一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液及其制备方法，该复方注射液包括以下重量份数的原料：黄芪提取液2?4份、鸡a-干扰素注射液6?8份。本发明的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，将黄芪提取液与鸡a-干扰素注射液进行复配，所得复方注射剂的药效起效更快，对禽类病毒性疾病的治疗效果更好；无药物残留，无毒副作用，使用方便，安全可靠；还具有增强机体免疫力、强化疫苗免疫效果，减少应激反应等生物学功能；除了治疗病毒性疾病的治疗外，还能进行机体的免疫调节，增强机体抗感染能力，用于家禽各种病毒性疾病感染前的预防，以及各种病因不明的肿瘤性疾病等的预防与治疗。
【专利说明】一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用注射液技术用于，具体涉及一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方 注射液，同时还涉及一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，传染病的发生与流行已成为阻碍我国畜牧业快速发展的重要因素，而禽 类病毒性疾病是制约家禽养殖业发展的重要因素之一，给养禽业造成巨大经济损失，如禽 流感、新城疫等。尽管多数病毒性疾病可用疫苗免疫预防，但效果不甚理想，家禽生产中因 漏免或免疫失败导致疫情爆发情况时有发生。目前国内外应用于禽类病毒性疾病的化学药 物主要是金刚烷胺和利巴韦林制剂，临床疗效不确切，而且存在如药物残留、影响蛋禽产蛋 率恢复等毒副作用。治疗手段和方法的缺乏、化学药物残留较为严重以及人类对畜禽产品 食用安全的高度关注，使得疗效优良、无毒副作用、无残留、绿色环保的兽用抗病毒药物的 研发备受关注。
[0003] 生物制品-基因工程禽a干扰素注射液是无毒、无害、无残留的生物制品，对抑制 病毒的复制和提高机体免疫力方面有一定的功效；但是干扰素不直接杀伤或抑制病毒，而 是在细胞感染病毒后，与未感染的细胞上的相关受体作用，使这些细胞合成抗病毒蛋白，防 治进一步感染，从而起到抗病毒的作用，但干扰素对已感染的细胞没有帮助，并且其必须再 局部细胞中达到较高的浓度才能诱导宿主细胞合成抗病毒蛋白。因此，现有的禽a干扰素 注射液普遍存在起效慢、疗效有限的问题，还不能满足使用的需求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，解决现有禽a 干扰素注射液存在的起效慢、疗效有限的问题。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备 方法。
[0006] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于治疗禽类病毒性疾病 的复方注射液，包括以下重量份数的原料：黄芪提取液2?4份、鸡a -干扰素注射液6? 8份。
[0007] 所述黄芪提取液是由以下方法制备的：
[0008] 1)将黄芪粉碎至颗粒粒径为250?300 iim，按照黄芪与水的质量比为1:6?10 的比例将黄芪浸于蒸馏水中，在60?75°C条件下进行恒温微波提取，得混合物A ;
[0009] 2)将混合物A进行离心分离，取上清液，用活性炭进行脱色，得混合物B ;
[0010] 3)将混合物B浓缩至比重为1. 15?1. 25,得混合物C ;
[0011] 4)向混合物C中加入6?8倍体积量的乙醇溶液，搅拌使其混合均匀后，进行离心 分离，取沉淀物并用蒸馏水稀释至比重为1. 05?1. 15,得混合物D ;
[0012] 5)将混合物D进行凝胶层析，收集吸收峰为280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取 液。
[0013] 步骤1)中所述微波提取的功率为250W，重复提取3?4次，每次提取时间为11? 15min〇
[0014] 步骤2)中所述离心分离的转速为3000?5000rpm，时间为12?16min ;步骤4) 中所述离心分离的转速为3000?5000rpm，时间为12?16min。
[0015] 步骤4)中所述乙醇溶液中乙醇的质量分数为70%?95%。
[0016] 步骤5)中所述凝胶层析所用凝胶为葡聚糖凝胶，层析柱的内径与高度比为 1:30?50 ;所述凝胶层析的洗脱液为蒸馏水，流速为0. 3?0. 6ml/min。
[0017] 本发明的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，所述鸡a-干扰素注射液可为 市售鸡a-干扰素注射液产品，或通过以下方法制备。
[0018] 所述鸡a-干扰素注射液是由以下方法制备的：
