专利名称：双峰驼褪黑素受体、编码基因及其获取方法
双峰驼褪黑素受体、编码基因及其获取方法所属技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种在双峰驼褪黑素受体、编码基因及其获取方法。
背景技术：
褪黑素(melatonin，MT)是由动物脑部的松果体细胞在暗环境下所分泌的吲哚类激素，其化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺。它的生理功能是由褪黑素受体(melatonin acceptor,MTR)介导的，松果体是生物钟的重要组成部分，通过分泌褪黑素的节律性改变来影响许多组织、腺体的代谢功能。因此，研究褪黑素及其受体作用机制、作用靶器官等对于揭示、提高和调控动物许多生理机能具有重要的基础研究价值。研究发现，MTR是一种具有多种生物学功能的蛋白质并与医学有着重要的关系。主要存在于肠组织上。MTR与MT特异性结合，通过信号转导系统产生生物学效应。MT可影响哺乳动物次级毛囊和毛绒生长，能够刺激体外培养的哺乳动物次级毛囊纤维生长，可调节生殖系统发育和功能，同时可以诱导皮毛提如成熟，提闻毛续广量。
褪黑素受体的研究，在2008年，李子海等人研究了褪黑素对毛发生长的影响就， 表明不同浓度的褪黑素对毛发生长和毛发颜色的影响不同。2011年，陈建波等人就褪黑素受体对绒山羊绒毛生长的影响及其作用机理作了研究，结果表明褪黑激素对绒山羊绒毛生长具有促进作用，褪黑激素是通过影响类胰岛素生长因子或催乳素的分泌间接影响绒毛生长；是通过调控皮肤组织中脱碘酶基因表达或者改变皮肤中催乳素受体基因可变剪接规律影响绒毛生长。
在双峰驼中，褪黑素受体具有广泛的生物学功能，尤其对动物毛发生长周期、换毛等其它生物节律和免疫活动等都具有重要的调节作用。因此，对骆驼褪黑素受体的研究将有助于细胞生物学和医学的发展。发明内容
一种双峰驼褪黑素受体，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO. 2 所示序列；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的，且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
一种双峰驼褪黑素受体编码基因，该序列是与毛囊发育和毛色形成密切相关的基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO.1 所示序列；
(b)由碱基简并或/和替代衍生的与(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且与 (a)编码相同功能蛋白质的序列。
本发明还提供了一种双峰驼褪黑素受体基因的克隆和测序方法，该方法包括步骤(I)组织分离(Isolation) ； (2)总 RNA 的分离(Total RNA isolation)包括①提取 RNA 的准备工作组织总RNA提取组织总RNA的鉴定。(3)全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括①引物设计及合成RT-PCR扩增；③克隆和测序，其特征在于 PCR引物的正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID NO. 4 01igo dT ；
上述从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA为将双峰驼耳部组织放入装有Trizol 的匀浆器管中匀浆，离心分离，吸取上清液，在15-30°C温育5分钟，加氯仿，剧烈震荡，继续在15-30°C温育2-3分钟，再次离心分离，吸取上清液，加异丙醇混合均匀，然后15-30°C温育10分钟，离心分离，所得沉淀物加75%乙醇洗涤，离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖电泳分析RNA的质量。
上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。
上述克隆和测序包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。
上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。
上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒。
上述质粒的转化为将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中，冰浴 30分钟，然后在42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加液体LB培养基，37°C 复活50分钟，后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上，37°C恒温培养10-15小时。
上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落，放入到加有PCR反应液的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同 Marker 一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落，放入含有的青霉素钠LB液体培养基中，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。
上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定，选择内切酶Bam H I和Hin d III。
本发明在提供了双峰驼褪黑素受体基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上；将人、鼠、牛等不同物种褪黑素受体基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的8个物种的八个褪黑素受体基因的CDS序列构建了系统发生树。本发明是通过以下技术方案实现的
本发明中的双峰驼褪黑素受体基因的cDNA序列是通过以双峰驼耳部组织中总 RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的褪黑素受体基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR 而获得的新基因序列。获得的双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见 SEQ ID NO. 2。
在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为1140bp，电泳结果见附图1，其中19-21位为起始密码子ATG，1105-1107位为终止密码子TAA，19-1107位为编码蛋白质区域(OTS)。 在SEQ ID NO.1，双峰驼褪黑素受体基因编码362个氨基酸。双峰驼与褐家鼠(AAG18471.1) 的褪黑素受体核酸序列具有94%的相似性。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的褪黑素受体基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。
对包括SEQ ID NO.1在内的8个物种的八条褪黑素受体基因的⑶S序列构建了系统发生树，结果发现双峰驼褪黑素受体同褐家鼠的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼褪黑素受体基因。
本发明所得到的褪黑素受体蛋白的基因序列和该蛋白结构的数据可用于研究其在黑素合成的下游途径中的重要作用，为阐明双峰驼绒毛生长机理和未来产生人为控制绒毛产量提供理论基础和依据，并能够为其它哺乳动物的绒毛生长机理研究奠定一定的生物学基础。
图1为双峰驼褪黑素受体基因RT-PCR产物电泳图2为构建系统发生树所用褪黑素受体氨基酸同源性比较；
图3为不同物种褪黑素受体氨基酸序列系统进化树。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1:双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列的克隆
1、组织分离(Isolation)
从内蒙古阿拉善盟双峰驼，快速采得样品，将耳部组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
2、总 RNA 的分离(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的准备工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍， 180°C烘烤4小时。
匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0.1 %的DEPC水冲洗。由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5%的SDS处理。
Tip头、EP管用0.1 %的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜， 高压灭菌30分钟DEPC失活。
(2)组织总RNA提取
取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有 Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000rpm离心10分钟。吸取上清液，15_30°C温育5分钟。 加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒。15-30°C温育2-3分钟。4°C 12000rpm离心 15分钟。吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000rpm离心 10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗涤RNA，4°C 7500rpm 离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。
(3)组织总RNA的鉴定
通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4_5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入I X TBE待用。琼脂糖凝胶用IXTBE配制。在IOul上样缓冲液 (2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2-3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。
3、全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
(I)引物设计及合成
根据GenBanK发表的绵羊(ACF74448.1)、褐家鼠(AAG18471.1)等物种的褪黑素受体基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼褪黑素受体cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列。引物用Primer Premier5. O自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID NO :4(反向)，序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID Ν0·4(反向)01igo dT
