用作治疗剂的可溶性蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病例如过敏性哮喘和炎性肠病的改进的结合蛋白。本发明更具体地涉及包含两个异源二聚体的复合物的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体基本上由以下组成：(i)第一单链多肽，其包含：(a)具有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和(b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和(ii)第二单链多肽，其包含：(c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和(d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL?CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。本发明还涉及如图1所示的可溶性结合SIRPα的抗体样蛋白。
【专利说明】用作治疗剂的可溶性蛋白
[0001]本发明涉及用作药物的、特别地用于预防或治疗自身免疫病和炎性疾病(例如过敏性哮喘和炎性肠病)的可溶解性、多特异性、多价结合蛋白。本发明的可溶性蛋白包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0002](i)第一单链多肽，其包含:
[0003](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0004](b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
[0005]和
[0006](ii)第二单链多肽，其包含:
[0007](c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0008](d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
[0009]本发明更具体地涉及对SIRPa具有特异性的可溶性结合蛋白。本发明的一个具体实施方案进一步由图1所示说明。
[0010]SIRPa (CD172 a )是由包括巨噬细胞、粒细胞和常规树状细胞(DC)的髓系细胞表达以及在神经元细胞上的免疫受体(van den Berg等人，2008, Trends inImmunol.，29(5):203-6)。SIRPa 是 CD47 的低亲和力配体(Rebres 等人，2001，J.Biol.Chem.;276(37):34607-16 ;Hatherley 等人，2007 J.Biol.Chem.;282 (19):14567-75 ;Hatherley 等人，2008 ；Mol.Cell ;31 (2) 266-77)，并且 SIRPa 与 CD47 的相互作用组成了基于黏附和双向信号传导控制的细胞通讯体系，所述细胞通讯体系调节免疫系统和神经元系统中的多种细胞功能。这些功能包括移行、细胞成熟、巨噬细吞噬噬和髓样树状细胞的细胞因子产生(van den Berg 等人，2008Trends in Immunol.29 (5): 203-6 ;Sarfati2009, Current Drug Targets, 9(10):852-50)。
[0011]来自动物模型的数据表明SIRPa /⑶47相互作用可以有助于或甚至控制几种病症的发病机理，所述病症包括自身免疫病、炎性疾病(Okuzawa等人,2008, BBRC ；371 (3):561-6 ；Tomizawa 等人，2007，J.1mmunol ; 179 (2):869-877)；局部缺血性疾病(Isenberg 等人，2008，Arter.Thromb Vase.Biol., 28 (4):615-21 ；Isenberg2008, Am.J.Pathol., 173(4):1100-12)或肿瘤学相关疾病(Chan 等人,2009, PNAS, 106(33):14016-14021 ；Majeti 等人,2009, Cell, 138(2): 286-99)。调节SIRPa /⑶47途径因此可以是用于多种疾病的有希望的治疗性选项。
[0012]已经建议使用针对⑶47、SIRP α或⑶47衍生的结合SIRP α的多肽的抗体作为治疗手段(例如见 W01998/40940、W02004/108923、W02007/133811 和 W02009/046541)。此外，结合SIRP α的CD47衍生的融合蛋白在疾病(如TNBS-结肠炎(Fortin等人，2009，JExp Med.，206(9): 1995-2011)、朗格汉斯细胞移行(J.1mmunol.2004，172:4091-4099)和关节炎(VlST Inc, 2008, Exp.0pin.Therap.Pat., 18 (5): 555-561))的动物模型中是有效的。
[0013]此外，提出 SIRP a/CD47 参与控制吞曬(van den Berg 等人，2008，Trends inImmunol.，29(5):203-6)，并且声称通过SIRP α结合多肽进行干涉来增进NOD小鼠系中的人干细胞植入(W02009/046541)，表明含有CD47胞外结构域(ECD)的治疗剂用于人干细胞移植中的潜在益处。 [0014]本发明提供了可溶性结合蛋白，它们包含第一和第二多肽链的异源二聚体，每种链包含与抗体重链或轻链序列融合的结合部分。所述可溶性蛋白可以对抗原、靶或结合配偶体具有单、双、三或四特异性，并且与现有技术的分子相比具有增加的价态。与现有技术的分子相比，本发明的可溶性蛋白具有提供增加数量的针对结合配偶体的特异性和增加的价态。这具有重要的优点，如下文所述。这些可溶性蛋白用作治疗剂。
[0015]本发明还提供用作治疗剂的改进的可溶性SIRPa结合蛋白。与现有技术的⑶47蛋白融合物相比，如本发明中所定义的结合SIRPa的抗体样蛋白可以提供增加针对靶向的表达SIRPa的细胞的亲合力，同时维持优异的可发展性特征的手段。另外，不受任何理论约束，预期较高的亲合力导致较长的药物动力学半寿期，从而提供增强的治疗功效。这些新的研究结果提供了靶向表达SIRPa的细胞的新治疗工具并且代表治疗性前景，特别地对于多种自身免疫病和炎性疾病、癌症或干细胞移植而言是如此。