[0019] a.取含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤后，再 用PBS缓冲液重悬，超声使菌体破壁后，离心并收集沉淀物；
[0020] b.将步骤a所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液溶解包涵体，离心收集 上清液，得变性蛋白溶液；
[0021] C.将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液中，4°C静置48h后，离心收集上清 液，得含有重组鸡a -干扰素蛋白的溶液；
[0022] d.从重组鸡a -干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡a -干扰素蛋白，进行蛋白处理 后，加入保护剂溶液进行混合，使重组鸡a -干扰素的含量为IO8?109IU/100ml，即得鸡 a _干扰素注射液；所述保护剂溶液可为所有可用于制备鸡a _干扰素注射液的添加剂组 合溶液；
[0023] 所述变性缓冲液的pH为8. 5,含有6mol/L盐酸胍、2mmol/L EDTA、50mmol/L Tris ? Cl、10mmol/L DIT ;所述复性缓冲液的 pH 为 8. 0,含有 0? 5mol/L L-Arg、2mmol/L EDTA、体积分数为 20% 的甘油、0? 9mmol/L GSSG、0. lmol/L Tris ? Cl。
[0024] 所述含有重组鸡a -干扰素蛋白的菌液是由以下方法制备的：
[0025] i)菌体培养阶段：将发酵培养基高温灭菌后，加入1ml、浓度为lOOmg/ml的Amp， 按体积百分比为5%?10%的量接入含有重组鸡a-干扰素蛋白的发酵用种子液，37°C培养 8?10h，培养过程中维持pH为7. 2,当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧上升至30%，补加 发酵培养基；
[0026] ii)碳源饲喂阶段：碳源消耗完后，流加补料培养基，使溶氧维持在30%以上，培养 过程中维持PH为7.2 ;
[0027] iii)诱导表达阶段：继续流加补料培养基，加入IPTG至终浓度为0. 5mM，诱导表达 目的蛋白，培养过程中维持PH为7. 2,溶氧维持在30%以上，诱导4h，得发酵液，即为含有重 组鸡a -干扰素蛋白的菌液。
[0028] -种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法，包括下列步骤：
[0029] A.制备黄芪提取液：
[0030] 1)将黄芪粉碎至颗粒粒径为250?300 ilm，按照黄芪与水的质量比为1:6?10 的比例将黄芪浸于蒸馏水中，在60?75°C条件下进行恒温微波提取，得混合物A ;
[0031] 2)将混合物A进行离心分离，取上清液，用活性炭进行脱色，得混合物B ;
[0032] 3)将混合物B浓缩至比重为I. 15?I. 25,得混合物C ;
[0033] 4)向混合物C中加入6?8倍体积量的乙醇溶液，搅拌使其混合均匀后，进行离心 分离，取沉淀物并用蒸馏水稀释至比重为1. 05?1. 15,得混合物D ;
[0034] 5)将混合物D进行凝胶层析，收集吸收峰为280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取 液；
[0035] B.制备鸡a _干扰素注射液：
[0036] a.取含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤后，再 用PBS缓冲液重悬，超声使菌体破壁后，离心并收集沉淀物；
[0037] b.将步骤a所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液溶解包涵体，离心收集 上清液，得变性蛋白溶液；
[0038] c.将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液中，4°C静置48h后，离心收集上清 液，得含有重组鸡a -干扰素蛋白的溶液；
[0039] d.从重组鸡a -干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡a -干扰素蛋白，进行蛋白处理 后，加入保护剂溶液进行混合，使重组鸡a -干扰素的含量为IO8?109IU/100ml，即得鸡 a _干扰素注射液；所述保护剂溶液可为所有可用于制备鸡a _干扰素注射液的添加剂组 合溶液；
[0040] C.取步骤A所得黄芪提取液2?4重量份、步骤B所得鸡a -干扰素注射液6? 8重量份进行混合，即得。
[0041] 其中步骤A中，步骤1)中所述微波提取的功率为250W，重复提取3?4次，每次提 取时间为11?15min。
