一种5’-尿苷酸二钠的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种5’-尿苷酸二钠的制备方法，所述方法有下述步骤组成：（1）将胞苷酸（CMP）或其钠盐、亚硝酸钠和去离子水混合，滴加酸和/或酸酐，并在滴加结束后继续反应0－6小时，得到反应溶液1；（2）当CMP残留量低于1%时，调节反应溶液1的pH值至6.4－7.2，得到反应溶液2；（3）将反应溶液2和95v/v%乙醇混合，结晶、过滤，得到5’-尿苷酸二钠粗品；（4）将5’-尿苷酸二钠粗品和水混合，调节pH值至7.0－8.5，得到反应溶液3；和（5）将反应溶液3和有机溶剂混合，重结晶，过滤，得到5’-尿苷酸二钠。
【专利说明】-种5'-尿音酸二钢的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核巧酸制备领域，尤其涉及一种5' -尿巧酸二轴的制备方法。
【背景技术】
[0002] 5' -尿巧酸二轴可作为生产核酸类药物的重要中间体，保健食品和生化试剂。并 用于制造尿巧二磯酸葡萄糖、尿巧H磯酸、聚腺尿巧酸等药物，在治疗多种重大的疾病方面 起着重要的作用。
[0003] 目前，随着尿巧H磯酸、二尿巧四磯酸、尿巧磯酸酶抑制剂等在医药领域应用范围 的扩大，及尿巧二磯酸葡萄糖焦磯酸化酶基因方面的应用，国内外科研机构和企业也加大 了对5' -尿巧酸二轴的研究开发力度。
[0004] 目前制备5' -尿巧酸二轴的方法主要有酶解法与化学合成法两大类。
[0005] 酶解法生产5' -尿巧酸二轴是历史最长，技术最成熟的生产方法。利用橘青霉发 酵生产出的核酸酶P1，或者从麦芽根中提取的磯酸二醋酶，与核糖核酸（RNA)进行酶解反 应，即得到四种单核巧酸（5' 一腺巧酸，5' 一鸟巧酸，5' 一胞巧酸，和5' 一尿巧酸）混合物 的水溶液。将该混合物用离子交换法分离、精制纯化，即得到5' 一尿巧酸二轴产品。该是 我国目前生产5' -尿巧酸二轴的主要方法。但酶解法存在生产周期长，分离与精制工序复 杂，投资大，加工成本高，产物容易染菌，储存期短等缺陷。
[0006] 化学合成法包括磯酸化和脱氨法两种方法。磯酸化方法是W尿巧为原料，对核巧 进行磯酸化。磯酸化的产物杂质多且直接产品5' -尿巧酸极性强，导致了提纯困难，耗时， 收率低，生产成本高。而脱氨法是W胞巧酸为原料，经一步脱氨反应，将胞巧酸直接转变为 尿巧酸，然而现有技术中要得到5' -尿巧酸二轴粗品至少要经历H个步骤；合成反应一水 蒸汽蒸觸一减压蒸觸，而后两步需要特殊的设备，增加能耗，同时增大工作量。
[0007] 因此，本领域迫切需要提供一种5' -尿巧酸二轴的新的制备方法。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供有效、简便的5' -尿巧酸二轴的制备方法。
[0009] 本发明中，提供了一种5' -尿巧酸二轴的制备方法，所述方法有下述步骤组成：
[0010] (1)将胞巧酸（CMP)或其轴盐、亚硝酸轴和水混合，滴加酸和/或酸酢，并在滴加结 束后继续反应0 - 6小时，得到反应溶液1 ;
[0011] (2)当CMP残留量低于1% (HPLC纯度，采用高效液相色谱法（HPLC)检测所得到的 色谱图中，CMP的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分比应低于1%)时，调节反应溶液 1的抑值至6. 4 - 7. 2,得到反应溶液2 ;
[001引（3)将反应溶液2和95v/v%己醇混合，结晶、过滤，得到5' -尿巧酸二轴粗品；
[0013] (4)将5' -尿巧酸二轴粗品和水混合，调节抑值至7. 0 - 8. 5,得到反应溶液3 ; 和
[0014] (5)将反应溶液3和有机溶剂混合，重结晶，过滤，得到5' -尿巧酸二轴。
[0015] 在另一优选例中，所述酸和/或酸酢选自无机酸、有机酸、或其酸酢中的一种或一 种W上；所述酸和/或酸酢的用量为胞巧酸或其轴盐质量的1 - 10倍；更佳地，所述无机酸 为盐酸、硫酸、磯酸；所述有机酸为巧樣酸、甲酸、己酸、丙酸、下酸、下二酸；所述酸酢为己 酸酢、丙酸酢、下酸酢。
[0016] 在另一优选例中，所述的胞巧酸或其轴盐的HPLC纯度在98%或W上。
[0017] 在另一优选例中，步骤（3)中将反应溶液2和0. 5 - 10倍量的95v/v%己醇混合 (即95%己醇体积：反应溶液2体积=0. 5 - 10,即为体积比V/V)。
[0018] 在另一优选例中，步骤（5)中所述的有机溶剂选自下述的一种或一种W上；甲醇、 己醇、丙醇、异丙醇、己二醇和丙H醇；所述有机溶剂的用量为0. 5 - 10倍量（即有机溶剂体 积：反应溶液3体积=0. 5 - 10,即为体积比V/V)。
[0019] 在另一优选例中，步骤（5)中所述的重结晶温度为5 - 40°C，重结晶时间为1 - 6 小时。
[0020] 在另一优选例中，步骤（1)中用冰盐水冷却使反应温度控制在25C -65C。
[0021] 在另一优选例中，步骤（2)中CMP残留量通过HPLC检测进行跟踪。
[0022] 据此，本发明提供了一种5' -尿巧酸二轴的新的制备方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1显示了实施例1制备得到的5-尿巧酸二轴产品的紫外吸收光谱图。
