专利名称：利西拉来的纯化方法
技术领域：
本发明属于药物化学领域，具体涉及利西拉来的纯化方法。
背景技术：
糖尿病是一种全球性的高发病，其主要分为I型和II型,后者占糖尿病患者总数的90%以上。通过胰高血糖素样肽I (GLP-I)受体拮抗剂利西拉来(Lixisenatide)联合基础胰岛素来治疗II型糖尿病患者，可显著改善其血糖控制，并提高其餐后血糖(PPG)的控制。 利西拉来是由43个氨基酸残基组成的长链多肽，而且肽序列中有如Ser、His、Pr0等在多肽固相化学合成过程中易异构化的氨基酸而导致利西拉来粗肽中含有很多异构体杂质。因此利西拉来的分离纯化成为该药品制备工艺中的技术难点，尤其是大规模制备的利西拉来的纯化已成为制约其产业化的瓶颈之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种利西拉来的纯化方法，尤其是通过多肽固相化学合成方法而大规模制备的利西拉来的纯化方法。本发明的利西拉来的纯化方法包括以下步骤步骤I :采用高效液相色谱(HPLC)方法对利西拉来粗肽进行纯化，所述HPLC方法以苯基硅烷键合硅胶为固定相，以D-酒石酸盐的甲醇/磷酸盐缓冲溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱；步骤2 :采用HPLC方法对步骤I所得到的馏分进行转盐纯化，所述HPLC方法以烷基硅烷键合硅胶为固定相，以冰醋酸溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱；步骤3 :收集溶液冻干。本发明通过采用以苯基硅烷键合硅胶为固定相，在流动相中加入D-酒石酸盐和质子给予体甲醇的HPLC方法纯化，可以一次性将利西拉来粗肽中的异构体杂质和其他难分离杂质很好地分离而去除。然后利用反相HPLC方法转成醋酸盐API，提高了产品的收率和纯度。此外，该纯化方法操作简便，有利于实现规模化制备的利西拉来的纯化。
图I实施例I中的利西拉来纯化后的色谱图。
具体实施例方式本发明的利西拉来的纯化方法包括以下步骤步骤I :采用HPLC方法对利西拉来粗肽进行纯化，所述HPLC方法以苯基硅烷键合硅胶为固定相，以D-酒石酸盐的甲醇/磷酸盐缓冲溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱；步骤2 :采用HPLC方法对步骤I所得到的馏分进行转盐纯化，所述HPLC方法以烷基硅烷键合硅胶为固定相，以冰醋酸溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱；步骤3 :收集溶液冻干。所述步骤I中的HPLC方法的流动相A相中的D-酒石酸盐的摩尔浓度优选为10mM 50mM。所述步骤I中的HPLC方法的流动相A相中的D-酒石酸盐优选为一种或多种选自D-酒石酸钠、D-酒石酸钾、D-酒石酸铵的D-酒石酸盐。·所述步骤I中的HPLC方法的流动相A相中的磷酸盐的摩尔浓度优选为20mM"50mMo所述步骤I中的HPLC方法的流动相A相中的磷酸盐优选为一种或多种选自磷酸
钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸铵或磷酸二氢铵的磷酸盐。所述步骤I中的HPLC方法的流动相A相溶液的pH优选为2. (Γ4. O。 所述步骤I中的HPLC方法的流动相A相中的甲醇占整个流动相A相的体积比优选为 10 20% (v/v)。所述步骤I中的HPLC方法的梯度按照流动相A相的百分比为
(75-85) %A 3a— > ( 55-65 ) %根据保留时间可适当调整。所述步骤2中的HPLC方法的流动相A相中的冰醋酸水溶液的体积百分浓度优选为 O. Γ0. 3% (v/v)。所述步骤2中的HPLC方法的固定相优选为八烷基硅烷键合硅胶、六烷基硅烷键合硅胶或四烷基硅烷键合硅胶。所述步骤2中的HPLC方法的梯度为95%A+S%B20_ >95%A+5%B」^85%A+15%B 2°_ >65%A+35%B，根据保留
时间可适当调整。本发明的纯化方法操作简单，从而使得操作成本低。此外，本发明的纯化方法中的利西拉来收率高，从而适合于利西拉来的大规模产业化生产，并且经纯化得到的利西拉来纯度高、杂质含量低，因此具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。实施例以下通过实施例对本发明进行详细说明。在以下实施例中，利西拉来含量的测定按照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)进行。色谱条件与系统适用性试验所用色谱柱以苯基硅烷键合硅胶作填充剂，色谱柱规格为4. 6*250mm，所填充的苯基硅烷键合硅胶的粒径为5μπι;以O. lmol/L磷酸铵缓冲液(取磷酸二氢铵11. 5g，加水至1000ml，用磷酸调节pH为2. 5)为流动相A相，以色谱纯乙腈为流动相B相，按下表I进行梯度洗脱；流速为I. Oml/分钟，检测波长为220nm，柱温为50°C ;理论板数按利西拉来峰计算应不低于5000。
