[0160] 实施例18-3 (溶剂为DMF/二甲基亚砜，即DMF和二甲基亚砜的混合溶剂）：？!11〇(3-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-I le-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu) -Leu-Wang树脂（肤树脂 18)的制备
[0161] 实施例17制得的肽树脂（17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C搅拌 10分钟，真空抽干，再加入l〇〇〇mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C搅拌20分钟，真空抽干， 用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干"WFm〇C-Arg(Pbf)-0H(165. 4mmol) 107. 3g，1-羟基苯并三氮唑（330. 8mmol)44. 7g，800mLDMF/ 二 甲亚砜（即DMF和二甲基亚砜的混合溶剂，体积比为5:3)，加入N，N-二异丙基碳二亚胺 (330. 8mmol)51. 8mL，将混合物在28°C搅拌16. 5小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈微弱阳 性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。加吡啶（165. 4mmol) 13. 3.mL，醋酸 酐（165. 4mmol) 15. 6mL，800mLDMF，将混合物在27°C搅拌1小时，茚三酮和四氯苯醌检测均 呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干。Pbf为2, 2, 4, 6, 7-五甲基 二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
[0162] 实施例18-4 (溶剂为DMF/二氯甲烷，S卩DMF和二氯甲烷的混合溶剂）=Fmoc-Arg( Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-P r〇-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu) -Leu-Wang树脂（肽树脂 18)的制备
[0163] 实施例17制得的肽树脂（17)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C搅拌10分 钟，真空抽干，再加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25°C搅拌20分钟，真空抽干，用DMF洗 漆一次，甲醇洗漆两次，DMF洗漆一次，二氯甲烧洗漆一次，真空抽干。加Fmoc-Arg(Pbf)-OH (165.4臟〇1)107.3§，1-羟基苯并三氮唑（330.8臟〇1)44.7 §，80011^01^/二氯甲烷（即01^ 和二氯甲烷的混合溶剂，体积比为5:4)，加入N，N-二异丙基碳二亚胺（330. 8mmol) 51. 8mL， 将混合物在28°C搅拌26小时，茚三酮和四氯苯醌检测均呈弱阳性，真空抽干。加吡啶 (165. 4mmol) 13. 3.mL，醋酸酐（165. 4mmol) 15. 6mL，800mLDMF，将混合物在 27°C搅拌 2 小时， 茚三酮和四氯苯醌检测均呈阴性，真空抽干，用DMF、甲醇、DMF、DMF依次洗涤，真空抽干。甲 醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。Pbf为2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰 基。
[0164] 实施例19:
[0165]Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu
[0166] (OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Wang树月旨 (肽树脂19)的制备
[0167] 实施例18制得的肽树脂（18)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25 °C搅 拌10分钟，真空抽干，再加入l〇〇〇mL20%哌啶/DMF溶液，在25 °C搅拌20分钟，真空抽 干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加 Fmoc-Pro-OH(165. 4mmol) 55. 8g，l-羟基苯并三氮唑（330. 8mmol) 44. 7g，800mLDMF，加入 N，N-二异丙基碳二亚胺（330. 8mmol) 51. 8mL，将混合物在28°C搅拌3小时，茚三酮检测呈阴 性，真空抽干，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，真空抽干。
[0168] 实施例20:
[0169]Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe -Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu) -Leu-Wang树脂（肤树 月旨20)的制备
[0170] 实施例19制得的肽树脂（19)中加入1000mL20%哌啶/DMF溶液，在25 °C搅 拌10分钟，真空抽干，再加入l〇〇〇mL20%哌啶/DMF溶液，在25 °C搅拌20分钟，真空抽 干，用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤一次，二氯甲烷洗涤一次，真空抽干。加 Boc-D-Phe-OH(165. 4mmol) 43. 9g，1-羟基苯并三氮唑（330. 8mmol) 44. 7g，800mLDMF，加入 N，N-二异丙基碳二亚胺（330. 8mmol) 51. 8mL，将混合物在25°C搅拌3小时，茚三酮和四氯苯 醌检测均呈阴性，真空抽干，DMF洗涤一次，甲醇洗涤一次，DMF洗涤两次，甲醇洗涤三次，真 空抽干。真空干燥至恒重，得保护比伐芦定多肽树脂347.lg。Boc为叔丁氧羰基。
[0171] 实施例21:
[0172] H-D-Phe-Pro-Arg-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pr〇-G Iu-Glu-Tyr-Leu-OH(比伐芦定）的制备
[0173] 按三氟乙酸：三异丙基硅烷：水=95:2. 5:2. 5 (体积比）配制溶液2. 5L，降温至 4°C，在搅拌的情况下，将347.Ig的肽树脂（20)加入到上述溶液中，26°C搅拌3小时。过滤， 滤液通过减压蒸馏浓缩，将比伐卢定粗品浓缩液加到〇°C甲基叔丁基醚中沉淀，离心沉降收 集到184. 6g比伐芦定粗品，HPLC纯度为85%。将比伐芦定粗品用5%乙腈/水(体积比）溶 解，配成15g/L，利用制备型高效液相在0. 1%三氟乙酸/水(体积比)和0. 1%三氟乙酸/乙 腈(体积比）梯度洗脱，分部收集需要的组分并检测，将合格的组分经减压旋蒸浓缩并除乙 腈，最后经冷冻干燥得HLPC纯度99. 2%的比伐芦定三氟乙酸盐纯品。