(2) RT-PCR 扩增
按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。 反转录反应液组成10ul2XBca 1st Buffer,4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture,0. 5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20，总体系为 20ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5 分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件 97°C变性5分钟；95°C 30秒一55V 30秒一72V I分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10 分钟，4 °C保存。
(3)克隆和测序
PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg琼脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOrpm离心I分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOrpm离心15秒，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOrpm离心15秒，倒掉管中液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I 分钟后，IOOOOrpm离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下在 EP 管中制备下列连接反应液pMD18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul，DNA20-40ng, Solution I 5ul，加dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。
质粒的转化。从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加 400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取IOOul铺于LB平板上，平板含0.1 % (V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒温培养10-15小时。
转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板，是指引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液及水加上刚才的单菌落就成了 PCR反应体系)的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增。PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落， 放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入O.1 % (V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下将转化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000rpm离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟.EP管中液体即为回收的质粒。
质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定.本研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和 Hin d II1.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul,Hin d III lul, IOXK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时。琼脂糖凝胶电泳检测。
重组质粒的测序。取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
实施例2 :双峰驼褪黑素受体基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
1、双峰驼褪黑素受体基因编码序列同源性比较
在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等七种动物的褪黑素受体基因编码蛋白序列， 将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较(见附图2)。比较结果显示SEQ ID NO. 2序列与褐家鼠的褪黑素受体氨基酸序列同源性为94. 00%。
2、褪黑素受体基因编码序列系统发生树构建
在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等七种物种的7条褪黑素受体基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树 (见附图3)。结果显示双峰驼褪黑素受体基因同褐家鼠的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼褪黑素受体基因。
序列表
<110>内蒙古农业大学
〈120〉双峰驼褪黑素受体的蛋白编码序列
<160>4
<170>PatentIn version3. 3
<210>1
<211>1140
<212>DNA
〈213〉阿拉善盟双峰驼
<400>权利要求
1.一种双峰驼褪黑素受体，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. 2 所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的，且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
2.一种双峰驼褪黑素受体编码基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO.1 所示序列；(b)由碱基简并或/和替代衍生的与(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且与(a)编码相同功能蛋白质的序列。
3.—种双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，该方法包括如下步骤(1)从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA；(2)根据人、鼠及牛不同物种的褪黑素受体基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR，其中引物的正向引物为 SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’反向引物为 SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；(3)克隆和测序。
4.按照权利要求3所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA为将双峰驼耳部组织放入装有Trizol的匀浆器管中匀浆，离心分离，吸取上清液，在15-30°C温育5分钟，加氯仿，剧烈震荡，继续在15-30°C温育2_3分钟，再次离心分离，吸取上清液，加异丙醇混合均匀，然后15-30°C温育10分钟，离心分离，所得沉淀物加75%乙醇洗涤，离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。
5.按照权利要求3所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖电泳分析RNA的质量。
6.按照权利要求3所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。
7.按照权利要求3所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述克隆和测序包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。
8.按照权利要求7所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。
9.按照权利要求7所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒。
10.按照权利要求7所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的转化为将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中，冰浴30分钟，然后在42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加液体LB培养基，37°C复活50分钟，后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上，37°C恒温培养10-15小时。
11.按照权利要求7所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落，放入到加有PCR反应液的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落，放入含有的青霉素钠LB液体培养基中，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
12.按照权利要求7所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。
13.按照权利要求7所述的双峰驼褪黑素受体编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定，选择内切酶Bam H I和Hin d III。
全文摘要
本发明涉及一种在双峰驼褪黑素受体、编码基因及其获取方法，本发明中的双峰驼褪黑素受体基因的cDNA序列是通过以双峰驼组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的褪黑素受体基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。本发明通过对包括SEQ ID NO.1在内的8个物种的八条褪黑素受体基因的CDS序列构建了系统发生树，结果发现双峰驼褪黑素受体同褐家鼠的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼褪黑素受体基因。
文档编号C07K14/72GK102993295SQ201210371328
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者张文彬, 哈斯苏荣 申请人:张文彬