重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用的制作方法

重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用。上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，通过使用亲和层析法将重组菌表达的可溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，尤其是将包涵体裂解，结合利用透析法和亲和层析法对包涵体中的不溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，并通过对提纯的条件和工艺参数进行优化，从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果，提纯度可达95%，而传统方法的提纯度为60%。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。
【专利说明】重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法 及其应用。

【背景技术】
[0002] 植原体（phytoplasma)是一类GC含量比较低，无细胞壁，仅有3层单位膜包被的 原核微生物，专性寄生于植物和昆虫。植物染病主要症状包括丛枝、黄化、花变叶、花器退化 等，由于植原体侵染性强，危害寄主广泛，曾造成许多经济作物、林木的大量死亡，带来严重 的经济损失。由于植原体为无细胞壁原核微生物，尚不能在人工培养基上离体培养，给分 类鉴定、传播机制、致病机制的研究带来许多困难。因为蛋白质是最终遗传信息功能的实施 者，而且植原体缺乏细胞壁，其膜蛋白可以直接与植物的细胞质或介体昆虫的细胞接触，在 寄主和病原的相互作用中起着重要作用。因此研究植原体膜蛋白对于建立植原体血清学检 测方法，揭示植原体的进化、致病性及其与寄主的相互作用具有重要意义。
[0003] 而免疫主导膜蛋白（immunodominant membrane proteins，IDPs)是大多数植原体 总细胞膜蛋白的主要部分。将各组植原体的免疫膜蛋白IDPs分成三种类型：（1)免疫主导 膜蛋白（immunodominant membrane protein，Imp)，代表性植原体有 SPWB、AP、ESFY、]3〕和 PYLR ; (2)免疫主导膜蛋白 A (immunodominant membrane protein A，IdpA)，代表性植原 体是WX ;(3)免疫抗原膜蛋白（antigenic membrane protein, Amp),代表性植原体是AY和 CP。1999年Michael Berg等从苹果丛枝植原体中分离出免疫主导膜蛋白（immunodominant membrane protein, Imp),并外源表达基因不同片段产物。研究中Berg等人分别在长春花 和烟草染病植株中检测到了分子量大约为19KDa大小相似的蛋白，序列分析表明该类蛋白 具有整合膜蛋白的特征，其N端暴露在细胞质一侧，一个疏水跨膜片段形成α螺旋锚定在 膜中，亲水的C端暴露在细胞外。2004年，Kakizawa等人克隆了植原体Sec (细胞分泌）系 统蛋白A、E、Y，且研究发现SecA有较强的免疫原性，其抗血清能检测多种植原体。但是由 于不同植原体膜蛋白特异性的差异，有些膜蛋白能够在大肠杆菌体系内完整表达，有些则 表达困难，且易形成包涵体，另一方面即使膜蛋白在大肠杆菌系统进行了表达，但由于膜蛋 白的疏水性、溶解度等性质为后续下游分离纯化膜蛋白造成了困难。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种有效提高重组植原体免疫 主导膜蛋白纯化度的方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种重组植原体免疫主导膜蛋白的应用。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0007] 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌，诱导表达；
[0008] 破碎经诱导表达后的重组菌，分离得到上清液一和沉淀物一；
[0009] 将上述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结 合缓冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡1?2小时后静置沉降，然后 依次经漂洗、洗脱处理，得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液；
[0010] 将上述沉淀物一悬重洗涤后并经孵育处理，得到所述沉淀物一的溶解液；将所述 沉淀物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所述结合缓冲液混合液中，该树脂悬液与结合缓 冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡1?2小时后静置沉降，然后依次 经漂洗、洗脱处理，得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液；
