专利名称：用于酶抑制的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于酶抑制的化合物和方法。本发明特别涉及基于酶抑制作用的治疗方法。
背景技术：
在真核生物中，蛋白质的降解主要是通过泛蛋白途径介导的，其中需要破坏的靶蛋白与76个氨基酸多肽泛蛋白相连接。一旦与靶蛋白连接，泛蛋白化蛋白质就充当26S蛋白酶体的底物，26S蛋白酶体是一种多催化功能蛋白酶，通过其三种主要的蛋白水解活性将蛋白质切割成为短肽。尽管蛋白酶体介导的降解在胞内蛋白质更新中具有基本功能，但是 它在I类主要组织相容性复合体(MHC)呈递、细胞凋亡、细胞分裂和NF-κ B激活等许多过程中都具有关键性作用。20S蛋白酶体是一种700kDa圆柱形多催化功能蛋白酶复合体，由28个亚基组成，这28个亚基构成4个环，在细胞生长调节、I类主要组织相容性复合体呈递、细胞凋亡、抗原加工、NF- K B激活和促炎信号转导中具有重要的作用。在酵母和其它真核生物中，7个不同的α亚基构成外环，7个不同的β亚基构成内环。α亚基用作19S(PA700)和11S(PA28)调节复合体的结合位点，还用作2个β亚基环构成的内部蛋白水解腔的物理屏障。因此，一般认为蛋白酶体在体内以26S颗粒(“26S蛋白酶体”)存在。体内实验已经证明，抑制20S形式的蛋白酶体，很容易与抑制26S蛋白酶体联系起来。在颗粒形成期间，切割β亚基氨基端前序列后，用作催化亲核基团的氨基端苏氨酸残基被暴露出来。因此，蛋白酶体中负责催化活性的亚基具有氨基端亲核残基，这些亚基属于N端亲核(Ntn)水解酶家族(例如，亲核N端残基为Cys、Ser, Thr和其它亲核部分)。该家族包括例如青霉素G酰基转移酶(PGA)、青霉素V酰基转移酶(PVA)、谷氨酰胺PRPP酰胺转移酶(GAT)和细菌糖基天冬酰胺酶。高等脊椎动物除了具有普遍表达的β亚基以外，还具有三种Y-干扰素-诱导性β亚基(LMP7、LMP2和MECL1)，它们分别替代其正常对应物X、Y和Ζ，由此改变蛋白酶体的催化活性。通过利用不同的肽底物，已定义了真核生物20S蛋白酶体的三种主要蛋白水解活性胰凝乳蛋白酶样活性(CT-L)，它在大的疏水残基后切割；胰蛋白酶样活性(T-L)，它在碱性残基后切割；肽基谷氨酰肽水解活性(PGPH)，它在酸性残基后切割。蛋白酶体还有另外两个次要的特征性活性=BrAAP活性，它在支链氨基酸后切割；SNAAP活性，它在小的中性氨基酸后切割。蛋白酶体的主要蛋白水解活性似乎是受益于不同的催化位点，因为抑制剂、β亚基中的点突变以及Y干扰素诱导性β亚基互换使这些活性发生不同程度的变化。虽然有多种用于抑制蛋白酶体活性的小分子实例，但是这些化合物通常缺乏开发利用细胞水平和分子水平上的蛋白酶体作用所必需的特异性、稳定性或功效。因此，需要合成位点特异性增加、稳定性和溶解性改善以及功效提高的小分子抑制剂，以研究细胞水平和分子水平上的蛋白酶体作用。
发明概沭本发明涉及通常称为肽α ’，β ’ -环氧化物和肽α ’，β ’ -氮丙啶的分子。我们认为母体分子可有效地、不可逆地、选择性地与N端亲核(Ntn)水解酶结合，并且可以特异性地抑制具有多催化活性的酶的某些特殊活性。曾经认为，蛋白酶体仅仅负责破坏变性蛋白和错折叠蛋白，但是现在认为蛋白酶体是组成型蛋白水解机器，通过信号依赖性方式的降解作用来调节各种胞内蛋白水平。因此，非常有益的是，鉴定出能够特异性干扰蛋白酶体活性和其它Ntn水解酶活性的试剂，从而用作探针以研究这些酶在生物过程中的作用。本文描述、合成并研究了靶向Ntn水解酶的化合物。本文公开了能够有效地、选择性地、不可逆地抑制特定蛋白酶体活性的肽环氧化物和肽氮丙啶，并且要求保护这些化合物。与其它几种基于肽的抑制剂不同，本文描述的肽环氧化物和肽氮丙啶在高达50 μ M的浓度下不会明显抑制非蛋白酶体的蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶和钙蛋白酶。在更高浓度时，可能会观察到抑制作用，但是如果所述抑 制剂仅仅与底物竞争，将是竞争性的且可逆的抑制。新的肽环氧化物和肽氮丙啶还可抑制NF-κ B激活以及稳定细胞培养物中的ρ53水平。此外，这些化合物具有抗炎活性。因而，这些化合物可以是独特的多功能分子探针，用于研究Ntn酶在正常生物过程及病理过程中的功能。