[0024] 图2显示了实施例1制备得到的5-尿巧酸二轴产品的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[00巧]发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现可W使用"一锅煮"的方法制备5'-尿 巧酸二轴，无需在中间环节除去油性物质和水分。在此基础上，完成了本发明。
[0026] 如本文所用，"胞巧酸（c^icbdic acid)"是指胞巧的磯酸醋。视磯酸连接部位不 同，有胞巧-磯酸（2'-胞巧酸）、胞巧：V -磯酸（3'-胞巧酸）和胞巧-磯酸 (5'-胞巧酸）H种。本发明所用的胞巧酸为胞巧5'-磯酸巧胞巧酸）。
[0027] 如本文所用，"HPLC纯度"是指将得到的待测产品(例如5' -尿巧酸二轴粗品或纯 品、胞巧酸等)，经过高效液相色谱（HPLC)检测，根据所得到的色谱图谱，进行面积归一法而 得到的待测产品的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分数。
[0028] 如本文所用，"UV含量"是指使用紫外-可见分光光度法测得的含量，该法中可W 使用吸收系数法计算含量。
[0029] 本发明提供一种5' -尿巧酸二轴的制备方法，所述方法由下述步骤组成：
[0030] 第一步，将胞巧酸（CMP)或其轴盐、亚硝酸轴和水混合，在6(TC W内滴加酸和/或 酸酢，并在滴加结束后继续反应0 - 6小时，得到反应溶液1 ;
[003。 第二步，当CMP残留量低于1%时，调节反应溶液1的抑值至6. 4 - 7. 2,得到反应 溶液2 ;
[003引第立步，将反应溶液2和0. 5 - 10倍量95v/v%己醇混合（即95%己醇体积；反应 溶液2体积=0. 5 - 10,即为体积比V/V)，结晶、过滤，得到5' -尿巧酸二轴粗品；
[0033] 第四步，将5'-尿巧酸二轴粗品和水混合，调节抑值至7. 0 - 8. 5,得到反应溶液 3 ;和
[0034] 第五步，将反应溶液3和0. 5 - 10倍量有机溶剂混合(即有机溶剂体积；反应溶液 3体积=0. 5 - 10,即为体积比V/V)，重结晶，过滤，得到5' -尿巧酸二轴。
[0035] 上述第一步中，所述酸和/或酸酢的用量为胞巧酸或其轴盐质量的1 - 10倍。
[0036] 上述第一步中，所述酸和/或酸酢选自无机酸、有机酸、或其酸酢中的一种或一种 W上；所述无机酸为盐酸、硫酸、磯酸；优选盐酸；所述有机酸为巧樣酸、甲酸、己酸、丙酸、 下酸、下二酸；优选己酸；所述酸酢为己酸酢、丙酸酢、下酸酢；优选己酸酢；所述无机酸、有 机酸、或其酸酢中的一种或一种W上的混合优选盐酸和己酸的混合。
[0037] 在本发明的一种优选实施方式中，上述第一步中继续反应1-3小时。
[0038] 上述第一步中涉及的胞巧酸或其轴盐的HPLC纯度在98%或W上。
[0039] 在本发明的一种优选实施方式中，上述第二步中用HPLC法检测跟踪第一步反应 中CMP的残留量，当CMP的残留量为0-0. 3% (HPLC纯度）时，用液碱调节反应溶液1的抑 值至 6. 4- 7. 2。
[0040] 在本发明的一种优选实施方式中，上述第H步中将反应溶液2和0.5 - 3倍量 95v/v%己醇混合，结晶、过滤，得到5' -尿巧酸二轴粗品。
[0041] 在本发明的一种优选实施方式中，上述第四步中用液碱调节抑值至7. 0 - 8. 5。
[0042] 上述第五步中可W使用本领域常用的有机溶剂重结晶的方法在本发明的一种优 选实施方式中，上述第五步中涉及的有机溶剂选自下述的一种或一种W上：甲醇、己醇、丙 醇、异丙醇、己二醇和丙H醇；更优选甲醇、己醇；所述有机溶剂的用量为0. 5 - 10倍量巧P 有机溶剂体积：反应溶液3体积=0. 5 - 10,即为体积比V/V);更优选为2 - 3倍量；重结 晶温度为5 - 40°C，重结晶时间为1 - 6小时。
[0043] 通过上述方法重结晶精制后的产品还可经过本领域常用的方法进行干燥处理，比 如过滤、干燥(例如但不限于，烘干）等。
[0044] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可W任意组合。本案说明书所掲示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所掲示的各个特征，可W任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所掲示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。
[0045] 本发明的主要优点在于：
[0046] 1、本发明提供的制备工艺采用了" 一锅煮法"。
[0047] 2、本发明提供的制备工艺简单，操作方便，生产成本低。
[0048] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，该些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按 重量计。
