专利名称：Dac hyp组合物和方法
DAC HYP组合物和方法I.发明背景 达珠单抗(Daclizumab, DAC)是人源化IgG1单克隆抗体，结合人高亲和性白介素-2(IL_2)受体a亚基(CD25或Tac)，其在活化的而不是静息的t-和B-淋巴细胞表面表达。当与活化的细胞上的CD25结合时，DAC阻断高亲和力IL-2受体复合物的形成，从而阻断IL-2诱导的活化细胞的增殖。如对PHA胚细胞的直接结合测试所测定，DAC以0. 3nM的近似结合亲和力(Kd)与⑶25结合，并以剂量依赖的方式抑制PHA胚细胞增殖(Hakimi等，1993，J. Immunol. 151(2)1075-85)。在次最优的IL-2剂量(2. 5ng/mL)下，15nM DAC对IL-2依赖性细胞系Kit225/K6 的增殖抑制了 50% (Pilson 等，1997，J. Immunol. 159(3) =1543-56) 在 IL-2 依赖性、抗原诱导的T细胞增殖测试中，使用0. 5-1 u g/mL(3-7nM)范围内的DAC时观察到50%的增殖抑制(Junghans 等，1990, Cancer Res. 50 (5) :1495-502)。一种形式的DAC之前由Hoffman-La公司以ZENAPAX 的商品名上市销售，其用作免疫抑制方案(包括环孢素和皮质类固醇)的佐剂以治疗肾移植患者的急性同种异体移植物排斥。ZENAPAX被提供为用于进一步稀释且静脉施用的浓缩物。每管浓缩物含有5mL溶液，所述溶液含有5mg/mL DAC、3. 6mg/mL 一水合磷酸二氢钠、llmg/mL十二水合磷酸氢二钠、4. 6mg/mL氯化钠、0. 2mg/mL聚山梨酯80以及足以将pH调节至pH 6. 9的HCl和/或NaOH0成人和儿童患者推荐剂量为I. Omg/kg，其通过使用50mL无菌的0. 9%氯化钠溶液稀释经计算的体积的25mg/5mL ZENAPAX浓缩物，并在15分钟的时间内通过外周或中央静脉进行静脉内施用来实现。DAC 还显不出治疗葡萄膜炎(Nussenblatt 等，2004, FOCIS 2004meeting ；Jul18-23, Montreal, QC. Abstract 4688 ；Nussenblatt 等，2003, J.Autoimmun. 21 :283-93)和多发性硬化症(参见如 Bielekova 等，2004，Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 101(23)8705-8708 ;Rose 等，2OO7, Neurology 69 :785-789 ;美国专利 No. 7，258，859)的效力，目前治疗多发性硬化症的课题正在进行临床实验。尽管已经证实DAC是安全且有效的，仍希望获得具有长储存寿命并且无需进一步配制或操作即可方便地施用的高浓度液体制剂，以及与ZENAPAX DAC相比具有改进特性(如安全性增强)的新的达珠单抗分子。2.发明简述如发明背景部分提到的，达珠单抗是与人白介素-2受体(IL-2R) a亚基(也被称为CD25或Tac)特异性结合的人源化IgG1抗体，所述人白介素_2受体是淋巴细胞活化的重要介导者。一种形式的达珠单抗之前由Hoffman-La公司以ZENAPAX 的商品名上市销售，当其用作免疫抑制方案(包括环孢素和皮质类固醇)的佐剂时，其在治疗肾同种异体移植物排斥中显示是安全且有效的(参见如欧洲药品局(“EMEA”)对ZENAPAX的市场授权)，在治疗多发性硬化症中也显示有效(参见如Bielekova等，2004，Proc. NaC I. Acad. Sci. USA101(23) :8705-8708 ;Rose 等，2007，Neurology 69 :785-789 ;美国专利 No. 7，258，859)。根据EMEA，ZENAPAX DAC在GS-NSO (鼠骨髓瘤)细胞中表达，并利用包括Q-S^harose层析、
S-Sepharose层析、渗滤、Q-Sepharose II层析、超滤、S-300凝胶过滤层析和超滤的过程进行纯化。现在已经发现在无血清、无胆固醇和无其他动物产物的培养基中适应性生长的NSO细胞系中表达并通过不同的过程分离的达珠单抗具有不同于、在某些情况下优于ZENAPAX达珠单抗(“ZENAPAX DAC")的特性和性质。这种新的达珠单抗在本文中被称为DAC HYP,其具有与ZENAPAX DAC不同的同等型谱(如通过阳离子交换层析所确定)；与ZENAPAXDAC不同的N-连接的糖基化谱(即使两种形式的达珠单抗均在NSO细胞中表达)；和在生物测试中低于ZENAPAX DAC的ADCC细胞毒性。如，达珠单抗的同等型可能源于重链N-和C-末端的异质性。达珠单抗成熟Vh链的氨基酸序列起始于图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO 4)的位置20。成熟Vh链的N-末端谷氨酰胺(Q)(图2中粗体、下划线文本)可以环化，形成焦谷氨酸(pE)。在某些情况下，信 号肽序列可以截短，剩余与成熟Vh链的N-末端谷氨酰胺残基相连的缬氨酸-组氨酸-丝氨酸(VHS)序列。由于每个达珠单抗分子包含两条Vh链，达珠单抗的多种N-末端同等型可以包括含有以下的形式(I)两个谷氨酰胺残基(Q/Q) ；(2) 一个谷氨酰胺残基和一个VHS序列(Q/VHS或VHS/Q) ；(3)两个VHS序列(VHS/VHS) ； (4) 一个谷氨酰胺残基和一个焦谷氨酸残基(Q/pE或pE/Q) ；(5) 一个焦谷氨酸残基和一个VHS序列(pE/VHS或VHS/pE);和
(6)两个焦谷氨酸残基(pE/pE)。还可能有不同的C-末端同等型，其含有0、1或2个C-末端赖氨酸(K)残基(0K，IK或2K)，产生复杂的同等型谱。相当令人惊奇的是，当ZENAPAX DAC Vh链的N末端谷氨酰胺完全环化为焦谷氨酸时，DAC HYP并没有达到完全环化。因此DAC HYP阳离子交换层析的特征在于pE/Q同等型峰和Q/VHS同等型峰。尽管不希望受任何理论的束缚，据信这些独特的pE/Q和Q/VHS同等型可以受到用于表达DAC HYP的先导序列的影响。因此，在一个方面中，本文公开的内容提供了一种达珠单抗组合物，如阳离子交换层析所确定，其中PE/Q同等型占N-末端同等型的3% -17%,3% -15%,5% -15%，更优选 5% -12%或 7% -12%，和 / 或其中 Q/VHS 同等型占N-末端同等型的1% -15%，更优选3% -12%。在某些实施方式中，达珠单抗组合物的特征在于与