[0042] 其中步骤A中，步骤2)中所述离心分离的转速为3000?5000rpm，时间为12? 16min ;步骤4)中所述离心分离的转速为3000?5000rpm，时间为12?16min。
[0043] 其中步骤A中，步骤4)中所述乙醇溶液中乙醇的质量分数为70%?95%。
[0044] 其中步骤A中，步骤5)中所述凝胶层析所用凝胶为葡聚糖凝胶，层析柱的内径与 高度比为1:30?50 ;所述凝胶层析的洗脱液为蒸馏水，流速为0. 3?0. 6ml/min。
[0045] 其中步骤B中，所述变性缓冲液的pH为8. 5,含有6mol/L盐酸胍、2mmol/L EDTA、 50mmol/L Tris .ClUOmmoVL DTT ;所述复性缓冲液的 pH 为 8.0,含有 0.5mol/L L-Arg、 2mmol/L EDTA、体积分数为 20% 的甘油、0? 9mmol/L GSSG、0. lmol/L Tris ? Cl。
[0046] 其中步骤B中，所述含有重组鸡a -干扰素蛋白的菌液是由以下方法制备的：
[0047] i)菌体培养阶段：将发酵培养基高温灭菌后，加入1ml、浓度为lOOmg/ml的Amp， 按体积百分比为5%?10%的量接入含有重组鸡a-干扰素蛋白的发酵用种子液，37°C培养 8?10h，培养过程中维持pH为7. 2,当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧上升至30%，补加 发酵培养基；
[0048] ii)碳源饲喂阶段：碳源消耗完后，流加补料培养基，使溶氧维持在30%以上，培养 过程中维持PH为7.2 ;
[0049] iii)诱导表达阶段：继续流加补料培养基，加入IPTG至终浓度为0. 5mM，诱导表达 目的蛋白，培养过程中维持PH为7. 2,溶氧维持在30%以上，诱导4h，得发酵液，即为含有重 组鸡a -干扰素蛋白的菌液。
[0050] 本发明的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，将黄芪提取液与鸡a _干扰素 注射液进行复配，所得复方注射剂的药效起效更快，对禽类病毒性疾病的治疗效果更好；无 药物残留，无毒副作用，使用方便，安全可靠；还具有增强机体免疫力、强化疫苗免疫效果， 减少应激反应等生物学功能；除了治疗病毒性疾病(新城疫、传染性法氏囊炎、传染性支气 管炎、传染性喉气管炎等）的治疗外，还能进行机体的免疫调节，增强机体抗感染能力，用于 家禽各种病毒性疾病感染前的预防，以及各种病因不明的肿瘤性疾病(如马立克氏病）等的 预防与治疗。
[0051] 本发明的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法，分别制备黄芪提取 液和鸡a -干扰素注射液，将两者进行混合即得复方注射液，工艺简单，操作方便，适合大 规模工业化生产。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[0053] 实施例1
[0054] 本实施例的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，包括以下重量份数的原料： 黄芪提取液2份、鸡a _干扰素注射液8份。
[0055] 本实施例的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法，包括下列步骤：
[0056] A?制备黄芪提取液：
[0057] 1)将黄芪表面洗净并晾干，粉碎至颗粒粒径为250?300 iim，按照黄芪与水的质 量比为1:6的比例将黄芪浸于蒸馏水中，在60°C条件下进行恒温微波提取，所述微波提取 的功率为250W，重复提取3次，每次提取时间为15min，得混合物A ;
[0058] 2)将混合物A进行离心分离，所述离心分离的转速为3000rpm，时间为16min，取上 清液，用活性炭进行脱色，得混合物B ;
[0059] 3)将混合物B浓缩至比重为1. 25,得混合物C ;
[0060] 4)向混合物C中加入7倍体积量的质量份数为70%的乙醇溶液，搅拌40min使其 混合均匀后，进行离心分离，所述离心分离的转速为3000rpm，时间为16min，取沉淀物并用 蒸馏水稀释至比重为1. 15,得混合物D ;
[0061] 5)将混合物D进行凝胶层析，所述凝胶层析所用凝胶为葡聚糖凝胶，层析柱的内 径与高度比为1:30 ;所述凝胶层析的洗脱液为蒸馏水，流速为0. 45ml/min，收集吸收峰为 280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取液。
[0062] B.制备鸡a _干扰素注射液：
[0063] 1)制备工程菌种子：
