一种规模化制备蟛蜞菊内酯化学对照品的方法
【专利摘要】本发明涉及一种规模化制备蟛蜞菊内酯化学对照品的制备新工艺。通过蟛蜞菊内酯稳定性及制备工艺流线化优化，采用自制大型中压或减压硅胶柱色谱纯化，批量获取纯度大于98%的蟛蜞菊内酯化学对照品，其规模可达十克级。
【专利说明】一种规模化制备蟛蜞菊内酯化学对照品的方法
[0001 ] 【技术领域】本发明涉及一种规模化制备膨蜞菊内酯(Wedelolactone )化学对照品的制备新工艺。主要包括乙酸乙酯萃取、自制大型中压或减压硅胶柱色谱纯化、重结晶三个步骤。
【背景技术】
[0002]蟛蜞菊内酯为香豆素类化合物，具有保肝、抗炎、增强免疫等功效，中国药典(2010版)将其列为中药墨旱莲的新增定量指标成分，实际应用缺口巨大，加上该对照品分离纯化步骤繁琐，均导致该对照品价格昂贵(市售1000-1500元，20mg/支)。因此批量获取大量对照品，不仅能满足墨旱莲相关制品的质量控制所需，而且对于深入研究其作用机制具有重要意义。
[0003]目前，从墨旱莲中制备蟛蜞菊内酯的报道多为实验室规模，步骤较繁琐，如张金生等(药学学报，36 (I): 34-37，2011)报道采用石油醚-乙醚-甲醇或95%甲醇渗滤提取、甲醇溶解除杂或乙酸乙酯萃取除杂、硅胶柱分离获取蟛蜞菊内酯，其中分离洗脱剂采用甲苯-丙酮-醋酸(6:8:1)或二氯甲烷-甲醇-水(14:9:4下层);原红霞等(中国实验方剂学杂志，17 (16):103-105，2011)报道采用95%乙醇渗滤提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱石油醚-乙酸乙酯梯度分离、sephadex LH-20纯化获取膨蜞菊内酯；Wagner等(Ger.DE3525363,德国专利)采用甲醇浸泡提取、乙酸乙酯萃取、C18反相HPLC梯度洗脱制备蟛蜞菊内酯，Kokai等(JP83228353,日本专利)采用水回流提取，丁醇-水(1:1)逆流-逆流分布、SephadexLH-20，该类文献或采用含苯及二氯甲烷毒性较大的洗脱溶剂，或采用Sephadex LH_20、C18价格昂贵的分离填料，且几乎均采用非常耗时的渗滤或浸泡提取，无法进行工业规模放大生产，对照品产量无法满足实际应用所需。
[0004]本发明通过系统提取、分离工艺优化研究，发现虽然蟛蜞菊内酯结构中含有一个内酯键和三个酚羟基(图1)，结构不太稳定，但用含醇量70%以上的乙醇提取，50°C减压浓缩时其含量未见明显变化，提示可以用回流提取代替渗滤提取，大大加快提取效率；萃取时热水的温度不大于40°C，蟛蜞菊内酯可以较好地保持稳定。硅胶柱分离时，采用柱床紧密、柱效较高的中压或减压层析柱进行分离，不仅可以获得更好的分离效果，且大大加快了分离进度；采用自制多种不锈钢柱作为层析柱，可方便加工为任意所需大直径柱，显著提高分离通量；同时通过仔细优化洗脱溶剂，最终选择在石油醚-乙酸乙酯混合流动相中添加适量醋酸，选用该洗脱溶剂，可实现硅胶柱上的等度洗脱且回收率较高，对于批量制备非常有利，因为只需调配一种比例的洗脱剂，大大降低了溶剂回收调配的难度。采用系统优化的本制备工艺，可实现蟛蜞菊内酯的规模化制备，其纯度在98%以上，制备规模可达10克级以上。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种工艺简单、易规模化的制备新方法，可以以墨旱莲醇提物为原料，经乙酸乙酯萃取、中压或减压硅胶柱色谱纯化、重结晶三个步骤，即可获得纯度大于98%的蟛蜞菊内酯化学对照品，其规模可达十克级。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案:
[0007]I)乙酸乙酯萃取:
[0008]墨旱莲醇提物，或墨旱莲药材经体积分数不小于70%的乙醇提取后减压干燥获得醇提物，加入提取物重量3-5倍体积的水，加热使其溶解，温度控制在30°C -40°C ;加入提取物重量1-2倍体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取2-4次，合并萃取液，减压浓缩至醇提物重量的1/3~1/6体积(ml/g)，然后拌入等比例重量(g/ml)的硅胶，干燥获得乙酸乙酯萃取物干粉；
[0009]2)中压或减压硅胶柱色谱纯化:
[0010]取径高比为2~12.5的不锈钢柱作为层析柱，装入萃取物干粉1-2倍重量的硅胶作为层析分离硅胶，干法上样；用石油醚:乙酸乙酯:醋酸(体积比8:2:1-6:4:1)混合溶剂洗脱，中压柱压力0.2-0.3MPa，减压柱压力在-0.08-0.09MPa，薄层色谱检测，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(体积比3:7:0.5-5:5:0.5)为展开剂，收集Rf值在0.40-0.48的洗脱液，减压浓缩，析出浅白色沉淀为蟛蜞菊内酯粗品；
[0011]3)重结晶:
[0012]上述对照品粗品用乙酸乙酯或甲醇溶解，-4°C-10°C以下放置析晶，即可获得纯度大于98%的蟛蜞菊内酯对照品，其外观为白色粉末。
[0013]所述步骤I)中拌样硅胶一定采用100-200目硅胶，否则上样硅胶比层析硅胶颗粒细，将在加压和减压中下沉，严重影响分离效果。
[0014]所述步骤2)的具体参数为，层析分离硅胶为100-200目或200-300目，装柱前不不需干燥活化处理，如将硅胶活化，其吸附能力太强，将大大降低对照品的回收率。洗脱剂中的石油醚沸程为60-90°C，洗脱剂洗脱控制在8~12倍柱体积，流速为100-150ml/min。
[0015]所述步骤3)的具体过程为，重结晶时所用乙酸乙酯为分析纯重蒸溶剂，甲醇为色谱级，母液需过滤后再行放置结晶。
[0016]以本发明从墨旱莲中分离蟛蜞菊内酯化学对照品具有如下优点和进步:
[0017]I)本发明工艺简单，便于流线化生产
[0018]本发明采用墨旱莲醇物经乙酸乙酯萃取，萃取液合并浓缩时不需浓缩成稠浸膏即可直接加入100-200目的硅胶拌样，通风橱挥干即可得萃取物干粉，适量研磨后即可作为第二步硅胶柱层析的待分离样品。第二步硅胶柱层析时采用等度洗脱溶剂，获得目标流份后通过减压干燥，一方面可获得蟛蜞菊内酯粗品，一方面回收溶剂便于重新调配循环使用，减压干燥时仍不需抽干溶剂，浓缩至小体积即可过滤放置析晶，获取蟛蜞菊内酯粗品，随后采用重蒸乙酸乙酯或色谱纯甲醇溶解过滤即可进行重结晶。三个分离步骤衔接的非常好，非常便于流线化生产。相较文献分离工艺每个步骤均需浓缩至干或稠浸膏，大大提高了分离效率。
[0019]2)本发明采用的技术手段非常适宜放大进行规模化生产。
[0020]本制备工艺对原料要求不高，工艺采用常见的70%乙醇提取，而非文献中采用的渗滤及浸泡操作，非常易于批量备料；硅胶柱层析采用不锈钢中压或减压层析，不但克服了传统玻璃中压柱的压力限制，同时不锈钢柱易于加工，可方便加工至所需的大直径柱，达到生产所需的大规模及高通量；硅胶填料便宜易得，所用溶剂仅涉及石油醚、乙酸乙酯、醋酸等常规溶剂，成本价廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1蟛蜞菊内酯的结构；
[0022]图2硅胶柱层析后获得的蟛蜞菊内酯粗品的HPLC分析图谱(351nm)；
[0023]图3蟛蜞菊内酯对照品重结晶后的HPLC分析图谱(351nm)；
[0024]图4蟛蜞菊内酯的ES1-MS负离子质谱图谱；
[0025]图5蟛蜞菊内酯的紫外色谱图。
【具体实施方式】
[0026]现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
[0027]实施例1
[0028]I)乙酸乙酯萃取:
[0029]墨旱莲醇取物3kg (四川省中医药科学院提供)，加入15L水，40°C加热使其溶解，加入4.5L乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至500ml，拌入500克100-200目的硅胶，拌匀，通风橱晾干，研磨后备用。