[0011] 将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体免疫 主导膜蛋白的溶液进行透析浓缩，得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。
[0012] 以及，一种上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植原体免疫 主导膜蛋白在医学免疫、克隆抗体、致病机理研究领域中的应用。
[0013] 上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，通过使用亲和层析法将表达植原体 免疫主导膜蛋白的重组菌表达的可溶性蛋白进行提纯，尤其是将包涵体裂解，结合利用透 析法和亲和层析法对包涵体中的不溶性蛋白进行提纯，并通过对提纯的条件和工艺参数进 行优化，从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果，提纯度可达95%，而传统方 法的提纯度为60%。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。
[0014] 正是由于上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植原体免疫 主导膜蛋白具有很高的纯度，可广泛应用于医学免疫、克隆抗体、分类鉴定、生理生化及其 致病机理的研究等领域。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1是本发明实施例重组植原体免疫主导膜蛋白纯化的方法工艺流程示意图；
[0016] 图2是本发明实施例中构建重组质粒pET_28a ( + ) -Imp的示意图；
[0017] 图3是本发明实施例分别将引物对一、引物对二、引物对三进行PCR扩增，将得到 的重组植原体免疫主导膜蛋白（Imp)基因后进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到三种引物对扩 增的检测结果，其中Μ列为Marker，即分子量标准，1列为引物对一的检测结果，2列为引物 对二的检测结果，3列为引物对三的检测结果；
[0018] 图4是本发明实施例将诱导表达后的重组菌和含空质粒的大肠杆菌得到的可溶 性蛋白和包涵体进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列为标准蛋白（marker)的 分子量，1列为包涵体的检测结果，2列为可溶性蛋白的检测结果，BSA列为参照的蛋白分子 量；
[0019] 图5是将本发明实施例1?9中不同咪唑浓度条件下纯化得到的可溶性重组植 原体免疫主导膜蛋白溶液进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列为标准蛋白 (marker)的分子量，1?9列分别对应实施例1?9的检测结果；
[0020] 图6为本发明实施例获得的不同量的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白与 lml50%Ni-NTA-His ·Β?ικ!树脂结合后再进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列 为标准蛋白（marker)的分子量，1列为10mg的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检 测结果，2列为8mg的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检测结果，3列为5mg的可 溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检测结果；
[0021] 图7为本发明实施例纯化得到的包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白溶液进行 SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列为标准蛋白（marker)的分子量，1列为第一 次洗脱的检测结果、2列为第二次洗脱的检测结果、3列为第三次洗脱的检测结果、4列为第 四次洗脱的检测结果；可见，随着洗脱次数的增加，洗脱得到蛋白的浓度越来越少，但纯度 会增加。
[0022] 图8为本发明实施例获得的包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白溶液浓缩后进行 SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列为标准蛋白（marker)的分子量，1列为包涵 体重组植原体免疫主导膜蛋白的分子量；