[0016]因此，在一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0017]⑴第一单链多肽，其包含:
[0018](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0019](b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
[0020]和
[0021](ii)第二单链多肽，其包含:
[0022](c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0023](d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
[0024] 申请人:先前已经开发了抗体样分子，称作“Fusobodies”，其中抗体的两条臂的可变区由哺乳动物结合分子的区域，例如SIRPa结合结构域替换，从而提供多价可溶性蛋白。本发明的可溶性蛋白与 申请人:的Fusobodies相似，因为这些分子也包含抗体序列。但是就本发明的分子而言，抗体序列的VH区和VL区一以及相关价态和抗原特异性一已经保留，这些区域与哺乳动物结合分子的区域融合。本发明的分子因此具有由双价抗体序列提供的一种或多种结合特异性，和由哺乳动物结合分子的4个单价区域提供的其他特异性。为区分本发明的可溶性蛋白与 申请人:先前开发的那些蛋白，术语“延伸型Fusobody”将在下文中使用。 申请人:先前开发的分子将继续称作“Fusobodies”或“非延伸型Fusobodies”。
[0025]在图1中显示延伸型Fusobody的一个实例，该图也描述了 申请人:先前开发的Fusobody,以及参照Q)47-Fc分子。
[0026]与现有技术的分子相比，本发明的可溶性蛋白具有增加的价态。基于每条多肽链的单价以及每对VH和VL区还提供了单价的抗原结合特异性，本发明的异源二聚体优选地具有三价态。本发明的可溶性蛋白因此基于由4条多肽链上的哺乳动物结合分子的区域贡献的四价和由抗体VH区和VL区贡献的二价，具有六价态(六价)。在优选的实施方案中，每一单链多肽是单价的，每一异源二聚体是三价的，并且每一可溶性蛋白(基于两个异源二聚体的复合物)是六价的。通过在每种第一和第二单链多肽中并入单价的结合分子和由每对VH区和VL区提供的单价抗原结合特异性，每个异源二聚体的价态是三价，即，每个异源二聚体可以结合多达三个独立的结合配偶体，或在相同的结合配偶体上结合多达3次。这与其中第一和第二多肽链的异源二聚体的价态是I价(即，同时需要两条链结合这种结合配偶体)的现有技术分子(例如W001/46261中披露的那些)形成对比至这样的程度:两个异源二聚体的复合物具有2价态。本发明的两个三价异源二聚体的复合物具有六价态，即，该蛋白质可以结合多达六个结合配偶体，或对相同的结合配偶体结合多达六次。本发明的异源二聚体是三价的，并且异源二聚体的复合物具有价态η χ3，其中η是该复合物内部所包含的异源二聚体的数目。在优选的实施方案中，该复合物包含两个异源二聚体并且具有6价态。包含多于两个异源二聚体的复合物具有大于6的价态(例如9、12、15或18的价态)。本发明可溶性蛋白的增加的价态导致较高的亲合力，有利地影响半寿期和功效。除了这些作用之外，(与具有较低亲合力的治疗性分子比较)具有高亲合力的治疗性分子的另一个优点是，可以用于例如多达10倍的给药剂量减少。
[0027]W02010/127284中公开了具有与抗体恒定区融合的双可变域的抗体样分子。公开的分子是双特异性的并且具有价态4，这源自该分子的每条臂上的两对VH区和VL区。在本发明的可溶性蛋白或延伸型Fusobody和W02010/127284中所公开的双可变域分子之间的关键差异之一是在本发明的可溶性蛋白/延伸型Fusobody的每条臂上仅使用一个可变域(即VH和VL)。通过使用哺乳动物结合分子的单价区域一例如细胞表面受体(如CD47)的胞外结构域一而不使用第二可变域，仍可以获得针对第二(或第三抗原)的特异性。使用天然受体结构域的优点之一是与其相关结合配偶体的相互作用是更可预测的、天然的、特异的，并且在治疗情形中，与可能包含免疫原性区域和/或突变以改善特异性、亲和力和亲合力的治疗性抗体或双可变域分子相比，哺乳动物结合分子的结构域不具有预期的免疫原性。与双可变域分子相比，使用与抗体可变域融合的单价哺乳动物结合区的另一个优点是以构象方式紧邻于抗体可变域布置哺乳动物结合分子的区域(并且仍保留所需的结合特异性)的问题远比其中总是要求精确且最佳地使用接头来布置具有不同特异性的两个可变域更简单。因而，采用现有分子实现的多特异性可以用本发明的可溶性蛋白更容易地实现，并且因而所述分子提供增加的价态和其他优点。
[0028]在一个方面，本发明提供包含本发明的两个或多个可溶性蛋白的多价可溶性蛋白复合物，其中如果所述蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是Nx6。
[0029]因此，在一个方面，本发明提供一种具有至少六价(或至少是六价)的可溶性蛋白，它包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0030](i)第一单链多肽，其包含:
[0031 ] (a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0032](b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的区域；
[0033]和
[0034](ii)第二单链多肽，其包含:
[0035](C)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0036](d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性(即是单价的)，并且哺乳动物结合分子的每个区域具有单价，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。[0037]在另一个方面，本发明提供可溶性蛋白的复合物，每个可溶性蛋白具有至少六价(或至少是六价的)，包含至少两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0038](i)第一单链多肽，其包含:
[0039](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0040](b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的区域；
[0041]和
[0042](ii)第二单链多肽，其包含:
[0043](c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0044](d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性(即是单价的)，并且哺乳动物结合分子的每个区域具有单价，从而所述可溶性蛋白的总价态是六，并且其中如果该 蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是Nx60
[0045]在另一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0046](i)第一单链多肽，其包含:
[0047](a)修饰的抗体重链序列，其以CH1-CH1-CH2-CH3顺序具有两个CHl区、CH2区和CH3区；和
[0048](b)与第一 CHl区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；和
[0049](ii)第二单链多肽，其包含:
[0050](c)修饰的抗体轻链序列，其具有两个融合的CL区；和
[0051](d)与第一 VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于所述可溶性蛋白的总价态是四。
[0052]在这个方面，可溶性蛋白的价态是4，然而，该分子保留延伸型Fusobody样结构，因为VH序列和VL序列分别被替换为CHl和CL序列。
[0053]在另一个方面，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体包含:
[0054](i)第一单链多肽，其包含:
[0055](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0056](b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的至少一个单价区域；和
[0057](ii)第二单链多肽，其包含:
[0058](c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0059](d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的至少一个单价区域；特征在于每对VH和VL CDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态至少是六。
[0060]在一个优选的方面，可溶性蛋白针对1、2或3种抗原具有结合特异性。该结合特异性源自(i)抗体序列的VH区和VL区的抗原结合特异性，和(ii)哺乳动物结合分子的每个区域的结合特异性。
[0061]在一个优选的方面，每个异源二聚体内部的Vh和VL区是对相同抗原、优选地对该抗原上的相同表位特异的。[0062]在一个优选的方面，包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子是相同的。在一个更优选的方面，包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域是相同的。
[0063]因此，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0064](i)第一单链多肽，其包含:
[0065](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0066](b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
[0067]和
[0068](ii)第二单链多肽，其包含:
[0069](c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0070](d)与VL区融合的相同哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
[0071]本发明还提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0072](i)第一单链多肽，其包含:
[0073](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0074](b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；
[0075]和
[0076](ii)第二单链多肽，其包含:
[0077](c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0078](d)与VL区融合的相同哺乳动物结合分子的相同区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
[0079]在一个实施方案中，哺乳动物结合分子的每个区域和每对VH和VL CDR序列对相同的单一抗原具有结合特异性。在一个实施方案中，哺乳动物结合分子的区域可以结合抗原上的第一表位，并且每对 VH和VL⑶R序列可以结合相同抗原上的第二表位。在另一个实施方案中，哺乳动物结合分子的区域和每对VH和VL CDR序列可以结合相同抗原上的相同表位。
[0080]在一个实施方案中，本发明的可溶性蛋白或延伸型Fusobody对两种抗原具有结合特异性，其中哺乳动物结合分子的每个区域对第一抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第二抗原具有结合特异性。在一个具体实施方案中，本发明的SIRPa结合蛋白对SIRP α具有特异性(基于包含于每种多肽序列内部的CD47胞外结合结构域)并且基于VH/VL和相关⑶R序列的特异性，对TNF α或环孢菌素A具有特异性。