[0030]2)中压硅胶柱色谱纯化:
[0031]取(pScmx I OOcm的不锈钢柱作为中压层析柱，装入1.5kgi00-200目硅胶作为分离硅胶，将乙酸乙酯萃取物拌样粉末均匀装入柱头，装填紧密；采用上海同田TBP2H10恒流泵作为中压泵，石油醚:乙酸乙酯:醋酸(7:3:1)混合溶剂作为洗脱剂，流速控制在150ml/min，压力约0.3MPa,洗脱10倍柱体积，约45L ;薄层色谱检测，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(4:6:0.5)为展开剂，紫外灯365nm处检视荧光斑点，收集Rf值为0.46的洗脱液，浓缩，析出灰白色沉淀7.2g (蟛蜞菊内酯粗品)，其纯度约为70% (图2);
[0032]3)重结晶:
[0033]上述蟛蜞菊内酯粗品以色谱甲醇加热溶解(<40°C)，用0.45微米的微孔滤膜抽滤，清液低温放置(冬季室温约10°c )，24h后析出白色沉淀，过滤，可得蟛蜞菊内酯纯品，母液可继续浓缩放置结晶，不同批次单独采用HPLC检测，合并纯度大于98%的批次作为蟛蜞菊内酯对照品，最终获取蟛蜞菊内酯对照品6.1gJ^HPLC归一化检测，其纯度为98.7% (图3)
[0034]上述对照品的UV、MS均和文献相一致(图4，5 )。
[0035]实施例2
[0036]I)乙酸乙酯萃取:
[0037]墨旱莲药材40kg，采用70%乙醇回流提取，第一次480L，第二次400L，各提取1.5小时，合并两次提取液，得醇提物浸膏约7kg ;加入35L水，40°C加热使其溶解，加入10.5L乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至2L，拌入2kg100-200目的硅胶，拌匀，通风橱晾干，研磨后备用。
[0038]2)减压硅胶柱色谱纯化:
[0039]取cp20cmx40cm的不锈钢柱作为减压层析柱，下配2.5L抽滤瓶作为收集器；装Λ 4.2kg200-300目硅胶作为分离硅胶，将乙酸乙酯萃取物拌样粉末均匀装入柱头，装填紧密；采用河南巩义予华牌循环真空泵作为减压泵，压力约在-0.09MPa，石油醚:乙酸乙酯:醋酸(8:2:1)混合溶剂作为洗脱剂，洗脱12倍柱体积，约180L;薄层色谱检测，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(5:5:0.5)为展开剂，紫外灯365nm处检视荧光斑点，收集Rf值为0.40的洗脱液，浓缩，析出灰白色沉淀15.3g (蟛蜞菊内酯粗品)，其纯度约为65% ；
[0040]3)重结晶:
[0041]上述蟛蜞菊内酯粗品以重蒸乙酸乙酯加热溶解(<40°C)，用0.45微米的微孔滤膜抽滤，清液低温放置(冬季室温约10°c )，24h后析出白色沉淀，过滤，可得蟛蜞菊内酯纯品，同实施例1类似步骤合并纯度大于98%的批次作为蟛蜞菊内酯对照品，最终获取蟛蜞菊内酯对照品10.9g，经HPLC归一化检测，其纯度为98.5% ；
[0042]实施例3
[0043]I)乙酸乙酯萃取:
[0044]墨旱莲醇取物Ikg (四川省中医药科学院提供)，加入5L水，40°C加热使其溶解，加入1.5L乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至200ml，拌入200克100-200目的硅胶，拌匀，通风橱晾干 ，研磨后备用。
[0045]2)中压硅胶柱色谱纯化:
[0046]取(p8cmx I OOcm的不锈钢柱作为中压层析柱，装入750克100-200目硅胶作为分离硅胶，将乙酸乙酯萃取物拌样粉末均匀装入柱头，装填紧密；采用上海同田TBP2H10恒流泵作为中压泵，石油醚:乙酸乙酯:醋酸(6:4:1)混合溶剂作为洗脱剂，流速控制在10ml/min，压力约0.2MPa,洗脱8倍柱体积，约24L ;薄层色谱检测，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(3:7:0.5)为展开剂，紫外灯365nm处检视荧光斑点，收集Rf值为0.48的洗脱液，浓缩，析出灰白色沉淀2.5g (蟛蜞菊内酯粗品)，其纯度约为75% ；