[0023] 图9为本发明实施例纯化后获得的重组植原体免疫主导膜蛋白进行Western Blotting检测的结果，其中Μ列为标准蛋白（marker)的分子量，1列为重组植原体免疫主 导膜蛋白的检测结果、2列为空白对照的检测结果；可见1列中所出现的条带为重组植原体 免疫主导膜蛋白；
[0024] 图10为将发明实施例获得的重组植原体免疫主导膜蛋白用于制备免疫抗体，并 用间接ELISA法测定的效价图。

【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0026] 本发明实施例提供了一种有效提高重组植原体免疫主导膜蛋白纯化度的方法。该 重组植原体免疫主导膜蛋白纯化方法的工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
[0027] S01，获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌，诱导表达；
[0028] S02,破碎步骤S01中经诱导表达后的重组菌，分离得到上清液一和沉淀物一；
[0029] S03,将步骤S02中得到的上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中，所述 树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡1?2小时 后静置沉降，然后依次经漂洗、洗脱处理，得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液；
[0030] S04,将所述沉淀物一洗涤，用溶解缓冲液悬重洗涤后的沉淀物一并经孵育处理， 得到所述沉淀物一的溶解液；将所述沉淀物一的溶解液加入至树脂悬液与结合缓冲液混合 液中，所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡 1?2小时后静置沉降，然后依次经漂洗、洗脱处理，得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋 白的溶液；
[0031] S05,将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体 免疫主导膜蛋白的溶液进行透析浓缩，得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。
[0032] 具体地，上述步骤S01中，获得表达植原体免疫主导膜蛋白重组菌的方法优选为：
[0033] ⑴扩增基因片段：首先，选取植原体免疫主导膜蛋白（Imp)的基因，该基因的DNA 序列在Gene bank已有公布，其中AP株基因序列登录号为AJ011678 ;为后续利用His标签 亲和层析法来纯化植原体免疫主导膜蛋白，因此合成含有6XHis Tag序列的植原体免疫主 导膜蛋白基因，该优选的6XHis Tag可以位于植原体免疫主导膜蛋白基因的C端或N端， 其对NTA琼脂糖中的镍离子有较强的亲和吸附作用，可以使被标签的植原体免疫主导膜蛋 白基因在亲和层析的过程中更容易纯化。接着，根据上述含有6XHis Tag序列的植原体免 疫主导膜蛋白基因设计引物对，利用常规的PCR反应进行目的基因扩增。
[0034] 进一步地，上述引物对为引物对一、引物对二、引物对三中的任一种；其中， 上述引物对一包含上游引物（FI) F' 5' -ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3' 和 下游引物（Rl) R'5'-CGCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3' ；上述引物对二包 R' 5' -CCCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3' ；上述引物对三包含上游引物（F1) F'5'-GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3' 和下游引物（R1)R'5'-CCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'。如图2所示，上述上游引物（F1)引入的酶切位点为Nde I，下游引物（R1)引入的酶切位点为Xho I。
[0035] 更进一步地，取上述PCR反应的体系为50ul，其中包含2ul的Imp基因 DNA模板、 lul的上游引物（Fl)、lul的下游引物（Rl)、25ul的DNA聚合酶(优选型号为Prime MIX)， 21ul的重蒸水（ddH20)。该PCR反应扩增的条件为：在95°C下预变性5min，在94°C下变性 2min，在50°C?60°C下退火lmin，在72°C下延伸2min，共30个循环，然后在72°C下延伸 lOmin，接着在4°C下保温。
[0036] 将上述三种引物对置于上述PCR反应体系中进行扩增，将得到的重组植原体免疫 主导膜蛋白（Imp)基因进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到三种引物对扩增的检测结果，结果请 参见图3,其中Μ列为marker，即DNA分子量标准，1列为引物对一的检测结果，2列为引物 对二的检测结果，3列为引物对三的检测结果。通过对比可知引物对一在上述PCR反应体系 下的扩增效果最好，在该扩增反应中，退火温度优选为50°C。
