比伐芦定中间体的固相合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及比伐芦定中间体的固相合成方法。
【背景技术】
[0002] 凝血酶是胰蛋白酶样高度特异的丝氨酸蛋白酶，催化活性位点为作用于精氨酸残 基的特异性袋状结构。除活性位点外，凝血酶上还有阴离子结合位点识别纤维蛋白原或肝 素。凝血酶在生理止血过程中起核心作用。水蛭素是天然存在的活性最强的凝血酶抑制蛋 白，由65个氨基酸组成，含硫酸化酪氨酸，和凝血酶通过二价结合形成特异紧密的1:1复合 物。水蛭素由N-端含紧密核心结构域与C-端延展带负电结构域组成，C-端结构域识别阴 离子结合位点后导致凝血酶发生微小的构象转换，随后N-端结构域与催化位点及邻近的 非极性区域结合，将十肽环状结构挤出活性位点。
[0003] 凝血酶活性位点抑制剂与阴离子结合位点抑制剂有协同效应，1990年 Maraganore,Feton和Kline在美国专利US5196404中，据此设计了凝血酶二价抑制剂比 伐芦定=H-D-Phel-Pro2-Arg3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn9-Glyic1-Asp11-Phe12-Glu13-G lu14-Ile15-Pro16-Glu17-Glu18-Tyr19_Leu2°-〇H。C-端 12 肽为水蛭素片段，能够结合阴离子 结合位点；N-端四肽D-Phe1-Pro2-Arg3-Pro4与活性位点结合；中间用四个连续的甘氨酸 Gly5-Gly6-Gly7-Gly8连接。因其Arg3-Pro4会被凝血酶缓慢水解而游离出活性位点，故为可 逆性二价凝血酶直接抑制剂。比伐芦定自2000年上市以来临床应用成长迅速，在美国的冠 脉介入手术中已取代肝素成为主导用药（Nat.Rev.DrugDisc. 2009;V0I8:353-354)。
[0004] 比伐芦定是含20个氨基酸残基的多肽，固相、液相合成技术都被尝试用于比伐芦 定的合成。液相合成的优点是每步中间产物的合成可以直接进行过程控制，并有机会得以 纯化；缺点是工艺复杂，占用较多工时与人力，需要较多设备与场地。固相合成工艺简单，占 用工时与人力较少，物料转移较少而节省设备与场地；其缺点是每步中间产物不可以纯化， 必须优化各步反应条件使得转化率接近100%、而且尽可能避免副反应的发生。比伐芦定的 合成中需要将体积庞大的保护精氨酸与Pro的亚氨基缩合，导致比伐芦定中Arg3-Pro4缩合 不完全。这不利于工艺过程中反应终点的控制，也在合成产物中引入了杂质、增加了纯化难 度。使用Fmoc-Arg(Pbf)-Opfp,Fmoc为9-莉甲氧羰基，Pbf为2, 2, 4,6, 7-五甲基二氢苯 并呋喃-5-磺酰基，Opfp为五氟苯酯，通过12小时以上的长时间反应能够改善缩合不完全 问题。先合成二肽中间体为Fmoc-Arg(Pbf) -Pro-OH，再用中间体进行缩合反应，来避开该缩 合难点。也有人发现使用5. 5-6. 5倍过量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH有助于该缩合反应的进行。 我们的实验表明增加投料量、延长反应时间、重复缩合并不能达到缩合完全。
[0005] 针对固相合成工艺中Arg3-Pro4位点的缩合困难问题，有专利使用五氟苯酯 Fmoc-Arg(Pbf)-Opfp来改善缩合不完全问题，但需要长达12小时的缩合反应。有专利使用 二肽中间体Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH来回避缩合困难，但需要复杂工艺制备二肽中间体。有 专利通过提高Fmoc-Arg(Pbf)-OH的投料量来推动反应，这样会增加物料成本，更重要的是 该方法对Wang树脂效果不佳。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有比伐芦定固相合成工艺中，Arg3-Pro4 位点的缩合困难、反应时间长、转化率低、收率低、反应工艺复杂、反应条件苛刻、生产成本 高、不利于工业化生产等缺陷，而提供了比伐芦定中间体的固相合成方法。本发明的固相合 成方法可促进大位阻的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行缩合反应，实现了比伐芦定的高载 样量合成，缩合率达可达到84%?100%，反应工艺简单、反应条件温和、转化率高、收率高、 生产成本低、适合于大规模工业化生产。
[0007] 本发明提供了一种肽树脂18的固相合成方法，其包括以下步骤：
[0008] 步骤1，在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂17进行脱除脯氨酸芴甲氧羰酰 基氨基保护基的反应，得到肽树脂17'；所述的肽树脂17为Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-A sn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-R10 ;所 述的肽树脂17,为H-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -I Ie-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-R10；