[0047]3)重结晶:
[0048]上述蟛蜞菊内酯粗品以色谱甲醇加热溶解(<40°C)，用0.22微米的微孔滤膜抽滤，清液低温放置(冬季室温约10°c )，24h后析出白色沉淀，过滤，可得蟛蜞菊内酯纯品，同实施例1合并纯度大于98%的批次作为蟛蜞菊内酯对照品，最终获取蟛蜞菊内酯对照品
1.9g，经HPLC归一化检测，其纯度为99.0%。
【权利要求】
1.一种规模化制备蟛蜞菊内酯化学对照品的方法，其特征在于:墨旱莲醇提物，经乙酸乙酯萃取、中压或减压硅胶柱色谱纯化、重结晶三个步骤，批量获取纯度大于98%的蟛蜞菊内酯对照品；具体步骤如下: 1)乙酸乙酯萃取: 墨旱莲醇提物，或墨旱莲药材经体积分数不小于70%的乙醇提取后减压干燥获得醇提物，加入提取物重量3-5倍体积的水，加热使其溶解，温度控制在30°C -40°C ;加入提取物重量1-2倍体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取2-4次，合并萃取液，减压浓缩至醇提物重量的1/3~1/6体积(ml/g，浓缩液体积/醇提物重量)，然后拌入等比例重量(g/ml，硅胶重量/浓缩液体积)的硅胶，干燥获得乙酸乙酯萃取物干粉； 2)中压或减压硅胶柱色谱纯化: 取径高比为2~12.5的不锈钢柱作为层析柱，装入萃取物干粉1-2倍重量的硅胶作为层析分离硅胶，干法上样；用石油醚:乙酸乙酯:醋酸(体积比8:2:1-6:4:1)混合溶剂洗脱，中压柱压力0.2-0.3MPa，减压柱压力在-0.08-0.09MPa，薄层色谱检测，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(体积比3:7:0.5-5:5:0.5)为展开剂，收集Rf值在0.40-0.48的洗脱液，减压浓缩，析出浅白色沉淀为蟛蜞菊内酯粗品； 3)重结晶: 上述对照品粗品用乙酸乙酯或甲醇溶解，-4°C -10°C放置析晶，即可获得纯度大于98%的蟛蜞菊内酯对照品，其外观为白色粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中拌样硅胶为100-200目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中层析分离硅胶为100-200目或200-300目，装柱前不需干燥活化处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中洗脱剂洗脱8~12倍柱体积。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤3)中重结晶时所用乙酸乙酯为分析纯重蒸溶剂，甲醇为色谱级，溶解后的母液需过滤后滤液再行放置结晶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:过滤采用的微孔滤膜为0.22-0.45微米的微孔滤膜。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:墨旱莲醇提物制备过程为，墨旱莲药材，加入药材重量10-12倍体积的乙醇溶液，其中乙醇的体积分数为70%-100%，回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，减压干燥即可得墨旱莲醇提物。
【文档编号】C07D493/04GK104045648SQ201310082363
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】肖红斌, 王莉, 彭杰, 程孟春 申请人:中国科学院大连化学物理研究所