[0037] (2)构建重组质粒：选用质粒pET_28a ( + )作为转化的载体，先用上述内切酶Nde I和Xho I同时酶切上述扩增好的重组植原体免疫主导膜蛋白（Imp)基因，并用同样的内切 酶Nde I和Xho I同时酶切上述质粒pET-28a( + )，再用连接酶将同样双酶切过的Imp基因 片段和质粒pET-32a ( + )进行连接，连接酶优选为T7连接酶，从而获得重组质粒pET-28a (+ )-Imp,该重组质粒如图2所示。
[0038] (3)构建重组大肠杆菌：将上述重组质粒pET_28a ( + ) -Imp转化入感受态大肠杆 菌，该感受态大肠杆菌为BL21 (DE3)、DH5 a、JM109中的任一种，优选为BL21 (DE3)，得到表 达重组植原体免疫主导膜蛋白（Imp)的重组菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )-lmp。
[0039] 进一步地，该步骤SOI中，在诱导表达之前，还可以包含筛选阳性植原体免疫主导 膜蛋白（Imp)重组菌的步骤：将上述重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-28a ( + ) -Imp接种在氨 苄青霉素（AMP)LB培养基上，由于质粒pET-28a ( + )与氨苄青霉素存在细菌抗性，经筛选获 得阳性菌落。
[0040] 再进一步地，该步骤S01中，诱导上述重组菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )-lmp表达 的方法为：先将上述重组菌BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-lmp接入10ml的LB液体培养基中过 夜培养，其中，该LB液体培养基中包含浓度为40ug/ml的硫酸卡那霉素（Kana)，培养的温度 为35?37°C，优选为37°C，搅拌的转速为200?250rpm，优选为200rpm ;然后按1%的接种 量转接至50ml的LB培养基中继续培养2?3小时；培养至0D600为0. 5?0. 8时，优选 0D600为0. 6,再加入诱导剂IPTC诱导植原体免疫主导膜蛋白（Imp)重组菌表达蛋白质至浓 度为0. 4mmol/L?0. 6mmol/L，接着在温度为35?37°C下培养4?6小时，优选为在37°C 下培养6小时。
[0041] 取含空质粒的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )作为空白对照组，用上述重组菌 BL21(DE3)/pET-28a ( + ) -Imp的诱导表达方法进行诱导表达。分别取lml的上Imp重组 菌菌液和空白对照组菌液，先离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，再用抽提试剂溶解菌体得 到上清液和沉淀物，其中抽提试剂优选为默克公司生产的Bugbuster Master Mix, 500ml规 格，货号为70548-4,该上清液为可溶性蛋白，该沉淀物为包涵体。将该上清液和包涵体悬 液进行SDS-PAGE凝胶电泳检测扫描，对目的蛋白Imp进行可溶性分析。分析结果如图4， 结果显示构建于pET-28a(+)原核表达载体中的植原体免疫主导膜蛋白（Imp)基因，在宿主 菌BL21(DE3)中经诱导表达后，目的蛋白Imp主要以包涵体形式存在。经凝胶扫描后，以已 知蛋白分子量的BSA为参照，通过Gene Tools半定量分析，得知包涵体的含量占总蛋白的 70%以上。
[0042] 具体地，上述步骤S02中，由于大部分的目的蛋白以包涵体的形式存在于重组菌 中，因此需要将步骤S01中经诱导表达后的重组菌破碎。破碎重组菌的方法包含直接破碎 法或复合破碎法，优选复合破碎法。其中，上述直接破碎法为采用裂解液破碎重组菌，裂解 液优选为默克公司生产的Bugbuster Master Mix(500ml规格，货号为70548-4)，此法使重 组菌的细胞粘度增大，并且镜检细胞的破碎率只有80%。上述复合破碎法为冻融和裂解液裂 解相结合的方法，裂解液优选为默克公司生产的Bugbuster Master Mix (500ml规格，货号 为70548-4):先将步骤SOI中经诱导表达后的重组菌液体离心分离成上清液和沉淀物，将 沉淀物在-40?-20°C的温度下冻融2?4次后，优选为在-20°C下冻融2次，加入裂解液， 该裂解液优选为默克公司生产的Bugbuster Master Mix(500ml规格，货号为70548-4);再 在室温下重悬，在20?25°C下振荡孵育30?60分钟，优选为在25°C下将重悬的细胞液振 荡孵育30分钟，使重组菌充分裂解；其中，上述抽提试剂与上述沉淀物的体积质量比为5? l〇ml/g，优选为5ml/g。上述复合破碎法使重组菌的细胞粘度降低，并且镜检细胞的破碎率 为 100%。