[0064] 将工程菌按体积分数为1%的比例接种菌液于20ml、含100微克/毫升Amp的LB 液体培养基中，30°C、200rmp振荡培养8?10h，将所得培养液接种至含Amp的LB平板，划 线培养，挑取单菌5?10个菌制备工程菌种子(挑5?10个单菌于LB中摇瓶培养0D600 至0. 5左右，按750ul加50%甘油250ul的比例，保种数十支，-20°C保存备用）；
[0065] 2)制备工程菌发酵种子液：
[0066] 将工程菌种子按体积分数0. 05%的量接种于200ml的2XYT培养液中，30°C、 200rpm培养10?12h，作为发酵罐用种子液；
[0067] 3)工程菌发酵生产制备含有重组鸡a _干扰素蛋白的菌液：
[0068] i)菌体培养阶段：将发酵培养基高温灭菌后，加入1ml、浓度为lOOmg/ml的Amp, 按体积百分比为5%?10%的量接入含有重组鸡a-干扰素蛋白的发酵用种子液，37°C通气 搅拌培养8?10h，培养过程中随着菌株的生长，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧上升 至30%，补加发酵培养基，培养过程用3M NaOH溶液和10%磷酸维持pH为7. 2 ;
[0069] ii)碳源饲喂阶段：碳源消耗完后，流加补料培养基甘油150ml/L、蛋白胨30g/L、 酵母粉30g/L、MgS04 ? 7H205. 5mg/L)，流加速度由溶氧控制（设定D0=30%，当DO大于30% 流加泵打开流加培养基，DO逐步下降，当DO下降到30%以下流加泵关闭)，大约每小时流加 26-35ml培养基；溶氧维持在30%以上，培养过程用3M NaOH溶液和10%磷酸维持pH为7. 2 ; [0070] iii)诱导表达阶段：继续流加补料培养基，加入IPTG至终浓度为0. 5mM，诱导表达 目的蛋白，培养过程用3M NaOH溶液和10%磷酸维持pH为7. 2,溶氧维持在30%以上，诱导 4h，得发酵液，即为含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液。
[0071] 4)制备鸡a _干扰素注射液：
[0072] a.取含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液，离心（5000g，IOmin)收集菌体，用PBS缓 冲液（恥(：1137臟〇1/1，1((：12.7臟〇1/1，恥 2册044. 3臟〇1/1，腿2?041.4臟〇1/1，？118.0)洗涤后， 再用PBS缓冲液重悬，超声（ano探头，超声7s间隔5s，持续30min)使菌体破壁后，离心 (lOOOOg，4°C，IOmin)并收集沉淀物；
[0073] b.将步骤a所得沉淀物(包涵体）用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液（6mol/L盐 酸胍，2mmol/L EDTA，50mmol/L Tris .CLlOmmoVL DIT，pH8. 5)溶解包涵体，离心（lOOOOg， 4°C，IOmin)收集上清液，得变性蛋白溶液；
[0074] c.将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液（0. 5mol/L L-Arg ;2mmol/L EDTA， 20% 甘油；0.9mmol/L GSSG，0. lmol/L Tris .CLpHS-O)中，4°C 静置 48h 后，离心（10000g， 4°C，IOmin)收集上清液，得含有重组鸡a -干扰素蛋白的溶液；
[0075] d.从重组鸡a -干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡a -干扰素蛋白，进行蛋白处理 后，稀释后加入保护剂溶液进行混合，使重组鸡a-干扰素的含量为109IU/100ml，即得鸡 a -干扰素注射液。所述保护剂溶液中含有吐温800. 24mg/ml、苯甲醇20mg/ml、磷酸氢二钠 8. 68mg/ml、磷酸二氢钠 6. 36mg/ml。
[0076] C.取步骤A所得黄芪提取液2重量份、步骤B所得鸡a -干扰素注射液8重量份 进行混合，即得。
[0077] 实施例2
[0078] 本实施例的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，包括以下重量份数的原料： 黄芪提取液3份、鸡a -干扰素注射液7份。
[0079] 本实施例的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法，包括下列步骤：
[0080] A?制备黄芪提取液：
[0081] 1)将黄芪表面洗净并晾干，粉碎至颗粒粒径为250?300 iim，按照黄芪与水的质 量比为1:8的比例将黄芪浸于蒸馏水中，在75°C条件下进行恒温微波提取，所述微波提取 的功率为250W，重复提取4次，每次提取时间为Ilmin，得混合物A ;