[0081]在另一个实施方案中，包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子是不同的。因此，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0082](i)第一单链多肽，其包含:
[0083](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0084](b)与VH区融合的第一哺乳动物结合分子的单价区域；[0085]和
[0086](ii)第二单链多肽，其包含:
[0087](c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和 [0088](d)与VL区融合的第二哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于所述第一和第二哺乳动物结合分子对第一和第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对所述第一或所述第二抗原具有特异性，因而可溶性蛋白是双特异性的，具有总价态六。
[0089]在一个备选实施方案中，VH区和VL区可以使不同的抗原结合至被哺乳动物结合分子的区域结合的一种或两种抗原。这种延伸型Fusobody是三特异性的，即可以结合三种不同抗原，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第三抗原具有结合特异性。因此，本发明提供一种可溶性蛋白，它包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0090](i)第一单链多肽，其包含:
[0091](a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和
[0092](b)与VH区融合的第一哺乳动物结合分子的单价区域；
[0093]和
[0094](ii)第二单链多肽，其包含:
[0095](C)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和
[0096](d)与VL区融合的第二哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于所述第一和第二哺乳动物结合分子对第一和第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第三种第二抗原具有特异性，因而可溶性蛋白是三特异性的，具有总价态六。
[0097]在特定的实施方案中，VH和VL⑶R序列对TNF α、环孢菌素A或衍生自它们的表位具有结合特异性。
[0098]在一个优选的实施方案中，哺乳动物结合分子的区域与抗体序列的N端部分(即，与定区和'恒定区)融合。因而，哺乳动物结合分子的区域的C端与抗体序列的N端融合。在一些实施方案中，这些序列直接连接，在一些实施方案中，可以使用接头序列。
[0099]在一个实施方案中，结合分子是细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、低分子量化合物(药物)、配体或细胞表面受体。优选地，该结合分子是哺乳动物单体的或同型聚合的细胞表面受体。结合分子的区域可以是完整分子或其可以保留该结合分子的生物活性的部分或片段。结合分子的区域可以是胞外区域或结构域。在一个实施方案中，所述哺乳动物单体的或同型聚合的细胞表面受体包含免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，例如它包含SIRPa结合结构域，所述SIRPa结合结构域可以是⑶47的胞外结构域。
[0100]在一个实施方案中，本发明涉及分离的可溶性SIRPa结合蛋白或结合SIRP α的延伸型Fusobody，其包含两个三价异源二聚体的六价复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0101](i)第一单链多肽，其包含在抗体的VH区的N端部分处融合的第一 SIRP α结合结构域；和，
[0102](ii)第二单链多肽，其包含在抗体的VL区的N端部分处融合的第二 SIRPa结合结构域。[0103]在一个优选实施方案中，ChI区、Ch2区和Ch3区可以衍生自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4相应区域的野生型或突变变体，其具有沉默的效应子功能和/或减少的细胞杀伤性ADCC或CDC效应子功能，例如减少的ADCC效应子功能。
[0104]在一个实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPa的延伸型Fusobody以0.05[I/S]或更小的kfGidl)从结合的人SIRP α解离，如采用双价动力学拟合模型，通过表面等离子体共振如BiaCORE测定法所测量。
[0105]在另一个实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRP α的Fusobody抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放。
[0106]例如，所述可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody以2nM或更小、InM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小例如在IOpM和2nM、或20pM和InM、或30pM和0.2nM之间的IC50抑制体外产生的单核细胞衍生性树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放，如树状细胞细胞因子释放测定法中所测量。
[0107]在另一个相关的实施方案中，每个异源二聚体的所述第一和第二单链多肽由二硫键共价地结合，例如使用相应ChI和Q区的半胱氨酸残基之间的天然二硫键。
[0108]在一个实施方案中，所述哺乳动物结合分子的每个区域在肽接头不存在下与其相应的VH序列或VL序列融合。在另一个实施方案中，所述哺乳动物结合分子的每个区域通过肽接头与其相应的VH序列或VL序列融合。肽接头可以包含5至20个氨基酸，例如，它可以是甘氨酸和丝氨酸氨基酸的聚合 物、优选地是(GGGGS)n，其中是I和4之间的任何整数，优选地是2。
