间体的浓度。
[0013] 然后向体系补加一定体积的NADH(10ymol/L)，使体系中总辅酶浓度达到 0. 2ymol/L;待反应平衡后，再次取样，检测产物浓度并补充一定体积的NAD+使辅酶总浓度 达到0? 3ymol/L;如此反复添加辅酶共4次，通过逐步提高辅酶总浓度至0? 5ymol/L，可避 免过量的NADH抑制NAD+向NADH的转化；最终检测产物DHA和沙格列汀手性中间体2的浓 度，沙格列汀手性中间体2产率可达80%-100°/〇。
[0014] 沙格列汀手性中间体2的高压液相色谱检测方法：采用C18 ( 4.6mmX250mm， 5 ym)色谱柱，流动相为乙腈一0.06%三氟乙酸溶液（20:80)，流速1.0 mL，min\柱温30°C，进样量10 y L;检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度55 °C，雾化气体为空气，载 气流速为2. 0 L ? min、
【具体实施方式】
[0015] 本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实 施例。
[0016] 实施例1 以0. 1 y mol/LNADH为起始辅酶，浓度10mmol/L的沙格列汀中间体1和50 mmol/L的甘 油进行偶联反应；反应条件为：pH 8. 5,1. Omol/L NH4C1 - NH40H的缓冲体系，GDH和苯丙氨 酸脱氢酶的用量分别为lU/mL和lU/mL，反应总体积1. 5 mL，温度30°C，转速为140 r/min， 待反应5min达到平衡后，取样200 y L，分别检测产物DHA和沙格列汀手性中间体的浓度； 然后向体系补加8 y L的NADH(10 ymol/L)，使体系中总辅酶浓度达到0? 2 ymol/L ;待反应 平衡后，再次取样200 y L，检测产物浓度并补充44 y L的NAD+使辅酶总浓度达到0. 3 y mol/ L ;如此反复添加辅酶共4次，最终辅酶总浓度达到0. 5 y mol/L ;最终检测产物DHA和沙格 列汀手性中间体2的浓度，沙格列汀手性中间体2的产物浓度为10mm〇l/L。
[0017] 实施例2 以0. 1 y mol/LNADH为起始辅酶，浓度20mmol/L的沙格列汀中间体1和200mmol/L的甘 油进行偶联反应；反应条件为：pH 8. 5,1. 0mol/L NH4C1 - NH40H的缓冲体系，GDH和苯丙氨 酸脱氢酶的用量分别为40U/mL和40U/mL，反应总体积1. 5mL，温度30°C，转速为140 r/min， 待反应5min达到平衡后，取出200 y L，分别检测产物DHA和沙格列汀手性中间体的浓度； 然后向体系补加25 y L10 y mol/L的NADH，使体系中总辅酶浓度达到0? 2 y mol/L ;待反应平 衡后，再次取样200 y L，检测产物浓度并补充22 y L的NAD+使辅酶总浓度达到0. 3 y mol/ L ;如此反复添加辅酶共4次，最终辅酶总浓度达到0. 5 y mol/L ;最终检测产物DHA和沙格 列汀手性中间体2的浓度，沙格列汀中间体2的产物浓度为16mmol/L。
[0018] 实施例3 以0. 1 ymol/LNADH为起始辅酶，浓度20mmol/L的沙格列汀中间体1和200mmol/L的 甘油进行偶联反应；反应条件为：pH 8. 5,1. 0mol/L NH4C1 - NH40H的缓冲体系，GDH和苯丙 氨酸脱氢酶的用量分别为50U/mL和50U/mL，反应总体积1. 5mL，温度30°C，转速为140 r/ min，待反应5min达到平衡后，取出200 y L，分别检测产物DHA和沙格列汀手性中间体的 浓度；然后向体系补加28 y L的10 y mol/L的NADH，使体系中总辅酶浓度达到0? 2 y mol/ L ;待反应平衡后，再次取样200 y L，检测产物浓度并补充24 y L的NAD+使辅酶总浓度达到 0. 3 y mol/L ;如此反复添加辅酶共4次，最终辅酶总浓度达到0. 5 y mol/L;最终检测产物 DHA和沙格列汀手性中间体2的浓度，沙格列汀手性中间体2的产物浓度为20mmol/L。
[0019] 实施例4 以0. 1 ymol/LNADH为起始辅酶，浓度20mmol/L的沙格列汀中间体1和200mmol/L的 甘油进行偶联反应；反应条件为：pH 8. 5,1. 0mol/L NH4C1 - NH40H的缓冲体