[0082] 2)将混合物A进行离心分离，所述离心分离的转速为4000rpm，时间为14min，取上 清液，用活性炭进行脱色，得混合物B ;
[0083] 3)将混合物B浓缩至比重为1. 05,得混合物C ;
[0084] 4)向混合物C中加入8倍体积量的质量份数为80%的乙醇溶液，搅拌30min使其 混合均匀后，进行离心分离，所述离心分离的转速为4000rpm，时间为14min，取沉淀物并用 蒸馏水稀释至比重为1. 05,得混合物D ;
[0085] 5)将混合物D进行凝胶层析，所述凝胶层析所用凝胶为葡聚糖凝胶，层析柱的内 径与高度比为1:40 ;所述凝胶层析的洗脱液为蒸馏水，流速为0. 3ml/min，收集吸收峰为 280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取液；
[0086] B.制备鸡a -干扰素注射液：
[0087] 1)制备工程菌种子：
[0088] 将工程菌按体积分数为1%的比例接种菌液于20ml、含100微克/毫升Amp的LB 液体培养基中，30°C、200rmp振荡培养8?10h，将所得培养液接种至含Amp的LB平板，划 线培养，挑取单菌5?10个菌制备工程菌种子(挑5?10个单菌于LB中摇瓶培养0D600 至0. 5左右，按750ul加50%甘油250ul的比例，保种数十支，-20°C保存备用）；
[0089] 2)制备工程菌发酵种子液：
[0090] 将工程菌种子按体积分数0. 05%的量接种于200ml的2XYT培养液中，30°C、 200rpm培养10?12h，作为发酵罐用种子液；
[0091] 3)工程菌发酵生产制备含有重组鸡a -干扰素蛋白的菌液：
[0092] i)菌体培养阶段：将发酵培养基高温灭菌后，加入1ml、浓度为lOOmg/ml的Amp， 按体积百分比为5%?10%的量接入含有重组鸡a-干扰素蛋白的发酵用种子液，37°C通气 搅拌培养8?10h，培养过程中随着菌株的生长，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧上升 至30%，补加发酵培养基，培养过程用3M NaOH溶液和10%磷酸维持pH为7. 2 ;
[0093] ii)碳源饲喂阶段：碳源消耗完后，流加补料培养基甘油150ml/L、蛋白胨30g/L、 酵母粉30g/L、MgS04 ? 7H205. 5mg/L)，流加速度由溶氧控制（设定D0=30%，当DO大于30% 流加泵打开流加培养基，DO逐步下降，当DO下降到30%以下流加泵关闭)，大约每小时流加 26-35ml培养基；溶氧维持在30%以上，培养过程用3M NaOH溶液和10%磷酸维持pH为7. 2 ;
[0094] iii)诱导表达阶段：继续流加补料培养基，加入IPTG至终浓度为0. 5mM，诱导表达 目的蛋白，培养过程用3M NaOH溶液和10%磷酸维持pH为7. 2,溶氧维持在30%以上，诱导 4h，得发酵液，即为含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液。
[0095] 4)制备鸡a _干扰素注射液：
[0096] a.取含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液，离心（5000g，IOmin)收集菌体，用PBS缓 冲液（恥(：1137臟〇1/1，1((：12.7臟〇1/1，恥 2册044. 3臟〇1/1，腿2?041.4臟〇1/1，？118.0)洗涤后， 再用PBS缓冲液重悬，超声（ano探头，超声7s间隔5s，持续30min)使菌体破壁后，离心 (lOOOOg，4°C，IOmin)并收集沉淀物；
[0097] b.将步骤a所得沉淀物(包涵体）用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液（6mol/L盐 酸胍，2mmol/L EDTA，50mmol/L Tris .CLlOmmoVL DIT，pH8. 5)溶解包涵体，离心（lOOOOg， 4°C，IOmin)收集上清液，得变性蛋白溶液；
[0098] c.将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液（0? 5mol/L L-Arg ;2mmol/LEDTA， 20% 甘油；0.9mmol/L GSSG，0. lmol/L Tris .CLpHS-O)中，4°C静置 48h 后，离心（lOOOOg， 4°C，IOmin)收集上清液，得含有重组鸡a -干扰素蛋白的溶液；
[0099] d.从重组鸡a -干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡a -干扰素蛋白，进行蛋白处理 后，稀释后加入保护剂溶液进行混合，使重组鸡a -干扰素的含量为2X 108IU/100ml，即得 鸡a -干扰素注射液。所述保护剂溶液中含有吐温800. 24mg/ml、苯甲醇20mg/ml、磷酸氢 二钠 8. 68mg/ml、磷酸二氢钠 6. 36mg/ml。
