专利名称：：制备新伐他汀及中间体的方法
技术领域：
：本发明一般性地涉及合成有机化学和医药化学领域。在一个方面，本发明提供了制备新伐他汀及各种中间体以及相关化合物的合成化学方法和化学酶方法。在一个方面，在本发明方法中应用到酶，如水解酶，例如酯酶。
背景技术：
：新伐他汀(Simvastatin)是有效的抗高胆固醇血症制剂。其销售的商品名是ZOCOR(Merck)。新伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀和普伐他汀是六氢化萘衍生物，作为HMG-CoA还原酶的抑制剂而应用，HMG-CoA还原酶是人体内产生胆固醇的生物合成途径中的控速酶(rate-controllingenzyme)。口服之后，作为无活性内酯的新伐他汀被水解为相应的P-羟基酸形式。这是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的抑制剂。该酶催化HMG-CoA转变为甲羟戊酸，这是胆固醇生物合成中的一个早期的和限速的步骤。新伐他汀、洛伐他汀(lovastatin)和普伐他汀是天然的发酵产物，其在它们的六氢化萘环系统的C-8位置上有2-甲基丁酸酯侧链。新伐他汀合成地来自于土曲霉04^erg///^fe〃'eiw)的发酵产物。带有C-82,2-二甲基丁酸酯侧链的化合物，包括新伐他汀，是比它们的2-甲基丁酸酯天然相对物更好的HMG-CoA还原酶抑制剂。因此，2,2-二甲基丁酸酯衍生物对于治疗动脉粥样硬化、高脂血症、家族性高胆固醇血症和相似疾病，具有更大的希望。然而，这些衍生物，包括新伐他汀，不是天然存在的，必须合成制备。结果是，将更有效的HMG-CoA抑制剂新伐他汀引入市场促进了对有效地、高产地制备新伐他汀的方法的需求。发明概述在一个方面，本发明提供了新方法，包括(i)在温和的条件下，用本发明的酶(例如，具有SEQIDNO:4所列出序列的示范性酶，由SEQIDNO:3编码)去除洛伐他汀侧链，(ii)在最后的步骤中，用相同的酶选择性去除酯保护基团，和(iii)应用新的条件引入新伐他汀侧链。本发明提供了用于制备新伐他汀的新颖的四步法，包括下列步骤:(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸的盐，产生三醇酸或三醇酸的盐；(b)在一个步骤中通过化学和/或酶促内酯化作用以及酰化作用产生4-酰基内酯(包括酰化内酯环上的第4位(4'-OH)，其中的环被如下所述的R-基团酰化)；(c)通过化学和/或酶促酰化作用，酰化4-乙酰基内酯的第8位(8'-OH)，产生4-酰基新伐他汀；和(d)通过化学和/或酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)选择性地去除4'位的酰基，从而制备新伐他汀。在一个方面，制备本发明新伐他汀的四步法包括图5中列出的过程。因此，在本发明的一个方面中，提供了以四步法进行的洛伐他汀向新伐他汀的化学酶促转化，如图5所概括显示。在可选的方面中，本发明制备新伐他汀的方法(例如，图5显示的过程)中洛伐他汀转化为新伐他汀的总产率是至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%或更多。确定何处发生了产率损失以及何处实现了工艺改进的示范性方案和研究讨论于下，例如，在实施例5、6、7和8中。在一个方面，本发明提供了四步途径，用以从洛伐他汀合成新伐他汀，如图5所示例描述，其中所述合成方案包括下列步骤步骤l:用能够水解洛伐他汀酸的酶，例如，如此处描述的水解酶或商业上可得到的水解酶，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸的盐，产生三醇酸。例如，用于酶促水解(S)-2-甲基丁酸酯侧链的示范性水解酶是酯酶SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3编码)、SEQIDNO:6(由例如SEQIDNO:5编码)、和SEQIDNO:2(由例如SEQIDNO:1编码)。SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3编码)。步骤2:在酰化剂存在的情况下，搅拌三醇酸，产生4-酰基内酯。步骤3:第8位羟基的酰化，可以化学进行，或用此处描述的水解酶或商业上可得到的水解酶酶促进行。步骤4:化学地或是酶促地(用此处描述的水解酶，例如酯酶，或商业上可得到的水解酶)选择性去除第4位的酰基保护基团，产生新伐他汀(参见，例如，图5，步骤5，指出了在可选的方面，甲基(Me)基团可以是垸基，或等价物，R-基团)。在一个方面，用例如由SEQIDNO:3编码的SEQIDNO:4酯酶催化内酯第4位的酰基基团的选择性水解。如果需要，或必要，在一个方面，此步骤也包括产生新伐他汀的铵盐和重结晶新伐他汀，随后对其重新内酯化。这提供了具有期望纯度的新伐他汀。选择性地，可以通过在酶(例如，水解酶或酯酶)以及合适的酰化剂存在的情况下搅拌三醇酸来实施步骤2。在一个方面，本发明提供了制备新伐他汀的方法，包括图6A中指出的方法。本发明提供了从洛伐他汀制备三醇酸的方法，包括图15A或16A所指出的方法。本发明提供了从洛伐他汀制备洛伐他汀的方法，包括图16A所指出的方法。本发明提供了从洛伐他汀酸制备三醇酸的方法，包括图16A中指出的方法。本发明提供了从三醇酸(triolacid)制备二醇内酯(diollactone)的方法，包括图8或图16B指出的方法。本发明提供了从二醇内酯制备酰基内酯的酶促方法，包括图16C指出的方法。本发明提供了从三醇内酯制备酰基内酯的方法，包括图16D指出的方法。本发明提供了从三醇内酯制备4-乙酰基内酯的方法，包括图9A指出的方法。本发明提供了从酰基内酯制备酰基新伐他汀的方法，包括图16E指出的方法。本发明提供了从4-乙酰基内酯制备4-乙酰基新伐他汀的方法，包括图9B指出的方法。在一个方面，本发明提供了从4-乙酰基内酯制备4-乙酰基新伐他汀的化学方法，例如，用图9B示例的条件或其变化，用三氟化硼作催化剂。本发明提供了从4-乙酰基新伐他汀制备新伐他汀的方法，包括图9C或图ll指出的方法。本发明提供了从酰基新伐他汀制备新伐他汀铵盐的方法，包括图16F指出的方法。本发明提供了从辛伐他汀铵盐制备辛伐他汀的方法，包括图16F指出的方法。本发明提供了经同二酰基化作用(homodiacylation)途径从洛伐他汀制备新伐他汀的方法，如图38所示例。可以用在一个、几个或全部这些步骤中的酶促水解中的示范性酶包括SEQIDNO:4(例如，由SEQIDNO:3编码)、SEQIDNO:6(例如，由SEQIDNO:5编码)、禾QSEQIDNO:2(例如，由SEQIDNO:1编码)。SEQIDNO:4(例如，由SEQIDNO:3编码)，或与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6具有50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性的酶。本发明提供了制备新伐他汀的方法，包括五步骤的异二酰基化作用(heterodiacylation)方法，具有下列步骤(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸；(b)在存在酸的情况下加热三醇酸或搅拌，产生二醇内酯；(c)通过酶促区域选择性酰化4'-OH，保护二醇内酯的内酯环上第4位的羟基(4'-OH)，产生4-酰基内酯；(d)通过化学和域酶促区域选择性酰化第8位，从而酰化4-酰基内酯的8位羟基(8'-OH)，产生4-酰基新伐他汀；和(e)化学或酶促地选择性去除第4位的酰基保护基团，从而生产出新伐他汀。在可选的方面，本发明方法可以在至少2个容器中进行，SP，以2罐、3罐等工艺过程。本发明方法可以在任意容器形式中实施，例如，毛细管阵列如GIGAMATRIX,DiversaCorporation,SanDiego,CA。本发明提供了制备新伐他汀的同二酰基化作用方法，包括下列步骤的方法(a)酶促水解(例如，用具有酯酶活性的多肽)洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸盐；(b)通过内酯化从三醇酸产生二醇内酯；(c)通过化学或酶促的酰化作用，酰化二醇内酯的内酯环上的第4位(4，-OH)和第8位(8'-OH)，产生4,8-二酰内酯；和(d)通过酶促水解，选择性去除4'位的酰基，从而制备新伐他汀。在本发明的其它方案中，通过在4位和8位加入选择性的保护基团，可以由二醇内酯合成其它组合物，例如，当R—基团选自(i)-H，甲基酸衍生物；(ii)Cl-n垸基，例如，甲基、乙基、丙基、丁基等，均为直链和支链，其中在一个方面，n是1和20之间的整数；(iii)取代的烷基，例如，氯乙酰、三氯乙酰、三氟乙酰、甲氧基乙酰、苯乙酰、4-氧戊基(乙酰丙酸)；(iv)苯基和取代的苯基例如苯基、对硝基苯基；和(力R'O-基团，产生羧酸盐保护基团，示例但不限于tBuOCO、PhOCO、PhCH2OCO，其中，在一个方面，R'O-基团产生羧酸盐保护基团，其中R'是(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任意一个基团。在本发明的这些可供选择的合成反应中，保护基团(R-基团)可以被化学地或酶促地区域选择性去除，生成所需的终产物。这些R-基团，或等价的R-基团，可以被用作本发明任何方法的任何步骤中的"保护基团"。例如，这些R-基团，或等价的R-基团，被用作如图5、图6A、图9、图10、图ll、图16C、图16D、图16E或图16F所阐释的本发明示范性方法或本发明等价工艺方法中的R-基团。在一个方面，本发明提供了从洛伐他汀合成新伐他汀的五步路线，如图6所示例，其中的合成过程包括下列步骤步骤l:用能够催化洛伐他汀酸水解的酶，例如，如此处描述的水解酶或可从商业途径得到的水解酶酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸。例如，可用于酶促水解(S)-2-甲基丁酸酯侧链的示范性水解酶是酯酶SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3编码)、SEQIDNO:6(由例如SEQIDNO:5编码)和SEQIDNO:2(由例如SEQIDNO:1编码)。SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3编码)。步骤2:在存在酸的情况下加热三醇酸或搅拌，产生二醇内酯。步骤3:应用如此处描述的水解酶或可从商业途径得到的水解酶，通过酶促区域选择性酰化作用，保护内酯环上的4'-OH。参见，例如，图6，步骤3，注意在可供选择的步骤中，甲基(Me)可以是任意烷基或等价的(例如，甲氧基、烷氧基、苯基等)R-基团。步骤4:酰化8位的羟基；可以用如此处描述的水解酶或可从商业途径得到的水解酶，化学地或酶促地进行。步骤5:化学或酶促地选择性去除4'位的酰基保护基团(如此处描述的水解酶例如酯酶，或可从商业途径得到的水解酶)，生成新伐他汀(参见例如图6，步骤5，注意在可选的步骤中，甲基(Me)可以是任意烷基或等价的R基团)。在一个方面，例如由SEQIDNO:3编码的SEQIDNO:4被用来催化内酯4'位酰基的选择性水解。如果需要或必须，在一个方面，此步骤也包括产生新伐他汀的铵盐和重结晶新伐他汀，随后重新酯化。这提供了所需纯度的新伐他汀。本发明也提供了方法，用能够水解洛伐他汀酸的酶，例如此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶(参见下面的实施例6，步骤1)，从洛伐他汀产生新伐他汀酸。本发明也提供了产生三醇酸的方法，包括用能够催化洛伐他汀酸水解的酶，例如此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸和/或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸。本发明提供了方法，用此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶，通过区域选择性酰化，保护内酯的羟基，例如，内酯环上的4，-OH(例如，二醇内酯上的，如图6所示)。本发明提供了酰化4-酰基内酯8位羟基的方法(如图6所示)，这可以用化学方法实施，或者用此处描述的水解酶或可从商业上得到的水解酶用酶促方法实施。本发明提供了方法，用于选择性去除内酯上的酰基，例如，内酯上的保护酰基，如图6所示的内酯上第4'位的保护性酰基，用化学方法或酶促方法进行。本发明也提供了方法，包括这些方法中的两种或更多种或全部，例如，化学酶促地从洛伐他汀、三醇酸、二醇内酯、4-酰基内酯或4-酰基新伐他汀产生新伐他汀。关于实施这些方法的本发明示范性方案，参见例如，下面的实施例5、6、7和8。在一个方面，用二甲基丁酸衍生物和路易斯酸催化剂(Lewisacidcatalyst)，区域选择性地酰化二醇内酯的第8位。在一个方面，本发明方法生成了带有<1%的洛伐他汀的新伐他汀，原因是，在一些情况下，将洛伐他汀与新伐他汀分离开来可能是低效率的。在可选的方面，本发明方法生成了新伐他汀，其中所述方法的总产率大于或等于(=)50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、710/0、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯°/。或更多。在一个方面，本发明方法生成新伐他汀，其中对洛伐他汀的起始酶促水解以大约20%w/v进行。在一个方面，本发明提供了产生新伐他汀的方法，包括图5示例出的方案("方案l")或其变化，这是合成新伐他汀的异二酰基化作用途径。在方案l(图5)的可选方面，步骤1可以包括化学或酶促水解；步骤2可以包括化学或酶促内酯化及酰化；步骤3可以包括化学或酶促酰化，步骤4可以包括化学或酶促水解，或其任何结合。在一个方面，这些水解反应中的至少一个是区域专一的(regiospecific)。在本发明任何方法的可选方面，至少一个步骤是在反应容器中进行的。在本发明任何方法的可选方面，至少一个步骤是用细胞提取物进行的。在本发明的任何一个方法的可选方面，至少一个步骤是在完整的细胞中进行的。细胞可以是任何来源，例如，植物细胞、细菌细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或酵母细胞。在本发明任何方法的一个方面，产生新伐他汀的铵盐。在一个方面，所述方法进一步包括新伐他汀的重结晶。在一个方面，所述方法包括重内酯化，以提供所需纯度的新伐他汀。在本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶进行的(例如，酯酶或脂酶)，所述水解酶是由与SEQIDNO:1有至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89°/。、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所编码的，或者是其酶学上的活性片段。在本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶进行的，所述水解酶是由与SEQIDNO:3有至少53%、54%、55°/。、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62°/。、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所编码的，或者是其酶学上的活性片段。在本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶进行的，所述水解酶是由与SEQIDNO:5有至少56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、7P/。、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91°/。、92%、93%、94°/。、95%、96°/。、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性的核酸所编码的，或者是其酶学上的活性片段。本发明任何方法的一个方面，至少一个酶促反应是通过水解酶(例如，酯酶)进行的，所述水解酶和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性，或者是其酶学上的活性片段。本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括用于实施本发明的试剂和水解酶。在一个方面，所述试剂盒包括至少一种水解酶，该水解酶和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少约51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或具有完全(100%)的序列同一性，或者是其酶学上的活性片段。在一个方面，所述试剂盒包括实施本发明方法的说明书。本发明的一种或多种实施方案的细节在下面的附图和描述中说明。根据说明书和附图以及从权利要求书，本发明的其它特征、目的和优势将是显然的。此处引用的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物，特别地在此并入作为参考，用于所有用途。附图简述图1是对三氟甲基磺酸盐(triflate)和醚合BFr催化的4-乙酰基内酯的酰化作用的示范性方案的说明，如下面的实施例5中详述。图2是对几种BF3.0Et2催化的酰化作用的结果的说明，如表3，如下面的实施例5所详述。图3是对表4的说明，显示了沉淀之前和沉淀之后，12g酰化反应产物的杂质分布，如下面的实施例5中所详述。图4是对表8的说明，显示了分离新伐他汀的数据，如下面的实施例5中所详述。图5说明了本发明的示范性过程，四步异二酰基化途径，用以从洛伐他汀合成新伐他汀。图6A和图6B说明了本发明的示范性过程，五步途径，用以从洛伐他汀合成新伐他汀(图6A)，和对洛伐他汀向新伐他汀转化的总结(图6B)。图7说明了对酶促水解乙酰基新伐他汀的示范性方案的结果的HPLC分析，如下面的实施例6中所详述。图8说明了本发明的示范性内酯化/酰化反应及其产物，如下面的实施例7中所详述。图9A说明了本发明的示范性内酯化/酰化方案，包括从三醇酸产生4-乙酰基内酯，如下面的实施例7中所详述。图9B说明了本发明的示范性方法，包括从4-乙酰基内酯产生4-乙酰基新伐他汀，如下面的实施例5中所详述。图9C说明了本发明的示范性方法，包括乙酰基新伐他汀向新伐他汀的转化，如下面的实施例5中所详述。图10说明了化学酰化第8位的示范性方案，如下面的实施例7中所详述。图11说明了本发明的示范性反应，4-乙酰基新伐他汀的酶促脱乙酰作用，如下面的实施例7中所详述。图12说明了用本发明示范性方案产生的两批新伐他汀的HPLC曲线，如下面的实施例7中所详述。图13说明了HPLC分析，显示了本发明示范性方案产生的新伐他汀样品的杂质曲线图，如下面的实施例7中所详述。图14说明了一张表格，显示了对本发明示范性方案的比较，所述方案是以三醇酸作为原料的一步内酯化/乙酰化作用，如下面的实施例7中所详述。图15A说明了本发明的示范性反应，包括用酯酶水解洛伐他汀为三醇酸，如下面的实施例5和7中所详述。图16A说明了从洛伐他汀制备洛伐他汀酸、以及从洛伐他汀酸制备三醇酸的示范性方法，如下面的实施例6中所详述。图16B说明了从三醇酸制备二醇内酯的示范性方法，如下面的实施例6中所详述。图16C说明了从二醇内酯制备酰基内酯的示范性方法，如下面的实施例6中所详述。图16D说明了本发明的示范性方案，包括对内酯的4位进行内酯化和酰化，如下面的实施例6中所详述。图16E说明了本发明的示范性方案，包括从酰基内酯制备酰基新伐他汀，如下面的实施例6中所详述。图16F说明了本发明的示范性方案，包括从酰基新伐他汀制备新伐他汀铵盐，和从新伐他汀铵盐制备新伐他汀，如下面的实施例6中所详述。图17A说明了本发明的示范性反应，包括用路易斯酸从二醇内酯制备新伐他汀、4'-酰基内酯(也称作异新伐他汀)和同新伐他汀(也称作二新伐他汀)的过程，如下面所详述。图17B说明了本发明的示范性反应，包括经酶促水解，从新伐他汀、4'-酰基内酯(异新伐他汀)和同新伐他汀(也称作二新伐他汀)制备新伐他汀和二醇内酯，如下所详述。图18A说明了本发明的示范性方案，包括合成4-乙酰基二醇内酯的方法，如下面的实施例3所详述。图18B说明了4-乙酰基内酯的结构、相应的二乙酸酯的结构以及消除产物，如下面的实施例3所详述。图18C说明了本发明的示范性反应，包括4-乙酰基新伐他汀的合成，如下面的实施例4所详述。图18D说明了本发明的示范性反应，包括经水解酶水解4-乙酰基新伐他汀，如下面的实施例4所详述。图18E说明了本发明的示范性反应，包括将洛伐他汀酶促水解为三醇酸，如下面的实施例2所详述。图19说明了制备4-乙酰基内酯的示范性过程，如下面的实施例13所详述。图20说明了4-乙酰基新伐他汀向新伐他汀的水解，和相应的消除产物以及酸，如下面的实施例5所详述。图21说明了一张表格，显示了选出的新伐他汀样品的杂质曲线图数据、HPLC分析数据和组分分析结果，如下面的实施例8所详述。图22是对本发明示范性反应的说明，例如，三醇酸向相应二醇内酯、3-乙酰基三醇酸和5-乙酰基三醇酸的转化，和随后向3,5-二乙酰基三醇酸、4-乙酰基内酯和消除产物的转化，如下面的实施例9所详述。图23是对用SEQIDNO:4的酯酶酶促水解洛伐他汀的研究的说明，如下面的实施例7所详述。图24是对应用DESIGNEXPERT软件，经部分析因设计对洛伐他汀的酶促水解进行最佳化的说明，如下面的实施例IO所详述。图25是总结影响洛伐他汀酸水解的四个因子的说明，如下面的实施例IO所详述。图26说明了应用DESIGNEXPERT软件，用中心复合设计对水解洛伐他汀进行的反应表面分析(ResponseSurfaceAnalysis)(RSA)的结果，如下面的实施例IO所详述。图27说明了用SEQIDNO:4原位水解洛伐他汀的最佳化结果，如下面的实施例IO所详述。图28说明了本发明的示范性反应，所述反应是大规模地水解洛伐他汀的方案，如下面的实施例IO所详述。图29说明了经SEQIDNO:4水解的新伐他汀的4-酰基衍生物，如下面的实施例10所详述。图30说明了本发明的应用SEQIDNO:4的示范性洛伐他汀水解方案，如下面的实施例11所详述。图31说明了放大方案(scaled-upprotocol)中的洛伐他汀向三醇酸的示范性酶促水解，如下面的实施例ll所详述。图32说明了将洛伐他汀酶促水解为三醇酸的放大方案，如下面的实施例ll所详述。