专利名称：新型多肽、水解抗菌肽及其制备方法
新型多肽、水解抗菌肽及其制备方法技术领域
本发明属于生物技术领域，具体说涉及一种新型多肽及其重组水解抗菌肽的制备方法。
背景技术：
抗生素的滥用会导致药物残留等公共卫生问题，并引发耐药菌株和新的致病亚型菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。开发新的抗菌药物成为一个越来越重大的研究课题。
抗菌肽是一种小分子的多肽类物质，具有广谱抗菌活性，对原核生物有作用，对真核生物无害。抗菌肽是生物防御系统中产生的一类对抗外源性病原体的肽类物质，是生物先天的、非特异性防御系统的重要组成部分。抗菌肽可与革兰阴性菌外膜的脂多糖或革兰阳性菌表面的肽聚糖结合，使其被破坏而形成穿膜通道，胞内离子大量流出，细胞因高渗破裂而死亡，不易产生耐药性。另外，它还具有免疫调节、促进损伤修复、中和内毒素及对抗脓毒性休克的作用。因此，抗菌肽具有极广泛的应用价值。
然而，抗菌肽的生产技术一直是个瓶颈。天然抗菌肽由于含量低，提取成本高，不可能实现产业化。可能实现抗菌肽大规模生产的技术平台有化学合成和基因工程技术。因制备成本相对较低，运用基因工程方法生产重组抗菌肽是一个令人关注的途径。大肠杆菌是迄今为止体内表达多肽最常用的宿主微生物，然而抗菌肽对大肠杆菌有毒性，经常不能成功表达，或以无活性的包含体形式表达，以最大程度减轻对宿主细胞的毒性。这对需正确折叠才有抗菌活性的大多数天然抗菌肽来说是致命的。一般地，线性抗菌肽的抗菌活性不依赖于结构。若线性抗菌肽串联起来在大肠杆菌中以包含体形式高效表达，再将包含体水解，将会直接释放出有活性的抗菌肽，这是利用大肠杆菌规模化生产高活性抗菌肽的有效途径。发明内容
有鉴于此，本发明提供一种核苷酸序列、含有该序列的重组载体及重组菌株，它们可以用于抗菌肽的制备。
为实现上述目的，本发明的技术方案为:
编码抗菌肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1所示。
含有所述的核苷酸序列的重组载体。
所述的重组载体， 在所述核苷酸序列的5’端引入BamHI位点，且在3’端XhoI引入位点，酶切后得酶切片段，同时对PGEX-4T-1上述位点进行酶切后，连接所述酶切片段和酶切后的PGEX-4T-1连接，得重组载体。
所述重组载体制备的重组菌株。
本发明的目的之二在于提供新型多肽及其制备方法，所述新型多肽为具有抗菌效果的多肽的中间品。其制备方法简单，可用于工业化生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案为:
所述的核苷酸序列编码的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
选择具有高抗菌活性的线性抗菌肽元件，线性抗菌肽元件有:1)RRWRIVVIRVRR、2)RIffVIffRR,3)RLARIVVIRVAR(Patel DA, et al.20 12)、4)RLCRIVVIRVCR、5)ILPffKffPffffPffRR(Hilpert K，et al.，2008)。把这些抗菌肽元件串联，按大肠杆菌偏好的密码子优化设计编码序列。
所述的抗菌肽的制备方法，具体包括以下步骤:
A抗菌肽基因的合成及表达载体构建
将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的编码序列5，和3，端引入BamHI和XhoI酶切位点，与PGEX-4T-1分别进行酶切后再连接构建重组质粒，并转化到BL21，构建重组菌株;
B诱导表达
步骤A所得重组菌株单菌落接种于含100 μ g/mL氨苄青霉素的BL培养基，37°C培养过夜，按5%体积比接种于IOOmL BL培养基中，37°C振摇培养至细菌浓度达到OD6tltl =0.6 时，按 0.lmmol/L 加入 IPTG, 37°C、180r/m 振摇培养 5h, 4°C、12000r/m 离心 IOmin 收集菌体，按每IOOml培养液加入20ml PBS重悬沉淀，得抗菌肽。
所述的抗菌肽的制备方法，步骤A所得重组菌株抗性培养至富集后，收集菌体，所述菌体中含有所述抗菌肽。
本发明的目的之三在于提供具有抗菌活性的多肽制剂，其抗菌效果好，商业应用价值大。
所述的抗菌肽制剂，所述制剂为水解抗菌肽。
所述的制剂的制备方法，在所述抗菌肽中调节pH值至2.0，加入胃蛋白酶，37°C孵育5h，用NaOH溶液调节pH至7.0，12000r/m离心lOmin，收集上清。上清经微滤、喷雾干燥或冻干，即为水解多肽制剂。