[0049] 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。
[0050] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0051] 下述实施例中涉及的HPLC数据通过下述方法获得：
[0052] 固定相：十八焼基娃焼键合娃胶（C18)
[0053] 流动相；0. 2mol/L磯酸盐缓冲液(配制方法；取磯酸氨二轴35. 8g、磯酸二氨钟 13. 6g，加水900ml溶解，用Imol/L氨氧化轴溶液调节抑值至7. 0,加入四下基漠化馈 1. 61g，加水至1000ml，摇匀即得）
[0054] 检测波长；262nm
[00巧]下述实施例中涉及的UV数据通过下述方法获得：
[005引称取0. 5g样品，精确至0. 0002g，加盐酸溶液（1 一 1000)溶解并准确配至1000血， 准确量取此溶液lOmL，加盐酸溶液（1 一 1000)并准确配至成250mU作为检测液。测定在 波长260nm处检测液的吸光度A。
[0057] 此处的含量是指5' -尿巧酸二轴的质量分数。5' -尿巧酸二轴的质量分数W W计， 数值W %表示，按公式（A. 1)计算： 「 0.5x1.859,4 r A
[0058] W= -X100 (A.l) m
[0059] 式中：
[0060] A--检测液的吸光度。
[0061] m-换算成干基后样品的质量的数值，单位为克（g)。
[0062] 实施例1
[0063] 在干燥的1000ml四口瓶中，安装尾气吸收装置，机械揽拌装置，物料滴加装置。加 入50g胞巧酸，150ml去离子水，揽拌溶解。加入50g亚硝酸轴，揽拌溶解。开始滴加盐酸， 共加入盐酸50ml，滴加完盐酸后，继续反应2小时，整个过程控制温度在5(TC W下。取样采 用HPLC法检测，CMP的残留量为0. 27%。用液碱调节反应液的PH值至6. 4 - 7. 2,加入2倍 量的95%己醇结晶，过滤，得5'-尿巧酸二轴粗品。将向上述粗品中加入适量水溶解，用液 碱调节反应液的PH值至7. 0 - 8. 5后，再用2倍量的己醇重结晶，过滤、烘干，得5-尿巧酸 二轴产品。HPLC: 99. 9%，UV: 98. 0〇/〇。
[0064] 实施例1所获产品的光谱数据汇总
[0065]
【权利要求】
1. 一种5' -尿苷酸二钠的制备方法，其特征在于，所述方法有下述步骤组成： (1) 将胞苷酸（CMP)或其钠盐、亚硝酸钠和水混合，滴加酸和/或酸酐，并在滴加结束后 继续反应0 - 6小时，得到反应溶液1 ; (2) 当CMP残留量低于1% (HPLC纯度)时，调节反应溶液1的pH值至6. 4 - 7. 2,得到 反应溶液2 ; (3) 将反应溶液2和95v/v%乙醇混合，结晶、过滤，得到5' -尿苷酸二钠粗品； (4) 将5' -尿苷酸二钠粗品和水混合，调节pH值至7. 0 - 8. 5,得到反应溶液3 ;和 (5) 将反应溶液3和有机溶剂混合，重结晶，过滤，得到5' -尿苷酸二钠。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酸和/或酸酐选自无机酸、有机酸、 或其酸酐中的一种或一种以上；所述酸和/或酸酐的用量为胞苷酸或其钠盐质量的1 一 10 倍。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸；所述有 机酸为柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸；所述酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的胞苷酸或其钠盐的HPLC纯度在 98%或以上。
5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中将反应溶液2和0. 5 - 10 倍量的95v/v%乙醇混合。
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5)中所述的有机溶剂选自下述 的一种或一种以上：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇和丙三醇；所述有机溶剂的用量为 0. 5 - 10 倍量。
7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5)中所述的重结晶温度为5 - 40°C，重结晶时间为1 一 6小时。
8. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1冲用冰盐水冷却使反应温度控 制在 25°C -65°C。
9. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中CMP残留量通过HPLC检测 进行跟踪。
【文档编号】C07H19/10GK104447922SQ201310442551
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】王宏, 傅得响, 卢凰姗 申请人:杭州美亚药业有限公司