图33说明了在放大方案中应用的洛伐他汀向三醇酸的示范性酶促水解，和对反应参数的总结，如下面的实施例11所详述。图34说明了对数据的图解总结，所述数据来自40g反应(a)在内酯化和浓缩之后(图34A)以及(b)粗产物(图34B)。图35说明了对数据的图解总结，所述数据来自100g反应(a)三醇酸(图35A)以及(b)内酯化作用之后(图35B)。图36说明了对数据的图解总结，所述数据来自lOg放大酶促水解反应，其中4-乙酰基内酯被酰化为4-乙酰基新伐他汀，如下面的实施例11所详述。图37说明了在本发明方法中应用的示范性化学酰化作用，其为应用酰基三氟甲基磺酸盐的路易斯酸催化的酰化作用，如下面的实施例11所详述。图38和图39说明了通过同二酰基化作用从洛伐他汀制备新伐他汀的示范性方法和条件，如下面的实施例12所详述。图40A和40B图形说明了用本发明方法用SEQIDNO:4对同新伐他汀进行的水解，以及得到的反应产物，反应的条件是lmM同新伐他汀和10mM同新伐他汀，如下面的实施例12所详述。发明详述本发明提供了新颖的化学和生物化学方法，用于产生新伐他汀(例如，ZOCORTM)及其中间产物。这些方法可以是高效的和在成本上有效的。在本发明的各种实施方案中，本发明用各种酶生物催化地催化反应，所述酶包括水解酶，例如酰基转移酶和酯酶。在一个方面，本发明提供了用水解酶将洛伐他汀酶促水解为洛伐他汀酸的方法。在一个方面，本发明提供了将洛伐他汀酸或其盐酶促水解为三醇酸或其盐的方法。在一个方面，本发明提供了用水解酶将二醇内酯酶促酰化为酰基内酯的方法。在一个方面，本发明提供了用水解酶将酰基内酯酶促酰化为酰基新伐他汀的方法。在一个方面，本发明提供了用水解酶水解内酯环的方法。本发明包括经体外或体内技术产生新伐他汀和各种中间产物的方法，所述技术例如，全细胞方案，如发酵或其它生物催化过程。在可选的方面，本发明提供了将洛伐他汀转化为新伐他汀的新颖的方法，如图5或图6A和6B所图示说明。在一个方面，应用二甲基丁酸衍生物和路易斯酸催化剂，经水解从洛伐他汀制备的二醇内酯在8位上被区域选择性地酰化。二醇内酯可以应用此处描述的化学酶方法从洛伐他汀而制备。在一个方面，本发明提供了方法，包括用路易斯酸从二醇内酯制备新伐他汀、4'-酰基新伐他汀和同新伐他汀，如图17A所说明。本发明的发明人发现，在路易斯酸存在的情况下，用羧酸衍生物处理二醇内酯，导致位置8处的优势酰化。在三氟甲基磺酸金属盐存在的情况下应用过量的乙烯基乙酸盐(酯)时，8-乙酰基衍生物几乎独有地以低的转化而产生。.到此为止的结果显示了，用二甲基丁酸酐和溶于二氯甲垸的Bi(0Tf)3或Cu(0Tf)2的联合在室温下处理二醇内酯，导致了快速反应，其中新伐他汀:4'-酰基内酯的比率>4:1。在一个方面，新伐他汀的分离和纯化是通过结晶进行的。在一个方面，本发明提供了筛选Lewis酸催化剂和/或酰化试剂的方法，用以提供选择性反应条件，以最大化新伐他汀的产量和最小化副产物。最大化新伐他汀的产量和最小化副产物有助于结晶方案。采用结晶分离/纯化新伐他汀导致了从洛伐他汀到新伐他汀的2步方法。在一个方面，本发明提供了方法，包括经酶促水解从新伐他汀、4'-酰基内酯新伐他汀和同新伐他汀制备新伐他汀和二醇内酯，如图17B所说明。在一个方面，如果异新伐他汀和同新伐他汀不能通过结晶降低为可以被净化的水平，则采用最终的酶促水解步骤协助回收产物。在一个方面，用酯酶(例如，具有SEQIDNO:4列出的序列的酶，由SEQIDNO:3编码的)处理新伐他汀、异新伐他汀和同新伐他汀的混合物，导致4'位置处的酰基的区域选择性水解，这产生了新伐他汀和二醇内酯的混合物。在一个方面，新伐他汀是通过结晶而分离的。选择性地，应用过量的酐将反应向产生新伐他汀和同新伐他汀的反向推进。这可以最小化异新伐他汀的量。酶促水解这样的混合物导致了新伐他汀的产生和迅速分离。在路易斯酸存在的情况下经区域选择性地酰化二醇内酯对新伐他汀进行制备的一个方面，用二氯甲垸中的二甲基丁酸酐(0.5当量(eq))在室温(RT)下处理二醇内酯，5mol。/。的Cu(OTf)2作为催化剂而存在。HPLC分析表明，在10分钟内二醇内酯的50%发生转化。新伐他汀(在8位处酰化)和异新伐他汀(在4位处酰化)的比值是4:1，产生了4%的同新伐他汀。在一个方面，本发明提供了方法，包括在图5的新颖的4步法或图6A的5步法中指明的步骤或其联合。在选择性的方面，本发明提供了方法，包括下列步骤中的至少一种、几种或全部步骤l:酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸盐，其中采用水解酶，例如此处描述的酶，例如，SEQIDNO:4，其由例如SEQIDNO:3编码，或商业上可得到的水解酶。步骤2:将三醇酸转化为4-乙酰基内酯，例如，在一个步骤中，例如在图5的步骤2中，或在两个步骤中，例如在图6A的步骤2和3中(在一个方面，在酸存在的情况下加热或搅拌三醇酸，产生二醇内酯)。歩骤3:保护二醇内酯内酯环上的4，-0H，产生4-乙酰基内酯，用例如此处描述的酶或商业上可得到的水解酶经区域选择性酰化而实施。步骤4:酰化8位上的羟基；这可以化学地进行，或用例如此处描述的酶或商业上可得到的水解酶而酶促进行。步骤5:或是化学地或是酶促地，选择性去除4'位的酰基保护基团，产生新伐他汀。如果需要，产生新伐他汀的铵盐并对新伐他汀重结晶，随后重新内酯化，提供具有所需纯度的新伐他汀。在一个方面，参照如上所述的步骤l，本发明提供了包括经酶促水解或化学水解从洛伐他汀制备出洛伐他汀酸的方法，如图16A所描述。本发明提供了经酶促水解或化学水解从洛伐他汀酸制备出三醇酸或三醇酸盐的方法，如图16A所描述。完全地或基本完全地(在可选择的方面，>99%、>98%、>97%或>96%)去除甲基丁酸酯侧链，对一种方法来说可能是必须的，原因是分离洛伐他汀和新伐他汀有难度，以及在新伐他汀API中洛伐他汀的允许水平低。已报道的水解洛伐他汀的方法需要应用高温和长的反应时间，以完全反应。在一个方面，洛伐他汀在温和的条件下被水解，其中采用水解酶(例如，具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、或SEQIDNO:6列出序列的酶，上述酶分别由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5编码)。这导致内酯环的水解和完全去除第8位的侧链。具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5中列出序列的酶已经被证明对甲基丁酸酯侧链酶促水解特别有效SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、或SEQIDNO:6。具有SEQIDNO:4所列出序列的酶已被亚克隆并在宿主如大肠杆菌CE.co/i)中表达。洛伐他汀在酶促活性所需的水性条件下可以显示出差的溶解性。因此，在一个选择性方面，洛伐他汀在水中的悬浮液的pH值被升高至pH>12，以实现内酯环的快速水解。这导致原位产生更加可溶的洛伐他汀酸盐。在一个方面，随后将反应混合物的pH值重新下调为适合水解反应的范围；并且加入酶。酶促水解条件也可以被施用于从发酵肉汤直接提取出的洛伐他汀和洛伐他汀酸的混合物。选择性地，可以将酶加入发酵肉汤并直接分离三醇酸。在一个方面，在水解之后，酸化反应混合物。三醇酸可以通过萃取和/或过滤被分离出来，并且直接在下一步骤中应用。选择性地，三醇酸在合适的结晶/沉淀步骤之后被分离出来。在一个方面，参照上述步骤2，本发明提供了包括图16B所说明的步骤的方法。在一个方面，通过在合适的溶剂中加热并用常规方法去除水而将平衡向内酯形式驱动，使三醇酸重新内酯化。选择性地，在合适的酸存在的情况下，搅拌将导致内酯环的闭合。在一个方面，参照上述的步骤3，本发明提供了方法，包括用具有所需活性和选择性的酶，例如水解酶如酯酶，酰化4'位羟基。在一个方面，用水解酶(例如，酯酶)酰化二醇内酯。可以变化酰基的性质，用以赋予其合适的特征，例如，变为乙酸酯以便容易去除，苯甲酸酯以增强结晶性，甲酸酯以增强水溶解性。在此处描述的示范性方法(例如，图5和6A，图38)的可选方面，包括步骤3(上)、4和5(下)中描述的反应物和试剂的可选方面，酰基可以被替代为任意合适的R-基团(g卩，"保护"基团可以是任何R-基团)，其中"R"可以是(i)-H，甲酰衍生物；(ii)Cl-n烷基，直链的和支链的；(m)取代的垸基基团，例如，氯乙酰、三氯乙酰、三氟乙酰、甲氧乙酰、苯乙酰、4-氧代苯基(乙酰丙酸酯)；(iv)苯基和取代的苯基例如，苯基、对-硝基苯基；(v)R'0基团，产生碳酸酯保护基团，示例但不限于tBuOCO、PhOCO、PhCH2OCO。在一个方面，R'0基团产生碳酸酯保护基团，R，是(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任何基团。在一个方面，当R是长链垸基基团时，应用对长链烷基酯有增强反应活性的酶。当R是长链烷基时，溶解性可能是一个问题。在一个方面，R是乙酸酯，这可以是有利的，原因是(i)容易加入，(ii)良好的水解酶活性，(iii)溶解性，(iv)试剂的成本。在一个方面，参照上述的步骤4，本发明提供了方法，包括图16E描述的步骤，并且在可选的实施方案中，包括图16E描述的试剂。在一个方面，用二甲基丁酸衍生物和合适的酰化催化剂(通过活性酰化或酶促酰化)的组合，加入所需的新伐他汀侧链。二甲基丁酸酐/路易斯酸的组合(例如，三氟甲基磺酸铋Bi(triflate)3，三氟甲基磺酸铜Cu(triflate)2),导致在室温下(RT)的快速反应。在一个方面，本发明提供了筛选合适的路易斯酸和反应条件的方法，包括温度、溶剂等等。可选方案中此酰化的最适条件或试剂可以用常规的筛选方法确定。在一个方面，在十分温和的条件下(例如，在一方面，在室温(RT)下，例如，约4(TC，用有机溶剂)，用催化酰基内酯酰化的酶在第8位加入二甲基丁酸酯基团，而不产生副产物。本发明提供了筛选在本发明方法中具有所需活性的可选酶的方法。可以通过用常规方法筛选酶在本发明各种方案中的有效性，对酶进行筛选。在一个方面，参照上述步骤5，本发明提供了方法，包括图16F描述的步骤，并且在可选的实施方案中，包括图16F描述的试剂。在一个方面，最终步骤需要选择性地去除4'位上的酰基。4'位上的酰基可以对碱催化的消除高度敏感，甚至仅在强度碱性条件下也敏感。因此，酶促水解曾是区域选择性去除此酰基的最方便的方法。已经证明，水解洛伐他汀的相同的酶(SEQIDNO:4(由SEQIDNO:3编码)，在上面的步骤1中)也是选择性水解内酯4'位酰基的有效催化剂。当在pH值为7时实施时，此酶促水解产生内酯环基本上完整的新伐他汀。一般方法本发明提供了生产新伐他汀和各种中间体的新颖的化学方法。金属人员将认识到，可以利用各种过程和方法学合成本发明方法中应用的起始化合物以及中间化合物，所述过程和方法学在科技文献和专利文献中详细描述，例如，OrganicSynthesesCollectiveVolumes,GilmanWa/.(Eds)JohnWiley&Sons,Inc.,NY;Venuti(1989)尸/w/^/^"6:867-873。可以结合科技文献和专利文献中详细描述的本领域中的任何方法或方案，来实践本发明。此处给出的对一般方法的讨论仅意图于示例性的目的。本领域的技术人员阅读本公开内容之后，其它的可选方法和实施方案将是显而易见的。酶在本发明任意方法的一方面，至少一个酶反应是由具有水解酶活性(例如，酯酶活性)的多肽进行的，例如，和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6至少有约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性、或完全(100%)相同序列的序列的水解酶，或其酶学上的活性片段。具有水解酶活性的多肽也可以是包括催化位点的肽、催化抗体和类似多肽。具有SEQIDNO:4列出序列的多肽是家族VII酯酶，禾口!3-内酰胺酶有同源性，并且与其共享SXXK基序。因此，可以在本发明的一个、几个或所有步骤中应用的酶，可以具有酯酶活性，并且具有和SEQIDNO:4至少约50。/。、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79°/0、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性、或完全(100%)相同序列的序列以及SXXF基序。具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:6列出序列的多肽是阿魏酸酯酶(feruloylesterases)。因此，可以在本发明的一个、几个或所有步骤中应用的酶，可以具有阿魏酸酯酶活性。本发明的方法中应用的酶可以通过任何合成或重组方法产生，或者，可以从天然来源或其组合分离出来。用来实践本发明方法的、编码酶的，不论是RNA、cDNA、载体、病毒或其杂化物(hybrids)，可以从多种来源分离出来、进行遗传工程、扩增、和/或重组表达/产生。从这些核酸产生的重组多肽可以被单独的分离或克隆并检测所需活性。可以用重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。将用于实施本发明的核酸可以用扩增方法产生，所述方法在本领域是熟知的，包括例如，聚合酶链式反应、PCR(参见，例如，PCRPROTOCOLS,AGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS,ed.Innis,AcademicPress,N.Y.(1990)和PCRSTRATEGIES(1995),ed.Innis,AcademicPress,Inc.,N.Y.,ligasechainreaction(LGR)(参见，例如，Wu(1989)Genomics4:560;Landegren(1988)Science241:1077;Barringer(1990)Gene89:117);转录扩增(参见，例如，Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173);禾口，自动维持序列扩增(参见，例如，Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874);Qg复制酶扩增(Q-betareplicaseamplification)(参见，例如Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477-1491)，自动QP复制酶扩增分析(automatedQ-betareplicaseamplificationassay)(参见，例如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes10:257-271)和其它RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA，Cangene,Mississauga,Ontario)。可选地，可以经公知的化学合成技术体外合成这些核酸，所述技术如，例如，在Adams(1983)J.Am.Cl想.Soc.105:661;Belousov(1997)NucleicAcidsRes.25:34403444;Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19:373380;Blommers(1994)Biochemistry33:78867896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;美国专利4,458,066号中有所描述。修饰核酸的技术如，例如亚克隆、标记探针(例如，用Klenow聚合酶进行随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交以及类似技术，在科技文献和专利文献中详细描述，参见，例如，Sambrook,ed.,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(2NDED.),Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,(1989);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,Ausubel,ed.JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1997);LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY:HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACIDPROBES,PartI.TheoryandNucleicAcidPreparation,Tijssen,ed.Elsevier,N.Y(1993)。获得和操作用于本发明的方法的实践中的核酸的另一有用方法是对基因组样品进行克隆，并且在需要的情况下，对从例如基因组克隆或cDNA克隆分离或扩增出来的插入物进行筛选和再克隆。用于本发明方法的核酸的来源包括基因组文库或cDNA文库，所述文库包含在，例如，哺乳动物人工染色体(MACs)，参见，例如，美国专利5,721,118、6,025,155;人类人工染色体，参见，例如，Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15:333-335;酵母人工染色体(YAC);细菌人工染色体(BAC);Pl人工染色体，参见，例如，Woon(1998)Genomics50:306-316;Pl-衍生载体(PACs)，参见，例如，Kern(1997)Biotechniques23:120-124;粘粒；重组病毒；噬菌体或质粒中。本发明的核酸和蛋白质可以用本领域技术人员熟知的许多方法中的任意一种进行检测、确认和定量。检测核酸和相应蛋白质的一般方法包括分析生物化学方法，如分光光度法、放射显影术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、高扩散色谱(hyperdiffosionchromatography),和类似方法，以及多种免疫学方法如液体或凝胶沉淀反应(fluidorgelprecipitinreactions)、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫分析(RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析、和类似方法。对核酸和多肽的检测可以通过公知方法如Southern分析、northern分析、凝胶电泳、PCR、放射标记、闪烁计数、和亲和色谱。在本发明示范性方法的各个方面，使用具有酯酶活性的多肽，例如酯酶。可以应用酯酶或酶(例如水解酶)或具有相似活性的其它多肽(例如，催化抗体或包括活性位点的肽)。筛选用于本发明的酶的任何方法均可以应用，并且这些方法在本领域中是公知的，所述酶用于例如水解洛伐他汀、洛伐他汀酸、4-乙酰基新伐他汀或新伐他汀。例如，用来确定欲在本发明方法中应用的酶的(多种酶)的一个示范性筛选条件组中，包括应用2.5mM的底物、100mM的磷酸盐缓冲液/共溶剂，pH7至pH8,30°C,48h,和下列组分(i)洛伐他汀或新伐他汀，溶于MTBE/缓冲液，(ii)洛伐他汀或新伐他汀，溶于甲苯/缓冲液，(iii)洛伐他汀酸或新伐他汀酸，溶于10%甲醇/缓冲液。筛选结果在lmM底物中中证实。应用此示范性的分析确定出，具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6列出序列的三种酶，对于水解洛伐他汀或洛伐他汀酸是有活性的。仅具有SEQIDNO:4列出序列的酶显示出水解新伐他汀的活性。在pH为9的10%MeOH/缓冲液中的25、50和lOOmM洛伐他汀酸中，进一步评价SEQIDNO:4和SEQIDNO:2;为了方便，用更多的可溶洛伐他汀酸作为底物。在许多情形下，SEQIDNO:4显示出对底物的高度转化，溶液产量是12-60%的三醇酸。在标准条件下(相同的总蛋白浓度，或相同的酶活性，用荧光底物甲基伞形酮丁酸盐(MUB)进行标准化)，比较包括酶编码序列的基因组克隆，比较它们对洛伐他汀酸的水解作用，所述酶具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:2、SEQIDNO:6列出的序列(例如，分别由示范性的SEQIDNO:3、SEQIDNO:1和SEQIDNO:5编码)。在反应条件下，具有包括SEQIDNO:4的序列的酶修饰出了最佳活性。对包括酶编码序列的基因组克隆进行亚克隆，所述酶具有SEQIDNO:4和SEQIDNO:2列出的序列(例如，分别由示范性的SEQIDNO:3和SEQIDNO:1编码)。SEQIDNO:2具有先导序列，认为其对分泌/定位是必须的，对SEQIDNO:2进行带有和不带有先导序列的亚克隆。对亚克隆进行MUB和洛伐他汀酸分析；仅带有先导序列的编码SEQIDNO:2的亚克隆显示出了对MUB的活性。并且，亚克隆均没有对洛伐他汀酸显示出活性。用包括编码SEQIDNO:4的核酸的基因组克隆进行的转座子插入试验鉴定出了对洛伐他汀酯酶活性负责的基因。此基因编码预测分子量是43KD的酯酶，通过从天然凝胶分离出该43KD条带和证实对洛伐他汀酸的活性以及通过MS分析，进一步证实其身份(identity)。包括编码SEQIDNO:4的核酸的大肠杆菌构建物能够水解洛伐他汀，得到向三醇酸的93-98%的转化，所述反应在21小时、在35°C、在350mM底物的条件下发生。毛细管阵列本发明的方法，和/或欲在本发明方法中应用的确定酶(多种酶)的筛选方案，可以全部或部分通过毛细管阵列来实施，如GIGAMATRIX,DiversaCorporation,SanDiego,CA。参见，例如W00138583。可以将试剂或多肽(例如酶)固定化或施加在阵列上，包括毛细管阵列。毛细管阵列提供了保持并筛选试剂、催化剂(例如酶)和产物的另一系统。该装置可以进一步包括排列在阵列中的相邻毛细管之间的间隙物质，和在间隙物质中形成的一个或多个参照标记。也可以将高通量筛选装置进行适应性修改并用其实施本发明方法，参见，例如，美国专利申请20020001809号。基于全细胞的方法本发明方法可以全部或部分地在全细胞环境中实施。本发明也提供了对细胞进行的全细胞进化或全细胞工程，以开发出具有新的表型的新细胞株，用于本发明方法，例如，包括本发明方法中应用的一种、几种或全部酶的新的细胞系。