[0009] 步骤2,在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤1中制得的 肽树脂17'与Fmoc-Arg(R2)-OH进行缩合反应，得到肽树脂18 ;所述的肽树脂18为Fmoc-A rS (R2) -Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu ( R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-R10；
[0010] 其中，R2为胍基保护基，所述的胍基保护基可以为本领域中对胍基进行保护的常 规保护基，优选2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、4-甲氧基-2, 3, 6-三甲基苯 磺酰基或2, 2, 5, 7, 8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；R3为酰胺保护基，所述的酰胺基保 护基可以为本领域中对酰胺基进行保护的常规保护基，优选三苯甲基、2, 4, 6-三甲氧基苄 基或4-甲基三苯甲基；&、1?5、1?6、1? 7和R8各自独立的为羧基保护基，所述的羧基保护基可以 为本领域中对羧基进行保护的常规保护基，优选叔丁基或金刚烷基；R9为酚羟基保护基，所 述的酚羟基保护基可以为本领域中对酚羟基进行保护的常规保护基，优选叔丁基或2-氯 三苯甲基；Leu-Rltl为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂与亮氨酸中的羧基缩合后的基 团；所述的Trityl-Cl类型树脂是指含有苄氯结构的树脂，优选2-氯三苯甲基树脂；所述 的羟基类型树脂是指含有羟基的树脂，优选wang树脂。
[0011] 在制备所述的肽树脂18的步骤1中，假设肽树脂17由具有具体摩尔量的起始原 料完全转化得到，因此，制备过程中使用的各个试剂的用量均依据该具有具体摩尔量的起 始原料计算得到。
[0012] 在制备所述的肽树脂18的步骤1或步骤2中，所述的非质子极性溶剂优选酰胺 类溶剂、酮类溶剂、亚砜类溶剂和齒代烃类溶剂中的一种或多种；所述的酰胺类溶剂优选 N，N'_二甲基甲酰胺（DMF);所述的酮类溶剂优选N-甲基吡咯烷酮（NMP);所述的亚砜类溶 剂优选二甲基亚砜（DMSO);所述的卤代烃类溶剂优选氯代烃类溶剂；所述的氯代烃类溶剂 优选二氯甲烷；所述的非质子极性溶剂进一步优选酰胺类溶剂和/或酮类溶剂，酰胺类溶 剂和/或亚砜类溶剂，酰胺类溶剂和/或齒代烃类溶剂，酮类溶剂和/或亚砜类溶剂，酰胺 类溶剂、酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂，酰胺类溶剂、酮类溶剂和齒代烃类溶剂的混合 溶剂，或者，酰胺类溶剂、亚砜类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂。所述的酰胺类溶剂和酮 类溶剂的混合溶剂优选N，N'_二甲基甲酰胺（DMF)和N-甲基吡咯烷酮的混合溶剂；所述的 酰胺类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂优选N，N'_二甲基甲酰胺（DMF)和二甲基亚砜（DMSO) 的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂优选N，N-二甲基甲酰胺（DMF) 和二氯甲烷（DCM)的混合溶剂；所述的酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂优选N-甲基吡咯 烷酮（NMP)和二甲基亚砜（DMSO)的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂、酮类溶剂和亚砜类溶剂 的混合溶剂优选N，N'-二甲基甲酰胺（DMF)、N-甲基吡咯烷酮（NMP)和二甲基亚砜（DMSO) 的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂、酮类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂优选N，N' -二甲基 甲酰胺（DMF)、N-甲基吡咯烷酮（NMP)和二氯甲烷（DCM)的混合溶剂；所述的酰胺类溶剂、亚 砜类溶剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂优选N，N'-二甲基甲酰胺（DMF)、二甲基亚砜（DMSO) 和二氯甲烷（DCM)的混合溶剂。
[0013] 当采用酰胺类溶剂和酮类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂与所述的酮类溶 剂的体积比优选3:1?3:10 ;当采用酰胺类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺 类溶剂与所述的亚砜类溶剂的体积比优选3:1?3:10 ;当采用酰胺类溶剂和卤代烃类溶剂 的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂与所述的卤代烃类溶剂的体积比优选3:1?3:10 ;当采 用酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂时，所述的酮类溶剂与所述的亚砜类溶剂的体积比优 选 1:10 ?10:1 ;