[0043] 该步骤S02中，将裂解后得到的混合物在4°C的温度下，以12000rpm的转速离心 20分钟，分离得到上清液一和沉淀物一。
[0044] 具体地，上述步骤S03中，采用亲和层析法提纯上清液一中的可溶性重组植原体 免疫主导膜蛋白（Imp)，提纯的方法优选为：首先，将树脂悬液与结合缓冲液轻柔吹打混 匀，待树脂自然地沉降后获得混合液，所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1?4 : 1?5,优选为1:4 ;进一步地，该树脂悬液优选为50%的Ni-NTA His ·Β?ικ!树脂悬液，该结 合缓冲液优选为lXNi-NTA结合漂洗缓冲液，该混合液为将上述50%的Ni-NTA His · Bind 树脂悬液加入1 XNi-NTA结合漂洗缓冲液中；更进一步地，上述50%的Ni-NTA His · Bind 树脂悬液的用量可根据重组植原体免疫主导膜蛋白（Imp)的表达量或者待纯化样品的量而 定，通常lml的50%的Ni-NTA His ·Β?η(1树脂可结合5?10mg的6XHis Tag的Imp蛋白， 优选为lml的50%的Ni-NTA His · Bind树脂结合5mg的6XHis Tag的Imp蛋白。取lml 的50%的Ni-NTA His .Bind树脂，分别加入5mg、8mg、10mg的6XHis Tag的重组Imp,吸附 后收集流出液，分别进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图6所示，可见当重组Imp质量大 于5mg时，流出液中有未被吸附的重组Imp,因此最好选择重组Imp的量为5mg/ml。
[0045] 进一步地，上述步骤S03中，上述IXNi-NTA结合漂洗缓冲液中含有浓度为0? 10mM/L的咪唑，PH值为7?8。接着，用枪吸取步骤S02中得到的上清液一使加入至上述 混合液中，使之与平衡好的Ni-NTA His ·Β?ικ!树脂混匀，在4?8°C的温度下振荡1?2小 时，优选为4°C下振荡1小时。此时上清液中的重组Imp已经较好地与Ni-NTA His · Bind 树脂结合，将该结合好的Ni-NTA His*Bind树脂加入层析住中，静置等待树脂自然沉降。由 于上述重组菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )-lmp表达的Imp由于带有6个His-Tag (组蛋白标 签)，与Ni-NTA His ·Β?ικ!树脂中的过渡金属离子Ni2+有较强的亲和吸附作用，当上清液一 中的可溶性重组Imp蛋白与Ni-NTA His ·Β?η(1树脂混合时，带有组氨酸标签的重组Imp特 异性结合到Ni-NTA His · Bind树脂里，使其他的杂蛋白游离。此外，咪唑也可以与Ni-NTA His · Bind树脂中的Ni2+竞争性结合，当1 XNi-NTA结合缓冲液含有低浓度咪唑时，除了帮 助重组植原体免疫主导膜蛋白更好地与树脂结合，还有助于洗涤掺杂到树脂里的杂蛋白； 而PH值为7?8的Ni-NTA结合缓冲液可以避开等电点，防止蛋白质沉淀，尤其在PH值为 7. 0时可有效提高纯化的重组植原体免疫主导膜蛋白量。
[0046] 再进一步地，该步骤S03中，漂洗步骤使用Ni-NTA漂洗缓冲液，优选为1 X Ni-NTA 漂洗缓冲液，其中Ni-NTA漂洗缓冲液中的咪唑浓度为20?60mM/L，PH值为7?8 ;洗脱步 骤使用Ni-NTA洗脱缓冲液，优选为1 X Ni-NTA洗脱缓冲液，Ni-NTA洗脱缓冲液中的咪唑浓 度为200?300mM/L，PH值为7?8。如上所述，咪唑也可以与Ni-NTA His · Bind树脂中 的Ni2+竞争性结合，当缓冲液中含有低浓度的咪唑时，可以洗涤掺杂到树脂里的杂蛋白；当 缓冲液中含有高浓度的咪唑时，可以将结合到树脂中的重组植原体免疫主导膜蛋白洗脱出 来；而PH值为7?8的缓冲液可以避开等电点，防止蛋白质沉淀，尤其在PH值为7. 0时可 有效提高纯化的重组植原体免疫主导膜蛋白量。因此，上述上清液一与Ni-NTA His · Bind 树脂混匀、静置沉降后，用上述Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗两次、再用Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱， 得到纯化的可溶性所述重组植原体免疫主导膜蛋白（Imp)。具体lXNi-NTA结合缓冲液、 Ni-NTA漂洗缓冲液以及Ni-NTA洗脱缓冲液中咪唑的浓度优化过程见后续具体实施案例， 优化结果见图5,其中Μ列为标准蛋白（marker)的分子量，1?9列分别对应实施例1?9 的检测结果。上述得到的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白（Imp)，在4?8°C的温度下， 用不含DTT的透析缓冲液透析3?4小时，替换缓冲液并继续透析2?3次，脱去高浓度咪 唑。优选为在4°C下透析4小时后，更换透析缓冲液继续透析2次，每次4小时，得到可溶 性頂P蛋白溶液；其中上述透析缓冲液包含0. 01?0. 02mol/L的Tris-HC1，PH值为8. 2? 8. 5。，优选为包含 0· 02mol/L 的 Tris-HCl，PH 值为 8. 5。