图18或图23的DAC HYP曲线基本相似的阳离子交换层析曲线。达珠单抗具有与重链残基Asn296相连的N-连接的寡糖。当利用酰胺酶PNGaseF使这些N-连接的寡糖释放并通过HPLC进行分析时，尽管事实上二者均是在NSO细胞系中重组产生，DAC HYP呈现与ZENAPAX DAC不同的糖基化谱。的确，DAC HYP的糖基化谱异常均一。参考图21的上面的图，ZENAPAX DAC的糖基化谱的特征在于代表寡糖G0_GlcNAc、G0、Gl、Man5、G2、Man6、Man7和唾液酸化寡糖的峰。图21的下面的图显示DAC HYP的糖基化谱的特征在于对应于GO-GlcNAc糖型和GO糖型的两个主峰以及对应于Gl糖型的次要峰。GO-GIcNAc糖型可占AUC的约5%至约20%，更通常占AUC的约7. 2%至14. 6%。GO糖型可占AUC的70%至99. 2%，更通常占AUC的80. 9%至99. 2%。Gl糖型可占AUC的1%至9%，更通常占AUC的I. 4%至3.8%。唾液酸化寡糖占总AUC的1.0%或更少。免疫原性和效应器功能的高水平对于长期施用的药物是个难题。此外，快速清除率可以降低药物的可用性。如技术人员所熟知的，治疗性抗体的糖基化方式的差异可以导致免疫原性的差异。具有高度均一的糖基化方式的抗体(如DAC HYP)可以提供有益的免疫原性谱、ADCC水平和清除率。此外，具有更加均一的糖基化方式的生物制剂减少了批次间的变化，并且可以改善一致性和稳定性。
因此，在另一个方面中，本文公开的内容提供了达珠单抗组合物，其特征在于均一的N-连接的糖基化谱。在一个实施方式中，达珠单抗组合物的特征在于N-连接的糖基化谱，如通过HPLC所测定，其包括总AUC约5-20%的GO-GlcNAc糖型，在某些实施方式中为总AUC 约 5%-18%或约 7-15% (如 7. 2%-14. 6%或 6. 9%至 14. 7%)的 GO-GIcNAc 糖型(在某些具体的实施方式中为总AUC 7. 3%的GO-GlcNAc糖型)，以及总AUC约70% -99. 2%的GO糖型，在某些实施方式中为总AUC约75% -90%、约75-92%或约81-88%的GO糖型(在某些具体实施方式
中总AUC 86%的GO糖型)。可选的，Gl峰少于总AUC的约10%、少于总AUC的约5%、少于总AUC的约4%或少于总AUC的约3%，在某些实施方式中为约1%至约4% (如I. 4%至3.8% )或约1%至约3%。Man5糖型优选占总AUC的约3%或更少。在其他实施方式中，达珠单抗组合物的特征在于与图19中所显示的谱实质相似的HPLC N-连接的糖型谱。在某些方面中，公开的达珠单抗组合物的特征在于总数为两个以上的糖型峰。在 某些实施方式中，公开的达珠单抗组合物的特征在于(a)对应于GO-GlcNAc糖型和GO糖型的两个主峰，其总共占总AUC的约75%至约100%、约80%至约100%或约85%至约100%和/或(b)对应于Man5，Man6，和Man7糖型的峰，其总共占总AUC的约6%或更少和/或(c)对应于Man6和Man7糖型的峰，其总共占总AUC的约2%或更少。在这样的实施方式中，G0-GlcNAc,G0,Gl和/或Man5的百分数可以以前段中所描述的量存在。DAC HYP的结合和抑制性质，以及如在测定对IL-2诱导的T细胞增殖的抑制的测试中所评价的DAC HYP功能效力，与ZENAPAX DAC的那些类似。然而，相当令人惊奇的是，DAC HYP显示出明显低于ZENAPAX DAC的ADCC细胞毒性，这可能是由于，至少部分地由于它们的非岩藻糖化甘露糖糖基化水平的差异(参见图21)。如图22A和图22B所示，如细胞测试中所测定，DAC HYP显示比ZENAPAX DAC低至少25%的ADCC细胞毒性。如技术人员可以认识到的，DAC HYP的降低的ADCC细胞毒性对于涉及不期望细胞死亡的长期给药的适应症有益，如治疗多发性硬化症和葡萄膜炎。在这些长期应用疗法的情况下，如，如在多发性硬化症和其他非肿瘤适应症的治疗中，DAC HYP疗法可以比使用ZENAPAX 的疗法更安全。因此，在另一个方面中，公开的内容提供了达珠单抗组合物，其特征在于在Iiig/1^的浓度下，显示低于约30%、25%、20%、15%、10%、5%或甚至更低的40(1细胞毒性，其中ADCC细胞毒性在利用25 1,40 1,50 I或60 I的效应细胞与靶细胞比率，如当利用KU225/K6作为靶细胞时和/或当利用来自3个或以上、6个或以上、10个以上或或50个或以上健康供体的PBMC效应细胞时的体外试验中测定。在具体实施方式
中，公开的内容提供了达珠单抗组合物，其特征在于在Iu g/mL的浓度下，显示5-30%、10-30%、15-30%、15-30%、5-25%、10-25%、20-30%、15-25%、15-35%或 20-35%范围的 ADCC 细胞毒性，其中ADCC细胞毒性在利用25 1,40 1,50 I或60 I的效应细胞与靶细胞比率，如当利用KU225/K6作为靶细胞时和/或当利用来自3个或以上、6个或以上、10个或以上或50个或以上健康供体的PBMC效应细胞时的体外试验中测定。考虑到DAC HYP是IgG1免疫球蛋白并且不含已知的能降低ADCC细胞毒性的框架突变，利用DAC HYP观察到的、与ZENAPAXDAC相比较低水平的ADCC细胞毒性是令人惊讶的。与ZENAPAX DAC相比，DAC HYP的安全性可以通过使用高产无血清过程进一步改善，该过程允许生产无牛血清白蛋白(BSA)的高纯产品。因此，本文公开的内容提供了达珠单抗组合物，其无BSA和/或是不存在BSA的细胞培养过程的产物。特征在于有I个或多个上面讨论特性的达珠单抗组合物(DAC HYP组合物)可以通过在哺乳动物细胞中重组表达方便地获得。尽管不希望受任何特定操作理论的束缚，据信I个或多个上面讨论的独特的特点和/或特性可能由于，至少部分地由于高产重组表达系统的使用。这可以以任何方法实现，如通过利用DHFR进行基因扩增，或利用处于弱启动子控制下的选择标记基因，所述弱启动子优选与驱动目标蛋白(优选分泌蛋白)表达的强启动子联合使用。不受理论的束缚，据信处于弱启动子控制下的标记选择有利于鉴定稳定转染子，在所述稳定转染子中，表达载体整合入转录活跃的染色体区域，从而获得高表达水平的目标蛋白。在一个实施方式中，驱动选择标记表达的弱启动子是SV40启动子(Reddy等，1978，Science 200 :494-502)，其中一个或两个增强子区域的活性已经如通过部分或完全缺失而降低或消除，可选的其与驱动目标蛋白表达的强启动子，如CMV IE启动子联合使用(Boshart 等，1985，Cell 41(2) :52130)。