[0109]在一个优选实施方案中，所述可溶性蛋白或结合SIRPa的延伸型Fusobody基本上由两个异源二聚体组成，其中每个异源二聚体的所述第一单链多肽包含免疫球蛋白恒定部分的铰链区，并且这两个异源二聚体彼此通过在它们铰链区处的半胱氨酸之间的二硫键
稳定缔合。
[0110]在一个实施方案中，本发明的可溶性蛋白包含选自以下的至少一个SIRPa结合结构域:
[0111](i)人细胞表面受体CD47的胞外结构域；
[0112](ii)衍生自SEQ ID NO:2的胞外结构域；
[0113](iii) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:57 多肽或其保留SIRPa结合特性的片段；和，
[0114](iv) SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 57 的或所述片段的变体多肽，所述变体多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRPa
结合特性。
[0115]在一个优选实施方案中，CD47的胞外结构域的区域是SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:57。
[0116]在一个具体的实施方案中，包含于所述第一和第二单链多肽内部的两个或多个SIRPa结合结构域彼此共有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或99.5%序列同一性百分数。在一个具体实施方案中，两个或多个SIRPa结合结构域具有相同的氨基酸序列。
[0117]在一个具体的实施方案中，在结合SIRP α的延伸型Fusobody内部的全部SIRP a结合结构域具有相同的氨基酸序列。例如，全部SIRP结合结构域由SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:4 或 SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:57 组成。
[0118]在一个具体实施方案中，本发明的所述可溶性蛋白或结合SIRPa的延伸型Fusobody包含两个异源二聚体,其中每个异源二聚体基本上由以下组成:
[0119](i)SEQ ID NO:20的第一单条重链多肽和SEQ ID NO:21的第二单条轻链多肽；
[0120](ii)SEQ ID NO:22的第一单条重链多肽和SEQ ID NO: 23的第二单条轻链多肽；或
[0121](iii) SEQ ID NO: 40的第一单条重链多肽和SEQ ID NO: 41的第二单条轻链多肽。
[0122]与抗体的重链和轻链相似，所述第一和第二单链多肽至少经一个二硫键稳定缔
八
口 ο
[0123]在一个相关的实施方案中，可溶性蛋白或结合SIRPa的Fusobody包含两个异源二聚体，其中每个异源二聚体的第一和第二单链多肽分别与(i)SEQ ID N0:20和SEQ IDN0:21、(ii)SEQ ID N0:22 和 SEQ ID N0:23 或(iii)SEQ ID N0:40 和 SEQ ID N0:41 的相应第一和第二单链多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性。优选地，这些分子保留如上文所述的结合SIRP α的延伸型Fusobody的有利功能特征。
[0124]在一个具体实施方案中，本发明的结合SIRP α的延伸型Fusobody的四个SIRP a结合结构域是在序列上相同的。
[0125]本发明还涉及包含两个或多个延伸型Fusobody或结合SIRP α的延伸型Fusobody的这类多价可溶性蛋白复合物，其中如果该蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是Nx6。
[0126]本发明还涉及用作药物或诊断工具，例如用于自身免疫病以及急性和慢性炎性病症的治疗或诊断中的此类可溶性蛋白或延伸型Fusobody、特别地是SIRP α结合蛋白或延伸型Fusobody。具体而言，SIRP α结合蛋白或延伸型Fusobody是用于治疗选自Th2介导的气道炎症、过敏性病症、哮喘、炎性肠病和关节炎的病症。
[0127]本发明的可溶性蛋白或Fusobody也可以在有需求的受试者中用于治疗或诊断局部缺血性病症、白血病或其他癌症或用于增加造血干细胞植入。
[0128]定义
[0129]为了可以更轻易地理解本发明，首先定义某些术语。额外的定义在详细描述中给出。
[0130]术语SIRPa指显示与⑶47 (整联蛋白缔合蛋白)黏附的人信号调节蛋白α (也称为⑶172 α或SHPS-1)。 人SIRP α包括SEQ ID NO:1，但是还包括但不限于任何天然多态性变体，例如，包括人SIRP α的单核苷酸多态性(SNP)或剪接变体。表1中描述了人类中在SIRP α核苷酸序列中发现的剪接变体或SNP的实例。
[0131]表1:SIRPa蛋白的变体
[0132]
【权利要求】
1.一种可溶性蛋白，其包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成: (i)第一单链多肽，其包含: (a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和 (b)与VH区融合的哺乳动物结合分子的单价区域； 和 (?)第二单链多肽，其包含: (c)具有VL区 和CL区的抗体轻链序列；和 (d)与VL区融合的哺乳动物结合分子的单价区域；特征在于每对VH和VLCDR序列具有针对抗原的特异性，从而所述可溶性蛋白的总价态是六。
