专利名称：一种调控植物叶片衰老的转录因子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控植物叶片衰老的转录因子及其应用。
背景技术：
叶片衰老是作物生长发育的一个关键环节，是一个受到严格调控的生理生化和分子生物学过程，不仅受到植株和叶片的发育进程影响，也受到外界环境因子的影响[Chandlee JM, et al, Physiologia Plantarum, 113: 1-8, 2001; Gepstein S， etal, Genome Biology, 5(3): 212, 2004; Nam HG, Trends Plant Sci, 8(6): 272-277， 2003]。叶片衰老的启动以后，光合功能迅速衰退，取而代之的是积累在叶片中的大分子营养物质被快速降解并高效地转运到新生或忙藏器官中[Nam HG, Curr Opin Biotech,8: 200-207， 1997; Nam HG, Annu Rev Plant Biol, 58: 115-136， 2007; Smart CM,New Phytolj 126: 419-448， 1994; Yoshida S. Current Opinion in Plant Biology,6: 79-84，2003]。因而，叶片衰老启动的时间节点关乎到作物的光合总量和营养物质的再利用效率，即启动过早会减少光合产物(干物质)的积累，而启动过晚则减少营养物质的再动员(remobilization)。研究表明，一些情况下,适当地延缓叶片衰老不仅可以增加作物的产量潜力，而且还能够提高作物的抗逆性[Rivero RM，et al, PNAS, 104(49):19631-19636，2007];另一些情况下，适当地加速叶片衰老不仅可以提高作物在逆境中的收获产量和质量，也可以提高植株水平上的抗逆(旱)性(Munne B, et al, FunctionalPlant Biology, 31: 203-216，2004)。因此，发掘叶片衰老启动及其进程的关键调控因子，建立它们在遗传改良上的应用模式，在作物的遗传改良上具有重要的应用前景。NAC是高等植物中所特有的一类转录因子，其命名来源于上世纪90年代发现的3个基因矮牵牛基因、拟南芥47 / / 和基因[Aida M, et al, Plant Cell, 9(6):841 - 857，1997]。NAC转录因子最主要的结构特点是各成员的N端含有高度保守的NAC结构域，整个N端区域可划分为5个亚结构域(A、B、C、D、E)，其中亚结构域A、C、D高度保守，亚结构域C、D序列中含有核定位信号(nuclear localization signals, NLS),可能与转录因子核定位及启动子上特定顺式元件的识别有关[Kikuchi K, et al, Mol Gen Genet, 262(6):1047-1051, 2000 ；0oka H, et al, DNA Res, 10(6) : 239-247，2003]。E 亚结构域在 NAP、AtNAC3、ATAF 和 0sNAC3 亚家族中高度保守[Ooka H, et al, DNA Res, 10(6) : 239-247，2003] ο C 端是转录激活功能区(transcrip tional activation regions, TARs),具有高度的多样性，该端的共同特点是一些氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸重复出现的频率高。2003年，Ooka等通过全基因组分析，在拟南芥中发现105个NAC转录因子，在水稻中则发现75个NAC成员。通过比较NAC结构域的氨基酸序列，将它们分成2个大族，3个亚族(08應034了八 ，應10。根据近几年报道，NAC家族又被划分为为5个亚族(0sNAC3，ATAF,NAM, AtNAC3, NAP)。
NAC转录因子在植物顶端分生组织及花器官分化[Sablowski RWM, et al, Cell,92 (I): 93-103，1998]、侧根形成[Mitsuda N, et al, Plant Cell, 17(11) : 2993-3006，2005]、次生壁增厚[Xie Q, et al, Genes Dev, 14 (23): 3024-3036, 2000]等植物特定发育过程以及抵抗生物(Hegedus D, et al, Plant Mol. Biol, 53: 383-397，2003)与非生物胁迫过程(Nogueira FT, et al, Plant Science, 169: 93-106，2005)中均起着重要作用，NAC转录因子在植物衰老进程也起着重要的调控作用[Guo YF, Gan S，Plant Journal, 46 (4) :601-612, 2006]。研究表明，NAC转录因子在植物的生长发育、器宫建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。相较于MYB类、bZIP类及WRKY类的转录因子，NAC转录因子的相关研究较少。AtNAP是拟南芥NAC家族中的一种转录因子。