这可以通过修饰细胞的遗传组分来进行，其中所述遗传组分是通过将核酸加入细胞而被修饰的，所述核酸例如本发明方法中应用的酶的编码序列。参见，例如，W00229032、WO0196551。"全细胞方法"中的宿主细胞可以是本领域技术人员已知的任何细胞，包括原核细胞、真核细胞，如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。为了检测本发明方法的中间产物或产物、或新表型的产量，通过代谢通量分析(MetabolicFluxAnalysis(MFA))，在细胞中以"实时"或"在线"时间范围监测细胞(或遗传上修饰的细胞)中的至少一个代谢参数。在一个方面，许多细胞，如细胞培养物，被"实时"或"在线"监测。在一个方面，许多代谢参数被"实日寸"或"在线"监测。代谢通量分析(MetabolicFluxAnalysis)(MFA)是基于己知的生物化学构架。根据质量守恒定律和对细胞内代谢物的准稳态假设(pseudo-steadystatehypothesis(PSSH))，构建了线性非依赖性代谢矩阵。在实施本发明方法中，确立了代谢网络，包括对所有通路底物、产物和中间代谢物的鉴定对所有的使通路代谢物互变的化学反应的鉴定，通路反应的化学计量，对催化反应的所有酶的鉴定，酶反应动力学，通路成分之间的调节性相互作用，例如，变构作用、酶-酶相互作用等等，酶或酶的任何其它超分子组分的细胞内区室化，和任何浓度梯度的代谢物、酶或效应分子或它们移动的扩散屏障的存在情况。—旦对特定细胞株确立了代谢网络，可以导入经矩阵概念进行的数学表示(mathematicpresentation)，用以在可得到在线代谢物组(metalolome)数据吋，估计细胞内代谢通量。代谢表型取决于细胞内整体代谢网络的变化。代谢表型取决于针对环境条件、遗传调节、发育状态和基因型等产生的通路使用上的变化。在本发明方法的一方面，在线MFA计算之后，通过研究通路使用，分析细胞的动态行为、它们的表型和其它性质。在通路分析之后，对细胞培养物的生理状态的调控将变得可能。本发明方法可以帮助确定如何调节发酵，这是通过确定如何改变底物供应、温度、诱导物的使用等，来控制细胞的生理状态，以沿着所需方向进行来实现的。在实施本发明方法中，MFA的结果也可以和转录物组(transcriptome)以及蛋白质组(proteome)数据相比较，用以设计试验和方案，用于进行代谢工程或基因改组等。代谢或生长的任何一个方面都可以被监测。监测mRNA转录物的表达在本发明的一方面，基因工程的表型包括增加或减少细胞中mRNA转录物的表达或在细胞中产生新的转录物。此增加或减少的表达可以通过应用荧光多肽来追踪，例如，包括本发明方法中应用的酶的嵌合蛋白质。mRMA转录物或信息(messages)也可以通过本领域的已知方法来检测和定量，包括，例如，Northern印迹、定量扩增反应、杂交于阵列、和类似方法。定量扩增反应包括，例如定量PCR，包括，例如定量反转录聚合酶链式反应或RT-PCR;定量实时RT-PCR，或"实时动力RT-PCR"(real-timekineticRT-PCR)(参见，例如Kreuzer(2001)Br.J.Haematol.114:313-318;Xia(2001)Transplantation72:907-914)。在本发明的一方面，基因工程的表型是通过敲除表达同源基因产生的。基因的编码序列或一个或多个转录控制元件可以被敲除，例如，启动子增强子。因此，转录物的表达可以被完全去除或仅仅被降低。在本发明的一方面，基因工程的表型包括增加同源基因的表达。这可以通过敲除负向调控元件，包括顺式或反式起作用的转录调节元件，或通过诱变正向调控元件来实现。可以通过与阵列上的固定化核酸进行杂交的方法，将包括细胞转录物或代表一个细胞的转录物的核酸样品或互补于一个细胞的转录物的核酸样品进行杂交，测定细胞中的一种或多种或所有转录物。监测多肽、肽和氨基酸的表达情况在本发明的一方面，基因工程的表型包括在细胞中增加或降低多肽的表达或产生新的多肽。此增加或减少的表达可以通过应用荧光多肽来追踪，例如，包括本发明方法中应用的酶的嵌合蛋白质。多肽、试剂和终产物(例如，新伐他汀)也可以通过本领域的已知方法来检测和定量，包括，例如，核磁共振(NMR)、分光光度法、放射显影术(蛋白质放射标记)、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、高扩散色谱(hyperdiffusionchromatography)、多种免疫学方法例如免疫沉淀、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫分析(RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析、凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)、用抗体染色、荧光激活细胞分选(FACS)、热解质谱法、傅里叶变换红外光谱、拉曼光谱、GC-MS和LC-电雾化以及加帽-LC-串联-电雾化质谱(cap-LC-tandem-electrospraymassspec加metries)和类似方法。也可以用美国专利6,057,103描述的方法或其变化来筛选新的生物活性。使用蛋白质阵列，可以测量一个细胞的多肽。确定序列同一性的程度在本发明任意一个方法的一方面，所述过程的至少一个步骤包括由水解酶(例如酯酶或酰基转移酶)进行的酶促反应(例如，酰化作用)，所述水解酶是由与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3禾口/或SEQIDNO:5具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71°/。、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，或序列完全(100%)相同的核酸编码的，或其酶学上的活性片段(或可选地，可商业得到的水解酶)。在本发明任意一个方法的一方面，至少一个酶促反应是由水解酶进行的，例如酯酶或酰基转移酶，具有和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，或序列完全(100%)相同的序列，或其酶学上的活性片段(或可选地，可商业得到的水解酶)。可以用已知方案或此处描述的本发明方法，经常规筛选，确定酶活性。例如，可以通过检测多肽或肽是否能够水解内酯环或酶促地酰化二醇内酯，来确定酶活性，如此处所述。可以用本领域中已知的许多序列比对算法和程序中的任一个来评价蛋白质和/核酸序列同源性。这种算法和程序包括但决不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、禾BCLUSTALW(参见，例如，Pearson(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(8):2444-2448;Altschul(1990)J.Mol.Biol.215(3):403-410;Thompson(1994)NucleicAcidsRes.22(2):4673-4680;Higginsetal.,MethodsEnzymol.266:383-402,1996;Altschuletal.,J.Mol.Biol.215(3):403-410,19卯；Altschuletal"NatureGenetics3:266-272,1993)。通常用序列分析软件测定同源性或同一性(例如，SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,1710UniversityAvenue,Madison,WI53705)。这种软件通过对各种删除、取代和其它修饰指定同源性程度来匹配相似序列。术语"同源性"和"同一性"，在两个或更多个核酸或多肽序列的语境中，是指两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在比较窗(comparisionwindow)或指定的区域上进行比较和比对得到最大对应性时，两个或更多个序列或子序列具有相同的氨基酸或核苷酸的具体百分数，正如使用任何数目的序列比对算法或通过人工比对和肉眼观察所测定。为了进行序列比较，一个序列通常作为参照序列，检测序列和所述参照序列相比较。当应用序列比对算法时，使检测序列和参照序列进入计算机，指定子序列的坐标(subsequencecoordinates),如果需要，指定序列算法程序参数。可以采用默认的程序参数，或可以指定备选参数。随后，根据程序参数，序列比对算法计算出检测序列相对于参照序列的序列同一性百分数。如此处所用，"比较窗"包括参照由连续残基数目中的任一数目构成的片段。例如，在本发明的可选方面，在两个序列被最佳联配之后，将在本发明的示范性多肽或核酸序列的从约20个至全长范围内任一处的连续残基，和相同数目连续位置的参照序列相比较。如果参照序列和本发明的示范性多肽或核酸序列有必要的序列同一性，例如，与SEQIDNO:l、与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6有50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、8815/0、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，并且序列是水解酶或编码水解酶，则可以将该序列用于本发明方法的至少一个步骤。在可选的实施方案中，在两个序列被最佳联配之后，将约20至600、约50至200和约100至150范围的子序列和相同数目连续位点的参照序列相比较。用于比较的序列联配方法是本领域公知的。可以通过下列算法进行用于比较的序列最佳联配，例如8!!1池&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法，Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性联配算法，person&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444,1988的相似性方法搜索，这些算法的计算机执行(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,564462012840Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过人工比对和肉眼观察。除了BLAST程序(BasicLocalAlignmentSearchToolattheNationalCenterforBiologicalInformation),确定同源性或同一性的其它算法包括，例如，AL!GN、AMAS(多重比对序列分析(AnalysisofMultiplyAlignedS叫uences))、AMPS(蛋白质多重序列比对(ProteinMultipleSequenceAlignmen切、ASSET(比对片段统计评价工具(AlignedSegmentStatisticalEvaluationTool))、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(生物学序列比较分析终端(BiologicalSequenceComparativeAnalysisNode))、BLIMPS(BLocksIMProvedSearcher)、FASTA，Intervals&Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smkh-Waterman算法、DARWIN、LasVegas算法、FNAT(ForcedNucleotideAlignmentTool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(FristenskySequenceAnalysisPackage)、GAP(GlobalAlignmentProgram)、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(SensitiveSequenceComparison)、LALIGN(LocalSequenceAlignment)、LCP(LocalContentProgram)、MACAW(MultipleAlignmentConstruction&AnalysisWorkbench)、MAP(MultipleAlignmentProgram)、MBLKP、MBLKN、PIMA(Pattern-InducedMulti-sequenceAlignment)、SAGA(SequenceAlignmentbyGeneticAlgorithm)和WHAT-IF。这些比对程序也可以用来筛选基因组数据库，用以鉴定具有基本上相同序列的多核苷酸序列。注释有一些功能信息的含基因组信息的数据库由不同的组织所维护，可以经因特网得到。BLAST、BLAST2.0和BLAST2.2.2算法也用来实施本发明。它们在例如Altschul(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402、Altschul(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中有所描述。进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开得到。此算法首先涉及，通过鉴定待询序列中W长度的短字符，鉴定出高度得分序列对(HSPs);其在与数据库序列中相同长度的字符串比对时，或是匹配于或是满足了一些正值的阈分值T。T是指相邻字符串得分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul(1990)见上文)。以这些起始的相邻字符串命中(neighboi'hoodwordhits)作为根据，开始搜索，以发现含有它们的更长的HSPs。字符串命中沿着每一序列在两个方向上延伸，直到累积的联配分数增加。对于核苷酸序列，累积分数是用参数M来计算的(M为对一对匹配残基的奖励分数；通常>0)。对于氨基酸序列，用得分矩阵计算累积分数。在下列情况下，字符串命中(wordhits)在每一方向上的延伸被停止累积联配分数从其最大获得值降低数量X;由于累积了一个或多个负记分残基联配，累积分数达到0或更低；或到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)应用的默认值是，字符串长(W)为11、期望值(E)是10、M=5、N=-4以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序应用的默认值是，字符串长为3、和期望值(E)为10，和BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci,USA89:10915)比対(B)是50、期望值(E)为10、M=5、N=-4和比对两条链。BLAST算法也对两条序列的相似性进行统计学分析(参见，例如，Kai'lin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873)。BLAST算法提供的一种相似性测定方法是最低总概率(smallestsumprobability)(P(N))，这表明了两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率。例如，如果在检测核酸和参照核酸的比较中，最低总概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001,则认为该核酸和参照序列相似。在一方面，蛋白质和核酸序列的同源性是用BasicLocalAlignmentSearchTool("BLAST")来评价的。例如，可以用5个特定的BLAST程序实施下列任务(1)BLASTP和BLAST3将氨基酸待询序列和蛋白质序列数据库相比较；(2)BLASTN将核苷酸待询序列和核苷酸序列数据库相比较；(3)BLASTX将待询核苷酸序列(两条链)的六框架概念上的翻译产物与蛋白质序列数据库相比较；(4)TBLASTN将待询蛋白质序列和在所有六个阅读框(两条链)中翻译的核苷酸序列数据库相比较；和(5)TBLASTX将核苷酸待询序列的六框架翻译产物和核苷酸序列数据库的六框架翻译产物相比较。BLAST程序通过鉴定相似片段来鉴定同源序列，这被称作在待询氨基酸或核酸序列与检测序列之间的"高度匹配的片段对(high-scoringsegmentpairs)"，所述检测序列优选地得自蛋白质或核酸序列数据库。高得分片段对(high-scoringsegmentpairs)优选地通过记分矩阵方法被鉴定出来(即被比对出来)，许多记分矩阵方法是已知的。优选地，应用的记分矩阵是BLOSUM62矩阵(Go画tetal.,Science256:1443-1445,1992;HenilsoffandHenilcoff,Proteins17:49-61,1993)。较不优选地，也应用PAM或PAM250矩阵(参见，例如，SchwartzandDayhoff,eds.,1978,MatricesforDetectingDistanceRelationships:AtlasofProteinSequenceandStructure,Washington:NationalBiomedicalResearchFoundation)。在本发明的一方面，应用NCBIBLAST2.2.2程序，这是blastp的默认选项。BLAST2.2.2程序中有约38个设置选项。在本发明的此示范性方面，除了默认滤过设置之外，应用所有的默认值(即，除了将滤过设置为关闭之外，将所有参数设置为默认值)；在其位置上，应用"-FF"设置，这使得不能滤过。应用默认的滤过通常导致Karlin-Altschul干扰，其原因是序列的短长度。用于本发明的此示范性方面的默认值包括"对低复杂性滤过(Filterforlowcomplexity):ON字符串长度(WordSize):3矩阵Blosum62空位罚分(GapCosts):(空位存在)existence:11空位延伸(extension):1"其它的默认设置可以是对低复杂性滤过OFF,对蛋白质的字符串长度为3，BLOSUM62矩阵，空位存在罚分为-11和空位延伸罚分为-1。示范性NCBIBLAST2.2.2程序设置的"-W"选项默认为0。这意味着，如果未加设置，蛋白质的字符串长度默认为3，核苷酸的字符串长度默认为11。参照下面的实施例进一步描述本发明；然而，应该理解，本发明不限于这些实施例。实施例实施例1:化学酶促地生产新伐他汀下面的实施例描述了本发明的示范性方案，例如，用于化学酶促地生产新伐他汀。洛伐他汀的酶促水解在7-10%MeOH/缓冲液中的浓度是0.1至0.5M的洛伐他汀或洛伐他汀酸中，评价具有SEQIDNO:4(由SEQIDNO:3编码)序列的酶，通过自动加入碱，将反应维持在pH9-9.5进行。例如，在500ml规模上，在0.5M洛伐他汀中，用含有14mg/ml总蛋白的酶SEQIDNO:4(来自裂解细胞的离心上清液)冻干制备物，在48小时之后观察到底物的完全转化。使反应混合物酸化(pH2)，离心收集沉淀并使之干燥。用iPrOAc萃取滤液，将有机相萃取物加入干燥滤饼。加热得到的悬浮液，在Dean-Stark仪器中回流，直至内酯化作用完成。将得到的溶液滤过硅藻土垫(Cditepad),用饱和(satd.)NaHC03洗涤滤液。浓縮得到的iPrOAc溶液直至(x0.5)，用己垸稀释并冷却至0"C。过滤沉淀出的固体并空气干燥，产生二醇内酯(63g，79.5%分离产率；其它10.3g产物在各种洗涤液和母液中得到鉴定)。产物含有<1%的洛伐他汀。二醇内酯的酶促酰化在室温下振荡二醇内酯(25mM)、乙酸乙烯酯(250mM)和南极洲假丝酵母(Om^Waa"tor"/cfl)月旨肪酶B(33mg)在TBME(lml)中的混合物。44小时之后，HPLC表明形成了单乙酸酯，转化率是60%。制备乙酰基新伐他汀在室温中，真空下，过夜干燥4-乙酰基内酯，在氮下储存，然后在氮下室温中溶解于无水二氯甲垸中(lg/2.5-3ml的比值)。同时，在最小量的乙腈中室温下溶解Cu(OTf)2(5moP/。)，随后向溶液中加入1.05-1.2当量的二甲基丁酸酐，室温下搅拌30分钟至1小时。在氮气氛下，在室温下，将此Cu(OTfV酸酐溶液通过注射器转移到4-乙酰基内酯溶液中，同时搅拌。当完成时(HPLC监测)，通过加入水淬灭(quench)反应，用饱和NaHC03洗涤。分离的有机层经Na2S04干燥，过滤并蒸发，得到粗产物4-乙酰基新伐他汀(〉99)。乙酰基新伐他汀的酶促水解3.22g乙酰基新伐他汀(终浓度为350mM);2mlMeOH;10(^14MTris;9.9mlzK;8ml酯酶(SEQIDNO:4，由例如SEQIDNO:3编码)，水中的125mg/ml冻干裂解物。反应在带有顶部搅拌和磁力搅棒的25ml容器中进行。pH稳态条件(pH-statconditions)是由DasGipSTIRRER-PRO⑧系统维持的；pH值7是通过加入10XNH40H维持的。转化率接近75%时，加入4ml的甲苯使物质溶解。使反应过夜进行，此时加入另外的溶剂(甲苯或二氯甲烷)以确保所有的不溶性物质被溶解。反应的最终组分是新伐他汀酸4.7%，新伐他汀90.9%，乙酰基新伐他汀0.9%，推断的新伐他汀消除产物是3.5%。最终的转化率是95.6%。实施例2:洛伐他汀酯酶分析在一方面，本发明提供了方法，包括用水解酶，例如，本发明的酶，例如SEQIDNO:3编码的SEQIDNO:4，酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸。在一方面，本发明提供了方法，包括酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生新伐他汀。下列例子描述了示范性的洛伐他汀酯酶分析，可以用其来实施本发明方法。例如，该示范性分析可以用来确定是否可以用水解酶例如酯酶来实施本发明方法。(a)细胞裂解(分析级)从B-PER(4.5L)(Pierce，#78248)、溶菌酶(200)iL)(Sigma，L-6876;贝亡存液10mg/ml)和DNaseI(40pL)(Sigma，DN-25;IC存液5mg/mL)，制备冰冷裂解液(足够用于9个样品)。同时，通过在950pL水中漩涡振荡并以16,000g在4。C离心15分钟，重悬浮50)aL的培养物。通过移液管吹打，将得到的细胞沉淀重悬浮在500nL裂解液中。在进行活性分析之前，将样品在冰上温育45分钟。