专利名称：双功能共缀物的制备方法
技术领域：
本发明涉及紫杉醇(Taxol)或多西紫杉醇(Docetaxel)与胞壁酰二肽(MDP)衍生物形成的共缀物及其合成方法和在治疗癌症方面的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属(Taxus brevifolia)植物中分得的紫杉烧类化合物之一 [1]，经美国国立癌症研究院(NCI)筛选，确定为抗肿瘤活性成分。起初的机理研究表明，紫杉醇属于有丝分裂抑制剂，即促进癌细胞微管蛋白聚合同时抑制其解聚，从而抑制癌细胞纺锤体的形成，使其生长过程停止于G2期和M期，达到抗癌的目的[2]。随后的机理研究表明，紫杉醇也可以作为细菌脂多糖(LPS)的模拟物，通过影响和改变免疫系统内巨噬细胞的功能来达到抗肿瘤的功效，如诱导巨噬细胞中的肿瘤坏死因子-α (TNF-α )和白介素-1 (IL-1)的表达[3，4]。此外，其还可以通过激活MAP-2激酶，促进酪胺酸磷酸化[5，6]等途径实现抗肿瘤的功效。胞壁酸二妝(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-1soglutamine,MDP)是分支杆菌细胞壁肽聚糖中具有免疫佐剂活性的最小有效结构单位[7，8]，其预先或同时与抗原注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。另外，胞壁酰二肽还具有其它的生物活性，如非特异性抗感染(肺炎杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、白色念球菌等)、非特异性抗肿瘤(纤维肉瘤、肝细胞瘤等)和免疫调节&13]等。研究表明，非特异性的免疫增强剂胞壁酰二肽可以协同细菌脂多糖(LPS)大大提高激活巨噬细胞表达细胞因子的能力[14_16]。因此本课题组推测，紫杉醇与胞壁酰二肽共同作用也会产生类似的协同机制，并首次提出将化疗药物紫杉醇与免疫增强剂胞壁酰二肽进行化学连接，合成一系列共缀物，并以生物学实验辅助验证其功效 ，实现化学治疗与免疫治疗相结合抗肿瘤并抗肿瘤转移的新思路[17]。本课题组已申请的早期专利[18]保护了两类共缀物，它们是通过将胞壁酰二肽分别连于紫杉醇的2'-位羟基(2’-0-MTC，Figure I)或去3' -N位苯甲酰基紫杉醇的
-位氨基(3’ -N-MTC, Figure I)形成的。研究发现，其中2’ -O-MTC共缀物在体外既保留了紫杉醇的抗癌活性，又可以显著协同小鼠巨噬细胞产生TNF-α和11-1，说明其可以潜在地抑制肿瘤的转移；而3’-N-MTC共缀物的各项活性测试结果则表现不明显。由此可以确定，该类共缀物的最佳连接位点是2'-位羟基。遗憾的是，2’-O-MTC共缀物未能够在实验小鼠体内展示抗肿瘤转移的实验结果，可能与分子的理化性质或者药学性质有关。为延续该新药设计理念，本课题组对2’ -O-MTC类化合物进行了系列优化，简化了胞壁酰二肽类分子，并使其在实验小鼠体内表现出显著的抗肿瘤以及抗肿瘤转移的功效，大大地提高了该类分子成为药物的可能性，即本专利所需要保护的全新研究成果。
权利要求
1.如式I所示的化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤I)中液相合成紫杉醇2，-O-烷烃二酸单酯包括如下具体步骤: (1)首先，将紫杉醇，烷烃基二酸酐和4-Ν，N-二甲基吡啶溶于吡啶中，室温搅拌4小时，反应完毕； (2)然后，先后以乙酸乙酯稀释吡啶溶液，以饱和硫酸铜溶液洗涤乙酸乙酯相，以水洗涤乙酸乙酯相； (3)最后，分离乙酸乙酯相，减压浓缩溶剂，向少量残余液中加入大量水，体系内析出白色固体，过滤，冷冻干燥，得到目标产物。