本发明的有益效果:本发明利用胃蛋白酶的水解特性，设计了一种多肽，将如SEQID NO:1所示的核苷酸序列编码序列克隆至PGEX-4T-1，在大肠杆菌中以包含体形式表达，实现了抗菌肽的高效表达，表达产物可在胃蛋白酶的水解下释放出高活性多肽。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1为抗菌肽经IPTG诱导在大肠杆菌中的表达情况(免疫印迹)，其中，M为蛋白质Marker, I为新型多肽。
图2为胃蛋白酶对重组的新型多肽的水解情况(免疫印迹)，其中，I为未水解，2-6依次水解1、2、3、4和5h。
图3为胃蛋白酶水解新型多肽后得到的水解抗菌肽对大肠杆菌的抑菌效果，其中，1-5依次水解1、2、 3、4和5h，C为水解的未诱导重组菌。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一新型多肽的重组表达载体构建I新型多肽基因的设计与合成根据大肠杆菌BL21菌株的密码子偏好性优化上述氨基酸序列的编码序列，釆用美国PE公司391型DNA自动合成仪合成基因序列。基因序列如SEQ ID NO:1所示:5’ -cgctggcaatggcgcgatcctcgccgttggcgcatcgtggttattcgtgtacgtcgtgatccggcggagatctacggcacgaaagagtctccgcagactcactactatgatccgcgtatctgggtgatctggcgccgtgacccacgtctggctcgcatcgttgtcatccgtgtagctcgtgacccgatcctgccgtggaaatggccatggtggccgtggcgtcgcgatccgcgtctgtgccgtattgttgtaattcgtgtatgccgtgatcctcgtcgctggtggtgccgcgatccgggtcgtcgccgtcgctctgttcagtggtgtgccgatccacgtcgttggtggacccgt-3’。(2)多肽表达载体及重组菌株的构建在编码基因的5 ’和3 ’端引入BamHI和XhoI酶切位点:5’ GGATCCcgctggcaatggcgcgatcctcgccgttggcgcatcgtggttattcgtgtacgtcgtgatccggcggagatctacggcacgaaagagtctccgcagactcactactatgatccgcgtatctgggtgatctggcgccgtgacccacgtctggctcgcatcgttgtcatccgtgtagctcgtgacccgatcctgccgtggaaatggccatggtggccgtggcgtcgcgatccgcgtctgtgccgtattgttgtaattcgtgtatgccgtgatcctcgtcgctggtggtgccgcgatccgggtcgtcgccgtcgctctgttcagtggtgtgccgatccacgtcgttggtggacccgt￡X￡^2r3’。利用BamHI/XhoI多克隆位点克隆到pGEX_4T_l质粒中，得抗菌肽的重组表达载体。实施例二新型多肽的制备`将实施例一制备的重组表达载体转化到表达菌株BL21中，构建BL21重组菌株。重组BL21菌株单菌落接种于含lOOyg/mL氨苄青霉素的BL培养基，37°C培养过夜，按5%体积比接种于IOOmL BL培养基中，37°C振摇培养至细菌浓度达到0D_ = 0.6时，按0.1mmol/L加入IPTG，370C、180r/m振摇培养5h，4°C、12000r/m离心IOmin收集菌体，按每IOOml培养液加入20ml PBS重悬沉淀，结果如图1所示。所述新型多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示， N’ -RRWRIVVIRVRRDPAEIYGTKESPQTHYYDPRIffVIWRRDPRLARIVVIRVARDPILPffKffPffffPffRRDPRLCRIVVIRVCRDPRRffffCRDPGRRRRSVQffCADPRRffffTR-C,o实施例三抗菌肽的制剂将菌体混悬液冰水浴，超声裂解，功率为125w，工作5s，间歇Is。向裂解液中加入盐酸调节PH至2.0，加入胃蛋白酶，37°C孵育5h，用NaOH溶液调节pH至7.0,12000r/m离心lOmin，收集上清。上清经微滤、喷雾干燥或冻干，即为水解抗菌肽。