[0047] 具体地，上述步骤S04中，首先，将步骤S02得到的沉淀物一进行进行溶解：将沉 淀物一重悬洗涤两次，洗涤步骤使用洗涤液，该洗涤剂优选为包涵体洗涤液，该洗涤液与 沉淀物一的体积质量比为15?20ml/g。优选地，上述包涵体洗涤液包含50?60mmol/L Tris-HCl，90 ?100mmol/L NaCl，0· 5 ?lmmol/L 乙二胺四乙酸，7 ?8mmol/L 聚乙二醇辛 基苯基酿，ρΗ8· 0 ?8. 2,优选为包含 50mmol/L 的 Tris-HCl、100mmol/L 的 NaCl、lmmol/L 的 乙二胺四乙酸（EDTA)、0. 5%的聚乙二醇辛基苯基醚，PH值为8. 0。
[0048] 接着，将洗涤后的沉淀物一用溶解缓冲液悬重并经孵育处理，得到所述沉淀物一 的溶解液。进一步地，在用溶解缓冲液悬重的步骤之前还包含离心分离的步骤：将洗涤后的 沉淀物一在4°C下以转速为12000rpm离心处理20分钟，收集沉淀物，该沉淀物主要为沉淀 物一中的包涵体。再进一步地，上述溶解缓冲液优选为包涵体溶解缓冲液，该包涵体溶解缓 冲液包含500?BOOmmol /T,的3_ (环己胺）_1_丙横酸盐（CAPS)、10?15mmol/L的N-十二 烷基肌氨酸钠和0. 8?1. Ommol/L的二硫苏糖醇，PH值为10?11，再优选为包含500mM的 CAPS、0. 3%的N-十二烷基肌氨酸钠和ImM的二硫苏糖醇，PH值为11. 0 ;其中，上述包涵体 溶解缓冲液与沉淀物的体积质量比为50?100ml/g，并且发明人通过大量的研究发现，当 沉淀物的量大于〇. 〇lg时，包涵体难以全部溶解，会有沉淀残留，因此包涵体溶解缓冲液与 沉淀物的体积质量比优选为l〇〇ml/g，可以彻底溶解该包涵体。再进一步地，上述孵育处理 优选为在室温下孵育15分钟。
[0049] 进一步地，该步骤S04中，将得到的沉淀物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所 述结合缓冲液混合液之前还包含还包含离心分离的步骤：将上述沉淀物一的溶解液在4°C 下以转速为12000rpm离心处理20分钟，得到上清液，该上清液主要包含包涵体中的重组 lmp〇
[0050] 进一步地，该步骤S04中，采用亲和层析法提纯沉淀物一的溶解液中的包涵体重 组植原体免疫主导膜蛋白（Imp):将上述沉淀物一的溶解液与上述50%的Ni-NTA His ·Β?ικ! 树脂混匀，在4°C下振荡结合1小时，此时沉淀物一溶解液的重组Imp蛋白已经较好地与树 脂结合，将该结合好的树脂加入层析住中，静置等待树脂自然沉降，用上述1 XNi-NTA漂洗 缓冲液漂洗两次、用上述lXNi-NTA洗脱缓冲液洗脱，得到蛋白溶液；用上述包涵体溶解缓 冲液稀释该蛋白溶液一，该包涵体溶解缓冲液稀释与蛋白溶液一的体积比为50:1，在4? 8°C的温度下，透析3?4小时，替换缓冲液并继续透析2?3次，用不含DTT的透析缓冲液 继续透析2?3次，每次透析3?4h，重新折叠变性蛋白，脱咪唑。优选为在4°C下透析4小 时后，更换透析缓冲液继续透析3次，每次4小时，用不含DTT的透析缓冲液继续透析3次， 每次透析4h，得到蛋白溶液二。其中上述透析缓冲液包含0. 01?0. 02mol/L的Tris-HCl、 0. 05?0. lmmol/L的二硫苏糖醇，PH值为8. 2?8. 5。，优选为包含0. 02mol/L的Tris-HCl、 0. ImM的二硫苏糖醇，PH值为8. 5。如果透析后样品中有可见的不溶物，在4°C的温度下 12000rpm (请核对是否有误？）离心10分钟去除沉淀。
[0051] 具体地，上述步骤S05中，将S03和S04得到的重组植原体免疫主导膜蛋白用 Millipore超滤管以十倍体系进行浓缩，浓缩电泳检测的结果请参见图8,其中Μ列为标准 蛋白（marker)的分子量，1列为包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白。
[0052] 上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，通过使用亲和层析法将重组菌表达 的可溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，尤其是将包涵体裂解，结合利用透析法和亲和 层析法对包涵体中的不溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，并通过对提纯的条件和工艺 参数进行优化，从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果，提纯度可达95%，而 传统方法的提纯度为60%。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。
[0053] 本发明实施例进一步提供了上述重组植原体免疫主导膜蛋白在医学免疫领域制 备抗体的方法：