(b)总蛋白定量蛋白质定量可以通过基于考马斯染料的任何分析，用Bradford法进行；此时应用的试剂盒是CoomassiePlusProteinAssayKit(Pierce,#23236)。按制造商的指南使用(可以从Pierce,Doc#0229得到)。将感兴趣的蛋白质溶液稀释到同时测定的已知蛋白质浓度的标准品(白蛋白)的线性范围内。得知蛋白质的浓度后，计算合适的稀释度，以允许合理地吸取O.l微克的总蛋白(g卩，在2至20pL范围)。(c)酶活性甲基伞形酮丁酸盐(MUB)水解使O.lpg总蛋白成为25pL，带有50mMTris-HClpH9缓冲液(缓沖型/pH是可变的)，置于96孔板中。同时制备4mMMUB(9.8mg，在10mLDMSO中)储液并分配在400nL的等分试样中，在-2(TC存储。将贮存液稀释至20(^M的工作浓度400jaL，溶于pH7.0的7.6mL10mMHEPES缓冲液。在动态地在300秒期间阅读荧光板读数器(SPECTRAMAXGEMINIXS:ex=360nm;em=465nm)之前即刻，向25pL样品中加入工作MUB液。工作液可以在4"C存储几天，而后发生降解。优选地，在每次分析之前，使等份DMSO贮存液解冻，并制备新鲜的工作液。SEOIDNO:4(100g水平)对洛伐他汀的水解包括将洛伐他汀酶促水解为三醇酸的本发明示范性反应示例于图18E中。1.将洛伐他汀(10xl0g，0.25mol)和水(13xl0mL)按交替的部分缓慢加入快速搅拌的MeOH(35mL，终体积是7%)和6MNaOH(43mL，0.26mol)的混合物中，混合物在配备有顶部搅棒搅拌器(overheadpaddlestirrer)的1L的3-颈烧瓶中。2.当得到均相混合物时，在35'C下搅拌该混合物，直至pH值降至8(大约2小时)，洛伐他汀因而转化为洛伐他汀酸。3.同时将冻干的酶(22.64g)和水重新结合(终体积是180mL)。将4MTris(4mL)和重新结合的酶溶液加入洛伐他汀酸溶液。加入水(108mL)使体积成为500mL，随后进行pH调控。4.用DASGIPAG-PRO⑧生物反应器，用30%的NH4OH维持pH为9.5，来控制反应。搅拌反应物48小时(备注1，如下)并维持在35C定期移去等分试样(10pL，在990pLMeOH中淬灭)，经HPLC监测反应进程(备注2，如下)。5.转移至4L烧杯中并用水稀释(1L)，使反应终止。用6MHCL调节混合物的pH值。在pH4.4时，混合物变得非常粘，同时沉淀出白色固体，使搅拌速度增加以防止混合物"凝胶化"。用总量120mL的6MHCL将混合物调节为pH2.5并再搅拌0.5小时。6.将得到的桨液通过21cmBuchner漏斗上的Whatman#1滤纸而过滤，用水(0.5L)洗涤潮湿的滤饼。使潮湿的滤饼在空气中干燥1小时；随后将其转移到4x600mL的冻干瓶中，并在冻干机上干燥48小时，产生浅白色的粉末(98.6g)(备注3，如下)。7.将滤液分为三等份，用单份EtOAc(500mL)萃取。尽管第一次萃取分离得容易，但第二和第三份形成乳液，所述乳液甚至在用饱和NaCl(100mL)处理后，也没有完全分离。用饱和("satd")NaC1(100mL)洗涤EtOAc萃取物，干燥0%2804)并过滤。在N2下搅拌滤液，在5分钟期间滴加溶于EtOAc(5mL)中的MeS03H溶液(0.2mL，3.1mmol;终浓度是~7mM)。4.5小时之后，用饱和NaHC03(200mL)、水(100mL)和饱和NaCl(100mL)洗涤反应液。在旋转蒸发仪上将EtOAc层浓缩至50mL，缓慢滴加已烷(200mL)，沉淀出二醇内酯。经过滤和干燥收集沉淀的固体(3.36g，纯度是81.3%);另外0.26g残留在母液中。8.确定总产率是94.9%(参见备注4，如下)。备注1.HPLC表明，100g水平的反应在22小时之后完成了97。/。，但常常搅拌反应较长吋间，以确保完全水解，2.样品是在配备有DAD的Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSB-苯基柱(4.6x75mm)(45。/。MeCN/0.P/。H3PO4等度(isocratic);lml/min;30°C;238nm)分析的。洗脱的顺序是三醇酸1.4分钟，二醇内酯1.9分钟，洛伐他汀酸3.8分钟，洛伐他汀7.3分钟。3.此阶段的滤饼由粗三醇酸和沉淀出的蛋白质组成。4.计算出的产物的总产量显示在表中5.<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>w由！HNMR分析，与内标甲基甲酸比较。*由HPLC分析，与工作标样比较。SEQIDNO:4(150g水平)对洛伐他汀的水解1.将洛伐他汀(150g，0.37mol)和水(300mL)按交替的部分缓慢加入快速搅拌的MeOH(52.5mL)和50%w/wNaOH(30niL，0.57mol)的混合物中，混合物在配备有顶部搅棒搅拌器的1L的3-颈烧瓶中。室温下搅拌反应物过夜，然后用浓縮HCl(25mL)将澄清的混合物酸化至pH7-8(备注1,如下)。2.将SEQIDNO:4(17g)和水重新结合(50mL水)并将其加入反应。再加入一份水水(300mL)，使反应总体积为750mL。3.用DASGIPAGFEDBATCH-pro⑧生物反应器，用30%的NH4OH维持pH为9.5，来控制反应。搅拌反应物并维持在35°C，定期移去等分试样(10pL，在990pLMeOH中淬灭)，由HPLC监测反应进程(备注2，如下)。4.86.3小时之后，HPLC表明，残留~1%的洛伐他汀酸并且反应被终止。将反应混合物转移至4L烧杯中，用水(1L)稀释并剧烈搅拌。用6MHCL(160mL)使混合物酸化至pH值2.5，室温下再搅拌1.5小时。5.将得到的浆液通过19cmBuchner漏斗上的Whatman#1滤纸而过滤，用水(0.5L)洗涤潮湿的滤饼。混合物容易地滤过，得到奶白色的滤饼和金黄色的滤液。使潮湿的滤饼在空气中干燥1小时；随后将其转移到4x600mL的冻干瓶中，并在冻干机上干燥，产生浅白色的粉末(154.8g)(备注3，如下)。6.将滤液分为三等份，用单份的EtOAc(600mL)萃取。用饱和NaCl(lOOmL)洗涤EtOAc萃取物、干燥(Na2S04)、过滤并浓縮为250mL。在N2下搅拌滤液，在5分钟期间滴加溶于EtOAc(4mL)中的MeS03H溶液(0.2mL，3.1mmol;终浓度是15mM)。70分钟之后，用饱和NaHCO3(200mL)和饱和NaCl(50mL)洗涤反应液。使EtOAc溶液保持过夜、轻轻倒出并在旋转蒸发仪上浓縮至120mL。缓慢滴加已烷(200mL)，沉淀出二醇内酯。过滤和干燥沉淀的固体(3.22g，纯度是92.3%);另外0.47g残留在母液中。7.确定总产率是98.9%(参见备注4，如下)。计算出的产物的总产量显示在下面的表中:<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>#由'HNMR分析，与内标甲基甲酸比较。*由HPLC分析，与工作标样比较。实施例3:4-乙酰基二醇内酯的合成本发明提供了合成4-乙酰基二醇内酯的合成方法，如图18A所示例。A.直接乙酰化三醇酸O0g水平)1.在N2下，将粗提的三醇酸(25.82g，59.1mmol)(备注1，如下)装进干燥的500mL圆底烧瓶中，随后加入干燥CH2Ch(200mL)。在N2下，室温下磁力搅拌该浆状混合物。加入DMAP(1.08g，8.8mmol;15mol%)，随后通过注射泵在8.5小时期间缓慢加入乙酸酐(15.8mL，共2.8当量)。在7.75小时，再加入一份DMAP(0.36g，2.9mmol)(备注2，如下)。2.用HPLC密切监测反应进程(备注3，如下)。3.11小时之后，加入水(5mL)淬灭反应，在工作前使混合物储存在-2(TC。使混合物滤过硅藻土垫以去除不溶物质，用CH2Cl2洗涤硅藻土垫。随后，用5%HC1(100mL)、H20(50mL)、饱和NaHC03(3x100mL)和饱和NaCl(lOOmL)洗涤滤液，干燥(Na2S04)并过滤。随后浓縮滤液(去除150mL)，加入EtOAc(100mL)并进一步浓縮至60mL。4.伴随着快速搅拌，在5分钟期间加入己烷(420mL)。过滤收集沉淀出的产物，用巳烷(100mL)洗涤并在真空下干燥，得到白色固体(17.4g，81.2%)(备注4、5，如下)。1.经'HNMR分析，用甲基甲酸作为内标，确定三醇酸的纯度是77.5%;其余的物质是沉淀的蛋白质/冻干物质。2.加入乙酸酐和DMAP的速度显示在下面的表中。DMAP和乙酸酐加入的顺序<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>3.样品是在Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSBTm-笨基柱(4.6x75mm)(40%MeCN/0.5%AcOH梯度；lml/min;RT;238nm)分析的。梯度和洗脱顺序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>4.还有2.20g(10.3。/。)乙酰基内酯残留在母液中，总产率是91.5%。5.HPLC百分面积显示:二醇内酯0.8%;4-乙酰基内酯98.5%;4,8-二乙酸酯0.2%，消除产物0.6%。B.直接乙酰化三醇酸(37g水平)1.应用粗提的三醇酸(48.43g，111mmol)(纯度77.45%)(备注1，如下)和DMAP(2.30g，18.8mmol;15mol%)，在无水CH2C12(375mL)中，如上述进行反应。在N2下，室温下磁力搅拌浆状混合物，并通过注射泵缓慢加入乙酸酐(34.6mL,3.3当量)(备注2，如下)。2.在N2下，将三醇酸(2287-40，48.43g，77.45%)装入1L的干燥烧瓶，随后3.在8小时之后，加入水(5mL)淬灭反应，搅拌10分钟，在工作前使混合物储存在-2(TC。使混合物滤过硅藻土垫以去除不溶物质，用CH2Cl2洗涤硅藻土垫。随后，用5%HC1(175mL)、H20(50mL)、饱和NaHC03(2x175mL，100mL)和饱和NaCl(175mL)洗涤滤液，干燥(Na2S04)并过滤。浓缩滤液(去除300mL)，加入EtOAc(200mL)并进一步浓縮至110mL。4.伴随着快速搅拌，在5分钟期间加入己垸(450mL)。过滤收集沉淀产物，用已烷(50mL)洗涤并在真空下干燥，得到白色固体(31.5g，78.4%)(备注3、4，如下)。C.直接乙酰化三醇酸(150g水平)1.应用粗提的三醇酸(154g)(备注1，如下)和DMAP(6.8g，55.7mmol;15mol%)，在无水CH2Cl2(lL)中，如上述进行反应。在N2下，机械搅拌反应浆液，并通过注射泵缓慢加入乙酸酐(备注2，如下)。先使反应保持在15°C1.5小时，随后室温下搅拌。2.在9.25小时之后，加入水(200mL)淬灭反应，室温下搅拌20分钟，然后维持过夜。3.使反应混合物通过硅藻土垫过滤，随后，用CH2C12(2x250mL)洗涤。用5%HC1(500mL)和H20(500mL)按顺序洗涤结合的滤液，随后浓縮(去除1.2LCH2C12)。向残余物中加入EtOAc(500mL)，再去除400mL溶剂。用饱和NaHC03(500mL)洗涤残留溶液，然后和NaHC03/H20混合物(500mL饱和NaHC03，500mLH20，再按份加入167.2gNaHC03粉末)搅拌(备注3，如下)。4.两层被缓慢地保持分离，用NaCl(250mL)洗涤有机层。干燥有机层(Na2SO4)、过滤并浓缩至500mL。5.伴随着快速搅拌，在45分钟期间向残留物加入已垸(3.5L)。过滤沉淀产物并干燥，得到白色固体(95g，70.7%)(备注4、5，如下)。备注1.粗提的三醇酸是从150g洛伐他汀的水解分离出以及此前反应的物质。2.加入乙酸酐的速度显示在下面的表中表加入乙酸酐的顺序<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>3.乙酸和二甲基丁酸应该被去除，以防止它们再次参与随后的酰化反应。4.还有10.1g(7.5。/。)乙酰基内酯残留在母液中，它和约0.16%水洗涤的产物丢失相结合，代表从洛伐他汀的78.4%的总产率。5.HPLC百分面积显示二醇内酉旨0.9%;4-乙酰基内酯98.7%;4,8-二乙酸酯0.2%，消除产物0.1%。6.'HNMR(CDC13)d0.90(d,J=6.94Hz,3H)，1.19(d,,T=7.57Hz,3H)，1.27-1.41(m,1H)，1.45-1.60(m,2H)，1.76-1.95(m,6H)，2.09(s,3H)，2.10-2.13(m,1H),2.14-2.20(m,1H)，2.32-2.41(m,1H)，2.41-2.50(m,1H)，2.67-2.75(m,1H)，2.75-2.82(m,1H)，4.23(brs,1H)，4.54-4.63(m,1H)，5.22-5.28(m,1H)，5.53-5.58(m,IH)，5.77-5.83(m,1H)，5.99(d,J=9.46Hz,1H);13CNMR(CDC13)d13.98，21.07，23.82，24.19，27.40，30.82，32.95，33.39,35.40，35.83，36.50，38.77，65.34，65.61，76.51，128.51，130.14，131.29，133.60,168.90，170.02。D.直接乙酰化三醇酸n50G水平)a.将粗提的三醇酸(151.21g，来自150g洛伐他汀)装入2L的干燥烧瓶，随后加入CH2C12(1.0L)。通过顶部机械搅拌器搅拌浆液并在室温下保持过夜。b.加入一份DMAP(6.8g，基于150g洛伐他汀为15mol%)，随后在20分钟期间加入乙酸酐(157.6ml，4.5当量)。用HPLC监测反应。c.3.5小时之后，加入水(IOOmL)淬灭反应，在室温下再搅拌3小时。使反应混合物通过Whatman#1滤纸过滤，用CH2C12(2x250ml)洗涤滤饼。d.用5%HC1(500mL)和H20(500mL)按顺序洗涤CH2C12，随后将有机层浓縮为400ml并用EtOAc(500ml)稀释。用饱和(satd.)NaHCO3(500ml)搅拌溶液，加入另外的NaHCO3(60g)以中和乙酸。用饱和NaCl(500ml)洗涤有机层，干燥(Na2S04)并过滤。将滤液浓缩至约100mL。伴随着搅拌，迅速向残留物加入已烷(500ml)。过滤沉淀产物并干燥，得到白色固体(112.6g，83.4%)(备注l、2，如下)。备注1.还有7.6g(5.7。/。)4-乙酰基内酯残留在母液中，代表了从洛伐他汀的总产率是89.1%。2.HPLC百分面积显示二醇内酯0.9%;4-乙酰基内酯99.0%;4，8-二乙酸酉旨0.45%，消除产物0.53%。E.直接乙酰化三醇酸(150G水平)1.将粗提的三醇酸(158.4g，来自150g洛伐他汀)装入2L的干燥烧瓶，随后加入CH2C12(625mL)。通过顶部机械搅拌器搅拌浆液并在室温下保持过夜。2.加入加入一份DMAP(6.8g，基于150g洛伐他汀为15mol%)，随后在17分钟期间加入乙酸酐(122.6ml，3.5当量)。用HPLC监测反应。2.5小时时，再加入一份乙酸酐(35ml，1.0当量)，随后在3.5小时时加入Et3N(25.8ml，0.5当量)(备注1，如下)。3.6.3小时之后，终止反应，使之经历前述的同样萃取操作。此时加入已垸沉淀出大块产物。使固体在CH2Cl2(300mL)和EtOAc(300ml)中重新溶解，浓缩至约130mL。加入己烷(650mL)沉淀出产物，收集该产物并干燥，得到白色固体(107.24g，79.8%)(备注2、3,如下)。遞1.反应在约60%转化时停止，加入Et3N协助乙酰化。2.还有10.7g(8.0。/。)4-乙酰基内酯残留在母液中，代表了从洛伐他汀的总产率是87.8%。3.HPLC百分面积显示二醇内酯0.6%;4-乙酰基内酯97.9%;4,8-二乙酸酯0.6%，消除产物0.9%。图18B说明了4-乙酰基内酯的结构，相应的二乙酸酯结构和消除产物。实施例4:4-乙酰基新伐他汀的合成下面的实施例描述了本发明的示范性方案，例如，4-乙酰基新伐他汀的合成，如图18C所示例。A.三氟化硼醚合物催化1.在2L的双颈烧瓶(备注l)中，使4-乙酰基内酯(110g，0.3mol)在真空下(0.1托)干燥过夜。2.在N2下，将干燥的原料室温溶解在无水CH2C12(875mL)中。3.如下制备催化剂。在N2下，在手套袋(glovebag)中将2,2-二甲基丁酸酐(7.1mL，30.3mmol)加入无水乙腈(125mL)，随后加入刚打开的BF3.OEt2(3.1mL，24.3mmol;8mol。/。)(备注2、3)。4.将2,2-二甲基丁酸酐(78mL，0.33mol;1.1当量)加入4-乙酰基内酯溶液，将混合物加热至40°C10分钟(备注4)。随后经导管加入BF3.OEt2的MeCN溶液(备注5)。使反应避光，在4(TC搅拌并由HPLC监测。5.5.5小时后，判断反应完成，使反应物在冰浴中冷却至5'C。加入饱和NaHC03250mL)，同时剧烈搅拌。分离水相层，用CH2Cl2(200mL)萃取。6.合并有机萃取物，干燥(Na2S04)、过滤并在低压下浓縮。向浓縮物中加入MeOH(200mL)(备注6);更多MeOH的去除造成4-乙酰基新伐他汀沉淀。将白色固体过滤、用冷的MeOH(100mL)洗涤并在真空下干燥(92.8g)。7.将母液浓縮至大约一半体积，在-l(TC冷却过夜。如果通过过滤收集产物(17.2g)并干燥，将第二次收获到产物(备注7)。8.HPLC图显示在表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>1.原料应该被研磨成粉末。以有助于去除大块中可能带有的乙酸。残留的乙酸会导致产生4,8-二乙酸酯。在升高的温度下真空干燥，可能引起分解。4-乙酰基内酯在40'C真空干燥时变成黄色。2.由于反应对湿气的存在是敏感的，因此起初将过量的酸酐加入乙腈，用以清除任何残留的水。预热酸酐，乙酰基内酯从反应容器中清除水。3.应该将新打开的BF3.0Et2用在反应中；以前打开过的试剂可能导致反应缓慢或甚至不发生反应。4.溶液必须在加入催化剂期间冷却下来，否则产生芳香族副产物。5.CH2Cl2/MeCN比值是7:1。典型地，该比值是6:1禾卩9:1之间。反应在MeCN中较快，但是产生的产物带有较不希望产生的杂质分布。6.MeOH应该在粗产物凝固之前加入，否则其难于在MeOH中重新溶解。在热的甲醇中溶解固体产物引起分解，并因此得到较低的产量。7.总的固体产量是110g(78.7%)。将最终的母液蒸发至干燥，与工作标样(workingstandard)比较，分析残余物，显示出还含有9.02g(6.8%)的产物。还有约2%的产物残留在含水洗涤物中。参见图18C。B.4-乙酰基新伐他汀的合成如上制备。4-乙酰基内酯(111.6g,91%)第一次收获86.2g第二次收获U.6g总量97.8g，75.8%分析'HNMR99.8%(与作为内标的甲基甲酸比较)HPLC98,1%(与工作标样4-乙酰基新伐他汀比较)含水洗涤物含有约1.9%，还有约7%残留在残余物中，总产率是84.7%。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>C.4-乙酰基新伐他汀的合成如上制备。4-乙酰基内酯(107g，96%)第一次收集90.4g第二次收集12.7g总量97.8g，79.3%分析"HNMR99.2%(与作为内标的甲基甲酸比较)HPLC96.8%(与工作标样4-乙酰基新伐他汀比较)含水洗涤物含有约1.8%，还有约7%残留在残余物中，总产率是88.1%。HPLC图显示在表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>D.卩比卩定/DMAP法1.在真空下使4-乙酰基内酯(2.6g，7.2mmol)室温下真空中干燥过夜，然后在氮气氛下室温溶解在无水吡啶中(6.0mL)，同时搅拌。加入DMAP(176mg，0.2当量)的1.5mL无水吡啶溶液，在冰浴中冷却该混合物。2.用注射泵在15分钟期间滴加2,2-二甲基丁酰氯(7.72g，8当量)。于0。C搅拌混合物约1小时，随后室温下搅拌1小时。3.在氮气氛下，于4(TC加热反应混合物，用HPLC监测反应。4-乙酰基内酯消耗之后(2天)，经旋转蒸发移去吡啶。残余物在EtOAc(20mL)和饱和NaCl(20mL)之间进行分配。干燥有机层(Na2S04)、过滤并蒸发，得到粗产物(96.5%)。E.Cu(OTfb/(酸)酐法1.在真空下室温干燥10.0g的4-乙酰基内酯(10.0g，27.6mmol)l小时，然后溶解于无水CH2C12(60mL)中并在氮气氛下搅拌。2.同时，在密封的瓶中制备无水MeCN(7.0mL)中的Cu(OTf)2(0.5g，5mol%)和2,2-二甲基丁酸酐(7.15mL，30.5mmol)的溶液并在室温下搅拌。3.使内酯溶液冷却至15°C。用注射泵滴加Cu(OTf)2和2,2-二甲基丁酸酐的溶液。用HPLC监测反应，并判定其在3.0小时内完成。4.用水(20mL)淬灭反应，并在CH2Cl2(100mL)和饱和NaCl(100mL)之间进行分配。随后用1M苹果酸(50mL)和饱和NaC1(50mL)的混合物搅拌有机层10分钟，随后用饱和NaCl(100mL)搅拌。干燥有机层(Na2S04)、过滤并蒸发，得到粗产物(12.8g，重量产率>100%)(备注3、4)。1.HPLC的产物分布面积百分数是4-乙酰基新伐他汀(79.5%)，消除产物(12%)，二新伐他汀(2%)，未鉴定杂质(6.5%)。2.柱层析之后，4-乙酰基新伐他汀以43%被分离。认为4-酰基新伐他汀对Si02层析的稳定性有限。3.HPLC的产物分布面积百分数是4-乙酰基新伐他汀(92.5%)，消除产物(2.7%)，二新伐他汀(1.7%)，未鉴定杂质(3.1%)4.柱层析之后，4-乙酰基新伐他汀以61%分离。SEOIDNO:4对4-乙酰基新伐他汀的水解本发明也提供了方法，包括用水解酶水解4-乙酰基新伐他汀，例如，图18D所示例。1.在25mL的三颈烧瓶中，将4-乙酰基新伐他汀(3.68g，8mmol)在MeOH(2mL)中的溶液加入4MTris缓冲液(O.lmL)在水(9.9mL)中的混合物中。剧烈搅拌该浆液(磁力搅拌和顶部搅拌)并加热至50°C。2.将SEQIDNO:4(lg冻干物质)溶解在水(8mL)中并加入到反应混合物。3.用DASGIPFEDBATCH-PRO⑧系统，通过加入10%NH3水溶液，将pH维持在6.75，用加热水浴将反应温度维持在5(TC。4.一旦反应达到75%的转化，加入甲苯(4mL)，目的是溶解产物和剩余原料。5.