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤I)中液相合成多西紫杉醇2'-O-烷烃二酸单酯包括如下具体步骤: (1)首先，将多西紫杉醇，烷烃基二酸酐和4-N，N-二甲基吡啶溶于N，N-二甲基甲酰胺中，室温揽祥2小时，反应完毕； (2)然后，先后以二氯甲烷稀释N，N-二甲基甲酰胺溶液，以2N盐酸水溶液洗涤二氯甲烷相，以水洗涤二氯甲烷相； (3)最后，分离二氯甲烷相，减压浓缩溶剂，用少量甲醇溶解残余物，再加入大量水，体系内析出白色固体，过滤，冷冻干燥，得到目标产物。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤2)中固相或液相合成胞壁酰二肽简化物包括具体步骤如下: O固相合成: (I)首先，液相合成中间体Fmoc-D-1so-Gln-OH ； (2 )然后，利用氨基树脂Rink-AmideAM作为固相载体，通过多肽固相合成策略先后向树脂引入氨基酸 Fmoc-L-Lys (Boc) -COOH、Fmoc-D-1so-Gln-COOH, Fmoc-L-Ala-COOH 和有机羧酸；缩合反应为常规的酰胺缩合反应，通过每次加入过量的上述三种氨基酸或有机羧酸之一和缩合剂HATU或HBTU或BOP或PyBOP中的任意一种可以使缩合反应完全；反应完成后，经充分洗涤树脂、裂解树脂以及纯化产物粗品等步骤，得到胞壁酰二肽简化物； 2)液相合成: (1)首先，合成中间体Boc-D-Glu (OBzl)-NH2 和 Boc-Lys (Z)-NH2 ； (2)然后，用活泼酯法先后合成二肽片段Boc-Ala-D-Glu(OBzl)-NH2和三肽片段R-Ala-D-Glu (OBzl)-NH2，用氢溴酸的醋酸溶液或者其他酸性或者碱性条件脱除三肽片段的Bzl保护基，继续用活泼酯法合成四肽R-Ala-D-1s0-Gln-Lys(Z)-NH2 ； (3)最后，用三氟化硼乙醚、三氟乙酸和乙硫醇混合溶液(体积比9:9:2)脱除Z保护基，得到产物粗品，纯化后得到胞壁酰二肽简化物。
5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于，固相合成方法种的氨基酸Fmoc-L-Lys (Boc) -COOH> Fmoc-D-1so-Gln-COOH、Fmoc-L-Ala-COOH 可以替换为其它任意天然及非天然氨基酸。
6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤3中紫杉醇或多西紫杉醇与胞壁酰二肽简化物的共缀物的液相合成包括具体步骤如下: 1)首先，将紫杉醇或多西紫杉醇W-O-烷烃二酸单酯与特定摩尔比例(2: 1-1: 2)的HOSu和DIC溶于二甲基亚砜或者N，N- 二甲基甲酰胺、或者N-甲基吡咯烷酮等溶液中中，在-20° C-+50。C温度范围内反应1-10小时； 2)然后，将等摩尔比例的胞壁酰二肽简化物加入上述二甲基亚砜、或者N，N-二甲基甲酰胺、或者N-甲基吡咯烷酮等溶液中，用N-甲基吗啉等弱碱性试剂将反应体系的pH值调节至6 8，继续反应1-10小时，反应完全后形成共缀物； 3)最后，向反应液中加入水、甲醇、乙醇、乙醚、石油醚、乙基丁基醚中的任意一种后析出固体，过滤，粗品经制备HPLC法或重结晶法纯化得到目标产物。
全文摘要
本发明公开了一类式(I)所示的双功能共缀物的化学合成及抗肿瘤与抗肿瘤转移作用，具体为紫杉醇(Taxol)与胞壁酰二肽(MDP)衍生物形成的共缀物，将紫杉醇与强效免疫增强剂胞壁酰二肽简化物进行相连，实现了化学治疗与免疫治疗相结合的抗肿瘤与抗肿瘤转移的双重功效。本发明结合固相合成和液相合成的方法合成了多个紫杉醇和胞壁酰二肽简化物的共缀物，并通过可靠的生物学实验方法及数据证明该类共缀物能用于制备抗肿瘤。
文档编号C07K1/113GK103204901SQ20121036192
公开日2013年7月17日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者刘刚, 赵楠, 马瑶 申请人:中国医学科学院药物研究所, 北京协和制药二厂