因此，在另一个方面中，公开的内容提供了用于产生重组细胞系的载体，重组细胞系能稳定表达高水平的达珠单抗，如DAC HYP，其中选择标记的表达处于SV40启动子的控制下，所述SV40启动子中增强子功能已经如通过一个或两个增强子序列的部分缺失而降低(命名为dE-SV40)。可以用于产生稳定表达细胞系的具体的dE-SV40启动子序列位于载体 pHAT. IgGl. rg. dE(SEQ ID NO 5)的位置 6536-6735，其在图 3A-图 3D 和图 3E (SEQ IDNO 12)中显不。可以用于产生稳定表达细胞系的具体载体的多种实施方式描述于2011年11月30日提交的美国申请61/565，419号和2011年11月30日提交的国际申请PCT/US11/62720号中，其通过引用并入本文。一般地讲，用于表达达珠单抗如DAC HYP的载体将包含由pHAT. IgGl. rg. dE所示例的一个或多个特征(描述于下面5. I节中)，如启动子。达珠单抗的两条链可以置于独立的转录调控下，但优选位于相同的载体上，而其编码区可以是含有内含子和外显子的基因组DNA或cDNA。作为独立的转录调控的替代方案，两条链可以表达为单个转录本或单个开放读码框，其编码区被内部核糖体进入位点或自切割内蛋白序列分开，在这种情况下，重链和轻链编码序列位于单个启动子的控制下。示例性启动子是CMV IE启动子和增强子(位于 pHAT. IgGl.rg. dE (SEQ ID NO 5)的位置 0001-0632 和 3982-4604 处)。其他特征包括转录起始位点(如果没有选择的启动子)，转录终止位点和复制起点。这些特征的示例展示于表I中，其中概述了 pHAT. IgGl.rg. dE的元件。用于在NSO细胞中由单个外源核酸表达达珠单抗如DAC HYP的重链和轻链的具体实施方式
，使用在哺乳动物细胞中可操作的选择标记，如新霉素磷酸转移酶(nec/)、潮霉素B磷酸转移酶(hyf)、潮霉素B磷酸转移酶(Hph)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puix/)、杀稻瘟素S脱氨酶(bsf)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)、谷氨酰胺合成酶(GS)或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。在优选的实施方式中，公开的载体中的选择标记是处于增强子减弱的SV40启动子控制下的大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶选择标记，其编码序列可以在图3A-图3D中所示pHAT. IgGl. rg. dE (SEQ ID NO 5)的位置6935-7793处找到。在另一个方面中，本文公开的内容提供了宿主细胞，其经用于重组生产达珠单抗如如DAC HYP的载体转染。宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞，包括如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO鼠骨髓瘤细胞、Sp2/0细胞、PER. C6细胞、Vero细胞、BHK细胞、HT1080细胞、C0S7细胞、WI38细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、MDCK细胞和293细胞。一经转染，载体可以整合入基因组从而产生稳定生产的细胞系。技术人员将领会的是，在指定施用于人的组合物中包含动物产物是不理想的。因此，优选不需要血清或其他动物产物(如胆固醇)来生长的宿主细胞。可以使需要这样动物产物的宿主细胞适应利用无血清和无其他动物产物的培养基。使鼠骨髓瘤NSO细胞适应在无血清和胆固醇的培养基中生长的方法描述于 Hartman 等，2007，Biotech. &Bioeng. 96(2) :294-306 和 Burky 等，2007，Biotech. &Bioeng. 96 (2) :281-293中。适应在无血清和无胆固醇培养基中生长的具体NSO细胞株已经使用上面描述的可用于产生DAC HYP的载体稳定转染(克隆7A11-5H7-14-43)。
如技术人员将认识到的，用于培养生产重组蛋白的细胞的基础和补料培养基以及其他变量如补料时间表、生长速率、温度和氧水平，可能影响表达的蛋白的产量和质量。优化这些条件的方法在技术人员所知范围内；示例性条件列于公开内容的示例性实施方式中。优选使细胞适应生长于无胆固醇、血清和其他动物源性成分的培养基中；在这种情况下基础和补料培养基优选包括能替代这些成分的限定性化学物质。还已经发现含有高水平葡萄糖，如10-35g/L葡萄糖的培养基有利地使细胞培养的生产力增加。在具体的实施方式中，基础培养基具有约10-20g/L，更优选约15g/L的葡萄糖和/或补料培养基具有22-35g/L，更优选约28g/L的葡萄糖。如本领域已知的，可以按照逐渐上升的补料时间表在8-15天，优选9-13天，或最优选10-13天的时间内将补料培养基加入细胞中。对于在NSO生产株7A11-5H7-14-43中表达的DAC HYP,生长和补料培养基的组分以及其他影响表达和生产的变量已经被优化。因此，公开的内容还提供了经优化的基础培养基、补料培养基、补料时间表以及用于以高产量和纯度生产达珠单抗的其他培养方法和条件。这些培养基以及培养参数和方法更详细地描述于5. 3节中。还已经发现利用某些层析步骤的组合从细胞培养物中纯化达珠单抗得到了经纯化的达珠单抗和DAC HYP药物物质组合物，以及在高浓度下以液体形式中稳定储存的液体达珠单抗和DAC HYP药物制剂，其中通常达珠单抗或DAC HYP的额定浓度为至少约IOOmg/mL±10-15%，在一些实施方式中为150mg/mL±10-15% (如通过UV光谱学或折光率所测定)。一般通过用具有约267-327m0sm/kg范围内的摩尔渗透压浓度(如270-3IOmOsm/kg)和25°C时约pH 5. 8-6. 2范围内的pH (如25°C时5. 9-6. I)的交换缓冲液与浓缩的达珠单抗制剂发生交换以产生中间制剂，接着用聚山梨酯稀释缓冲液稀释中间制剂以获得稳定的高浓度液体制剂，从而制备稳定的高浓度达珠单抗药物制剂，其中如通过UV光谱学或折光率所测定，所述高浓度液体制剂包含约100mg/mL±10%达珠单抗(如DAC HYP)，在某些实施方式中包含至少约150mg/mL达珠单抗(如DAC HYP)。稀释缓冲液与交换缓冲液相同，但含有约0-10% (w/v)的聚山梨酯80，其以一定量使用以使最终稳定的高浓度达珠单抗制剂具有计算的聚山梨酯80浓度(额定浓度)，其在0. 02-0. 04%范围内，在某些实施方式中为约0.03% (w/v) 0交换和稀释缓冲液中可以包含多种不同的缓冲剂和赋形剂以得到限定范围内的摩尔渗透压浓度和pH。