2.根据权利要求1所述的可溶性蛋白，其中蛋白质针对1、2或3种结合配偶体具有结合特异性。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域是相同的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的每个单价区域和每对VH和VL CDR序列对相同的单一抗原具有结合特异性。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的区域能结合抗原上的第一表位，并且每对VH和VL⑶R序列能结合相同抗原上的第二表位。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，其中哺乳动物结合分子的区域和每对VH和VL CDR序列能结合相同抗原上的相同表位。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对两种抗原具有结合特异性，其中哺乳动物结合分子的每个区域对第一抗原具有结合特异性，并且每对VH和VLCDR序列对第二抗原具有结合特异性。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子是不同的。
9.根据权利要求8所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对两种抗原具有结合特异性，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，并且包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL⑶R序列对第一抗原或第二抗原具有结合特异性。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的可溶性蛋白，所述蛋白质对三种抗原具有结合特异性，其中包含于第一单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第一抗原具有结合特异性，包含于第二单链多肽内部的哺乳动物结合分子的区域对第二抗原具有结合特异性，并且每对VH和VL CDR序列对第三抗原具有结合特异性。
11.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是蛋白质、细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、低分子量化合物、配体、细胞表面受体、或其片段。
12.根据权利要求11所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子是单体的或同聚的细胞表面受体的胞外结构域。
13.根据权利要求12所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物单体的或同聚的细胞表面受体包含IgSF结构域。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子包含SIRPa结合结构域。
15.根据权利要求14所述的可溶性蛋白，其中所述SIRPa结合结构域选自: (i)人细胞表面受体CD47的胞外结构域； (ii)SEQID NO:2的衍生的胞外结构域；
(iii)SEQID NO: 3,SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO: 57 的多肽或其保留 SIRP a结合特性的片段；和，
(iv)SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 57 的或所述片段的变体多肽，所述变体多肽具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性并保留SIRP a结合特性。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的可溶性蛋白，其中包含于所述第一和第二单链多肽内部的两个或多个SIRP a结合结构域彼此共有至少60、70、80、90、95、96、97、98、99或99.5%序列同一性百分数。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的可溶性蛋白，其中两个或多个SIRPa结合结构域具有相同的氨基酸序列。
18.如权利要求14至17中任一项所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体内部的SIRPa结合结构域具有相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的可溶性蛋白，其中SIRPa结合结构域是具有选自SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5和SEQ IDNO:57的氨基酸序列的人细胞表面受体CD47的胞外结构域。
20.根据权利要求15所述的可溶性蛋白，其包含两个异源二聚体的复合物，其中每个异源二聚体基本上由以下组成: α)第一单链多肽，其包含: (a)具有VH区、CHl区、CH2区和CH3区的抗体重链序列；和 (b)CD47的胞外结构域的单价区域，所述CD47区域的羧基端与VH区的N末端融合；和 (?)第二单链多肽，其包含: (c)具有VL区和CL区的抗体轻链序列；和 (d)CD47的胞外结构域的单价区域，所述CD47区域的羧基端与VL区的N末端融合。
21.根据权利要求20所述的可溶性蛋白，其中CD47的胞外结构域的所述区域是SEQIDNO:3 或 SEQ ID NO:57。
22.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中VH和VLCDR序列对TNF α、环孢菌素A或衍生自它们的表位具有结合特异性。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的可溶性蛋白，其以0.05[l/s]或更小的koff(kdl)从结合的人SIRPa解离，如采用双价动力学拟合模型，在BiaCORE测定法中所测量。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的可溶性蛋白，其抑制体外产生的单核细胞衍生的树状细胞中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放。
25.根据权利要求24所述的可溶性蛋白，其以0.1nM或更小的IC5tl抑制体外产生的单核细胞衍生的树状细胞中金黄色葡萄球菌Cowan菌株粒子刺激的促炎细胞因子释放，如在树状细胞细胞因子释放测定法中所测量。