定期取出等分试样(20pL，在980^LMeOH中淬灭)，用以通过HPLC监测反应进程(备注l，如下)。当判断反应结束时，通过离心使反应混合物澄清(45000xg，4°°C，25分钟)，得到甲苯上层、水相澄清层和压縮的固体沉淀。用HCl将澄清的水相层调节至pH2.5。观察到絮状沉淀。通过离心使混合物澄清(45000xg，4°°C，25分钟)，形成另一个小的沉淀。6.通过HPLC检测每一组分，将新伐他汀浓縮在有机相和沉淀物中。用二氯甲烷(100mL)萃取沉淀物，离心分离得到的乳液(45000x，4'C,25分钟)。合并CH2Cl2层，干燥(Na2S04)并蒸发，得到黄色油状物(3.05g，91%)(备注2，如下)。1.在Waters1100SeriesHPLC上，用ZorbaxSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(45%MeCN/0."/。H3PO4梯度，1ml/分钟；RT;238nm)分析样品。梯度和洗脱顺序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>SEOIDNO:4对4-乙酰基新伐他汀的水解本发明也提供了方法，包括用酯酶水解4-乙酰基新伐他汀，例如，SEQIDNO:4的酯酶，参见图18D。1.在配备有磁力搅拌棒和顶部搅拌器的2L的圆底烧瓶中，将4-乙酰基新伐他汀(96.6g，0.21mol)和SEQIDNO:4(20g)的混合物悬浮在10%MeOH(1L)中。剧烈搅拌混合物并在热水浴中保持在60°C。2.用DASGIPFEDBATCH-pro⑧系统，通过加入10%NH3水溶液，将pH维持在7.5。用HPLC监测反应。3.24小时之后，将反应混合物转移到4x250mL离心瓶中并以10,000rpm在4"离心15分钟。将上清液轻轻倒出并弃去。沉淀物在水中(4x250mL)重悬浮，如前进行离心。再次轻轻倒出上清液并将其弃去。4.将离心沉淀转移至烧结的玻璃漏斗，除去过量的水。用丙酮(2xl50mL)润洗离心瓶，将丙酮转移至漏斗。向漏斗中加入硅藻土(Celite)(10g)，磨碎混合物并吸干。5.用CH2C12(5x200ml)洗涤漏斗上的残余物，每一次后进行研磨，如果需要，再加入硅藻土。6.用饱和NaCl(100ml)洗涤合并的洗液，弃去水相层。干燥有机层(Na2S04)，过滤并将溶剂换为甲苯(2Q0ml)。7.向甲苯溶液加入已烷(600ml)，同时搅拌；加入约300ml之后，开始沉淀。过滤沉淀物并干燥，产生白色固体(69.9g，79.7%)。8.将母液冷却至-20。C过夜，收集第二批新伐他汀(3.5g，4.0%)。实施例5:本发明的示范性合成过程下面的实施例描述了本发明的示范性方案，例如，从洛伐他汀合成新伐他汀的过程。步骤l:洛伐他汀水解本发明也提供了方法，包括从洛伐他汀生成三醇酸，如图15A所示例。鉴定了新的洛伐他汀酯酶(序列如SEQIDNO:4列出和随后的亚克隆)之后，努力的重点集中在产生可分级(scaleable)的酶促水解方法上。提出的新伐他汀方法的所需参数之一是，酶促反应在高的底物加载量下进行。起始的筛选和证实反应是用洛伐他汀酸进行的，原因是它的水溶性高。用洛伐他汀进行的反应慢得多，原因是洛伐他汀在水中的溶解度较低，特别是在较低的pH值(7-8)和高底物加载量时。溶解性的缺乏通过首先化学地原位打开内酯环而被克服。因此，用1当量的NaOH处理洛伐他汀在MeOH/水(反应终浓度是7-10%MeOH)中的悬浮液，并搅拌混合物几小时，直至洛伐他汀被转化为更加可溶的洛伐他汀酸。当完成开环时，将反应混合物的pH调节至pH9.5，随后加入酶，尽管在许多情况下，不必要对pH进行调节，原因是pH在进行开环时降低到可接受值。通过加入重构成的酶溶液引发酶促反应。随后在35-4(TC搅拌混合物，通过自动加入10-30%NH4OH，将pH保持在9.5不变。在这些条件下，通常在48小时处获得洛伐他汀向三醇酸的>98%的转化。接近结束时，反应大大减慢。一系列的大规模水解的结果总结于表1中。表l:洛伐他汀水解<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>试验2和3显示了异常的长反应时间。在这两种情况下，洛伐他汀内酯开环是用大大过量的NaOH完成的，需要添加HCl将pH调回合适的范围，用于进行酶促反应。此前观察到，高的盐浓度对酶促水解产生有害影响。而且，由于在其时的可利用性有限，初始的酶进料(11%w/w)少于以前应用的量；再加入几份酶，使酶的总进料达到17%w/w。用水稀释反应混合物并随后将混合物酸化为pH约2，使反应终止。在这些条件下，三醇酸、变性蛋白质和其它培养基/细胞组分从溶液中沉淀出来。对于起始的小规模反应，稀释反应物，用回流的iPrOAc使此混合物经历连续的液体萃取。在这些条件下，发生三醇酸内酯化，二醇内酯可以从浓縮的iPrOAc萃取物沉淀而容易地得到。对于大规模的反应，通过过滤，分离沉淀的三醇酸/变性蛋白质混合物，在滤饼仍然潮湿时，将其悬浮在iPrOAc中并使其经历共沸蒸馏，实现内酯化。通过过滤，去除不溶的变性蛋白质/细胞组分，通过浓縮和沉淀，分离出二醇内酯。此方法在10-30g规模上的效果很好，产生二醇内酯，而无需纯化三醇酸。然而，随着反应规模增加(50-100g)，共沸蒸馏需要对更浓縮的溶液进行较长的回流时间，以形成内酯化。在这些条件下分离出的二醇内酯的产量减少，并且产物被增加量的黄色油状物所污染，估计是由于三醇酸或二醇内酯的聚合引起的。在实验室中〉100g规模时，最方便的工作是稀释和酸化酶反应混合物。通过过滤收集不溶物质并干燥此潮湿的滤饼；起初的冻干物用于干燥，但是对其它的试验，将滤饼在真空炉中30-40'C干燥。分析粗产物(在内标存在的情况下，进行'HNMR)表明，其含有约78%的三醇酸，其余物质是变性蛋白质、细胞和培养基组分。过滤之后，可以用EtOAc萃取滤液，再回收约2%的产物。此物质可以被分离，或是作为三醇酸或是内酯化(7mMMeS03H)为二醇内酯，并加入到下一步骤。步骤2:乙酰化作用本发明也提供了方法，包括从三醇酸产生4-乙酰基内酯，如图9A所示例。随后的对此过程的改变，即(i)直接从三醇酸酰化为4-乙酰基内酯和(ii)改进导入二甲基丁酸酯侧链的条件，改进了此过程。来自洛伐他汀水解步骤的粗产物含有三醇酸和变性蛋白质和细胞/培养基组分。将粗产物悬浮在CH2C12(10-15%w/v)中并在DMAP(0.15当量)存在下，用三当量(即3当量)的乙酸酐处理。研究表明，4-乙酰基内酯8位的乙酰化慢，并且可以合理地加以控制。用HPLC监测反应，典型地，在残留<2%二醇内酯时，终止反应；此时产生<2%的二乙酸酯。可能产生一些消除产物，特别是在反应物被搅拌过长时期时。完成反应之后，加入水淬灭反应，通过硅藻土垫过滤，去除不溶物。用CH2Cl2洗涤该垫，用稀酸洗涤合并的滤液(用以去除DMAP)并用饱和NaHC03洗涤用以去除乙酸。在大规模上，发现更方便的是，在酸洗涤之后，将溶剂替换为EtOAc，以有助于用碱进行随后的洗涤。在碱萃取之后，使溶液干燥、过滤和浓縮。随后加入已垸，导致4-乙酰基内酯以白色固体沉淀出来。几个较大试验的产量及产物分布总结于表2中。表2:三醇酸直接乙酰化为4-乙酰基内酯<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>1圆括号中的值包括母液中未回收的产物2圆括号中的值包括回收的第二次收获的产物3也含有0.24%的4-乙酰基洛伐他汀，和0.5%的未知杂质，时间是4分钟时(步骤3:酰化作用本发明也提供了方法，包括从4-乙酰基内酯产生4-乙酰基新伐他汀，如图9B所示例(用，例如，2,2-二甲基丁酸酐)。催化剂的确定报道的引入新伐他汀侧链的条件不适于过程的放大。反应(i)在纯吡啶中进行，(ii)使用多达8当量的2,2二甲基丁酰氯，和(iii)在升高温度下需要几天。在我们的控制下，从这种反应条件分离出的产物以低产量得到，并且质量差(2-乙酸基的消除是主要的问题)。可选择的溶剂/碱不改进反应。用二甲基丁酸酐作为酰化剂，通过转变为Lewis酸催化反应，得到相当大程度的改进。检测三氟甲基磺酸铋(Bismuthtriflate)(Bi(OTf)3(已经报道，(Bi(0Tf)3是使醇新戊酰化(pivaloylation)的有效催化剂)。此反应较吡啶路线更加清洁。然而，(Bi(0Tf)3不能从商业途径得到，并且难于从产物去除铋残渣。可以从商业途径得到的三氟甲基磺酸铜(Cu(OTf)2)也有良好的效果，仅加入10%的催化剂和1.05当量的二甲基丁酸酐，在室温下就得到好的产物量。在此情况下，铜盐的去除是一个问题。此时，我们已经研究了一系列Lewis酸，研究它们催化二醇内酯8位的区域选择性酰化，直接产生新伐他汀的能力。在研究的>20例Lewis酸中，对铋、铜、钪、铟、铝的三氟甲基磺酸盐和TMSOTf以及BF3.0Et2，发现了活性。在相同条件下，Li、Mg、Zn、La、Pr、Sm、Yb的三氟甲基磺酸盐没有活性，三氟甲基磺酸吡啶盐或咪唑镜盐也没有活性，Bi、In或Sr的乙酸盐也没有活性。BF3.0Et2是酰化4-乙酰基内酯的有吸引力的催化齐l」，原因是它可以便宜地得到。三氟化硼的其它各种加合物作为酰化催化剂被测定。B&的THF加合物和二甲胺加合物均不是适合的Lewis催化剂。使用其它可以从商业得到的B&.溶剂化物也观察到了活性，但是，由于它们不优于BF3.OEt2，用醚合物进行进一步优化。条件的优化针对三氟甲基磺酸盐和BF3醚合物催化的4-乙酰基内酯酰化，检测一系列的溶剂和条件，如图1所示例。最佳结果在CH3C12、MeCN、二氯乙烷或其混合物中得到。几个BF3.0Et2催化的酰化结果总结于表3中，如图2所示例。在存在更高比例MeCN时，反应更快，但产量差(比较试验l、3)。用新鲜的BF3.0Et2观察到更好的结果(比较试验1、2、6);BF3.0Et2在MeCN中的以前打开过瓶的BF3.0Et2(试验2)和预先等分的BF3.0Et2贮存液(试验6)的结果较差。最小的催化剂浓度是需要的；4moPX的催化剂得到不完全的反应(试验4)。在所有反应中，可以见到一些少量的杂质。这些中的一些，例如，二乙酸酯或4-乙酰基洛伐他汀存在于起始的4-乙酰基内酯中，或者是原料中杂质的直接结果，例如，由二醇内酯产生的二新伐他汀。通过从含水MeOH中沉淀出粗产物，可以大大降低大多数这些杂质的水平；表4显示了沉淀之前和之后，12g酰化反应产物的杂质情况，如图3所示例。20-100g水平的一系列反应的产率显示在表5中；表明了分离后的产率以及残余物的位置和估计量。表5.4-乙酰基内酯的酰化结果反应4-乙酰时间分离含水部分3残余物4总产率基内酯1小时的固体2克克%克克％%121.0321.00.5L590.18226.1<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>条件4-乙酰基内酯10%w/v;BF3.OEt28mol%;40°C;5-9:1DCM/MeCN在从MeCN/水或单独的MeCN沉淀之后含水洗液中物质针对工作标样用HPLC分析测定浓縮后残留在母液中；由NMR测定，针对内标步骤4:酶促脱乙酰作用本发明也提供了方法，包括将乙酰基新伐他汀转化为新伐他汀，如图9C所示例。在对4-乙酰基新伐他汀进行酶促脱乙酰化中，需要克服两个明显的障石尋(i)原料4-乙酰基新伐他汀和产物新伐他汀在水溶液中的不溶性，(ii)4-乙酰基的敏感性，其在pH〉7时迅速发生消除。4-乙酰基新伐他汀的水解必须在接近pH7时进行，在此时，不可能通过打开内酯环增加溶解度，这和洛伐他汀的水解反应不一样。对于4-乙酰基新伐他汀的水解，使用例如由SEQIDNO:3编码的SEQIDNO:4，10mM底物被迅速水解，SEQIDNO:3是在大肠杆菌中克隆的酯酶基因。随后在200mM的反应提示出在46小时发生91-93%的转化；4-氯乙酰基衍生物显示出等同的转化，而4-甲酰基衍生物在24小时完全反应。尽管4-甲酰基由于其溶解性和反应性是引人注意的底物，但我们没能开发出对它的有效合成。当反应在MTBE双相系统中进行时，全部三种衍生物的结果相似。许多反应参数是用SEQIDNO:4来测定的。在pH8时开始水解，导致形成不可接受水平的消除产物，而用5^二隨烷作共溶剂或表面活性剂(0.P/。TritonX-100或Tween-20)得到不好的结果。尽管反应速度在5(TC时大大增加，但由于反应混合物变得越来越粘稠，所有的反应通常在转化约90%时停止。对于50mM底物时的双相反应，在这些条件下，应用MTBE、二丁醚或甲苯为共溶剂，作用很好，而应用氯化溶剂导致了可忽略不计的活性。如果水解在5(TC时开始，pH为7，存在10%的MeOH，可能在多达300-400mM时进行反应。5-6小时之后，由于反应物变得很粘，向反应物中加入等量的甲苯。在这些条件下，观察到几乎全部转化，消除达到最小。至此阶段，所有的酶促反应是用从新伐他汀制备而来的4-乙酰基新伐他汀进行的。从容易得到的新伐他汀制备此底物，使我们能够在开发其它合成步骤的同时，进行对最终酶促水解的初步研究。不幸的是，最初从洛伐他汀制备出的底物的质量是不同的，这取决于应用的Lewis酸催化剂和纯化的程度。这些物质导致结果显著可变，起始的酶促脱乙酰的良好结果不能重复。4-乙酰基新伐他汀水解为新伐他汀的一组反应的结果总结在表6中。在所有情况下，用10%MeOH和相同批次的酶(SEQIDNO:4-2)进行反应。图20说明了将4-乙酰基新伐他汀水解为新伐他汀，和相应的消除产物以及酸。表6:4-乙酰基新伐他汀的酶促水解试验批次规模mM温度pH时间克°c小时酸新伐他汀4-乙酰基消除%%新伐他汀％12719-9310200507.0792合成的10200507.0431.390.86.61.31.593.91.13.53合成的20200507.07942719-9510200507.0453.892.703.53.095.50.51.05"5100507.0456"5200507.53375^"5200507.0458"5200457.0459"5200407.0221.495.32.70.62.594.81.6U1.596.11.40.91.394.23.60.942.756.70.610"10200507.51811"5200508.01812"5200507.0181.393.24.51.02.993.52.11.50.984.114.20.9*在24小时期间分4份加入的酶表6中的前两次试验将水解从洛伐他汀制备(试验l)和从新伐他汀制备(试验2)的4-乙酰基新伐他汀相比较。在200mM时，与从新伐他汀(试验2)制备出的底物的43小时相比，底物2719-93的质量明显地差，需要79小时达到92%的转化率。另一方面，与合成底物(试验3)的79小时相比，在200mM时，底物2719-95(试验4)在45小时时达到98%转化率。底物2719-93的纯度低，受到残余的2,2-二甲基丁酸的污染并一致地得到不好的结果。尽管在低转化率时，在2,2-二甲基丁酸存在下，没有观察到抑制效应，但在高转化率时，其可能对水解反应速度的明显降低负责。在20g规模时，来自新伐他汀的4-乙酰基新伐他汀结果不佳(比较试验2、3)。尽管此结果可能反映了搅拌大规模反应中的问题，但此物质比底物2719-95(试验4)的反应慢得多。尽管消除产物由于可能作为Michael受体可能作为不可逆抑制物起作用，但当反应在消除产物存在下进行时，在低浓度时没有观察到抑制效应。用底物2719-95得到的结果得到了一致结果。反应在100和200mM时(试验5、6)得到相似结果，这可能反映出了原料在反应混合物中恒定的低溶解度。在pH为7时，在50。C观察到了比40-45。C高的转化率(试验7-9)。试验10-12表明，反应在某些程度上是pH依赖性的，在pH7.5-8.0时观察到比pH7时(85%)高的转化率(94-96%)。这再次反映了底物在更碱性条件下的溶解度较高。然而，在较高pH下，转化率的提高伴随着新伐他汀酸水平的轻度增加。尽管更高的pH值增加反应速度，但在到达pH8时，它不显著增加消除的量。事实上，所有的反应显示出了<2%百分面积的消除产物，试验2和3除外；试验2、3的起始4-乙酰基新伐他汀已被约3.5%的消除产物所污染。对酶反应的进一步研究集中于试图通过改变反应温度及pH值来縮短反应时间。表7中的数据表明，可以通过在更高的温度下操作，可縮短反应时间，但是数据可能用于搅拌不同规模反应的效果而复杂化(比较试验13-16)。然而，增加温度和/或酸使产生的新伐他汀酸量增加，但通常地不使消除产物显著增加(最高量见于6(TC和pH8(试验20))。在本实验室规模操作的情况下，新伐他汀酸损失在含水蒸汽中。然而，包括酸性操作的操作条件可能重新内酯化为新伐他汀，同时捕获这些物质中的一些物质。表7:4-乙酰基新伐他汀的水解温度和pH的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在表7中，所有的反应在200mM下进行*-批次-方法加入酶**-重复进行最新的在100g规模上的试验(试验21)是在6(TC和pH7.5时进行，结合磁力搅拌和顶部搅拌，以有效地混合反应瓶中的内容物。在这些条件下，在24小时之后，观察到原料的转化率为约98%。酶催化水解反应对试验室规模(lab-benchscale)形成了挑战。反应混合物的过滤非常慢，这推测是由于沉淀的蛋白质形成的过滤器中的污垢造成的。替代地，离心是将沉淀的新伐他汀从大量上清水溶液中分离出来的方便方法；大多数新伐他汀酸在此阶段丢失。随后用CH2Cl2消化湿的离心出的沉淀两次，每次将上清液轻轻倒出。含有新伐他汀产物块的合并的有机上清液被干燥、过滤，溶剂替换为甲苯。向此甲苯溶液中加入己烷并冷却，造成新伐他汀沉淀。甚至在CH2C12消化之后，离心的沉淀仍含有显著量的产物;推测CH2C12不能有效地进入湿的离心沉淀和萃取出夹带的产物。在一个示范性修改中(试验4，表8)，用丙酮和硅藻土处理离心沉淀，随后过滤。随后可以用CH2Cl2容易地萃取出硅藻土垫。随后干燥合并的含水丙酮和CH2Cl2洗液，并将溶剂替换为甲苯。加入已垸使新伐他汀迅速沉淀，随后过滤和干燥新伐他汀。冷却母液至-20。C导致第二次分离产物；表8中的产量数据(图4)是合并的第一次和第二次产物。本发明提供了从洛伐他汀生成新伐他汀的新的实施路线。在本发明的可选方面，该路线的突出特征包括i.应用新的洛伐他汀酯酶，它可以在35'C和pH9.5时，在底物加入量是0.5M，在约48小时时，以99%的转化率去除2-甲基丁酸酯侧链。存在着通过增加反应温度来显著提高反应速度的可能性。示范了将粗三醇酸转化为4-乙酰基内酯的单釜内酯化/乙酰化反应。常规得到从洛伐他汀的80%总产率，另有8-10%的潜在产物残留在母液中。ii.发现了引入新伐他汀侧链的新的和温和的条件，其采用与二甲基丁酸酐的BF3.0Et2催化酰化。反应始终地在约100g规模，在10%的底物加载量下进行，提供了产率约80%的4-乙酰基新伐他汀。另有8-10%的潜在产物残留在反应残留物中。iii.最终的步骤采用如第一步骤中应用的相同的洛伐他汀酯酶，以去除敏感的乙酰基，产生新伐他汀。此反应在20-100g规模上，在9%w/v底物加载量下进行，在24-48小时显示出98%的产率。实施例6:本发明的示范性过程下列实施例描述了本发明的示范性方案，包括从洛伐他汀合成新伐他汀的方案。本发明提供了从洛伐他汀制备洛伐他汀酸，和从洛伐他汀酸制备三醇酸的方法，如图16A或"步骤1"所示例。在此方面，方案实现了甲基丁酸酯侧链的完全(>99%)去除。这是重要的，这是因为在分离洛伐他汀和新伐他汀中存在的困难，和新伐他汀API中可允许的低洛伐他汀水平(为了完全(>99%)反应，水解洛伐他汀的一些过程需要应用高温和长反应时间)。用水解酶(例如，如此处所述)使洛伐他汀在温和条件下水解，导致内酯环水解和8位上侧链的完全去除。可以用于甲基丁酸酯侧链的此酶促水解的示范性水解酶是酯酶SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3编码)、SEQIDNO:6(由例如SEQIDNO:5编码)禾口SEQIDNO:2(由例如SEQIDNO:1编码)。SEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3编码)。每一酯酶序列被亚克隆并在不同的宿主中表达，并以不同规模发酵，包括200升(L)规模。洛伐他汀在酶促活性所需的含水条件下显示出差的溶解度。可选地，在一个方面，将洛伐他汀在水中的悬浮液的pH值升高到pH>12，实现内酯环快速水解，导致原位产生更加可溶的洛伐他汀酸盐。实际上，用1摩尔当量的NaOH水溶液处理洛伐他汀在水/MeOH中的悬浮液，并搅拌直至完成溶解。然后将反应混合物的pH值再次调节至适于酶促反应的范围并加入酶。在可选的方面，酶促水解条件可以被施用于直接从发酵肉汤提取出的洛伐他汀和/或洛伐他汀酸的混合物，或者可以将酶加入发酵肉汤并直接分离三醇酸。水解之后，谨慎地酸化反应混合物，通过萃取和/或过滤分离三醇酸。一方面，直接在下一步中应用三醇酸，或者在合适的结晶/沉淀步骤之后以固体形式分离出三醇酸。本发明提供了从三醇酸制备二醇内酯的方法，如图16B或"步骤2"所示例。一方面，通过在合适的溶剂中加热，三醇酸被重新内酯化，通过用传统方法去除水，使平衡移向内酯形式。可选地，一方面，通过在合适的酸存在下搅拌，三醇酸被重新内酯化。这也将导致内酯环闭合。二醇内酯可以在此阶段被纯化，通过从合适的溶剂(几种溶剂)中结晶/沉淀来实施。本发明提供了从二醇内酯制备酰化内酯的方法，如图16C或"步骤3"所示例。一方面，用具有所需活性和选择性的酶，酶促地进行对4'位羟基的区域选择性酰化。酰基的性质可以变化，用以赋予合适的特性，例如，变为乙酸酯以便容易去除，变为苯甲酸酯以增强结晶度，变为甲酸酯以增强水溶解性。。在可选的方面，如图16D所示例(步骤2和3，上述，合并)，在本发明方案的"简化变化"(telescopedvariation)中，内酯化和4位内酯的酰化在单釜中进行。在碱(例如，DMAP)存在下用2当量酸酐处理时，三醇酸首先经历内酯化，随后在内酯的4-OH进行选择性酰化，产生4-酰基内酯。随后通过从合适的溶剂(几种溶剂)中结晶/沉淀，分离并纯化产物。本发明提供了从酰基内酯制备酰基新伐他汀的方法，通过例如，化学或酶促酰化来进行，如图16E或"步骤4"所示。二甲基丁酸衍生物和合适酰化催化剂的组合可以被用来引入所需的侧链，例如，新伐他汀侧链。虽然已经描述了二甲基丁酰氯/二甲基氨基吡啶的组合，但反应时间过长，条件苛刻，并产生了不可接受水平的副产物。与之对比，本发明的二甲基丁酸酐/路易斯酸(例如，三氟甲基磺酸铋Bi(triflate)3、三氟甲基磺酸铜Cu(triflate)2)的组合BF3.Et20致使在室温下快速反应。对合适的路易斯酸和反应条件(温度，溶剂等)的筛选可以确定此酰化反应的最适条件。—方面，酶催化的酰基内酯的酰化被用来在十分温和的条件下(室温-40'C，有机溶剂)，在8位导入二甲基丁酸酯基团，而不产生副产物。