一方面，本发明提供含有三元杂环的抑制剂。这些抑制剂在约50 μ M以下的浓度时，可以抑制N端亲核水解酶(例如20S蛋白酶体或26S蛋白酶体)的催化活性。关于20S蛋白酶体，特定的水解酶抑制剂在约5μΜ以下的浓度时，抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，而不会抑制20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性或PGPH活性。所述水解酶抑制剂可以是例如肽α ’，β ’ -环氧酮或α ’，β 氮丙啶酮，所述肽可以是四肽。所述肽可以包含支链或直链的侧链，例如氢、C1^6烷基、CV6羟基烷基、C1^6烷氧基烷基、芳基、C1^6芳烷基、C1-S烧基酸胺、Cu烧基胺、CV6竣酸、Cu竣基酷、CV6烧基硫醇或CV6烧基硫酿，例如异丁基、
I-萘基、苯基甲基和2-苯基乙基。α’，β’-环氧酮或α’，β’-氮丙啶酮的α’-碳可以为手性碳原子，例如(R)或β构型的碳，正如本文定义的手性碳原子。另一方面，本发明提供药物组合物，其中包含药学上可接受的载体和药用有效量的水解酶抑制剂，它改善神经变性性疾病(例如阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease))、肌肉萎缩病、癌症、慢性传染病、发热、肌肉废用、去神经、神经损伤、禁食和免疫相关性疾病等的效应。另一方面，本发明提供抗炎组合物。另一方面，本发明提供以下的方法抑制或减轻患者的HIV感染；影响患者的病毒基因表达水平；改变生物体的蛋白酶体产生的各种抗原肽；测定生物体的细胞、发育或生理过程或输出量是否由特定Ntn水解酶的蛋白水解活性调节；治疗患者的阿尔茨海默病；降低细胞的肌肉蛋白降解速率；降低细胞的胞内蛋白降解速率；降低细胞的P53蛋白降解速率；抑制患者的P53相关性癌生长；抑制细胞的抗原呈递；抑制患者的免疫系统；抑制生物体的ΙκΒ-α降解；减少细胞、肌肉、器官或患者的NF-κ B含量；影响细胞周期蛋白依赖性真核细胞周期；治疗患者的增殖性疾病；影响细胞的癌基因蛋白的蛋白酶体依赖性调节；治疗患者的癌生长；治疗患者的Ρ53相关性细胞凋亡；筛选细胞的N端亲核水解酶加工的蛋白。所有上述方法都包括对患者、细胞、组织、器官或生物体给予或使其接触有效量的含有本文公开的水解酶抑制剂的组合物。根据下面的发明详述和所附的权利要求书，本发明的其它特征和优点将会是显而易见的。发明详沭本发明涉及可用作酶抑制剂的化合物。这些化合物通常可用于抑制在N端具有亲核基团的酶。例如，含有在侧链具有亲核基团的N端氨基酸(例如苏氨酸、丝氨酸或半胱氨酸)的酶或酶亚基的活性，可以被本文描述的酶抑制剂成功地抑制。在N端具有非氨基酸亲核基团(例如保护基或糖基)的酶或酶亚基的活性，也可以被本文描述的酶抑制剂成功地抑制。
虽然不希望受任何具体理论的束缚，但是认为Ntn的N端亲核基团与本发明酶抑制剂的环氧官能团形成共价加合物。例如，在20S蛋白酶体的β 5/Pre2亚基中，一般认为，N端苏氨酸在与下文描述的肽环氧化物或肽氮丙啶反应后，不可逆地形成吗啉代或哌嗪基加合物。以上加合物形成过程将涉及环氧化物或氮丙啶的开环裂解。在含有连接至α ’碳的基团的实施方案中，α 碳(构成环氧环或氮丙啶环部分的碳)的立体化学构型可以是(R)或(S)。本发明在某种程度上基于本文公开的结构-功能信息，这些信息表明了下述的优选立体化学关系。注意，优选的化合物可能含有多个立体中心，这些立体中心具有所指出的上-下关系(或者关系，其中图示的β在纸平面之上)或(R)-(S)关系(即不需要化合物中所有立体中心都符合指出的优选状态)。在某些优选实施方案中，α ’碳的立体化学结构是(R)，即X原子为β或在分子平面之上。关于立体化学结构，遵循测定绝对立体化学结构的Cahn-Ingold-Prelog规则。例如，QrRanic Chemistry (Fox 和 Whitesell ；Jones and Bartlett Publishers, Boston,MA(1994);第5-6节，第177-178页，该节内容通过引用结合到本文中)介绍了这些规则。肽类可以具有重复的主链结构，侧链从主链单元延伸出来。