适于配制稳定的高浓度液体达珠单抗和DAC HYP药物制剂的交换缓冲液的具体非限定性示例含有约40mM琥珀酸盐和约IOmM NaCl并在25°C时具有约6. 0的pH。适于与该交换缓冲液使用的稀释缓冲液的具体非限定性示例含有约40mM琥珀酸盐、约IOOmMNaCl和约1% (w/v)聚山梨酯80，并在25°C时具有约6. 0的pH。可以使用酸或碱调节最终制剂的PH以获得25°C时约6. O的实际pH。稳定的高浓度液体达珠单抗制剂的特征在于聚集水平低，如通过大小排阻层析所测定，其通常含有至少95 %的单体和少于3 %的聚集体，有时少于I. 5 %的聚集体，更通常大于99%的单体和少于0. 8%的聚集体。高浓度液体达珠单抗药物制剂的其他纯度特征更详细地描述于5. 6节中。高浓度达珠单抗药物制剂的特征还在于储存期长，在不会产生大于5%的降解和形成大于3%的聚集体(如分别通过SDS-PAGE和大小排阻层析所测定)的情况下，其储存在2-8 °C时能够稳定长达54个月或更长时间，如至少5年，在加速条件下(23-270C /60±5 %的相对湿度)储存时能够稳定长达9个月的时间，而在加压条件下(38-420C /75±5%的相对湿度)储存时能够稳定长达3个月的时间。如上所述，可以通过用聚山梨酯稀释缓冲液稀释中间制剂以获得已完成的达珠单抗药物制剂，从而制备稳定的高浓度液体达珠单抗制剂。因此，在另一个方面中，公开的内 容提供了无聚山梨酯的经纯化的达珠单抗(优选DAC HYP)中间制剂，其含有至少150mg/mL达珠单抗，在某些实施方式中含有约170-190mg/mL达珠单抗，其可以用聚山梨酯稀释缓冲液进行稀释以获得本文描述的稳定的高浓度达珠单抗液体药物制剂。在具体的实施方式中，浓缩的无聚山梨酯中间制剂额定含有约155mg/mL或约180mg/mL的达珠单抗(优选DACHYP)、约40mM柠檬酸钠和约IOOmM NaCl，在25°C时pH为6. O。在具体的实施方式中，浓缩的无聚山梨酯中间制剂额定含有约155mg/mL或约180mg/mL达珠单抗(优选DAC HYP)、约40mM琥珀酸钠和约IOOmMNaCl，在25°C时pH为6. O。达珠单抗组合物的特征在于聚集物水平低，其在下面进一步描述。已经发现通过超滤浓缩的达珠单抗会诱导形成聚集体，其会导致高浓度达珠单抗药物制剂含有不可接受水平(如>3%)的聚集体。因此，优选在浓缩达珠单抗药物物质之前利用“精炼”步骤以去除聚集体。浓缩前可接受的聚集体水平将取决于将被浓缩的达珠单抗药物物质的浓度、最终达珠单抗药物制剂中的期望浓度以及最终达珠单抗药物制剂中可接受的聚集体水平。如，如果期望获得含有少于3%聚集体的150mg/mL达珠单抗制剂，并且达珠单抗药物物质必须被浓缩10到30倍(如20倍)以实现该已完成的达珠单抗制剂，则将被浓缩的达珠单抗组合物应当含有< 0. 3%的聚集体，优选< 0. 2%的聚集体，优选甚至更低水平，如约0. I %的聚集体。可以利用多种已知技术获得含有可接受聚集体水平的起始达珠单抗药物物质组合物，以用于浓缩成本文描述的经浓缩的达珠单抗中间制剂和最终药物制剂，所述技术包括，如强阳离子交换层析和疏水相互作用层析。然而，已经令人惊讶的发现，弱阳离子交换层析将含有4-12mg/mL范围内的达珠单抗和高至2. 5%聚集体的达珠单抗组合物的聚集体水平降至极低水平，通常降至约0. I %聚集体。与利用含氮溶液(如硫酸铵溶液)的疏水相互作用层析相比，使用弱阳离子交换以去除聚集体在环境上更加温和。因此，在另一个方面中，公开的内容提供了精炼达珠单抗组合物以去除聚集体的方法，这样得到的精炼组合物通常包含约4至15mg/mL的达珠单抗，如通过大小排阻层析所测定，其中0.3%或更少(如0.2%或更少或者0.1%或更少)是聚集体形式。该方法通常包括使含有约4-10mg/mL,通常约8-9mg/mL,优选约8. 5mg/mL达珠单抗和> 0. 5%聚集体的达珠单抗组合物在适宜缓冲液中流经弱阳离子交换树脂以吸附达珠单抗，并用洗脱缓冲液洗脱被吸附的达珠单抗。可用的弱阳离子交换树脂包括但不限于CM-650M(ToSohBiosciences)、CM-Sepharose、CM-HyperD。平衡、清洗和洗脱缓冲液的组分取决于所使用的弱阳离子交换树脂，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。对于CM-650M树脂(TosohBiosciences，产品编号101392)，含有约20mM柠檬酸钠、pH为4. 5的平衡和清洗缓冲液，以及含有20mM柠檬酸钠和75mM硫酸钠、pH为4. 5的洗脱缓冲液运作良好。所用流速取决于树脂的选择和柱尺寸。对于具有约10-30cm(如17-19cm)范围内的床高的CM-650M树脂圆柱形柱，约50-200cm/hr范围内(如90_110cm/hr,优选约100cm/hr)的流速运作良好。层析可以于室温或者更低温度下进行，如4°、10°、15°、20°或25°C范围内的温度。通常使用的温度范围是18-25 °C (如18-22 °C )。依据ZENAPAX EMEA, ZENAPAX DAC的纯化过程包括以下12个步骤(i)培养基浓缩；
(ii) Q-Sepharose 层析；(iii) S-Sepharose 层析；(iv)低pH处理以失活病毒；(V)浓缩/渗滤；(vi)DV50过滤以去除病毒；(vii)Q-Sepharose II 层析；(viii) Viresolve 层析以去除病毒；(ix)超滤浓缩；(xi) S-300凝胶过滤层析；(xii)超滤浓缩(xiii)无菌灌装入瓶。该过程效率低，纯化产率低。已经发现利用较少步骤的过程可以实现较高的产量，同时获得较高的纯度，这使得所得达珠单抗药物物质能够配制成上面描述的高浓度药物制齐U。因此，本文公开的内容还提供了分离和/或纯化达珠单抗药物物质和高浓度药物制剂的改进的方法。该过程联合利用蛋白A亲和层析、强阴离子交换层析(Q-Sepharose)和弱阳离子交换层析(CM-650M)，这使得进行连续性流动处理而无需稀释过程中间产物。获得经纯化的达珠单抗药物物质的改进的方法包括以下步骤(i)蛋白A亲和层析，以从其他细胞培养组分中分离达珠单抗；(ii)低pH病毒失活；(iii)强阴离子交换(Q-Sepharose)层析，以去除DNA(iv)弱阳离子交换(CM-650M)层析，以减少聚集体；和(V)过滤，以去除病毒。如本领域公知，确切的体积、柱尺寸和操作参数将部分取决于纯化的规模。用于大规模纯化的具体体积、柱尺寸和操作参数描述于5. 4节中。可以利用多种常规方法，如微过滤、离心和直接从生物反应器中深度过滤，从细胞培养物中收获将通过上述方法被纯化和可选地被配制的粗达珠单抗。然而，已经发现可以通过在低于15°C的温度下将细胞培养物的pH降至约pH5以使细胞絮凝，从而方便地收获粗达珠单抗，所述絮凝的细胞可以通过离心去除。在一个具体实施方式