本发明提供了从酰基新伐他汀制备新伐他汀铵盐和从新伐他汀铵盐制备新伐他汀的方法，如图16F或"步骤5"所示。最终的步骤需要选择性去除4'位的酰基。4'位的酰基对于碱催化的消除反应高度敏感，这甚至是在仅轻度的碱性条件下。因此，酶促水解是区域选择性去除此酰基的最方便的方法。证实了在步骤l(如上)中水解洛伐他汀的酯酶(SEQIDNO:4，例如由SEQIDNO:3编码)也可以有效地催化内酯4'位酰基的选择性水解。在pH7处进行时，酶促水解产生新伐他汀，其内酯环基本上完整。可以用本领域己知的任何分析来筛选、表征等等。例如，酶筛选可以应用任何标准的HPLC和TLC分析，这些中的许多对本领域的技术人员是己知的。下面描述了实施本发明方法的另一示例性方案和可选的条件。洛伐他汀向三醇酸的酶促水解(步骤1)在7-10%的MeOH/缓冲液中的0.1-0.5M浓度的洛伐他汀或洛伐他汀酸中，评价SEQIDNO:4(例如由SEQIDNO:3编码)，其中通过自动加入碱，将反应维持在pH9-9.5。在500ml规模上，0.5M洛伐他汀时，用含有14mg/ml总蛋白的酶SEQIDNO:4(由SEQIDNO:3编码)的冻干制备物(来自裂解细胞的离心上清液)得到了最佳结果；在48小时后观察到底物完全转化。三醇酸向二醇内酯的内酯化(步骤2)使反应混合物酸化(pH2)，通过离心收集沉淀物并干燥。用iPrOAc萃取滤液，将有机萃取物加入干燥的滤饼。在Dean-Stark设备中，加热得到的悬浮液至回流，直至完全内酯化。使得到的溶液过滤通过硅藻土垫，用饱和(satd.)NaHC03洗涤滤液。浓縮得到的iPrOAc溶液，直至(x0.5)，用已垸稀释并冷却至0'C。过滤沉淀出的固体，并将其在空气中干燥，产生二醇内酯(63g，79.5%分离产率；其它10.3g的产物被鉴定在各种洗液和母液中)。产物含有<1%的洛伐他汀。二醇内酯的酶促酰化(步骤3)室温下(RT)振荡二醇内酯(25mM)、乙酸乙烯酯(250mM)和南极洲假丝酵母脂肪酶(33mg)在TBME(1mL)中的混合物。44小时(h)之后，HPLC表明，产生了单乙酸酯，转化率是60%。制备乙酰基新伐他汀(步骤4)在室温下真空过夜干燥4-乙酰基内酯，在氮下储存，然后在氮下室温溶解于无水二氯甲烷中(lg/2.5-3ml的比值)。同时，在最小量的乙腈中室温溶解Cu(OTf)2(5md%)，随后向溶液中加入1.05-1.2当量的二甲基丁酸酐，室温下搅拌30分钟至1小时。在氮气氛下，在室温下，将此Cu(OTf)2/酸酐溶液通过注射器转移到4-乙酰基内酯溶液中，同时搅拌。当完成时(HPLC监测)，通过加入水淬灭反应，用饱和NaHC03洗涤。分离的有机层经Na2S04干燥，过滤并蒸发，得到粗产物4-乙酰基新伐他汀(>99%)。乙酰基新伐他汀的酶促水解(步骤5)酶促水解乙酰基新伐他汀的此示范性方案应用3.22g乙酰基新伐他汀(终浓度350m)M;2mlMeOH;lOO)il4MTris;9.9ml7K;8mlSEQIDNO:4(由例如SEQIDNO:3编码)(水中的125mg/ml冻干裂解物)。反应在带有顶部搅拌和磁力搅棒的25ml容器中进行。pH稳态条件是由DasGipSTIRRER-PRO⑧系统维持的；通过加入10%NH4OH使pH值维持在7。转化率接近75%时，加入4ml的甲苯使物质溶解。使反应过夜进行，此时加入另外的溶剂(甲苯或二氯甲垸)以确保所有的不溶性物质被溶解。用HPLC分析样品，如图7所示例。反应的最终组分是新伐他汀酸4.7%，新伐他汀90.9%，乙酰基新伐他汀0.9%，推断的新伐他汀消除产物是3.5%。最终的转化率是95.6%。实施例7:本发明的示范性实施方案下面的实施例描述了本发明的示范性方案，包括从洛伐他汀合成新伐他汀的方案，例如，图5中列出的增加总产率的方案，即异二酰基化合成新伐他汀的途径。本实施例描述的方案将洛伐他汀转化为新伐他汀的总转化率提高到至少为60%，并确定何种情况下发生产率的损失，何种情况下实现了工艺的改进。步骤l:洛伐他汀水解图15A示例了本发明的示范性反应，用酯酶将洛伐他汀水解为三醇酸。一方面，此步骤涉及最初的内酯环的化学开环(用1当量NaOH)，产生水溶性洛伐他汀酸。调节pH和体积之后，酶的浆液被加入反应，随后将反应维持在pH9.5以及4(TC，直至洛伐他汀酸的转化率为99.5%。可选的示范性条件应用10%w/v的底物加载量(0.25M)和10%w/v的粗酶/底物加载量。从前，在实验室的M00g规模上，最方便的操作是稀释和酸化酶反应混合物。通过过滤收集不溶性物质，在真空炉中在3(TC至4(TC干燥此潮湿的滤饼。分析粗产物(在内标存在下用)HNMR)表明，其含有约78%的三醇酸，推测其余物质是变性蛋白质、细胞和培养基组分。进行研究以回答在此起始步骤中是否发生了不可接受的产量损失问题。据推测，相对高的酶加载量导致(i)产物不可逆地吸收到沉淀蛋白质中，(ii)由于副反应造成产量损失，特别是在沉淀的酶被携带至步骤2，即内酯化/乙酰化步骤时(iii)粗的酶制备物，其含有能够在此阶段或随后的阶段中与产物反应的其它组分。进行尝试以改进此情况，通过(i)降低酶加载量(ii)通过使用前的简单预处理，增加酶制备物的纯度(iii)通过超滤方法，从失效的酶中分离出三醇酸产物。降低酶加载量起始的步骤1是在20%w/v底物(0.5M)，20%w/w酶/温度加载量下进行的。在此条件下，反应通常在4(TC，24-36小时内完成。随后稀释反应物，然后酸化和沉淀产物；在0.5M时的酸化总是形成难于搅拌的稠浆液。例如，用SEQIDNO:4酯酶对洛伐他汀酶促水解进行的初步研究，是在0.35至0.5M，以15%至20%加载量进行的，如图23所示例。这些研究显示了，可以获得高的底物加载量；然而，转化的速度需要优化。由于反应物在操作期间已需要稀释，降低底物浓度至0.25M(10%w/v)和降低粗提酶进料为10%，将不影响此过程的容积效率。在这些条件下，酶促水解在24-36小时间，提供了洛伐他汀酸向三醇酸的99.5%的转化。酶预处理当所需酶和其它污染蛋白质之间存在热稳定差异时，通常用热处理作为纯化酶粗提制备物的方便方法。由于洛伐他汀酯酶显示出良好的热稳定性(步骤1和4在40-5(TC进行)，可使其在6(TC经历30分钟，随后离心，将上清液用于水解。热预处理酶和未处理酶的活性没有差异。超滤超滤被认为是从失效酶和其它高分子量杂质中分离出三醇酸产物的方法，所述杂质可能通过吸收或副反应降低此步骤或随后步骤中的产量。洛伐他汀水解完成之后，使含有可溶三醇酸的反应混合物通过中空的纤维膜装置(SpectrumLabsMINIPROS中空纤维模块，带有聚砜微孔膜；10K截流；1050cm2表面积)。收集流出物，用水稀释剩余的残渣并使之通过该装置。随后酸化合并的洗脱液，收集沉淀出的三醇酸。这和4-乙酰基新伐他汀水解步骤不同，有一个例外，在保留的残渣中没有观察到明显的产物滞留。下表显示了几个试验的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>1相对于工作;际样，粗三醇酸的HPLC分析2基于HPLC纯化，分离出的三醇酸的产率3总产率，包括分离物和洗液、滤液、残渣中的产物(三醇酸和二醇内酯;i4酸化反应混合物和过滤沉淀的三醇酸及失效的酶5反应混合物在沉淀前通过中空纤维束。步骤2:乙酰化作用图8和图9说明了方案2，本发明的示范性内酯化/乙酰化反应，及其产物。来自洛伐他汀水解步骤的粗产物包括三醇酸和变性的蛋白质和细胞/培养基组分。以前，在DMAP(0.15当量)存在的情况下，在一步/一釜工艺中，将此粗提物悬浮在CH2C12(10-15%w/v)中并用乙酸酐(3当量)处理。用HPLC监测反应，典型地在残留<2%的二醇内酯时终止反应，此时产生了<2%的二乙酸酯。产生了一些消除产物，特别是在搅拌反应物过长时间的情况下。完全反应之后，添加水淬灭反应，过滤通过硅藻土垫，去除不溶性物质。用CH2C12洗涤此垫，用稀酸洗涤合并的滤液(去除DMAP)并用饱和NaHC03洗涤以去除乙酸。碱萃取之后，使溶液干燥、过滤和浓縮。随后加入已垸，导致4-乙酰基内酯以白色固体沉淀出来。以前认为，在这些条件下，发生起始的唯一的内酯化，随后在4位羟基上乙酰化；仅在长反应时间时，二乙酰化和消除反应才变得明显。—些数据表明，可测定量的乙酰化首先在开链形式的3和/或5羟基处发生，内酯化之后发生的4羟基处的乙酰化产生所需产物，但是5羟基处的乙酰化最终产生二乙酰酸(diacetylacid)形式(参见图8示例的流程)。此杂质在以前被误认为消除产物，因为它们均有相同的HPLC保留时间。图14的表中的数据对以二醇内酯(其不能形成二乙酰酸副产物)或三醇酸作为原料的一步内酯化/乙酰化条件进行比较。总之，三醇酸得到的4-乙酰基内酯的产率较低，原因是5-8%的物质转变成二乙酰酸副产物。避免此杂质的一个策略是，进行酸催化的内酯化，以唯一地产生二醇内酯，随后乙酰化。此顺序可以在同一单釜中进行，无需分离二醇内酯(单釜/两步工艺)。对这两种方法的直接比较在50g规模上进行，如下面的表所总结。这两种方法是相当的，两步乙酰化方法有利，其总产率高出3-4%。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>酸沉淀三醇酸和酶反应混合物在酸沉淀前通过中空纤维束过滤仅乙酸酐酸催化的内酯化，随后乙酰化5包括分离的物质和母液中的物质。由于表中的数据表明，乙酰化步骤显示了良好的质量平衡，大多数产率损失发生在步骤l，即洛伐他汀水解和分离中。步骤3:酰化作用化学酰化内酯8位的示范性方案示例在图10中。以前的条件应用2,2-二甲基丁酸酐作为酰化剂，用于导入新伐他汀侧链。酸酐是不能从商业途径得到的，应用其制备物中多当量的酰基氯对全过程造成了非常高的化学成本。试验中使用可从商业途径得到的二甲基丁酰氯(2当量)，存在LiBr作为酰化催化剂，用吡啶(2当量)捕获释放的酸。操作之后，蒸发反应溶液至干燥，用iPrOH滴度得到的固体，过滤浆液，产生质量可接受的4-乙酰基新伐他汀(总产率86-89%;纯度95%)。步骤4:酶促脱乙酰化图11说明了本发明的示范性反应，4-乙酰基新伐他汀的酶促脱乙酰化。在对4-乙酰基新伐他汀进行酶促脱乙酰化中，需要克服两个明显的障碍一原料4-乙酰基新伐他汀和产物新伐他汀在水溶液中的不溶性，一4-乙酰基的敏感性，其在pH〉7时迅速发生消除反应。4-乙酰基新伐他汀的水解必须在接近pH7时进行，在此时，不可能通过打开内酯环增加溶解度，这和洛伐他汀的水解反应不一样。为了改进此步骤，开发出了与洛伐他汀水解相同的策略(i)降低酶加载量(ii)通过使用前的简单预处理，增加酶制备物的纯度(iii)通过超滤方法，从失效的酶中分离出产物(iv)用表面活性剂增加底物的溶解度(0再次用10%w/v(0.25M)的底物浓度，并将粗提酶加载量降低至10%w/w，得到的反应在48小时的转化率仍>95%。(ii)可选的示范性水解反应是用热预处理酶的上清液组分进行的。(iii)用超滤纯化产物使操作复杂化。新伐他汀在水中是不溶的(0.03mg/ml)。然而，当转化完全时，通过加入1当量的NaOH使反应混合物的pH值增加，导致内酯环打开和产物溶解。随后，使反应混合物通过中空纤维膜装置过滤，分离失效的酶。和洛伐他汀水解不同的是，超滤含有新伐他汀酸和失效酶的反应溶液产生显著量的产物，其保留在膜装置中。酸化洗脱液，新伐他汀酸没有沉淀并被萃取，并以其铵盐的形式被沉淀。此顺序的总回收情况差。(iv)检测五种表面活性剂(Ti'itonX-IOO、Tween80、Tween20、AOT禾口CTAB)通过增加底物溶解度而增强水解反应的能力。0.05%w/v的TritonX-100在小规模上(lg)不增加反应速度。然而，当反应规模增加时，该效应变得较不明显。最终的反应条件应用5%MeOH作为"湿润"剂(wettingagent);否则不溶性原料倾向于"爬"上(creepup)瓶壁。认为完成时(转化率>95%),过滤反应混合物并在真空下干燥滤饼。将干燥滤饼在CH2Cl2中悬浮，得到含有凝胶样物质的棕/灰色的粘稠溶液。将其通过硅藻土垫过滤，用甲苯洗涤硅藻土垫。从滤液中去除CH2Ch和己烷的加入以88-89%的总产率沉淀出新伐他汀(相对于标样的纯度是97.5%)。其它批次的粗提新伐他汀也都是从甲苯/已烷中以单一的纯化方法结晶出来的。步骤l-4:总产率总产率下面的表("全过程的产率总结")展示了两个50g规模试验的全过程的结果。全过程的产率总结<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>总产率百分数是分离的产率加上母液/洗液等中的产率基于50g洛伐他汀进料的新伐他汀产率百分数三醇酸和酶的酸沉淀反应物在三醇酸分离前通过中空纤维膜过滤同时内酯化/乙酰化或内酯化，之后乙酰化新伐他汀的总产率是51-58%，还有5-8%的物质保留在母液中(甲苯/已烷)。此物质经过元素分析，经HPLC分析，相对于商业级新伐他汀标准品的纯度是97.4-97.5%。杂质矛既况(lmpurityprofile)图12示例了用本发明的本示范性方案产生的两批新伐他汀的HPLC曲线。两个样品均显示出98%百分面积的新伐他汀。从甲苯/已烷中重结晶使大多数杂质的水平比粗产物降低至少50%，例如，未反应的4-乙酰基新伐他汀从1.7-1.8%减少到0.3-0.5%，消除产物甚至进一步从1-2%降低到0.2%。二醇内酯和4-乙酰基内酯的水平从0.5%降低到0.1-0.2%。图13是对HPLC分析的说明，显示出从50g规模反应分离出的新伐他汀样品的杂质概况。总结新伐他汀是应用本发明的示范性4步化学酶方法，从洛伐他汀制备出来的。在两个50g规模的示范性反应中，新伐他汀以51%和58%的总产率被分离出来。每一步中分离物质的产率是步骤l-2，82-85%;步骤3，83-89%和步骤4，74-82%。在步骤3和4中，还有6-14%的产物残留在母液中。酶加载量降低至10%粗酶/底物，热预处理和应用离心的上清液降低了加载入体系的残渣的量。超滤反应混合物对从失效酶分离出产物没有明显的益处。完成工艺所需的试剂:步骤1:洛伐他汀(kg);洛伐他汀酯酶；Tris缓冲液(L);MeOH(L);EtOAc(L);巳垸(L)。步骤2:二醇内酯(kg);乙酸酐(kg)，二甲氨基吡啶(kg);二氯甲烷(L);EtOAc(L);已烷(L);4-乙酰基内酯。步骤3:4-乙酰基内酯(kg);二甲基丁酰氯(kg);二氯甲垸(L);EtOAc(L);MeOH(L);已烷(L);4-乙酰基新伐他汀。步骤4:4-乙酰基新伐他汀化g);洛伐他汀酯酶；Tris缓冲液(L);EtOAc(L);已烷(L);甲苯(L);新伐他汀。实施例8:洛伐他汀的酶促水解下列实施例提供了本发明的示范性方案，其包括洛伐他汀的水解。步骤l:酶促水解进行50g和2xl50g规模的洛伐他汀水解。反应在0.5M底物，pH9.5,4CTC下进行，通过加入10%的NH4OH维持pH值不变。所有三个反应的过程相似，在约24小时，达到>99%的转化率(通过归一化HPLC峰面积)。使反应混合物酸化为pH约2.5。根据反应的规模、搅拌的效率/力和稀释的程度，反应混合物在此操作中可以"凝固"，需要进一步稀释。"沉淀的产物容易地被过滤，在真空炉中将潮湿的滤饼在约4(TC干燥。静止时，更多的三醇酸和二醇内酯从酸性含水滤液中沉淀(1-4%)。讨论尽管反应是在0.5M(20w/v)底物下进行的，但反应混合物必须用达到相等体积的水来稀释，以防止反应混合物在操作期间凝固。容积效率可以通过一开始就使反应在0.25M进行而得到改进。50g反应显示出，在含水滤液中有异常高含量的三醇酸(估计是12%)，这导致下一步中的总产率较低。步骤2:内酯化/乙酰化3个反应是用来自50和150g反应物的干燥滤饼(三醇酸/沉淀蛋白质)进行的。反应在标准条件下如所预期地进行(4当量Ac20，15%DMAP)。产物从EtOAc/已垸沉淀出来的4-乙酰基内酯在两步中以66-78%的产率(第一次收获)分离出来；约7%残留在母液中步骤3:酰化在通常条件下进行26g和98g规模的反应较小的反应在2次收获中4-乙酰基新伐他汀的产率是79.8%。产物是从MeOH(2X)中分离出来的(通过加入水从MeOH中沉淀出产物的尝试是不成功的)。98g的反应在操作之后被分为2份工艺流(processstream)。一份(约25%物质)直接转向最终的酶促水解步骤。剩余的物质从MeOH(2X)中沉淀，在两次收获中得到74%的产率；另有12%的产物残留在母液中。步骤4:酶促水解27g规模的反应(10Xw/v底物)是在pH7.5和55'C进行的(外部温度)。在20小时后观察到4-乙酰基新伐他汀的转化率是98%。对粗分离物的分析表明，新伐他汀的产率是91%。从甲苯/已烷中分离并沉淀物质，在两次收获中得到88%产率的新伐他汀。这代表了从洛伐他汀的总产率是46%。杂质情况和HPLC分析的结果显示在下面的表中。在一种情况下，将粗乙酰基新伐他汀向前带入最终的酶促步骤，而不纯化。MeOH中的工艺流经真空蒸馏而浓縮，以用水稀释时提供正确的浓度。然而，底物从反应混合物中以不溶的聚结蜡样球沉淀出来，。向混合物中加入甲苯以溶解底物。酶的加入使反应非常慢。92小时后，主要产物是新伐他汀酸，带有约20%的消除产物。最终69g规模反应在pH7.5/50。C时是慢的，需要4天达到充分的转化，在此期间，产生约10%的新伐他汀酸。产物被分离，产率是60%。讨论从干燥滤饼分离新伐他汀；提取效率不同。一些试验显示出较长的反应时间，但是这可以反映出底物的质量。图21中示例的表显示了所选新伐他汀样品的杂质概况、HPLC分析和元素分析。粗洛伐他汀的水解粗洛伐他汀(91。/。)的水解是在4x10g规模上，用两份酶(SEQIDNO:4，由例如SEQIDNO:3编码)在pH9.5/4(TC进行的。和此酶的反应在此时间段内得到99.5°/。的转化率(一份在27小时后的转化率是96%，另一份20%加载量的酶在18.75小时的转化率是99.4%)。合并3个反应，如此处所述进行反应。分析表明，三醇酸作为粗滤饼的的产率是89.4%，估计有5%损失在含水滤液中。在此处所述的条件下内酯化/乙酰化三醇酸。实施例9:洛伐他汀的酶促水解下面的实施例提供了本发明的示范性方案，其包括洛伐他汀的水解。步骤l:洛伐他汀的酶促水解A:从三醇酸分离失效的酶热处理酶促水解完成后，将4x10g反应物加热至80-85°C1小时。没有明显的变性蛋白质沉淀；反应物保持为混浊的墨绿/黑色。冷却至室温对反应混合物的颜色或粘度没有造成明显的变化。pH控制用CELITE⑧硅藻土(3g)处理时，10g酶粉末在pH10.5的10%MeOH/水中的溶液不能容易地过滤。调节为pH6造成大块沉淀，其不能容易地过滤，甚至在用相同重量CELITE硅藻土延长搅拌后，也不能容易地过滤。调节至pH6和离心之后，上清液仍含有物质，所述物质在进一步降低pH之后沉淀。三醇酸在约0.2M时，在pH9.5-3.5范围内是可溶的。微量过滤离心去除少量的不溶物之后，使4x10g合并的酶促水解物过滤通过SpectrumLabs聚砜中空纤维束(10KMW截流；1050cm2)。这是在三醇酸沉淀前从反应混合物中去除高MW物质的方便方法。溶液以合理的速度(约3-4小时过滤约1L溶液)过滤。微量过滤后，降低流出液的pH值不产生沉淀，直至约pH4时。将沉淀的三醇酸容易地过滤并在真空下干燥。B.酶批次的性能(PerformanceofEnzymeBatches)应用4份洛伐他汀酯酶。在0.5M/20。/。酶加载量和0.25M/10n/。酶加载量时对4份酶的比较显示，所有份的酶的性能相当，在23小时的转化率是99%，在23-40.5小时的转化率是>99.5%。两种酶使用试验(4xl0g和5X10g)经历微量过滤操作。在两种情况下，分离的三醇酸针对三醇酸工作标样的纯度仅是82.7和83.8%。当分析残渣时，仅有83-86%的物质。步骤2:内酯化/乙酰化本发明提供了方法，其包括将三醇酸转化为相应的二醇内酯、3-二乙酰基三醇酸和5-二乙酰基三醇酸，以及随后转化为3,5-二乙酰基三醇酸、4-乙酰基内酯和消除产物，如图22所示。一定量的三醇酸和二醇内酯是通过化学水解(KOH/MeOH)和共沸内酯化(iPrOAc)制备的。与工作标准品相比，三醇酸的纯度是99.4%，而二醇内酯的纯度是94.5%。两种化合物均经过标准条件(AC20，15%DMAP;在CH2Cl2中10。/。w/v)下的内酯化和/或乙酰化。反应通过HPLC监测，并通过用水淬灭以及用酸和NaHC03洗涤而终止；将CH2Cl2稀释为已知体积并针对4-乙酰基内酯工作标准品而分析；所有含水洗液和残渣也被分析。三醇的两次内酯化/乙酰化反应得到分析液的产率是78.9%和87.4%;产物中的杂质包括(HPLC面积百分数)0.4%二醇内酯，5.6%消除产物，1.5%4，8-二乙酰基内酯，0.5%未知。二醇内酯的两次乙酰化反应得到分析液的产率是88.5%和94.7%;产物的杂质分布比三醇酸反应少。以前在更稀释条件下0'C时在CH2C12中的反应显示出，HPLC上有两个新的峰，其保留时间长于二醇内酯。这些峰随反应的进行而降低。随着乙酰化的进行，在乙酰基内酯峰之前相邻的一个峰增大。以前将此指定为消除的内酯产物。LC-MS数据表明，此峰实际上是消除产物和3,5-二乙酰基三醇酸的组合。参见图22，其说明了这些反应和它们的相应产物(三醇酸转化为相应的二醇内酯、3-二乙酰基三醇酸和5-二乙酰基三醇酸，和随后转化为3，5-二乙酰基三醇酸、4-乙酰基内酯和消除产物)。与三醇酸内酯化/乙酰化相比，预形成的二醇内酯的乙酰化得到更高的产率和更无杂质的产物。步骤3:酰化作用保留的4-乙酰基新伐他汀样品由HPLC(238和210nmUV检测和ELSD)和LC-MS进行分析。在210nm或ELSD光谱上没有观察到大的新的峰。化合物离子化的缺乏妨碍了对微量杂质进行的LC-MS分析。步骤4:酶促水解用于去除4-乙酰基的本发明可选方法酶催化的醇解MeOH存在情况下(32当量)，与甲苯中的5种酶不反应；向这些反应物加入水(0.6%v/v)不造成任何水解。在湿的可混溶水的溶剂(9种溶剂)中酶促水解；用一份酶(SEQIDNO:4，由例如SEQIDNO:3编码)在43小时后没有产物信号，带有不同程度的消除。酶催化氨解7种酶，使用甲苯或MTBE中的nBuNH2;背景消除后主要为产物。H202/NaHC03:在过量固体NaHC03存在下，增加50%H202在MeOH、THF或丙酮中的量；没有乙酸酯去除的信号。酸催化的甲醇分解；0.1M乙酰基新伐他汀在30%HCI/MeOH中过夜产生新伐他汀和新伐他汀甲酯的混合物。实施例10:洛伐他汀酶促水解的部分析因设计为了优化反应，对洛伐他汀的酶促水解进行部分析因设计。部分析因设计是用DESIGNEXPERTTM软件对0.35M洛伐他汀酸、Na盐进行的，结果显示在图24中。对图24的备注是1.酶活性是对甲基伞形酮丁酸盐测定的，并表示为0.1吗总蛋白得到的斜率。2.达3小时时三醇酸产生的速度。3.45.5小时产生的三醇酸(％)。