通常，每个主链单元都有与其连接的侧链，虽然在某些情况下，侧链是氢原子。在其它实施方案中，并不是所有主链单元都连接有侧链。可用于肽环氧化物或肽氮丙啶的肽具有两个以上的主链单元。在某些可用于抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样(CT-L)活性的实施方案中，存在2-8个主链单元，而在某些可用于CT-L抑制的优选实施方案中，存在2-6个主链单元。从主链单元伸出的侧链可包括天然脂族或芳族氨基酸侧链，例如氢(甘氨酸)、甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、仲丁基(异亮氨酸)、异丁基(亮氨酸)、苯基甲基(苯丙氨酸)以及构成氨基酸脯氨酸的侧链。侧链还可以是其它支链或直链的脂族或芳族基团，例如乙基、正丙基、正丁基、叔丁基和芳基取代的衍生基团，例如I-苯基乙基、2-苯基乙基、(1_萘基)甲基、(2-萘基)甲基、1_(1_萘基)乙基、1_(2_萘基)乙基、2_(1_萘基)乙基、2-(2-萘基)乙基和类似组合基团。所述芳基可以被以下基团进一步取代支链或直链CV6烷基、取代的烷基、乙酰基等，或者其它芳基或取代的芳基(例如苯甲酰基等)。杂芳基也可用作侧链取代基。杂芳基包括含氮、氧和硫的芳基，例如噻吩基、苯并噻吩基、萘并噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、喷噪基、嘿吟基、喧琳基等。在某些实施方案中，极性或带电残基可以被引入肽环氧化物或肽氮丙啶。举例来讲，可以引入天然存在的氨基酸，例如含羟基氨基酸(Thr、Tyr, Ser)或含硫氨基酸(Met、Cys)，以及非必需氨基酸，例如氨基乙磺酸、肉碱、瓜氨酸、胱氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸等。也可以包含非天然存在的含带电或极性部分的侧链取代基，例如含一个或多个羟基、短链烷氧基、硫基、硫代、竣基、酷基、_■氧憐基、酸胺基或氣基的CV6烧基或C6_12芳基，或者被一个或多个卤素原子取代的上述取代基。在某些优选实施方案中，在肽部分的侧链上存在至少一个芳基。在部分实施方案中，主链单元为酰胺单元[_NH-CHR-C( = O)-]，其中R为侧链。这样的表示方法没有排除天然存在的氨基酸脯氨酸或其它非天然存在的环状仲氨基酸，本领域技术人员能够理解这一点。在其它实施方案中，主链单元为N-烷基化酰胺单元(例如N-甲基等)、烯烃类似物(其中一个或多个酰胺键被烯键置换)、四唑类似物(其中四唑环使主链呈顺式构型)、或者这些主链键的组合。在另外一些实施方案中，氨基酸α-碳被α-烷基取代修饰，例如氨基异丁酸。在另外一些实施方案中，侧链被局部修饰，例如通过ΛΕ或Az脱氢修饰，其中双键位于侧链的α和β原子之间，或者例如通过ΛΕ或ΛΖ环丙基修饰，其中 环丙基位于侧链的α和β原子之间。在另外一些利用氨基酸基团的实施方案中，可以使用D-氨基酸。其它实施方案可以包括侧链与主链环化、形成二硫键、形成内酰胺、形成偶氮键以及下述文献阐述的其它修饰Hruby和Boteju :“PeptideS and Mimics, Designof Conformationally Constrained”，Robert A. Meyers 主编,Molecular Biology andBiotechnology A Comprehensive Desk Reference”，VCH Publishers(1995),第 658-664页，通过引用结合到本文中。本发明一方面涉及具有结构式(I)的化合物或其药学上可接受的盐
权利要求
1.一种具有下式(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐
2.权利要求I的化合物，其中X为OA1、! 2和R3独立选自Cu烷基和CV6芳烷基；R7和R8独立选自氢和C1^烷基。
3.权利要求2的化合物，其中R1和R3均为C^6烷基；R2为CV6芳烷基；R7和R8独立选自氢和甲基。
4.权利要求3的化合物，其中R1和R3均为异丁基、R2为苯基甲基，R7和R8均为氢。
5.权利要求4的化合物，其中R5为氢，L为C=O或SO2,R6为Ar-Y-0