中，通过将细胞培养物的pH降至约pH 5，将培养物冷却至低于15°C (如4°C ) 30-90分钟，并对所得悬液进行离心以去除细胞，从而收获粗达珠单抗。该过程通常适用于任何向培养基中分泌重组蛋白的细胞培养物，而不是特定适用于产生达珠单抗或治疗性抗体的培养物。可以使用多种不同的酸，包括弱或强的有机酸，或者弱或强的无机酸来调节培养物的pH。对于达珠单抗培养物，已经发现柠檬酸作用良好。收获前可以使用浓缩的柠檬酸溶液，如0. 5M-2M溶液调节培养物的pH。
通过利用三个层析步骤、病毒失活、病毒过滤和最终超滤来完成DAC HYP的纯化。蛋白A亲和层析是纯化过程中的第一个步骤，其清除大部分过程相关的杂质。为使蛋白A亲和柱能够再利用，必须使其再生并消毒。已经发现NaOH水溶液能够有效地完成柱的再生和消毒。然而，使用NaOH溶液可能使蛋白A树脂降解，增加总生产成本。还已经发现使用含有NaOH和苯甲醇的溶液对蛋白A亲和层析树脂进行消毒能够得到良好的结果，并使纯化循环数显著增加。因此，公开的内容还提供了使蛋白A亲和柱和树脂再生和消毒的消毒溶液和方法。缓冲液通常含有约100至500mM柠檬酸钠、约10至30mM NaOH和约0. 5至3%(v/v)苯甲醇，并具有约pH 10至13范围内的pH。缓冲液还可以可选地包括其他组分，如盐和/或洗涤剂。柠檬酸钠和苯甲醇对于保护蛋白A树脂免受NaOH破坏和增强杀微生物活性均很重要。在具体实施方式
中，蛋白A消毒缓冲液包含约200mM柠檬酸钠、约20mM NaOH和约1% (v/v)苯甲醇。如5. 4.2节所描述，含有苯甲醇和氢氧化钠的消毒溶液具有有益的抗微生物效果，并可以用于在任何抗体纯化过程中对蛋白A柱进行消毒。消毒缓冲液可以用于在分批式过程中对蛋白A层析树脂进行消毒，其中用过量的(如I. 5-2X体积)消毒缓冲液清洗树脂，随后在过量的(如I. 5-2倍体积)消毒缓冲液中孵育约30-45分钟，随后用平衡缓冲液或储存缓冲液平衡。消毒缓冲液还可以用于对制备好的蛋白A层析柱进行消毒，其中用过量的(如I. 5-2倍柱体积)消毒缓冲液以适宜流速(如约110-190cm/hr或135-165cm/hr)对柱进行清洗,使柱在零流动的条件下保持约30-40min,随后用平衡缓冲液或储存缓冲液对柱进行清洗。适宜的平衡和储存缓冲液描述于0节中。用本文描述的消毒缓冲液对蛋白A柱进行消毒使单批树脂可以使用的纯化次数显著增加。如用常规NaOH缓冲液消毒(如50mM NaOH,0. 5M NaCl)时，单批蛋白A树脂通常仅可维持约30个纯化循环，而用本文描述的消毒缓冲液消毒的蛋白A柱可以使用多于100个纯化循环。尽管不希望受任何操作理论的束缚，据信本文描述的消毒缓冲液部分地保护了经固定化的蛋白A免受NaOH诱导的降解，从而使树脂的使用寿命增加。因此，尽管预期对所有蛋白A树脂都有改善，包括使用设计为抵抗NaOH降解的蛋白A突变株的那些(如MabSuRe树脂)，然而当用于对使用未修饰的经固定化蛋白A或未经改造为对NaOH稳定的蛋白A的蛋白A树脂和柱进行消毒时，本文描述的消毒缓冲液特别有益。公开的内容进一步提供了包括使用蛋白A亲和树脂进行多于30、多于35或多于40个抗体纯化运行以及在一些情况下高达50个或高达100个蛋白纯化循环的方法，其包括如本文中所公开进行纯化运行并用消毒溶液清洗树脂。如上所述，达珠单抗与活化的而非静息的T和B淋巴细胞上表达的的⑶25特异性结合，并阻断IL-2与CD25的结合，从而抑制高亲和力IL-2受体复合物的形成，抑制活化的T-和B-细胞的增殖。本文中描述的DAC组合物和制剂，特别是DAC HYP组合物和制剂，同样与⑶25特异性结合并显示类似的生物学性质。因此本文中描述的DAC组合物和制剂，特别是DAC HYP,因而可以用于通常针对达珠单抗特别是ZENAPAX描述的任何测试和治疗方法中。因此，本文公开的内容还提供了利用本文中描述的DAC组合物和制剂，特别是DACHYP组合物和高浓度稳定液体制剂抑制活化的T-和B-细胞增殖的方法，其在体外应用中和体内作为治疗方法来治疗活化的T-和B-细胞增殖在其中发挥作用的疾病，如治疗和预防同种异体移植物排异，治疗葡萄膜炎和治疗多发性硬化症。该方法通常包括使活化的T-和/或B-细胞与足以抑制其增殖的量的本文中描述的达珠单抗组合物或制剂接触。对于治疗方法，该方法通常包括对受试者施用一定量的达珠单抗组合物，如本文中描述的DAC HYP组合物或高浓度DAC制剂，以提供治疗效果。在一个具体的实施方式中，达珠单抗组合物和制剂可以单独或与其他药剂如3干扰素联合用于治疗多发性硬化症。本文描述的DAC组合物可以每周至每月(如每周、每两周、每月两次、每四周或每月)以75mg 至 300mg (如 75mg、lOOmg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg 或 300mg)或lmg/kg至4mg/kg范围内的剂量对患者皮下施用。组合物可以提供于便于皮下使用的预充注射器中，优选以100mg/mL± 10-15%或150mg/mL± 10-15%的达珠单抗额定浓度。还可以对经浓缩的DAC组合物进行稀释以用于静脉施用。3.附图简述图I提供了 DAC-HYP轻链cDNA (·SEQ ID NO : I)和已翻译的氨基酸序列(SEQ IDNO 2) o粗体、下划线的天门冬氨酸(D)残基是经恰当加工的成熟蛋白的首个氨基酸，该残基上游的氨基酸序列对应于信号序列。图2提供了 DAC-HYP轻链cDNA (SEQ ID NO :3)和已翻译的氨基酸序列(SEQ IDNO 4) 0粗体、下划线的谷氨酰胺(Q)残基是经恰当加工的成熟蛋白的首个氨基酸，该残基上游的氨基酸序列对应于信号序列。图3A-图3D共同提供了载体pHAT. IgGl. rg. dE的全长核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。图3E提供了可以用于选择高产生产株的dESV40启动子(SEQ ID NO 12)的具体实施方式