四个因素影响洛伐他汀酸水解产生的三醇酸％、酶浓度、缓冲液浓度和MeOH的量，如图25所示例，其中所有反应用含有SEQIDNO:4的大肠杆菌的澄清裂解物进行，并且反应是在pH稳态状态下，在DasGipFEDBATCH-PRO系统中进行的。响应曲面分析(ResponseSurfaceAnalysis(RSA))是用DESIGNEXPERT⑧软件，用对水解0.35M洛伐他汀的中心复合设计(centralcompositedesign)进行的，结果在图26中说明。对图26的备注是1.酶活性是对甲基伞形酮丁酸盐测定的，并表示为O.l叱总蛋白得到的斜率(RFU/s)。2.达3小时时三醇酸产生的速度。3.45.5小时产生的三醇酸(％)。对用SEQIDNO:4的洛伐他汀原位水解进行优化，这样产生了不显著量的NaCl:加入MeOH中的0.85g洛伐他汀和等摩尔的NaOH。向洛伐他汀酸中加入含有SEQIDNO:4的大肠杆菌的澄清裂解物。显著的因素是甲醇浓度([MeOH])，酶浓度([Enzyme])是非常显著的，以及缓冲液浓度([Buffer])在低[Enzyme]时有轻微的影响。参见图27，其说明了对结果的总结。可以用响应曲面分析(ResponseSurfaceAnalysis(RSA))的结果大规模地水解洛伐他汀，例如，用图28所示例的方案。反应在100g规模上成功进行(0.5M);在27小时的转化率是97.5%;生产率Xg/g酯酶/h;特异活性0.084pmol/mg酯酶/min。研究SEQIDNO:4的底物特异性新伐他汀的许多4-酰基衍生物被SEQIDNO:4活性水解，如图29所示例。乙酰基新伐他汀的化学水解导致内酯环脱水。实施例ll:示范性水解方案本实施例描述了本发明的示范性方案，包括制备新伐他汀及中间产物的工业放大工艺，例如在图5和6所示例。用SEQIDNO:4(参见例如图5步骤l)将洛伐他汀水解为三醇酸的酶促水解方案被完成，图30示例了此示范性洛伐他汀水解方案的结果。SEQIDNO:4的酶来源是来自小型发酵罐的裂解物。本方案对于来自10L发酵物的亲液物质(lyophilate)在12g规模上(0.5M)，39小时的转化率是99%(24小时是90%)。总结用于本研究的参数催化剂加载量转化率时间56%w/w100%大约4小时33%w/w97%大约24小时22%w/w97%大约24小时在22%w/w亲液物质加载量时，用10L发酵物水解lkg洛伐他汀。大规模酶促水解洛伐他汀为洛伐他汀酸为三醇酸，是在DasGipFEDBATCHPRO生物反应器中进行的，pH—直是9，底物浓度是500mM，7%MeOH，40°C，如图31所示例。放大的酶促水解洛伐他汀为二醇内酯的示范性方案在图32的示意图中描述，其可以是示例性的工业规模过程。此反应和对反应参数的总结(反应规模，操作，理论产量，产物克数，产率％)，在图33中被说明。(a)50克(g)反应的数据总结于图34A(内酯化和浓縮之后)和34B(粗产物)中，(b)100g反应的数据总结于图35A(三醇酸)和35B(内酯化之后)中。利用图6步骤5的反应，甲基(Me)4-乙酰基新伐他汀被酶促水解为新伐他汀。此反应的结果和从此反应得到的结论是在pH〉7是容易消除(在pH8是13%)。酶促水解容易地发生，但是被溶解度所限。甲酸酯>乙酸酯氯代乙酸酯>甲氧基乙酸酯。100mM(5%w/v)水解过夜，pH值是7。200mM在10%MeOH中在20小时的转化率是84%，温度是50°C。200mM在7小时，用50%w/w亲液物质，转化率是84%。400mM双相，带有甲苯。反应进行至80-90%，随后停止。不溶的新伐他汀捕获了未反应的底物。总结这些反应(300mM(14%w/v)底物，所有的反应带有顶部搅拌和下部的搅棒，pH7，10%NH4OH;5(TC)和最终转化率270mM乙酰基新伐他汀，13mM同型新伐他汀(homosimvastatin)，溶剂是等体积的甲苯，最终转化率是88.2%。300mM乙酰基新伐他汀，溶剂是10X甲醇(MeOH)，最终转化率是91.3%。300mM乙酰基新伐他汀，溶剂是10X甲醇(MeOH)，在6小时添加甲苯，最终转化率是96.1%。实施例12:新伐他汀的同二酰基化(homodiacylatioii)途径本实施例描述了本发明的示范性方案，即制备新伐他汀的同二酰化基过程，如图38和39所示例。一方面，同二酰基化工艺包括具有下述步骤的方法(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸；(b)通过内酯化从三醇酸产生二醇内酯；(c)通过化学酰化，酰化二醇内酯内酯环的内酯环上的4位(4'-OH)和8位(8'-OH)，产生4,8-二乙酰基内酯；禾口(d)通过酶促水解，选择性去除4'位的酰基，从而制备新伐他汀。应用本发明的同二酰基化方法的好处是四步合成；原位酶促水解洛伐他汀单一的酰化剂-没有区域选择性。决定何时应用本发明的同酰基化方法需要考虑的问题可能需要应用过量的二甲基丁酰氯；苛刻的条件一可能有不可接受水平的消除；在酶促水解上可能有困难可以用温和的酰化条件去除4'-二甲基丁酸酯可能是有困难的。—方面，进行本发明的同二酰基化方法示例于图39中。用SEQIDNO:4,在lmM规模上进行水解，形成新伐他汀和新伐他汀酸。应用100mM生物反应器。主要产生三醇酸，同时存在痕量的新伐他汀酸。溶解度需要注意。在不同底物浓度下进行小规模的反应；2天后的转化结果<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>图40A和40B以图形分别示例了用SEQIDNO:4对同型新伐他汀的水解以及在1mM同型新伐他汀和10mM同新伐他汀的反应条件下得到的反应产物。实施例13:制备新伐他汀的示范性过程本实施例描述了本发明的示范性过程，用于制备新伐他汀、新伐他汀中间体或等同化合物。本发明的本示范性过程包括下列方法(i)用洛伐他汀酯酶水解洛伐他汀和随后的"单釜/一步"内酯化/乙酰化(如步骤1和2)，(ii)用二甲基丁酸酐和BF3(Et20)(A)或Cu(0Tf)2(B)催化剂酰化4-乙酰基内酯(如歩骤3)。用二甲基丁酸酐/吡啶/DMAP(C)进行的酰化包括在内，用于比较，证明本方法的优势。(iii)用洛伐他汀酯酶水解乙酰基新伐他汀(如步骤4)。4-乙酰基内酯(50g规模)制备4-乙酰基内酯的示范性过程，如图19所示例，包括1.将洛伐他汀(50.05g，124mmol)称入配备有磁力搅棒和N2进口的1L3-颈烧瓶中。加入2MNaOH(65mL，130mmol)并搅拌桨液。加入MeOH(10mL)和BHT(0.25g)，在5(TC水浴中搅拌浆液1小时。此时，所有的洛伐他汀已经溶解，得到粘的淡黄色溶液。用水(175mL)稀释该溶液，将温度调节至40'C。2.同时，将洛伐他汀酯酶(5.0g粗提酶冻干物)称入聚丙烯离心瓶中，在水中(100mL)悬浮并在室温下搅拌30分钟。随后将混合物在4'C以10,000rpm离心15分钟。将上清液加入洛伐他汀酸反应混合物。用又一份水(150mL)润洗离心瓶，将其加入反应混合物。(参见下面的备注1)。3.将反应的pH调节至pH9.5，并在DASGIPAGFEDBATCH-PRO⑧生物反应器上，通过自动加入10X的NH4OH，维持在40。和pH9.5。4.定期移除反应混合物的等分试样(25)iL)，用MeOH稀释并用HPLC检测(参见下面的备注2)。26.5小时后，残留0.5%的未反应洛伐他汀酸。43小时后终止反应。5.将反应混合物在1L的烧杯中稀释为800mL并冷却至+12'C。伴随着剧烈搅拌，用6MHCI将pH值降低为pH2.5。在N2下过滤沉淀固体，用水(300mL)洗涤，在真空炉中在4(TC干燥潮湿的滤饼(参见下面的备注3)。6.在配备有温度计、附加漏斗、磁力搅棒和N2进口的1L的三颈烧瓶中，将粗提的三醇酸滤饼悬浮在CH2C12(500mL)中。在冰浴中冷却浆液并在N2下搅拌。7.将二甲基氨基吡啶(2.24g，18.3mmol;0.15当量)力卩入反应混合物。乙酸酐(35mL,0.37mol;3当量)放置在附加漏斗中，在12分钟期间滴加入反应混合物，温度维持在8.5-9.2°C。8.每30分钟移除反应混合物的等分试样(25^L)，用MeOH稀释并用HPLC检测(参见下面的备注4)。9.30分钟后，去除冷却浴，在室温下搅拌反应物(参见下面的备注5)。加入Ac20后6.25小时终止反应(参见下面的备注6)。将反应混合物过滤通过硅藻土垫，用CH2C12(2x100mL)洗涤该垫。用水(200mL)、1.2MHC1(200mL)和水(100mL)洗涤合并的滤液。10.在旋转蒸发器(rotovap)上浓縮有机层(去除250mL)并用EtOAc(300mL)稀释。向有机溶液中加入水(400mL和固体NaHC03(53g)，搅拌混合物30分钟。分离有机层。用水(400mL)稀释含水层并用EtOAc(150mL)萃取。合并EtOAc萃取物并用水(IOOmL)和饱和(satd.)NaCl(50mL)的混合物洗涤，随后用饱和NaCl(100mL)洗涤。干燥(Na2S04)、过滤和浓縮有机层(从600mL体积中去除420mL)。11.用顶部搅拌器搅拌浅黄色浓缩溶液，迅速加入己烷(200mL)，产生浓的白色沉淀。加入又一份的已垸(300mL)，在冰浴中冷却混合物1.5小时。12.过滤沉淀固体，用冷的20%EtOAc/已烷(80mL)洗涤，空气中千燥0.5小时，随后在真空炉中4(TC干燥过夜。13.蒸发母液至干燥。将得到的黄色油状物重新溶解在EtOAc(25mL)中，通过滴加已烷(175mL)，将第二次收获的产物沉淀出来。通过过滤收集沉淀固体并在真空炉中4(TC干燥(参见下面的备注7)。备注:1.反应的总体积是500mL，这相应于0.25M(10%w/v底物)的底物浓度和10%w/w的粗酶加载量。2.样品是在配备有DAD的Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(45o/oMeCN/0.10/0AcOH等度;lml/min;30°C;238nm)分析的。洗脱的顺序是三醇酸1.4分钟，二醇内酯1.9分钟，洛伐他汀酸3.8分钟，洛伐他汀7.3分钟。3.此阶段的滤饼(43.61g)由粗三醇酸和沉淀蛋白质组成。针对三醇酸工作标准品的HPLC分析表明，含水滤液含有0.69g三醇酸(1.6%)和0.69g二醇内酯(1.8%)。4.样品是在配备有DAD的Waters1100SeriesHPLC上，用ZORBAXSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(45%MeCN/0.1%AcOH等度；lml/min;30°C;238nm)分析的。洗脱的顺序是三醇酸1.4分钟，二醇内酯1.9分钟，二乙酸酯酸(diacetateacid)/消除产物3.6分钟，4-乙酰基内酯4.1分钟，二乙酸酯7.6分钟。5.反应混合物在开始是结块的，但是剧烈搅拌破坏了大的团块。2小时后，反应混合物被超声降解分散成一些仍为较小的块。建议研磨粗三醇酸滤饼，而后将其悬浮在溶剂中。最终的反应混合物是乳状的白色悬浮液。6.淬灭前的HPLC表明，存在1.1%的二醇内酯、3.9%的二乙酸酯酸/消除产物和1.2%的二乙酸酯。7.计算产物的总产量，如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>4-乙酰基新伐他汀的合成制备4-乙酰基新伐他汀的示范性过程，如图18C所示例，包括A.三氟化硼醚合物催化1.在2L的双颈烧瓶中，使4-乙酰基内酯(110g，0.3mol)在真空下(O.l托)干燥过夜(参见下面的备注1)。2.在N2下，将干燥的原料室温溶解在无水CH2C12(875mL)中。3.如下制备催化剂。在N2下，在手套袋中将2,2-二甲基丁酸酐(7.1mL，30.3mmol)加入无水乙腈(125mL)，随后加入新开封的BF3.OEt2(3.1mL，24.3mmol;8mol%)(参见下面的备注2、3)。4.将2,2-二甲基丁酸酐(78niL，0.33mol;1.1当量)加入4-乙酰基内酯溶液，将混合物加热至40°C10分钟。随后经导管加入BF3.OEt2的MeCN溶液(参见下面的备注4)。使反应避光，在40'C搅拌并由HPLC监测。5.5.5小时之后，判断反应完成，使反应物在冰浴中冷却至5°C。加入饱和NaHCO3(250mL),同时剧烈搅拌。分离水相层，用CH2C12(200mL)萃取。6.合并有机萃取物，干燥(Na2S04)、过滤并在低压下浓缩。向浓缩物中加入MeOH(200mL)(备注5);更多MeOH的去除造成4-乙酰基新伐他汀沉淀。将白色固体过滤、用冷的MeOH(100mL)洗涤并在真空下干燥(92.8g)。7.将母液浓縮至大约一半体积，在-10'C冷却过夜。如果通过过滤收集产物(17.2g)并干燥，将第二次收获到产物(参见下面的备注6)。8.HPLC图显示在下面的表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>备注:1.在升高的温度下真空干燥，可能引起分解。4-乙酰基内酯在4(TC真空干燥时变成黄色。2.由于反应对湿气的存在是敏感的，因此在刚开始将过量的酸酐加入乙腈，用以清除任何残留的水。3.应该在反应中使用新开封的BF3.OEt2;以前打开过的试剂可能导致反应缓慢或甚至不发生反应。4.CH2Cl2/MeCN比值是7:1。典型地，该比值是6:1禾Q9:1之间。反应在MeCN中较快，但是产生的产物带有较不希望产生的杂质情况。5.MeOH应该在粗产物凝固之前加入，否则其难于在MeOH中重新溶解。在热的甲醇中溶解固体产物引起分解，并因此得到较低的产量。6.总的固体产量是110g(78.7%)。将最终的母液蒸发至干燥，针对工作标样分析残余物，显示出还含有9.02g(6.8%)的产物。还有约2%的产物残留在含水洗涤物中。B.Cu(OTfy(酸)酐法1.在真空下室温千燥10.0g的4-乙酰基内酯(10.0g，27.6mmol)l小时，然后溶解于无水CH2C12(60mL)中并在氮气氛下搅拌。2.同时，在密封的瓶中制备并搅拌无水MeCN(7.0mL)中的Cu(OTf)2(0.5g，5mol。/。)禾卩2，2-二甲基丁酸酐(7.15mL，30.5mmol)溶液。3.使内酯溶液冷却至15r。用注射泵滴加Cu(OTf)2和2,2-二甲基丁酸酐的溶液。用HPLC监测反应，并判定其在3.0小时内完成。4.用水(20mL)淬灭反应，并在CH2C12(100mL)和饱和NaCl(100mL)之间进行分配。随后用1M苹果酸(50mL)和饱和NaC1(50mL)的混合物搅拌有机层10分钟，随后用饱和NaCl(100mL)搅拌。干燥(Na2S04)、过滤并蒸发有机层，得到粗产物(12.8g〉100y。重量产率)(参见下面的备注1、2)。备注1.HPLC检测产物分布的面积百分数是4-乙酰基新伐他汀(92.5%)，消除产物(2.7°/。)，二新伐他汀(1.7%)，未鉴定杂质(3.1%)。2.柱层析之后，4-乙酰基新伐他汀以61%被分离。C.卩比啶/DMAP法1.在真空下使4-乙酰基内酯(2.6g，7.2mmol)室温下干燥过夜，然后在氮气氛下室温溶解在无水吡啶中(6.0mL)，同时搅拌。加入DMAP(176mg，0.2当量)的1.5mL无水吡啶溶液，在冰浴中冷却该混合物。2.用注射泵在15分钟期间滴加2,2-二甲基丁酰氯(7.72g，8当量)。于(TC搅拌混合物约1小时，随后室温下搅拌1小时。3.在氮气氛下，于4(TC加热反应混合物，用HPLC监测反应。4-乙酰基内酯消耗之后(2天)，经旋转蒸发移去吡啶。残余物在EtOAc(20mL)和饱和NaCl(20mL)之间进行分配。干燥(Na2S04)、过滤并蒸发有机层，得到粗产物(96.5%)(参见下面的备注1、2)。备注1.HPLC检测产物分布的面积百分数是4-乙酰基新伐他汀(79.5%)，消除产物(12%)，二新伐他汀(2%)，未鉴定杂质(6.5%)。2.柱层析之后，4-乙酰基新伐他汀以43%被分离。认为4-乙酰基新伐他汀对Si02层析的稳定性低。洛伐他汀酯酶对4-乙酰基新伐他汀的水解制备4-乙酰基新伐他汀的示范性方案，如图18D所示例，包括1.在配备有搅棒和pH电极的500mL三颈圆底烧瓶中，称入4-乙酰基新伐他汀(39.69g，86.2mmol)(参见下面的备注1)。加入水(295mL)、MeOH(20mL)和BHT(0.24g)。在5(TC水浴中搅拌，用0.5MNaOH调节pH为7-8。2.将洛伐他汀酯酶(7g)称入离心瓶并在水(150mL)中悬浮。于6(TC搅拌混合物30分钟，随后在冰上冷却。随后在4。C以10,000rpm使混合物离心125分钟。将一份上清液(92mL)加入反应混合物。3.于50°C搅拌反应并通过自动加入10%NH4OH，用DASGIPFEDBATCH-PRO⑧系统将反应维持在pH7.5。4.定期移除反应混合物的等分试样(25^L),用MeOH稀释并用HPLC检测(参见下面的备注2)。42小时后，转化率是96.8%(产物与原料峰面积的比值)。64小时后终止反应。5.使反应混合物通过配有Whatman#1滤纸的13cmBuchner漏斗而过滤，用水(IOOmL)洗涤滤饼。在真空炉中于40。C下使潮湿的滤饼干燥过夜(参见下面的备注3)。6.在CH2C12(200mL)中悬浮干燥的新伐他汀滤饼。室温下搅拌该混合物，得到含有凝胶样物质的粘稠的棕色溶液。将硅藻土(lg)加入混合物并持续搅拌。随后使混合物通过粗糙烧结玻璃漏斗上的硅藻土垫(IOg)而过滤(备注4)。用甲苯(100mL)洗涤硅藻土垫。7.在旋转蒸发器(rotovap)上浓縮滤液，去除012<:12(浴温度是20°C)。用甲苯(150mL)稀释残余物并在室温下搅拌。缓慢滴加已烷(50mL);在加完之前开始沉淀。室温下撹拌该浆液过夜。随后在冰浴上冷却浆液，滴加又一份已烷(50mL)。随后过滤冷的浆液，用冷的25%甲苯/已垸(50mL)洗绦滤饼。短暂地在空气中干燥滤饼，随后在真空中约3(TC下干燥。8.在相似条件下，相同规模上进行第二次反应(40.68g，88.3mmo1)。这两次试验的结果在备注5中列表。敏1.由于原料和产物都是不溶的，故需要有效的搅拌。物质趋向于粘附在瓶壁上，导致分析反应程度上的潜在误差。建议研磨原料以降低颗粒大小和使用湿润剂。2.样品是在Waters1100SeriesHPLC上，用ZorbaxSB-Phenyl柱(4.6x75mm)(60-90%MeCN/0.5%AcOH梯度；lml/min;RT;238nm)分析的。梯度和洗脱顺序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>3.此阶段的滤饼(35.28g)由粗新伐他汀和一些酶相关物质组成。相对于新伐他汀工作标样的HPLC分析表明，含水滤液含有0.30g新伐他汀(1.0%)。4.不溶的凝胶样物质可以在硅藻土垫上产生妨碍过滤的沉淀物。5.上述两次试验的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>描述了本发明的许多实施方案。然而，应该理解的是，可以进行各种变化而不背离本发明的精神和范围。因此，其它实施方案包含在所附权利要求范围内。序列表<110>戴弗萨公司朱作霖J査普林、k库什特德约黄子林w格林伯林<120>制备新伐他汀及中间体的方法<130>564462012840<140>NotYetAssigned<141>2004_10-20<150>US60/542,100<151>2004-02-O4<150>US60/513,237<151>2003-10-21<160>6<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>1629<212>DNA<213>未知的<220><223>环境的<糊〉1atgsgcctttgcgtcattcgattcstcgccggsactttggtacttgtggcgtcagtgga—a60tcggcagttgctcaacaagcgtgtgctgscctgstgggcctcgsgctgcc120atsacgtccgctgcagtggctaccgsgggcCC33tCCC3Csgccggcgstctttggssgc180actgaccccattgtggctccgaagtgcgggcggtcscgcgccctacgs的240gactccgagattcgwtcgsgctctggctgccgctctccg300caia^ttggtagcggtggctgggctggttcgcggggctgat3ggccctctt360csgcgcggttstgccgtagctcagcgataggtttggtgcct420gscgcctcctgggctatcggcc3tccgca333gctgstcgatttcggttatcgcgccgtg480gtgttcaggcctgcgcgcctactttggccgcggtcsggst540ctgagctacttcsgcggttgttct33tggcggacgcgaggctctcatggaggcgcagcgc600根克温摩伯紧<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>GluGlyProlieProGinProAlsliePheGlySerThrAspProlie505560ValAlaProGluArgCysGluValArgAlaValThrArgProThrLys65707580AspSerGlulieArg工leGluLeuTrpLeuProLeuSerGlyTrpAsn859095GlyLysTyrLeuGinlieGlySerGlyGlyTrpAlaGlySerlieAsn100105110ArgThrGlyLeu工leGlyProLeuGinArgGlyTyrAlaValAlaAla115120125ThrAspAsnGlyHis工leSerGluGlyLeuValProAspAlaSerTrp130135140Ala工leGlyHisProGinLysLeulieAspPheGlyTyrArgAlaVal145150155160HisGluThrSerValGinAlaLysAla工leLeuArgAlaTyrPheGly165170175ArgGlyGinAspLeuSerTyrPheSerGlyCysSerAsnGlyGlyArg180185190GluAlaLeuMetGluMaGinArgTyrProGluAspPheGluGlylie195200205工leAlaGlyAlaProAlaAsnAsnTrpSerArgLeuPheThrGlyPhe210215220ValTrpAsnGluArgAlaLeuAlaAspAspPro工leProProAlaLys225230235240LeuThrAlalieGinAlaAlaAlalieAlaAlaCysAspThrLeuAsp245250255GlyValGluAspGlyLeulieGluAsnProArgAlaCysSerPheAsp260265270ProArgSerMetValCysThrAlaAspAspAlaSerAspCysLeuThr275280285GluGlyGinValAlaThrLeuHisArglieTyrSerGlyProThrAsn290295300ProArgThrGlyGluArgliePheProGlyTyrProMetGlyThrGlu305310315320AlaValProGlyGlyTrpValProTrp工leValSerAlaSerSerGlu325330335ValProSer工leGinAlaSerPheGlyAsnSerTyrTyrGlyHisAla340345350ValPheGluGinSerAsnTrpAspPheArgThrLeuAspPheAspGin355360365AspValAlaPheGlyAspAlaLysAlaGlyProValLeuAsnAlaThr370375380AsnProAspLeuArgSerPheArgAlaAsnGlyGlyLysLeu工leGin385390395400TyrHisGlyTrpGlyAspAlaAlalieThrAlaPheSerSerlieAsp405410415TyrTyrGluAsnValArgAlaPheLeuAspArgPheProAspProArg420425430SerGluAsnThrAsp工leAspGlyPheTyrArgLeuPheLeuValPro435440化GlyMetGlyHisCysSerGlyGly工leGlyProSerSerPheGlyAsn450455460GlyPheArgSerAlaArgThrAspAlaGluHisAspLeuLeuSerAla465470475480LeuGluAlaTrpValGluArgAspThrAlaProGluArgLeulieGly485490495ThrGlyThrAlaValGlyAspProThrAlaThrLeuThrArgProLeu500505510CysProTyrProArgThrAlaArgTyrLeuGlySerGlyAsnSerAsn515520525AspAlaAlaAsnPheGluCysAlaLeuProAlaGlyValGin530535540<210>3<211>1209<212>DNA<213>未知的<220><223>环境的<4〇0>3atgg333tccatggtacatgtttcacttggtgcggcaggsgtttgascga60astttgcgtg3gcgcggcg3sgtsggsgcgtccgtttgcgtcacgttgcscggcgsascc120gtagtggacttgtggggcggcstggcgcgtgccgscactcagscgccstggscggcggsg180acggtcagtattgttttttcCtCCSCC333ggcgcaacggcactctgcgcccatstgctg240gcgtcacgcggcc33ctgg3tcttg3tgc3ccsgtcgcc3cct3Ctggccggaatttgcc.300cssgccggcaaagctcgcatcccggtgss3atgctcttgatggtctccct360gccgtscgg3csccgctgccccsgggtgcctacgctgactgggaactgatggtC33tscg420ttggccaaggaagsgccgttttgggs3cctggc3cccgcs3cggctatc3tgcgctcacc糊stggggtggctggtggg3g3sgtggtgcgscgtgtctctggtssgtcgcttgggscattc540ttccaagaggagatcgccaggccgttggggttagatttctggattggctt600C33gsggcscgggtcgcgccg己tg3tcgcggcggagcctgatccgc333gcctcttcttc"0caagaggtcgcgsagcctggggccttscsgtcgctcgtsctccttssctccggcggctst720atgggtgctcagcctgagtstgsctcgcgggcggcgcatgcggccgagattggtgcsgcc780ggtggtstcacc3scgc3cgcggcctggcsggcstgtacgC3cc3ctggcctgcggaggc840gggtggagttggtcsgtcctgacatgctggcccgastgtccsgagtggcc900tctgcgsctgggsgsgstgccgtgctcstg3tgcca_3cccggtttgccctgggcttcstg960asgtccatggac33ccgccgggsgcctgctggcgtgcagg3c己gcgcgctctttggggsg1020gsggcttttggccstgtgggggccgggggttcgtttggttttgccgstcc1080atgtcctttggctstaccatgggctggg3gccgggctcsscccgcggggg1140tggstgcs3Cct3ccgctcgttagggtstcsgtcgg3tgcctctggsgcc1200tggscctgs1209<formula>formulaseeoriginaldocumentpage76</formula>LeuGlyThrPhePheGinGluGlu工leAlaArgProLeuGlyLeuAsp180185190PheTrpI丄eGlyLeuProAlaGluGinGluAlaArgValAlsProMet195200205lieAlaAlaGluProAspProGinSerLeuPhePheGinGluValAla210215220LysProGlyAlaLeuGinSerLeuValLeuLeuAsnSerGlyGlyTyr225230235240MetGlyAlaGinProGluTyrAspSerArgAlaAlaHisAlaAlaGlu245250255工leGlyAlaAlaGlyGly工leThrAsnAlaArgGlyLeuAlaGlyMet260265270TyrAlaProLeuAlaCysGlyGlyLysLeuLysGlyValGluLeuVal275280285SerProAspMetLeuAlaArgMetSerArgValAlaSerAlaThrGly290295300ArgAspAlaValLeuMetMetProThrArgPheAlaLeuGlyPheMet305310315320LysSerMetAspAsnArgArgGluProAlaGlyValGinAspSerAla325330335LeuPheGlyGluGluAlaPheGlyHisValGlyAlaGlyGlySerPhe340345350GlyPheAlaAspProLysAlaGlyMetSerPheGlyTyrThrMetAsn355360365ArgMetGlyLeuGlyMaGlyLeuAsnProArgGlyGinSerLeuVal370375380AspAlaThrTyrArgSerLeuGlyTyrGinSerAspAlaSerGlyAla385390395400TrpThi:<21〇>5<211>1578<212>DKIA<213>未知的<220><223>环境的<400>5atgagatcsgcagctcgcatcagcgtggcggcsgttgcctttctttgcctgctcttgacg603ctcgggtttccgcccagatcgtgccggcgatggaatgtgcggatctggcgaatcsgcag120cttcccaacacgacgatcacctcggcccagaccgtcaccaccggatcgttaacgcccccg180ggctcgacgaatccgatcaccgacctgcctcctttctgccgtgtcacaggcgccstcgcc240ccgscgagcgagtcgcacatcctcttcgaggtctggctgccgctggstaaatggaacggc300asgttcgccggcgtgggcaacggcggctgggccggcatcatctccttcggcgccctcgga360agccagctca3gcgcggctacgcgaccgcctccacgaatacgggtcscgaagcggcgccg420gggstgaacgcagccaggtttgcgttcgagaagccggagcsgcttstcgacttcgcctat480cgctcccagcacgagacggccctgaaagcgaaggcgctggttcaggctttctacgggaag540ccgccggaacactcctatttcstcgggtgctcstcgggtgggtaccagggcctgatggag600gcccsacgatttccggccg3ctacgacgggatcgtcgccggtatgccggcgaacaactgg6603cacggctgstggccggcgscttggacgcgatccttgccgtctccgtagatcctgccagc720caccttcccgtctccgcattgggtctgttgtatcgctcggtgctcgctgcctgcgscggc780stcgacggtgttgtagacggtgttctggaggatccgcgccgatgccggttcgacccggcc840gtgttga_tgtgc33ggcgg3tcsgsatcccgstggctgccttacgccggctcaggtggsa900gcggcacggcgcstatscggcggtctgaaggatcccssgaccggcgctcagctctatccg960gggctggcgccgggaagcgagccgttctggccgcaccgcaatccggcgaatccgttccct1020attccgatcgcgcactacaagtggctcgtctttgccgstccasactgggattggagaaca1080ttcaagttcacggatccggcggactaccaggctttcctcaatgcggaagccacgtatgcc1140cctsctctcaatgcgaccaatccggacctccgggagttcagccggcgcggcggcaggttg1200attcsgtaccatggctggaacgatcagctgattgccccgcaasacagcatcgactattac1260gsgagcgtcctttcgttcttcgggtccggcaaacaggstcgagcgcagaccgtgcgcgag1320gttcagagcttct3ccggctgttcatggcgccgggtstggctcactgtggaggcggtaca1380ggtccgaactcatttgacstgctggatgccctcgagssgtgggtggaaggcgggatagcg1440ccggaacgagtccttgcgacgcgttccataaacggcgtagtcgaccggctgcgcccgctc1500tgtccatatccgcaggtcgccgtgtacsagggtcatggggatscaaacgacgccgcgaac1560ttcgtctgtcgcgattag<210〉6<211〉525<212〉PRT<213>未知的<220><223〉环境的<220><221>信号<222〉(1)...(25)<400〉6MetArgSerAlaAlaArg工leSerValAlaAlaValAlaPheLeuCys151015LeuLeuLeuThrThrArgValSerAlaGin工leValProAlaMetGlu202530CysAlaAspLeuAlaAsnGinGinLeuProAsnThrThr工leThrSer354045AlaGinThrValThrThrGlySerLeuThrProProGlySerThrAsn505560Pro工leThrAspLeuProProPheCysArgValThrGlyAlalieAla65707580ProThrSerGluSerHis工leLeuPheGluValTrpLeuProLeuAsp859095LysTrpAsnGlyLysPheAlaGlyValGlyAsnGlyGlyTrpAlaGly100105110工lelieSerPheGlyAlaLeuGlySerGinLeuLysArgGlyTyrAla115120125ThrAlaSerThrAsnThrGlyHisGluAlaAlaProGlyMetAsnAla130135140AlaArgPheAlaPheGluLysProGluGinLeu工leAspPheAlaTyr1451501551601578<formula>formulaseeoriginaldocumentpage80</formula>工leGinTyrHisGlyTrpAsnAspGinLeu工leAlaProGinAsnSer405410415工leAspTyrTyrGluSerValLeuSerPhePheGlySerGlyLysGin420425430AspArgAlaGinThrValArgGluValGinSerPheTyrArgLeuPhe435440化MetAlaProGlyMetAlaHisCysGlyGlyGlyThrGlyProAsnSer450455460PheAspMetLeuAspAlaLeuGluLysTrpValGluGlyGlylieAla465470475糊ProGluArgValLeuAlaThrArgSer工leAsnGlyValValAspArg485490495LeuArgProLeuCysProTyrPr〇GinValAlaValTyrLysGlyHis500505510GlyAspThrAsnAspAlaAlaAsnPheValCysArgAsp51552052权利要求1.用于制备新伐他汀的方法，其包括图5、图6A或图38中列出的方法。2.用于制备新伐他汀的方法，其包括具有下列步骤的方法(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸±卜.(b)内酯化和酰化三醇酸，产生4-乙酰基内酯，其中所述酰化包括通过区域选择性酰化4'-OH，保护内酯环上的4位羟基(4'-OH);(c)酶促酰化4-乙酰基内酯的8位羟基(8，-OH)，产生4-乙酰基新伐他汀；和(d)化学地或是酶促地选择性去除4'位的酰基保护基团，从而产生新伐他汀。3.权利要求2所述的方法，其中所述步骤(b)中的酰化包括，通过酶促区域选择性酰化4，-OH，保护内酯环上的4位羟基(4'-OH)。4.权利要求2所述的方法，其中所述步骤(c)中的酶促酰化4-乙酰基内酯8位羟基(8'-OH)，酶促地区域选择性酰化第8位，产生4-乙酰基新伐他汀。5.用于制备新伐他汀的同型二酰基化方法，包括具有下列步骤的方法(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸；(b)通过内酯化，从三醇酸产生二醇内酯；(c)通过化学酰化，酰化二醇内酯的内酯环上的第4位(4，-OH)和第8位(8，-OH)，产生4,8-二乙酰基内酯；禾口(d)通过酶促水解，选择性去除4'位的酰基，从而产生新伐他汀。6.权利要求l、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述至少一个步骤是在单独的反应容器中进行的。7.权利要求1所述的方法，其中所述至少两个步骤是在单独的反应容器中进行的。8.权利要求l、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述至少一个步骤是用细胞提取物进行的。9.权利要求l、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述至少一个步骤是在全细胞中进行的。10.权利要求1、权利要求2或权利要求5所述的方法，进一步包括新伐他汀的结晶。11.权利要求10所述的方法，进一步包括新伐他汀的重结晶。12.权利要求1、权利要求2或权利要求5所述的方法，进一步包括重新内酯化，用以提供具有所需纯度的新伐他汀。13.权利要求1、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述至少一个酶促反应是用水解酶进行的，所述水解酶是由与SEQIDNO:1有至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)的核酸所编码的，或者是其酶促活性片段。14.权利要求1、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述至少一个酶促反应是用水解酶进行的，所述水解酶是由与SEQIDNO:3有至少53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82°/o、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)的核酸所编码的，或者是其酶促活性片段。15.权利要求1、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述至少一个酶促反应是通过水解酶进行的，所述水解酶是由与SEQIDNO:5有至少56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)的核酸所编码的，或者是其酶促活性片段。16.权利要求1、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述至少一个酶促反应是通过水解酶进行的，所述水解酶具有的序列和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99。/。或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)，或者是其酶促活性片段。17.权利要求l、权利要求2或权利要求5所述的方法，其中所述方法包括酶促水解洛伐他汀，产生三醇酸或三醇酸盐，随后通过内酯化三醇酸和酶促酰化内酯环的第4位(4'-OH)，产生4-酰基内酯，之后酶促酰化4-酰基内酯，产生4-乙酰基新伐他汀，然后通过区域选择性酶促水解4-乙酰基新伐他汀，产生新伐他汀。18.制备4-乙酰基内酯的方法，包括酶促水解洛伐他汀，产生三醇酸或三醇酸盐，随后通过内酯化三醇酸，产生二醇内酯，然后通过区域选择性酰化二醇内酯中内酯环上的第4位(4'-OH)，产生4-乙酰基内酯。19.制备4-乙酰基新伐他汀的方法，包括酶促水解洛伐他汀，产生三醇酸或三醇酸盐，随后通过内酯化三醇酸，产生二醇内酯，之后通过区域选择性酶促酰化二醇内酯中内酯环上的第4位(4'-OH)，产生4-乙酰基内酯，然后通过区域选择性酶促酰化4-乙酰基内酯中内酯的第8位(8'-OH)，产生4-乙酰基新伐他汀。20.从洛伐他汀制备三醇酸或三醇酸盐的方法，包括(a)提供洛伐他汀、洛伐他汀或洛伐他汀盐，以及酯酶；(b)在酯酶催化洛伐他汀水解为三醇酸或三醇酸盐的条件下，用酯酶接触洛伐他汀、洛伐他汀或洛伐他汀盐。21.权利要求20所述的方法，其中所述酯酶的序列和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(100%)。22.从洛伐他汀制备三醇酸或三醇酸盐的方法，包括如图15A、图16A、图18E或图19中列出的方法。23.从洛伐他汀酸制备三醇酸的方法，包括如图16A中列出的方法。24.从洛伐他汀制备洛伐他汀酸的方法，包括如图16A中列出的方法。25.从三醇酸制备二醇内酯的方法，包括如图8中列出的方法。26.从二醇内酯制备酰基内酯的方法，包括如图16C中列出的方法。27.从三醇酸制备酰基内酯的方法，包括如图16D中列出的方法。28.从三醇酸制备4-乙酰基内酯的方法，包括如图9A中列出的方法。29.从酰基内酯制备酰基新伐他汀的方法，包括如图16E中列出的方法。30.从4-乙酰基内酯制备4-乙酰基新伐他汀的方法，包括如图9B中列出的方法。31.从4-乙酰基新伐他汀制备新伐他汀的方法，包括如图9C或图11中列出的方法。32.从酰基新伐他汀制备新伐他汀铵盐的方法，包括如图16F中列出的方法。33.从新伐他汀铵盐制备新伐他汀的方法，包括如图16F中列出的方法。34.从洛伐他汀、三醇酸、4-酰基内酯或4-酰基新伐他汀制备新伐他汀或相关化合物的方法，包括如图5、图6A或图38中列出的方法，其中在步骤3中加入的4位保护基团是R基团，所述R基团选自(i)-H，甲基或甲酰衍生物；(ii)Cl-n烷基，直链和支链的，其中n是l和20之间的整数；(iii)取代的垸基；(iv)苯基和取代的苯基例如苯基、对硝基苯基；和(v)R'O-基团，其形成碳酸酯保护基团，其中所述R'是(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任何一个基团。35.权利要求34所述的方法，其中所述取代的烷基包括氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯乙酰基、4-氧戊基(乙酰丙酸)或其等价物。36.权利要求34所述的方法，其中所述碳酸酯保护基团包括tBuOCO、PhOCO、PhCH20CO或其等价物。37.试剂盒，包括试剂和至少一种水解酶，用于实施权利要求l、权利要求2或权利要求5的方法。38.权利要求37所述的试剂盒，其中所述至少一种水解酶的序列和SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，或序列完全相同(IOO%)，或者是其酶促活性片段。39.制备新伐他汀的方法，包括5步异二酰基化过程，所述过程具有下列步骤(a)酶促水解洛伐他汀、洛伐他汀酸或洛伐他汀酸盐，产生三醇酸或三醇酸jm，(b)内酯化三醇酸，产生二醇内酯；(c)通过酶促地选择性酰化4'-OH，保护二醇内酯的内酯环上的第4位羟基(4，-OH)，产生4-酰基内酯；(d)通过酶促地选择性酰化第8位，酰化4-酰基内酯的第8位羟基(8'-OH)，产生4-酰基新伐他汀；和(e)化学地或是酶促地选择性去除4'位的酰基保护基团，从而产生新伐他汀。40.权利要求39所述的方法，其中在步骤(b)中的内酯化三醇酸产生二醇内酯包括，加热三醇酸或在酸存在下进行搅拌，产生二醇内酯。全文摘要本发明提供了制备新伐他汀及各种中间体的合成化学和化学酶方法。在一个方面，在本发明方法中应用酶，如水解酶，例如酯酶。文档编号C07DGK101415833SQ200480036202公开日2009年4月22日申请日期2004年10月20日优先权日2003年10月21日发明者B·摩根,J·查普林,K·库什特德约,M·伯克,M·莱温,W·格林伯林,朱作霖,黄子林申请人:戴弗萨公司