[0100] c.取步骤A所得黄芪提取液3重量份、步骤B所得鸡a -干扰素注射液7重量份 进行混合，即得。
[0101] 实施例3
[0102] 本实施例的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，包括以下重量份数的原料： 黄芪提取液4份、鸡a -干扰素注射液(市售）6份。
[0103] 本实施例的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法，包括下列步骤：
[0104] A?制备黄芪提取液：
[0105] 1)将黄芪表面洗净并晾干，粉碎至颗粒粒径为250?300 ilm，按照黄芪与水的质 量比为1:10的比例将黄芪浸于蒸馏水中，在70°C条件下进行恒温微波提取，所述微波提取 的功率为250W，重复提取4次，每次提取时间为13min，得混合物A ;
[0106] 2)将混合物A进行离心分离，所述离心分离的转速为4000rpm，时间为12min，取上 清液，用活性炭进行脱色，得混合物B ;
[0107] 3)将混合物B浓缩至比重为1. 15,得混合物C ;
[0108] 4)向混合物C中加入6倍体积量的质量份数为95%的乙醇溶液，搅拌20min使其 混合均匀后，进行离心分离，所述离心分离的转速为5000rpm，时间为12min，取沉淀物并用 蒸馏水稀释至比重为1. 10,得混合物D ;
[0109] 5)将混合物D进行凝胶层析，所述凝胶层析所用凝胶为葡聚糖凝胶，层析柱的内 径与高度比为1:50 ;所述凝胶层析的洗脱液为蒸馏水，流速为0. 60ml/min，收集吸收峰为 280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取液；
[0110] B.取步骤A所得黄芪提取液4重量份、鸡a-干扰素注射液(市售）6重量份进行 混合，即得。
[0111] 实验例
[0112] 本实验例将实施例1?3所得复方注射液置于恒温25°C环境中，定期检测其pH值 及外观，结果如表1所示。
[0113] 其中，对比例为市售鸡a-干扰素注射液。
[0114] 表1实施例1?3所得复方注射液不同时间的pH值及外观
【权利要求】
1. 一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：包括以下重量份数的原 料：黄芪提取液2?4份、鸡a -干扰素注射液6?8份。
2. 根据权利要求1所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：所述 黄芪提取液是由以下方法制备的： 1) 将黄芪粉碎至颗粒粒径为250?300 iim，按照黄芪与水的质量比为1:6?10的比 例将黄芪浸于蒸馏水中，在60?75°C条件下进行恒温微波提取，得混合物A ; 2) 将混合物A进行离心分离，取上清液，用活性炭进行脱色，得混合物B ; 3) 将混合物B浓缩至比重为1. 15?1. 25,得混合物C ; 4) 向混合物C中加入6?8倍体积量的乙醇溶液，搅拌使其混合均匀后，进行离心分 离，取沉淀物并用蒸馏水稀释至比重为1. 05?1. 15,得混合物D ; 5) 将混合物D进行凝胶层析，收集吸收峰为280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取液。
3. 根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤 1) 中所述微波提取的功率为250W，重复提取3?4次，每次提取时间为11?15min。
4. 根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤 2) 中所述离心分离的转速为3000?5000rpm，时间为12?16min ;步骤4)中所述离心分 离的转速为3000?5000rpm，时间为12?16min。
5. 根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤 4) 中所述乙醇溶液中乙醇的质量分数为70%?95%。
6. 根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤 5) 中所述凝胶层析所用凝胶为葡聚糖凝胶，层析柱的内径与高度比为1:30?50 ;所述凝胶 层析的洗脱液为蒸馈水，流速为〇. 3?0. 6ml/min。