。图4A-4B提供了载体pHAT. IgGl. rg. dE的示意图(图4A)，其源于经调节以表达任何重和轻链基因或甚至非抗体多肽的载体pABX. gpt(图4B)。图5提供了 DAC HYP的示例性生产过程。图6展示了蛋白A亲和层析过程中产物级分的UV(280nm)、pH和电导率监测。图7展示了 Q-Sepharose层析过程中产物级分的UV (280nm)、pH和电导率监测。图8展示了 CM阳离子交换层析过程中产物级分的UV (280nm)、pH和电导率监测。图9提供了 DAC HYP超滤系统的示意性展示。图10提供了 0-60分钟的DAC HYP肽层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。图11提供了 55-115分钟的DAC HYP肽层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。图12提供了 110-170分钟的DAC HYP肽层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。图13提供了 DAC HYP 150mg/mL批次批次I和批次2的覆盖圆二色光谱。参照是100mg/mL 的 DAC HYP 制备品。图14A-图14B分别提供了覆盖的零级紫外光谱和覆盖的二级导数紫外光谱。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。所有三种光谱显示于图14A和图14B的每一个中，但是一旦相互覆盖即以单个光谱出现。图15A-图15B分别提供了全比例和扩展比例的大小排阻层析图。参照谱是IOOmg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。图16是DAC HYP聚集作为时间函数的制图。图17显示了还原的和非还原的SDS-PAGE (分别是左图和右图)。参照谱是IOOmg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。图18显示了 DAC HYP的阳离子交换层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。峰标记对应于不同的N-和C-末
端同等型。图19显示了从DAC HYP上酶切下的N-连接寡糖的HPLC层析图。参照谱是IOOmg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。图20显示了 DAC HYP的ADCC反应曲线。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次I和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。图21显示了从DAC HYP (下图)和ZENAPAX DAC (上图)释放的N-连接寡糖的HPLC层析图，其展示它们不同的糖基化谱。图22A-图22B提供了两种DAC HYP制备品(称作DAC HYP批次3和DAC HYP批次4)、DAC Penzuburg和ZENAPAX DAC的ADCC活性之间的比较，其中利用效应细胞对靶细胞比率可变的ADCC测试方式(图22A)以及抗体浓度可变的ADCC测试方式(图22B)。图23 提供了 DAC HYP、DAC Penzuburg 和 ZENAPAX DAC 电荷同等型的比较。4.发明详述本文公开的内容在其他事物中提供了具有特定性质的DAC组合物、在不同温度下 稳定储存的特别可用于某些施用方式的高浓度DAC制剂、可用于生产DAC组合物的载体和宿主细胞、可用于生产DAC组合物的经优化的培养基肉汤和培养条件、纯化DAC组合物和高浓度DAC制剂的方法，以及利用DAC组合物和高浓度制剂以例如抑制活化的T-和/或B-细胞增殖以及治疗和/或预防活化的T-和/或B-细胞所介导的疾病(如多发性硬化症)的方法。本文中使用的达珠单抗(DAC)是指具有图I中展示的轻(VL)链序列(SEQ ID NO 2的位置21-233)和图2中展示的重(VH)链序列(SEQ ID NO 4的位置20-465)的人源化IgGl单克隆抗体。DAC的⑶R序列如下VlCDR#I SASSSISYMH (SEQ ID NO 6)VlCDR#2 T T S N L A S (SEQ ID NO :7)
VlCDR#3 HQRSTYPLT (SEQ ID NO :8)VhCDR#1 S Y R M H (SEQ ID NO :9)VhCDR#2 YINPSTGYTEYNQKFKD (SEQ ID NO :10)
VhCDR#3 G G G V F D Y (SEQ ID NO :11)文献中已经报导了某些达珠单抗分子，一种具体形式的DAC之前由Hoffman LaRoche公司以ZENAPAX的商品名上市销售,其作为免疫疗法(包括环孢素和皮质类固醇)的佐剂用于预防肾移植患者中的同种异体移植物排斥。以ZENAPAX的商品名销售的DAC形式在本文中被称为“ZENAPAX DAC”。德国Penzberg的一个机构生产的另一种形式的DAC,尽管从未市售，已经用于某些临床试验中。这种形式的DAC在本文中被称为“DAC Penzberg”。如本文中所描述，本文公开的内容部分地涉及新形式的DAC，其具有不同于，在一些情况下优于ZENAPAX DAC和DAC Penzberg的特性和性质的特性和性质。因此，本文公开的内容部分地涉及新的DAC组合物。新DAC组合物的特征在于如简述部分中更完整描述的 一个或多个以下特征(I)特征性pE/Q和/或Q/VHS N-末端同等型；(2)以两个主峰和一个次要峰为特征的均一的N-连接寡糖谱；(3)与ZENAPAX DAC和DAC Penzberg相比降低的ADCC细胞毒性；和(4)当配制为高达150±10_15%的额定浓度时具有低水平的聚集体形式(< 3% ) o具有一个或多个这些特性和/或性质的DAC组合物在本文中被称为“DAC HYP”组合物。为了列举本文中描述的本发明的多个方面和特征，描述了具有所有四项上述性质的具体DAC HYP，以及具体组合物和其生产和纯化方法。然而，将要理解的是，DAC HYP组合物不需要具有所有四项上述特性以落入本文公开的范围内。在具体实施方式
中，DAC HYP具有上述特性⑴至⑷中的至少两项(如至少⑴和⑵，⑴和⑶，⑴和⑷，⑵和⑶，
(2)和⑷或(3)和⑷的组合)或上述特性⑴至⑷中的至少三项(如至少⑴、⑵和
(3)，(I)、(2)和(4)，(I)、(3)和(4)，⑵、(3)和(4)的组合)。当配制为IOOmg+10-15%或甚至150±10-15%的浓度时，这样的DAC HYP组合物还可以具有< 3%的聚集体、< 2%的聚集体以及甚至更低水平，如< I %的聚集体。此外，尽管本文中描述的发明的某些方面和实施方式使用DAC HYP进行展示和列举，技术人员将领会的是，其不限于DAC HYP，并通常可用于达珠单抗组合物中，也不限于具有与DAC相似的⑶25特异性结合性质的IgG2、IgG3、和IgG4抗-⑶25抗体以及未经人源化的适合施用于人体的抗-⑶25抗体。这些多种不同的抗⑶25抗体在本文中被称为“DAC类似物”。这样的DAC类似物常常包括上面提及的6个DAC⑶R，但可以包括其他⑶R序列。可以利用标准的测试和方法确认DAC HYP组合物的特性和性质。例如可以利用阳离子交换层析并在220nm下检测来评估N-末端和C-末端同等型谱。在一种具体的方法中，100 ii L测试样品(溶于缓冲液A中的lmg/mL抗体)在室温下，在装配ProPac WCX-10G保护柱(Dionex公司)的ProPac WCX-10柱(Dionex公司)上利用以下分离梯度进行解析(柱用缓冲液A平衡)