Guo等[Guo YF, Gan S，PlantJournal, 46(4) : 601-612, 2006]研究发现，AtNAP在调控拟南芥衰老过程中起着重要的\\作用；AtNAP仅在衰老叶片中表达，且AtNAP的表达量与叶片的衰老程度成正相关，变化趋势与衰老标志基因说似J相一致；拟南芥突变体部无论是在自然生长状态下还是在黑暗诱导状态下均出现叶片衰老滞后表型；诱导AtNAP过表达时，转基因植株出现明显的提前衰老现象；进一步研究发现水稻、四季豆的NAP皆能异源互补拟南芥突变体atoa/ 的滞绿表型，说明NAP转录因子在调控植物衰老中起着重要的作用。此后NAC家族其它成员在衰老过程中的作用不断被发现。Kim等发现突变体ore7衰老延缓的表型是由基因^⑶似突变造成的，OREl的表达随衰老进程上调，而在转录后水平调控OREl的miR164在衰老过程中受到抑制[Kim JH，et al, Science,322(5917) : 1053-1057, 2009] 'OREl的同源基因ORSl也在衰老过程中发挥着积极作用，ORSl过表达株系衰老提前，而ORSl的表达被抑制后衰老进程也相应的延迟，此外ORSl的表达受 H202 高度诱导[Balazadeh S，et al, Molecular Plant, 4(2): 346-360，2011]；VNI2不但调控木质部导管的形成，而且能够整合ABA介导的非生物胁迫响应，在衰老过程中发挥着重要作用，VNI2在衰老中发挥负调控作用，突变体衰老加速，而过表达VNI2可以延缓衰老[Yang SD, et al, Plant Cell, 23(6) : 2155-2168，2011];新近发现的另一个H202响应的NAC类转录因子JUBl同样是一个衰老的负调控因子，JUBl可能通过调节胞内H202的水平而调控系统的衰老进程[Wu AH, et al, Plant Cell, 24(8) : 482-506，2012]。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够调控植物叶片衰老的转录因子及其应用。本发明提供的能够调控植物叶片衰老的植物转录因子，具体为ANAC072蛋白，来源于拟南芥、油菜等物种，见图2所示，但不局限于这些物种，包括与拟南芥UrahWoASi1S
)中ANAC072 (NCBI基因登录号为At4g27410，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)的同源性高于30%的类似蛋白。本发明所提供的拟南芥衰老相关转录因子，是具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 2衍生的蛋白质。
本发明的拟南芥ANAC072转录因子的编码基因，是下列核苷酸之一 I) SEQ ID NO: I所示的DNA序列。2)编码SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多核苷酸。序列表中SEQ ID NO :1由973个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第I位至945位碱基；序列表中SEQ ID NO 2由314个氨基酸残基组成。本发明还涉及所述植物叶片衰老相关转录因子ANAC072蛋白的编码基因的表达载体。本发明还涉及所述拟南芥叶片衰老相关转录因子ANAC072的编码基因的细胞系。含有本发明基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围。本发明的基因在 调控植物叶片衰老性状、提高作物产量中可有重要应用。
图I为拟南芥ANAC072与其它拟南芥NAC家族转录因子系统发生树。图2为拟南芥ANAC072与其它植物该衰老相关转录因子的进化树分析。图3为黑暗处理6天后野生型拟南芥和突变体的离体叶片衰老表型。图4为正常生长34天后Co I-O、anac072~l和anac072-2的第3、4片真叶中ANAC072的表达情况。图5为正常生长34天的状态下Col-Q、anac072_l的离体叶片表型。图6为正常生长40天的状态下Co\_Q、anac072_l和anac072_2的自然生长状态的衰老表型。图7为正常生长40天后CoH、anac072_l和mac072-2的离体叶片衰老表型。
具体实施例方式实施例I :拟南芥转录因子ANAC072插入突变体材料的获得
I.I拟南芥材料准备
取在16h L/8h D光照，23°C条件下培养20天的拟南芥叶片。1.2 RNA 提取
取拟南芥材料约O. lg。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加Iml TRIzoKinvitrogen公司),混勻后,室温放置15分钟,加O. 2ml氯仿:异戍醇(24:1),剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经O. 1% DEPC处理过的ddH20水中，贮存于_80°C备用。I. 3 cDNA第一链合成和反转录PCR