26.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体的所述第一和第二单链多肽由二硫键共价地连接。
27.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中每个异源二聚体的所述第一单链多肽包含免疫球蛋白恒定部分的铰链区，并且所述两个异源二聚体彼此通过所述铰链区处的~ 硫键稳定缔合。
28.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子的每个区域在肽接头不存在下与其相应的VH序列或VL序列融合。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述哺乳动物结合分子的每个区域通过肽接头与其相应的VH序列或VL序列融合。
30.根据权利要求29所述的可溶性蛋白，其中所述肽接头包含5至20个氨基酸。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的可溶性蛋白，其中所述肽接头是甘氨酸和丝氨酸氨基酸的聚合物，优选地是(GGGGS)n，其中η是I和4之间的任何整数，优选地是2。
32.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白，其中抗体的ChI区、Ch2区和Ch3区衍生自人IgGl、IgG2或IgG4相应区域的沉默突变体，其具有降低的ADCC效应子功能。
33.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述异源二聚体包含: (i)SEQID NO:`20的第一单链多肽和SEQ ID NO:21的第二单链多肽； (ii)SEQID NO:22的第一单链多肽和SEQ ID NO:23的第二单链多肽；或 (iii)SEQID NO:40的第一单链多肽和SEQ ID NO:41的第二单链多肽。
34.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其中所述第一单链多肽和所述第二单链多肽具有与以下的相应第一单链多肽和第二单链多肽至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性:
(i)SEQID NO:20 和 SEQ ID NO:21;
(ii)SEQID NO:22 和 SEQ ID NO:23;或
(iii)SEQID NO:40 和 SEQ ID NO:41。
35.根据权利要求1至27中任一项所述的可溶性蛋白，其包含: (i)由SEQ ID NO:77的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID N0:78的核苷酸序列编码的轻链；或 (?)由SEQ ID NO:79的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO:80的核苷酸序列编码的轻链；或 (iii)由SEQ ID NO:97的核苷酸序列编码的重链；和由SEQ ID NO:98的核苷酸序列编码的轻链。
36.包含两个或多个根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白的多价可溶性蛋白复合物，其中如果所述蛋白质复合物包含N个可溶性蛋白，则价态是N x6。
37.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用作药物或诊断工具。
38.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于治疗或诊断自身免疫病和/或急性和慢性炎性疾病。
39.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于治疗选自Th2介导的气道炎症、过敏性疾病、哮喘、炎性肠病和关节炎的疾病。
40.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于治疗缺血性疾病、白血病或其他癌症。
41.根据任一前述权利要求所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物，用于在有需求的受试者中增加造血干细胞植入。
42.药物组合物，其包含与一种或多种可药用载体组合的权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物。
43.根据权利要求42中所述的药物组合物，其额外地包含至少一种其他有效成分。
44.分离的核酸，其编码根据权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白的一个异源二聚体的至少一条单链多肽。
45.根据权利要求44中所述的分离的核酸，或克隆载体或表达载体，其包含选自SEQID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:97 和 SEQ ID NO:98 的至少一种核酸。
46.适用于产生根据权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物的重组宿主细胞，其包含编码所述蛋白质的所述异源二聚体的所述第一和第二单链多肽和任选地分泌信号的核酸。
47.根据权利要求46所述的重组宿主细胞，其包含稳定整合于基因组中的SEQIDNO:77 和 SEQ ID NO:78 ;或 SEQ ID NO:79 和 SEQ ID NO:80;或 SEQ ID NO:97 和 SEQ IDNO:98的核酸。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞系。
49.用于产生根据权利要求1至36中任一项所述的可溶性蛋白或蛋白质复合物的方法，包括在产生所述可溶性蛋白或蛋白质复合物的适宜条件下培养根据权利要求46至48中任一项所述的宿主细胞和分离所述蛋白质。
【文档编号】C07K19/00GK103635490SQ201280029556
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2011年6月16日
【发明者】T·胡贝尔, F·科尔宾格, K·韦尔岑巴赫 申请人:诺瓦提斯公司