[0014] 当采用所述的酰胺类溶剂、酮类溶剂和亚砜类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类 溶剂、所述酮类溶剂和所述的亚砜类溶剂的体积比优选3 :(1?10) :(1?10)，进一步优 选3:(1?5):(1?5)，再进一步优选3:1:1或3:1:2 ;当采用所述的酰胺类溶剂、酮类溶 剂和卤代烃类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂、所述的酮类溶剂和所述的卤代烃类 溶剂的体积比优选3 :(1?10) :(1?10);当采用所述的酰胺类溶剂、亚砜类溶剂和卤代 烃类溶剂的混合溶剂时，所述的酰胺类溶剂、所述的亚砜类溶剂和所述的齒代烃类溶剂的 体积比优选3 :(1?10) :(1?10)。
[0015] 在制备所述的肽树脂18的步骤1中，所述的溶剂与所述的肽树脂17的摩尔比优 选 100:1 ?200:1，进一步优选 120:1 ?160:1。
[0016] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤1中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除 脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的常规有机碱，优选哌啶。
[0017] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤1中，所述的有机碱与所述的肽树脂17的摩 尔比优选10:1?50:1，进一步优选20:1?30:1。
[0018] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤1中，所述的脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保 护基的反应的温度，可以为本领域中该类脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的常 规温度，优选22°C?28°C。
[0019] 在制备所述的肽树脂18的步骤2中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂17' 的摩尔比优选100:1?200:1，进一步优选120:1?140:1。
[0020] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合剂可以采用本领域中该类缩 合反应中的常规缩合剂，优选N，N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、六氟磷酸苯并 三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐中的一种 或多种。
[0021] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合剂与所述的 Fmoc-Arg(R2) -OH的摩尔比优选1:1?1:3,进一步优选1:1?1: 2。
[0022] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的催化剂可以采用本领域中该类缩 合反应中的常规催化剂，优选1-羟基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羟基苯并三氮唑。
[0023] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的催化剂与所述的 Fmoc-Arg(R2) -OH的摩尔比优选1:1?1:4,进一步优选1:2?1: 3。
[0024] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的肽树脂17'与所述的 Fmoc-Arg(R2) -OH的摩尔比优选1:1?1:5,进一步优选1:1?1: 2。
[0025] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合反应的温度可以采用本领域 中该类缩合反应的常规温度，优选22°C?28°C。
[0026] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2中，所述的缩合反应的进程可以采用本领域 中的常规测试方法(如茚三酮检测显微弱阳性和/或四氯苯醌检测显微弱阳性）进行监控， 反应时间优选Ih?30h，进一步优选2h?26h。
[0027] 在制备所述的肽树脂18的方法步骤2反应结束后，得到的肽树脂18还可以通过 后处理步骤进行纯化。所述的后处理步骤采用的方法和条件可按本领域常规的此类反应的 后处理步骤的方法和条件进行，一般包括如下