实施例四水解抗菌肽的水解效果测试实施例3方法所得的水解抗菌肽样本分别经10 % SDS-PAGE分离后转印NC膜，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2h ;TBST洗涤3次；加入小鼠抗GST单克隆抗体(I: 4000，体积稀释)，室温孵育Ih ；TBST洗涤3次；再加入碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(l: 5000，体积稀释)，室温孵育I小时；TBST洗涤3次；置BCTP/NBT显色液中显色。结果如图2所示，经免疫印迹分析可见，随着水解时间的延长，沉淀中的重组多肽含量在逐步降低，水解5小时沉淀中重组多肽。实施例五水解抗菌肽的抗菌效果测试重组人工水解多肽的抑菌实验(薄层琼脂糖孔穴扩散法)，具体为:在含1.5%琼脂的LB培养基中，加入培养至对数生长期的大肠杆菌K88，使琼脂内的细菌浓度达到107CFU/ml，摇匀，倒入培养皿，待其冷却凝固后，用打孔器在培养基上等距离打6个孔(直径8mm)，依次加入不同水解时间的多肽水解液和未诱导的重组菌株培养物水解液，30 μ I/孔，各组均做3个重复，置于37°C培养24h。观察结果，或如图3所示，由抑菌实验结果可见，用胃蛋白酶水解产生了有活性的物质，并且这种抗菌物质是由重组多肽产生的。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要 求范围当中。
权利要求
1.编码新型多肽的核苷酸序列，其特征在于，如SEQID N0:1所示。
2.含有权利要求1所述的核苷酸序列的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，在所述核苷酸序列的5’端引入BamHI位点，且在3’端引入XhoI位点，BamHI和XhoI位点酶切后得酶切片段，同时对pGEX_4T_l上述位点进行酶切后，连接所述酶切片段和酶切后的PGEX-4T-1连接，得重组载体。
4.权利要求2所述重组载体制备的重组菌株。
5.权利要求1所述的核苷酸序列编码的新型多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
6.权利要求5所述的新型多肽的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤: A新型多肽基因的合成及表达载体构建 将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的编码序列5’和3’端引入BamHI和XhoI酶切位点，与PGEX-4T-1分别进行酶切后再连接构建重组质粒，并转化到BL21，构建重组菌株； B诱导表达 步骤A所得重组菌株单菌落扩大培养，加入IPTG诱导后，37°C、180r/m振摇培养5h，4°C、12000r/m离心IOmin收集菌体，按每IOOml培养液加入20ml PBS重悬沉淀，得新型多肽。
7.根据权利要求6所述的新型多肽的制备方法，其特征在于:步骤A所得重组菌株抗性培养至富集后，收集菌体，所述菌体中含有所述新型多肽。
8.权利要求5所述的新型多肽的制剂，其特征在于，所述制剂为水解后的所述新型多肽，即水解抗菌肽。
9.权利要求8所述的制剂的制备方法，其特征在于，在所述抗菌肽中调节pH值至1.5-2.0，加入胃蛋白酶至充分水解，并调节pH至中性，离心后收集上清液；上清液经微滤、喷雾干燥或冻干，即为水解抗菌肽。
全文摘要
本发明涉及一种新型多肽及其重组水解多肽的制备方法，具体为抗菌肽及其制备方法，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；本发明根据胃蛋白酶的水解特性，人工设计了一条可被其良好水解的多肽，根据大肠杆菌BL21菌株的密码子偏好性，化学合成编码序列，克隆到pGEX-4T-1质粒中，转化到BL21菌株，用IPTG诱导，实现以包含体形式高效表达的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白。收集诱导表达菌体，在胃蛋白酶水解作用下释放出耐受胃蛋白酶的有活性的抗菌肽。重组新型多肽及其水解多肽可作为畜禽饲料添加剂或用于畜禽疾病的预防与治疗。
文档编号C07K14/00GK103194442SQ20131010806
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月29日 优先权日2013年3月29日
发明者沈克飞, 郑华, 曹兰, 徐登峰, 付利芝, 杨睿, 王孝友 申请人:重庆市畜牧科学院