6.权利要求5的化合物，其中各个Ar独立选自苯基、吲哚基、苯并呋喃基、萘基、喹啉基、喹诺酮基、噻吩基、吡啶基和吡唑基。
7.权利要求I的化合物，其中Ar被Ar-Q-取代，Q选自化学键、-O-和C^6烷基。
8.权利要求5的化合物，其中Z为Cu烷基。
9.权利要求8的化合物，其中Z被Ar取代。
10.权利要求9的化合物，其中Ar为苯基。
11.权利要求4的化合物，其中R5为氢，L为C=O或S02，Z不存在，R6选自Ar-Y和杂环基。
12.权利要求11的化合物，其中R5选自色酮基、苯并二氢吡喃基、吗啉代和哌啶基。
13.权利要求11的化合物，其中R6为Ar-Y，Ar选自苯基、吲哚基、苯并呋喃基、萘基、喹啉基、喹诺酮基、噻吩基、吡啶基和吡唑基。
14.权利要求4的化合物，其中R5为氢，L为C=O或SO2,Z不存在，R6为C1^6烯基。
15.权利要求14的化合物，其中Cm烯基为取代的乙烯基。
16.权利要求15的化合物，其中所述取代基为芳基或杂芳基。
17.权利要求16的化合物，其中所述取代基为任选被1-4个取代基取代的苯基。
18.—种药物组合物，该组合物包含权利要求1-17中任一项的化合物以及药学上可接 受的载体。
19.一种抑制N端亲核水解酶的方法，其中所述抑制剂在约5 μ M以下的浓度时，所述抑制剂抑制所述20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，而不会抑制所述20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性或肽基谷氨酰肽水解(PGPH)活性。
20.一种治疗炎症的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
21.—种抑制或减轻HIV感染的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
22.—种治疗神经变性性疾病的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
23.一种治疗肌肉萎缩病的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
24.一种治疗癌症的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
25.一种治疗慢性传染病的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
26.一种治疗过度增殖性疾病的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
27.一种治疗肌肉废用的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
28.一种治疗免疫相关性疾病的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
29.一种影响患者病毒基因表达水平的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
30.一种改变生物体的蛋白酶体产生的各种抗原肽的方法，该方法包括给予治疗有效量的权利要求1-17中任一项的化合物。
全文摘要
含有三元杂环、基于肽的化合物能有效地选择性抑制特异性N端亲核(Ntn)水解酶活性。所述化合物能够不同程度地抑制具有多种活性的Ntn的各种活性。例如，本发明化合物可以选择性抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。所述基于肽的化合物包括环氧化物或氮丙啶，并且在N端官能化。所述基于肽的化合物除了具有其它治疗用途以外，还具有抗炎特性和细胞增殖抑制作用。
文档编号C07K5/06GK102875642SQ20121036101
公开日2013年1月16日 申请日期2005年5月9日 优先权日2004年5月10日
发明者M.S.史密斯, G.J.莱迪, R.T.博尔查德特, B.A.布宁, C.M.克鲁斯, J.H.穆塞尔, K.D.申克, P.A.拉德尔 申请人:普罗特奥里克斯公司