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2Pg制备的总RNA，0. 5μ1 Rnaseinhibitor,加 DEPC 处理过的去离子水至 8· 5μ1, 2μ1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C, 5min,室温放置 IOmin, 13000rpm 简短离心 5s。再依次加入 4μ1 5 X First-Strand buffer, 0. 5M-1RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-1 dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37°C反转录I小时，90°C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离心5秒钟，存放于_20°C待用。I. 4 anac072~l插入突变体材料的鉴定
根据 TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 ANAC072 全长 CDS 序列及插入位点，设计了三条引物 ANAC072-LB (5，GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’)、ANAC072-LP (5，AGTGATCGAGTGCTTCAGGAC 3’)和 ANAC072-RP (5，ACTCGTGCATAATCCAGTTGG 3’)作为 PCR 反应的引物。PCR反应体系为50μ1，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，55°C复性40s，72°C延伸70s，循环35次，72°C充分延伸5min。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，得到纯合突变体材料。1.5插入突变体材料的鉴定
根据 TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 ANAC072 全长 CDS 序列及插入位点，设计了三条引物 ANAC072-LB (5，GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’)、ANAC072-LP (5，CTGGGCTAACGGATCTTTCTC 3’ )和 ANAC072-RP (5， GCTACATTTGTGAGATAATCTTAATGG 3’ )作为PCR反应的引物。PCR反应体系为50μ1，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s， 55°C复性40s，72°C延伸70s，循环35次，72°C充分延伸5min。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，得到纯合突变体材料。实施例2 :拟南芥转录因子ANAC072功能分析
2.I序列比较分析
用Genedoc软件分析了 ANAC072与其他拟南芥NAC家族蛋白的同源性，结果表明ANAC072具有典型保守的NAC domain,如图I所示。我们利用软件建立了 ANAC072同其他拟南芥NAC家族蛋白的系统发生树，其中ANAC072与ANACO19、ATNAC3的亲缘关系最近。而后，我们发现在油菜、大豆、杨树等植物中存在与ANAC072同源性较高的蛋白，如油菜BnNAC485与拟南芥ANAC072有很高的同源性。图2展示了植物中ANAC072蛋白的系统进化关系。2. 2.突变体叶片衰老指标分析
2.2. I拟南芥基质培养
基质组分蛭石黑土 珍珠岩9 : 3 : 0. 5 营养液组分
权利要求
1.一种植物叶片衰老相关转录因子，其特征在于为ANAC072蛋白，来源于拟南芥或油菜物种，包括与拟南芥中ANAC072蛋白的同源性高于30%的类似蛋白，ANAC072蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一种拟南芥叶片衰老相关转录因子ANAC072的编码基因，其特征在于是下列核苷酸之一 1)SEQ ID NO: I所示的DNA序列； 2)编码SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.含有权利要求I所述植物叶片衰老相关转录因子ANAC072蛋白的编码基因的表达载体。
4.含有权利要求2所述拟南芥叶片衰老相关转录因子ANAC072的编码基因的细胞系。
5.如权利要求I所述植物叶片衰老相关转录因子ANAC072蛋白在延缓叶片衰老从而提高作物产量的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控植物叶片衰老的转录因子及其应用。本发明所提供的植物ANAC072蛋白，来源于拟南芥、油菜等物种，但不局限于这些物种，包括与拟南芥中ANAC072蛋白(氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)的同源性高于30%的类似蛋白。拟南芥ANAC072转录因子的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQIDNO:1；2)编码序列表中SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸。本发明涉及的蛋白将在植物延缓叶片衰老从而提高作物产量方面提供基因资源和方法。
文档编号C07K14/415GK102850446SQ20121036631
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者蒯本科, 高炯, 李收, 梁宁菁 申请人:复旦大学