利西拉来含量的测定方法准确称取适量利西拉来粗品，加水制成含2. Omg/ml利西拉来粗品的溶液作为供试品溶液，另准确称取适量利西拉来对照品，加水制成含I. Omg/ml利西拉来对照品的溶液作为对照品溶液；取对照品溶液和供试品溶液各20 μ I分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积按外标法计算，即得到利西拉来的含量。表I利西拉来含量测定的色谱法中的洗脱梯度
时间(分钟)_流动相A相(％)_流动相B相(％ )
0-4080-6020-40 40-4560-3040-70
45-543070
54-5530-8070-20
55-60_80_20_实施例I将利西拉来粗肽4. Og (含利西拉来I. 08g)用纯化水200ml溶解,过滤,收集滤液备用。纯化色谱条件高效液相色谱仪型号Waters 2545色谱柱50X250mm，内装苯基硅烷键合硅胶为固定相填料，该填料的粒径为10 μ m0流速80ml/分钟。检测波长280nm。流动相A相IOmM D-酒石酸铵和30mM磷酸二氢铵的20%甲醇/80%水溶液(v/v)，用磷酸调pH为2. O。流动相A相配制过程称取18. 4g D-酒石酸铵和34. 5g磷酸二氢铵，适量纯化水溶解后过O. 45 μ m滤膜过滤，滤液全部收集到IOL血清瓶，加入2L色谱纯甲醇后加纯化水至IOL刻度，用磷酸调pH为2.0。流动相B相色谱纯乙腈。梯度82%A+18%B3^mn > 62%A+38%B上样量2.Og(IOOml)。纯化过程使色谱柱平衡5分钟后上样，运行梯度纯化，监测并分段收集目的峰馏分。对所收集的馏分进行纯度检测(纯度检测的色谱条件与上述利西拉来含量测定的条件相同，以面积归一化法进行测定)，将纯度大于等于98%的馏分除去大部分乙腈后用于转盐；将纯度大于等于70%小于98%的馏分除去大部分乙腈后回收并重复该纯化过程，再次收集纯度大于等于98%的馏分除去大部分乙腈后也用于转盐；纯度小于70%的馏分按废液处理。分两次进样，重复以上操作。转盐色谱条件
高效液相色谱仪型号Waters 2545色谱柱50 X 250mm,内装反相C8色谱填料，该填料的粒径为10 μ m。流速80ml/分钟。检测波长280nm。流动相A相0. 10%冰醋酸(v/v)溶液。流动相B相色谱纯乙腈。
权利要求
1.一种利西拉来的纯化方法，其包括以下步骤 步骤I:采用高效液相色谱法对利西拉来粗肽进行纯化，所述高效液相色谱法以苯基硅烷键合硅胶为固定相，以D-酒石酸盐的甲醇/磷酸盐缓冲溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱； 步骤2 :采用高效液相色谱法对步骤I所得到的馏分进行转盐纯化，所述高效液相色谱法以烷基硅烷键合硅胶为固定相，以冰醋酸溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱； 步骤3 :收集溶液冻干。
2.权利要求I的方法，其中所述步骤I中高效液相色谱法的流动相A相中的D-酒石酸盐的摩尔浓度为10mlT50mM。
3.权利要求I的方法，其中所述步骤I中高效液相色谱法的流动相A相中的D-酒石酸 盐为一种或多种选自D-酒石酸钠、D-酒石酸钾、D-酒石酸铵的D-酒石酸盐。
4.权利要求I的方法，其中所述步骤I中高效液相色谱法的流动相A相中的磷酸盐的摩尔浓度为20mM 50mM。
5.权利要求I的方法，其中所述步骤I中高效液相色谱法的流动相A相中的磷酸盐为一种或多种选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸铵或磷酸二氢铵的磷酸盐。
6.权利要求I的方法，其中所述步骤I中高效液相色谱法的流动相A相溶液的pH为2. 0 4· O。
7.权利要求I的方法，其中所述步骤I中高效液相色谱法的流动相A相中的甲醇占整个流动相A相的体积比为10 20%。
8.权利要求I的方法，其中所述步骤2中高效液相色谱法的流动相A相中的冰醋酸溶液的体积百分浓度为O. Γ0. 3%。
9.权利要求I的方法，其中所述步骤2中高效液相色谱法的固定相为八烷基硅烷键合硅胶、六烷基硅烷键合硅胶或四烷基硅烷键合硅胶。
全文摘要
本发明涉及一种利西拉来的纯化方法，其包括以下步骤步骤1采用高效液相色谱法对利西拉来粗肽进行纯化，所述高效液相色谱法以苯基硅烷键合硅胶为固定相，以D-酒石酸盐的甲醇/磷酸盐缓冲溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱；步骤2采用高效液相色谱法对步骤1所得到的馏分进行转盐纯化，所述高效液相色谱法以烷基硅烷键合硅胶为固定相，以冰醋酸溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱；步骤3收集溶液冻干。
文档编号C07K14/575GK102875663SQ20121036363
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者覃亮政, 刘建, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司