权利要求
1.经修饰的NSO细胞，其已经适应于在无血清和胆固醇的培养基中生长并被改造以表达重组蛋白，所述细胞当生长于无血清和胆固醇的培养基中时能够在10天分批补料方法中在100L培养中达到超过100mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
2.权利要求I的经修饰的NSO细胞，其能够达到超过以下的体积生产力 (a)当生长于无胆固醇和动物衍生组分的培养基中时在10天分批补料方法中在1，000L培养中100mg/L/天重组蛋白； (b)当生长于无胆固醇和动物衍生组分的培养基中时在10天分批补料方法中在16，000L培养中100mg/L/天重组蛋白； (c)在13天分批补料方法中在至少100L培养中200mg/L/天重组蛋白； (d)当生长于无胆固醇的培养基中时在13天分批补料方法中在1，000L培养中200mg/L/天重组蛋白； (e)当生长于无血清和胆固醇的培养基中时在10天分批补料方法中在16，000L培养中100mg/L/天重组蛋白。
3.权利要求I的经修饰的NSO细胞，其中所述分批补料方法包括按照以下时间表加入补料培养基，其中加入的体积代表初始细胞培养体积的百分数:
4.权利要求I的经修饰的NSO细胞，其用可用于表达抗⑶25单克隆抗体的核酸稳定地转染，可选地其中抗⑶25单克隆抗体包含序列对应于SEQ ID NO :2位置21-233的Vl链以及序列对应于SEQ ID NO 4位置20-465的VH链。
5.生产重组蛋白的方法，其包括培养权利要求I的经修饰的NSO细胞(a)在10天分批补料方法中在100L、1，000L或16，000L培养中能够产生至少100mg/L/天重组蛋白或在13天分批补料方法中在100L、1，000L或16，000L培养中产生至少200mg/L/天重组蛋白的条件下； (b)无血清和胆固醇存在，以及可选地无环庚三烯酚酮和氢化可的松存在； (c)在含有10-35g/L葡萄糖的基础和/或补料培养基中；或 (d)在含有15g/L葡萄糖的基础培养基和/或含有28g/L葡萄糖的补料培养基中，可选地其中所述基础培养基由PFBM2±10%或PFFM3±10%的组分构成，并且其中所述细胞在基础培养基中培养1-3天，接着在补料培养基中培养10-13天。
6.可用于重组表达目标蛋白的载体，其包括驱动在哺乳动物细胞中可操作的选择标记表达的弱启动子以及驱动目标蛋白表达的强启动子，可选地其中所述载体是PAbX. gpt或pHAT. IgGl. rg. dE和/或所述目标蛋白是(a)治疗性抗体；(b)抗CD25抗体；(c)包含达珠单抗(dacIizumab)⑶R的抗⑶25抗体；或(d)达珠单抗。
7.获得具有高目标蛋白体积生产力的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括用权利要求6的载体转染细胞，并选择能够在10天分批补料方法中在100L、I, 000L或16，000L培养中产生至少100mg/L/天目标蛋白或能够在13天分批补料方法中在100L、1，000L*16，000I^§养中产生至少200mg/L/天重组蛋白的细胞。
8.包含达珠单抗的组合物，其中达珠单抗的特征在于存在pE/Q重链N-连接的同等型和/或Q/VHS重链N-末端同等型，可选地其中所述pE/Q重链N-末端同等型占达珠单抗的约3-17%、约3-15%、约6-15%、约5-15%、约5-12%或约7-12%，或可选地其中所述Q/VHS重链N-末端同等型占达珠单抗的约1-15%或约3-12%。
9.权利要求8的组合物，其中所述达珠单抗重链存在于以下N-末端同等型中
10.权利要求8的组合物，其中所述达珠单抗的特征在于阳离子交换层析同等型谱基本与图18类似，可选地其中所述达珠单抗是DAC HYP。
11.包含达珠单抗的组合物，其中所述达珠单抗的特征在于N-连接的糖基化HPLC谱含有两个主峰，一个对应于寡糖GO-GlcNAc，一个对应于寡糖G0，其中这两个峰合并的AUC占所有峰的总AUC的约75-100%、约80-100%、约85-100%或约88-99. 5%，可选地其中 (a)所述GO-GIcNAc峰的AUC占所有峰的总AUC的约5-20%、约5-18%、约7-15%或约6-16%，所述GO峰的AUC占所有峰的总AUC的约70-99. 2%、约75-92%、约75-90%、约78-90%或约81-88%，并且可选地，其中N-连接的糖基化谱具有少于约3%的Man5或少于约 0. 5 % 的 G2、Man6 和 / 或 Man7 ； (b)所述N-连接的糖基化谱含有对应于唾液酸化寡糖的第三个峰，所述唾液酸化寡糖峰的AUC占所有峰的总AUC的I %或更少，或其中N-连接的糖基化谱含有对应于寡糖Gl的第三个峰，所述Gl峰的AUC占所有峰的总AUC的少于约10%、少于约5%、少于约4%、少于约3%或约1-5%或约1-4%或约1-3% ； (c)所述N-连接糖基化谱含有对应于Man5、Man6和Man7糖型的峰，其总共少于总AUC的约6% ;或(d)所述达珠单抗具有与图19或图21下图基本相似的N-连接的糖基化HPLC谱。
12.包含达珠单抗的组合物，如在体外细胞测定法中所测量，其显示(a)低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、低于10%或低于5%的ADCC平均细胞毒性或(b)5_30%、10-30 %、10-25 %或15-25 %的ADCC平均细胞毒性，所述体外细胞测定法利用来自至少3个健康供体的效应细胞和以KU225K6作为靶细胞，达珠单抗浓度为I U g/mL,效应细胞与靶细胞的比率为约25 1，可选地其中所述测试利用来自至少6个或至少10个健康供体的效应细胞。
13.权利要求12的组合物，其中所述达珠单抗是DACHYP。
14.可用于制备达珠单抗药物配制剂的组合物，其包含约150-190mg/mL达珠单抗和一定量的赋形剂，以使用稀释缓冲液对所述组合物进行稀释得到经稀释的组合物，所述经稀释的组合物含有约85-165mg/mL或85_115mg/mL或150±15mg/mL达珠单抗，并具有约267-327m0sm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25°C时约pH 5. 8-6. 2范围内的pH，并且如通过大小排阻层析所测量，其中至少约95%的达珠单抗是单体形式。