7. 根据权利要求1所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：所述 鸡a-干扰素注射液是由以下方法制备的： a. 取含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤后，再用 PBS缓冲液重悬，超声使菌体破壁后，离心并收集沉淀物； b. 将步骤a所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液溶解包涵体，离心收集上清 液，得变性蛋白溶液； c. 将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液中，4°C静置48h后，离心收集上清液，得 含有重组鸡a-干扰素蛋白的溶液； d. 从重组鸡a-干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡a-干扰素蛋白，进行蛋白处理后，力口 入保护剂溶液进行混合，使重组鸡a _干扰素的含量为IO8?109IU/100ml，即得鸡a -干 扰素注射液。
8. 根据权利要求7所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：所述 变性缓冲液的 pH 为 8. 5,含有 6mol/L 盐酸胍、2mmol/L EDTA、50mmol/L Tris ? ClUOmmol/ L DTT ;所述复性缓冲液的pH为8. 0,含有0. 5mol/L L-Arg、2mmol/L EDTA、体积分数为20% 的甘油、〇? 9mmol/L GSSG、0. lmol/L Tris ? Cl。
9. 根据权利要求7或8所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于： 所述含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液是由以下方法制备的： i)菌体培养阶段：将发酵培养基高温灭菌后，加入lml、浓度为lOOmg/ml的Amp，按体 积百分比为5%?10%的量接入含有重组鸡a -干扰素蛋白的发酵用种子液，37°C培养8? l〇h，培养过程中维持pH为7. 2,当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧上升至30%，补加发酵 培养基； ii)碳源饲喂阶段：碳源消耗完后，流加补料培养基，使溶氧维持在30%以上，培养过程 中维持PH为7.2 ; iii )诱导表达阶段：继续流加补料培养基，加入IPTG至终浓度为0. 5mM，诱导表达目的 蛋白，培养过程中维持pH为7. 2,溶氧维持在30%以上，诱导4h，得发酵液，即为含有重组鸡 a -干扰素蛋白的菌液。
10. -种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法，其特征在于：包括下列 步骤： A. 制备黄芪提取液： 1) 将黄芪粉碎至颗粒粒径为250?300 iim，按照黄芪与水的质量比为1:6?10的比 例将黄芪浸于蒸馏水中，在60?75°C条件下进行恒温微波提取，得混合物A ; 2) 将混合物A进行离心分离，取上清液，用活性炭进行脱色，得混合物B ; 3) 将混合物B浓缩至比重为1. 15?1. 25,得混合物C ; 4) 向混合物C中加入6?8倍体积量的乙醇溶液，搅拌使其混合均匀后，进行离心分 离，取沉淀物并用蒸馏水稀释至比重为1. 05?1. 15,得混合物D ; 5) 将混合物D进行凝胶层析，收集吸收峰为280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取液； B. 制备鸡a-干扰素注射液： a. 取含有重组鸡a-干扰素蛋白的菌液，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤后，再用 PBS缓冲液重悬，超声使菌体破壁后，离心并收集沉淀物； b. 将步骤a所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液溶解包涵体，离心收集上清 液，得变性蛋白溶液； c. 将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液中，4°C静置48h后，离心收集上清液，得 含有重组鸡a-干扰素蛋白的溶液； d. 从重组鸡a-干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡a-干扰素蛋白，进行蛋白处理后，力口 入保护剂溶液进行混合，使重组鸡a _干扰素的含量为IO8?109IU/100ml，即得鸡a -干 扰素注射液； C. 取步骤A所得黄芪提取液2?4重量份、步骤B所得鸡a -干扰素注射液6?8重 量份进行混合，即得。
【文档编号】C07K1/14GK104208662SQ201310462847
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】范超杰, 李建正, 陈建晖 申请人:郑州后羿制药有限公司