[0054] S06,将步骤S05中得到的重组植原体免疫主导膜蛋白免疫动物：
[0055] 选取体重为2kg左右的家兔2只，每只采血4ml制备阴性对照血清；将上述重组植 原体免疫主导膜蛋白用PBS稀释到300ug/ml，取lml蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂充分 乳化。首次免疫通过背部皮下多点注射，在4个不同部位分别各注射约500 μ 1弗氏完全佐 剂乳化的抗原溶液；首次免疫两周后，将Imp蛋白溶液与等量弗氏不完全佐剂充分乳化。采 用同样的免疫方法加强免疫四次。第三次加强免疫七天后采血测定血清抗体效价。第四次 加强免疫后，待效价达到要求，用颈动脉全采血法收集血液，用5倍体积的PBS缓冲溶液稀 释，在4°C的温度、10, OOOrpm的转速下离心lOmin，分离上清抗血清在-20°C下分装保存。
[0056] S07,纯化多克隆抗体
[0057] 将硫酸铵固体粉末缓慢加入步骤S05中得到的血清上清液，磁力搅拌混匀，使硫 酸铵终浓度达到50%，于4°C冰箱中静置过夜；在10, OOOrpm的转速下离心30min，弃上清 液，将沉淀物用5ml(请提供具体容量)50%硫酸铵溶液洗涤1?2次，离心处理后取沉淀物， 该沉淀物用3ml的PBS充分溶解，离心去除不溶物，用于下一步的柱层析；取用lml上述结 合缓冲液平衡处理后的琼脂糖Protein A材料，用亲和层析法分离纯化出多克隆抗体；缓 慢的将抗血清上柱，上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗；用洗脱缓冲液洗脱，收集流出液； 洗脱后立刻用1M的Tris-HCl碱性缓冲液将收集到的抗体溶液调pH至中性，避免抗体失 活，于-80°C的温度下保存。
[0058] 进一步地，用Anti-His · Tag(HRP)标记步骤S07中得到的纯化多克隆抗体，用 Western blot检测带6XHis-Tag的IMP纯化蛋白。结果如图9所示，显示与对照样品相 t匕，在18KD?25KD间出现一条特异性条带。
[0059] 进一步地，采用间接ELISA法对上述多克隆抗体进行效价分析：（1)包被抗原：用 碳酸盐包被缓冲液稀释后的抗原蛋白并进行包被，加入酶标板(聚乙烯板)中，l〇〇uL/孔，在 4°C下包被过夜；（2)洗涤：弃去孔内的包被液，每孔加满TBST缓冲液洗板3次，轻轻拍干； (3)封闭：用封闭液进行封闭，每孔200ul，在37°C下孵育1小时；（4)孵育一抗：弃去封闭 液，TBST缓冲液洗板3次，加入不同稀释度的纯化的Imp多克隆抗体与抗血清(倍比稀释比 例为 1 :1000,1 :2000,1 :4000,1 :8000,1 :16000,1 :32000,1 :64000,1 :128000),每孔加入 100 μ 1，在37°C下孵育lh，同时做空白对照和阴性对照；（6)加酶标抗体：于每个孔板中加 入稀释的羊抗兔IgG-HRP100 μ 1，在37°C下孵育lh，弃去板孔中液体，用TBST缓冲液洗板3 次，轻轻拍干；（7)底物显色：每孔加入100ul底物显色液TMB，在37°C下避光作用30min ; (8)终止反应：加入终止液50 μ 1终止反应，用酶标仪在波长450nm处测定每孔的0D值。计 算实验组的〇D45(l与阴性对照的0D 45(I比值（P/N)。测定结果如表1、图10所示。
[0060] 表1抗血清多克隆抗体效价测定
[0061]

【权利要求】
1. 一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，包括如下步骤： 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌，诱导表达； 破碎经诱导表达后的重组菌，分离得到上清液一和沉淀物一； 将所述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结合缓 冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡1?2小时后静置沉降，然后依次 经漂洗、洗脱处理，得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液； 将所述沉淀物一悬重洗涤后并经孵育处理，得到所述沉淀物一的溶解液；将所述沉淀 物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所述结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结合 缓冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡1?2小时后静置沉降，然后依 次经漂洗、洗脱处理，得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液； 将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体免疫主导 膜蛋白的溶液进行透析浓缩，得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。