[0174] 实施例22 :比伐芦定粗品、纯品HPLC检测方法，质谱鉴定方法及结果。
[0175] 试验所得的粗品及纯品均按以下分析方法：
[0176]仪器：Waters2695
[0177]色谱柱：Diamonsil_C18, 4. 6*250mm, 5 um ;流速：I.OmT,/mi n;检测波长：214nm
[0178] 流动相A:20mM磷酸二氢钾水溶液（pH3. 0);流动相B:90%乙腈水溶液
[0179]
【主权项】
1. 一种肽树脂18的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1，在非质子极性溶 剂中，将有机碱与肽树脂17进行脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂 17' ；所述的肤树脂 17 为 Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R 5)-Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9) -Leu-Rltl ;所述的肽树脂 17' SH-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -I le-Pro-Glu (R7) -Glu (R8) -Tyr (R9)-Leu-R10 ； 步骤2,在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤1中制得的肽树 脂17'与Fmoc-Arg (R2)-OH进行缩合反应，得到肽树脂18 ;所述的肽树脂18为Fmoc-Arg (R2 )-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (R3) -Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R5) -Glu (R6) -Ile-Pro-Glu (R7) -G Iu (R8) -Tyr (R9) -Leu-R10 ； 其中，R2为胍基保护基；R3为酰胺保护基；R4、R5、R 6、R7和R8各自独立的为羧基保护基； R9为酚羟基保护基；Leu-Rltl为Trityl-Cl类型树脂或羟基类型树脂与亮氨酸中的羧基缩合 后的基团； 步骤1或步骤2中，所述的非质子极性溶剂为N，N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜的混合溶 剂。
2. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于： 所述的R2为2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、4-甲氧基-2, 3, 6-三甲基 苯磺酰基或2, 2, 5, 7, 8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基； 和/或， 所述的R3为三苯甲基、2, 4, 6-三甲氧基苄基或4-甲基三苯甲基； 和/或， 所述的R4、R5、R6、R7和R8各自独立的为叔丁基或金刚烷基； 和/或， 所述的R9为叔丁基或2-氯三苯甲基。
3. 如权利要求2所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于： 所述的TrityI-Cl类型树脂为2-氯三苯甲基树脂；所述的羟基类型树脂为wang树脂。
4. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于： 所述的N，N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜的混合溶剂中，所述的N，N-二甲基甲酰胺与所 述的二甲亚砜的体积比为3:1?3:10。
5. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽树脂18的 步骤1中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂17的摩尔比为100:1?200:1。
6. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于： 在所述的肽树脂18的步骤2中，所述的非质子极性溶剂与所述的肽树脂17'的摩尔为 100:1 ?200:1。
7. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽树脂18 的步骤1中，所述的有机碱为哌啶；所述的有机碱与所述的肽树脂17的摩尔比为10:1? 50:1 ;所述的脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应的温度为22°C?28°C。
8. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于： 在所述的肽树脂18的步骤2中，所述的缩合剂为N，N-二异丙基碳二亚胺、二环己基碳 二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲 六氟磷酸盐；所述的缩合剂与所述的Fmoc-Arg(R2)-OH的摩尔比为1:1?1:3。
9. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于： 在所述的肽树脂18的步骤2中，所述的催化剂为1-羟基苯并三氮唑和/或6-氯-1-羟 基苯并三氮唑；所述的催化剂与所述的Fmoc-Arg (R2)-OH的摩尔比为1:1?1:4 ;所述的肽 树脂17'与所述的Fmoc-Arg (R2) -OH的摩尔比为1:1?1: 5。
10. 如权利要求1所述的肽树脂18的固相合成方法，其特征在于：在所述的肽树脂18 的步骤2中，所述的缩合反应的温度为22°C?28°C。
【专利摘要】本发明公开了比伐芦定中间体的固相合成方法。本发明提供了肽树脂18的固相合成方法：步骤1，非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂17进行脱除脯氨酸芴甲氧羰酰基氨基保护基的反应，得到肽树脂17’；步骤2，在非质子极性溶剂中，缩合剂和催化剂存在的条件下，将步骤1中制得的肽树脂17’与Fmoc-Arg(R2)-OH进行缩合反应，得到肽树脂18；所述的非质子极性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜的混合溶剂。本发明的固相合成方法可促进大位阻的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH顺利完成缩合反应，工艺简单、反应条件温和、转化率高、缩合率达到84%～100%、生产成本低、适合于大规模工业化生产。
【IPC分类】C07K1-06, C07K1-04, C07K14-815
【公开号】CN104558161
【申请号】CN201310505070
【发明人】江锡铭, 洪勇, 琚姝, 丁金国, 黄臻辉
【申请人】上海第一生化药业有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月23日