15.组合物，其包含 (a)约4至15mg/mL达珠单抗,其中0.I %或更少的达珠单抗是聚集体形式,可选地其中所述组合物通过在弱阳离子交换树脂上通过柱层析对含有约4到15mg/mL达珠单抗、其中上至2. 5%的达珠单抗是聚集体形式的达珠单抗组合物进行纯化而获得；或(b)约85_165mg/mL 或约 85_115mg/mL 或约 135_165mg/mL 达珠单抗；和约0. 02-0. 04%(w/v)聚山梨酯80,其中所述组合物具有约267-327m0sm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25°C时约pH 5. 8-6. 2范围内的pH，并且如通过大小排阻层析所测量，至少约95%或至少约99%的达珠单抗是单体形式，其中所述组合物适合施用于人，可选地其中所述组合物基本由约100mg/mL或约150mg/mL达珠单抗、约40mM琥拍酸钠、约IOOmM氯化钠和约0. 03%(w/v)聚山梨酯80组成，并在25°C时具有约6. 0的pH。
16.适合皮下施用的药物组合物，其包含约85-165mg/mL、约85_115mg/mL或约135-165mg/mL达珠单抗，其中在约2_8°C范围内的温度下储存约12个月时间后聚集体形式的达珠单抗的百分数不超过约2 %或约3 %，或者在约2-8°C范围内的温度下储存约18个月时间后不超过约3%。
17.从细胞培养物中收获重组蛋白的方法，其包括步骤 (i)将表达并分泌重组蛋白的细胞培养物的pH调节至约pH4. 5-5. 5范围内的pH ; (ii)将经PH调节的细胞培养物在约4至15°C范围内的温度下孵育约30-90分钟；并 (iii)将孵育后的经PH调节的细胞培养物离心，以除去细胞碎片。
18.生产经纯化的达珠单抗组合物的方法，其包括步骤 (i)将达珠单抗从达珠单抗粗制品中吸收到亲和层析树脂上； (ii)用清洗缓冲液清洗亲和树脂，以去除污染物； (iii)用洗脱缓冲液洗脱已吸收的达珠单抗； (iv)通过将pH调节至约pH3-4范围内的pH并将经pH调节的洗脱物在特定温度下孵育足以使病毒失活的一段时间，从而使洗脱物中的病毒失活； (V)将病毒失活的洗脱物中和至约pH 7. 7-7.9(25°C下测量)范围内的pH或约pH7.7-8.5(25°〇下测量)范围内的pH; (vi)使经中和的洗脱物流过强阴离子交换层析树脂； (Vii)使步骤(Vi)的洗脱物中的达珠单抗吸收到弱阳离子交换层析树脂上；和 (Viii)从弱阳离子交换层析树脂上将已吸收的达珠单抗洗脱下来；可选地，包括步骤 (ix)对步骤(Viii)中洗脱下的达珠单抗组合物进行过滤，以去除病毒；和 (x)通过超滤来对经过滤的溶液进行浓缩，以获得包含约85-180mg/mL达珠单抗的经纯化的达珠单抗组合物。
19.权利要求18的方法，其中所述达珠单抗粗制品从细胞培养物中收获，可选地利用权利要求17的方法。
20.权利要求18的方法，其中进行步骤(i)至(X)，其进一步包括用稀释缓冲液对经纯化的达珠单抗组合物进行稀释以获得包含约85-165mg/mL达珠单抗和约0. 02-0. 04% (w/v)聚山梨酯80的组合物的步骤，其中所述组合物具有约267-327m0sm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25°C时约pH 5. 8-6. 2范围内的pH，并且如通过大小排阻层析所测量，至少约95 %的达珠单抗是单体形式，可选地，其中所获得的组合物具有少于50ppm的来自达珠单抗重组来源的宿主细胞蛋白、少于IOppm的蛋白A，并且组合物中不多于3%的达珠单抗是聚集体形式。
21.培养基，其是基础培养基PFBM2或补料培养基PFFM3。
22.达珠单抗组合物，其通过包括在达珠单抗分泌到培养基中的条件下培养根据权利要求I的宿主细胞的步骤的方法而获得，可选地，其中所述方法进一步包括从细胞培养基中分离所分泌的达珠单抗的步骤。
23.用于对蛋白A亲和层析树脂进行消毒的缓冲液，其包含约100-500mM柠檬酸钠、约10-30mM NaOH 和约 0.5-3% (v/v)苯甲醇。
24.对蛋白A亲和层析柱进行消毒的方法，其包括用权利要求23的消毒缓冲液以足以使柱消毒的流速和时间对柱进行清洗，可选地，其中用约I. 8倍柱体积的消毒缓冲液以约150cm/hr的流速对柱进行清洗，经清洗的柱不流动孵育约30-45分钟，接着用平衡缓冲液平衡。
25.治疗患有多发性硬化症的患者的方法，其包括对患者施用足以提供治疗益处的量的 DAC HYP。
26.权利要求25的方法，其中施用DACHYP组合物 (a)静脉内； (b)以对应于约0. 8-0. 9mg/kg 或约 lmg/kgDAC HYP 的量； (c)每周一次,持续至少6周、至少12周、至少24周时间； (d)以单一疗法；或 (e)根据(a)至⑷的任意组合。
27.权利要求26的方法，其中DACHYP以单一疗法施用，并且所述患者已经对之前^-干扰素的治疗无应答或者已经终止了之前P-干扰素的治疗。
28.权利要求26的方法，其中DACHYP辅佐P -干扰素施用。
29.权利要求25的方法，其中施用DACHYP组合物 (a)皮下； (b)以对应于约lmg/kgDAC HYP的量，可选地每2周一次，或以对应于约2mg/kg DACHYP的量,可选地每4周一次； (c)持续总共约24周时间；或 (d)根据(a)至(c)的任意组合。
30.权利要求29的方法，其中所述DACHYP组合物以对应于75mg至300mg DAC HYP或150mg或300mg的量施用。
31.权利要求30的方法，其中所述DACHYP组合物每4周施用一次，可选地持续总共至少48周时间。
32.权利要求30的方法，其中所述DACHYP以单一疗法施用，可选地，其中所述患者已经对之前￠-干扰素的治疗无应答或者已经终止了之前￠-干扰素的治疗。
33.权利要求30的方法，其中所述DACHYP辅佐P -干扰素施用。
全文摘要
本文公开的内容涉及适合皮下施用的达珠单抗组合物及其制造方法。
文档编号C07K1/18GK102796705SQ20121024726
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月25日 优先权日2011年5月27日
发明者T·哈特曼, P·W·索尔, J·E·伯基, M·C·韦森, P·Y·黄, T·J·罗宾逊, B·帕特里奇, J·Y·索 申请人:雅培生物医疗公司