2. 根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述 树脂悬液为50%的Ni-NTA-His ·Β?ικ!树脂悬液；所述结合缓冲液为Ni-NTA结合缓冲液，所 述Ni-NTA结合缓冲液中的咪唑浓度为0?10mM/L，PH值为7?8。
3. 根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述 漂洗步骤使用Ni-NTA漂洗缓冲液，所述Ni-NTA漂洗缓冲液中的咪唑浓度为20?60mM/L， PH值为7?8 ;所述洗脱步骤使用Ni-NTA洗脱缓冲液，所述Ni-NTA洗脱缓冲液中的咪唑浓 度为200?300mM/L，PH值为7?8。
4. 根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于， 所述沉淀物一洗漆步骤使用包涵体洗漆缓冲液，所述洗漆缓冲液包含50?60mmol/L Tris-HCl，90 ?100mmol/L NaCl，0· 5 ?lmmol/L 乙二胺四乙酸，7 ?8mmol/L 聚乙二醇辛 基苯基醚，ρΗ8· 0?8. 2。
5. 根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述 淀物一经洗涤后用包涵体溶解缓冲液重悬，所述包涵体溶解缓冲液包含500?600mmol/L 的3-(环己胺）-1-丙磺酸盐、10?15mmol/L的N-十二烧基肌氨酸钠和0. 8?lmmol/L的 二硫苏糖醇，PH值为10?11。
6. 根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述 透析步骤为将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液和包涵体中重组植原体免疫主 导膜蛋白的溶液加入至透析液中，在4?8°C的温度下透析3?4小时；所述透析缓冲液包 含 0· 01 ?0· 02mol/L 的 Tris-HCl、0. 05 ?0· lmmol/L 的二硫苏糖醇，PH 值为 8. 2 ?8. 5。
7. 根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述 破碎经诱导表达后的重组菌的方法为直接破碎或复合破碎；其中，所述复合破碎的方法为： 将所述经诱导表达后的重组菌在-4?_20°C的温度下冻融2?4次，加入抽提试剂，在20? 25°C的温度下重悬，振荡孵育30?60分钟；其中所述抽提试剂体积与所述经诱导表达后的 重组菌的质量比为5?10ml/g。
8. 根据权利要求1所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在于，所述 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌的方法如下： 合成含有6XHis Tag序列的植原体免疫主导膜蛋白基因，设计引物对，扩增所述植原 体免疫主导膜蛋白基因； 将所述植原体免疫主导膜蛋白基因克隆至表达质粒上，得到重组质粒； 用所述重组质粒转化感受态大肠杆菌，得到表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌。
9. 根据权利要求8所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，其特征在 于，所述引物对为引物对一、引物对二、引物对三中的任一种；其中，所述引物对一包 含上游引物 F' 5' -ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3' 和下游引物 R' 5' -CGCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所述引物对二包含上游引物 F' 5' -CGCCATATGGAAGGTA AGCAGCAAATAACGA-3' 和下游引物 R' 5' -CCCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所 述引物对三包含上游引物F' 5' -GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物 R' 5'-CCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'。
10. 如权利要求1?9所述的重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植 原体免疫主导膜蛋白在医学免疫、克隆抗体、致病机理研究领域中的应用。
【文档编号】C07K1/22GK104232710SQ201310253850
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月24日 优先权日:2013年6月24日
【发明者】刘仲健, 李利强, 肖新菊, 张丽君, 罗焕亮, 梁楠楠 申请人:深圳市兰科植物保护研究中心