一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学和细胞生物学领域，设及一种快速中止CAR-T细胞杀伤作用 的分子刹车及其用途。具体地，该分子刹车作为一个元件插入嵌合抗原受体（chimeric antigenreceptors,CAR)内部特定位置，能快速中止嵌合抗原受体修饰T细胞对祀细胞的 杀伤作用。本发明还设及表达包含该分子刹车的CAR-T细胞用于恶性肿瘤及病毒感染性疾 病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 嵌合抗原受体修饰的T细胞khimericantigenreceptorengineeringT cells,简称CAR-T细胞）在难治性的B细胞恶性肿瘤的治疗中已取得巨大成功，完全缓解 率达到90% ;在其它实体瘤的治疗中也显示了良好的应用前景。但CAR-T细胞在临床应用 中可能产生针对正常组织细胞的误攻击（脱祀效应，ontarget/off-tumoreffect),或由 于大量释放炎性细胞因子引起细胞因子风暴等毒副作用。因而，如何提高CAR-T细胞治疗 的安全性是一大棘手问题。
[0003] 嵌合抗原受体（CAR)由一个单链抗体（scFv，由抗体\区氨基酸序列和VΗ区氨基 酸序列经Linker连接而成），通过较链结构与源于TCR复合体或者I姐高亲和受体的跨膜 和胞内信号结构连接构成。表达CAR的T细胞可通过非MHC限制性途径与抗原反应。此 夕F，与常规的TCR只能针对的蛋白抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，还包括糖类和糖脂 类TAA，而运些抗原不像蛋白抗原那么容易突变（化rr化inImmunol2009;21:215-23; Blood2010;116:1035-44;CancerRes2011;71:3175-81;JCancer2011;2:378-82)。 自1989年，由Es化ar和其同事首次提出CAR的概念W来，其已经历了Ξ个不同的发展阶 段。第一代CAR受体，包含胞外特异识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3ζ 或FcεRI丫 的ITAM(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs)信号链来 传递。但是第一代CAR受体缺乏Τ细胞的共刺激信号，导致Τ细胞只能发挥瞬间效应，在 体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个 共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞活化的两种信号，包括如CD28,CD134/0X40， CD137/4-1BB，lymphocyte-specificproteintyrosinekinase(LCK)，inducibleT-cell c〇-stimulato;r(IC0。^及0酷乂-日(：1:;[￥日1:;[0]1proteinlO(DAPlO)等结构域，增强了T细胞 的增殖能力及细胞因子的分泌功能，比-2、IFN-丫W及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境 的免疫抑制、延长AICD(activationinducedcelldeath,AICD)。第Ξ代CAR受体，在第二 代CAR的基础上，增加了另外一种共刺激信号分子的胞内结构域，如在共刺激结构CD28和 ITAM信号链的之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，产生一个Ξ重信号的CAR受体，第 Ξ代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。
[0004] 可W看到，第一代CAR只提供T细胞活化的第一信号，第二代与第Ξ代的CAR是 将T细胞激活所需的两个信号进行了合并，将第二信号CD28或/和4-1BB细胞内信号区域 直接连接到CD3Z分子，从而绕过了肿瘤细胞通常第二信号如B7等缺乏所引起T细胞不能 激活的障碍，第一信号与第二信号合并后，大大提高了对τ细胞激活、增殖及杀伤能力，使 之疗效大幅度增加。但随之给临床治疗带来了一定风险，因为第二代与第Ξ代CAR修饰后 T细胞会针对某些少量表达肿瘤相关抗原的正常组织产生超强的反应，呈"瀑布"式过量增 加，造成对正常组织的过激免疫反应。目前已有两个注射CAR修饰后的T细胞而导致死亡 的病例报道。其一例应用第Ξ代CAR(针对化r2)，患者由于急性肺水肿而死亡，其原因是 CAR"的T细胞误攻击低表达化r2的肺上皮细胞（Mol化er2010;18:843-51);另一例应 用第二代CAR(针对CD19)，死亡原因复杂，但伴随着血液中细胞因子水平的增高（HumGene Ther2010;21:1039-42;MolTher2010;18:666-8)。在一项临床试验中，11 例肾细胞癌患 者接受了特异性识别CAIX抗原的第一代CAR-T细胞治疗，其中5例在治疗后出现肝脏毒 性，其毒性很可能是因为CAR修饰的T细胞W表达少量CAIX的胆管上皮细胞为目标，从而 造成了对肝脏的损害（JClinOncol. 2006 ;24(13) :e20-2)。
[0005] 为解决运一安全性隐患，目前最常用方法是引入自杀机制，使CAR-T细胞在表达 CAR之外，共表达一个自杀基因，例如：
[0006] 1.代谢型自杀基因：是基于无毒性药物在基因修饰的细胞内转化为具有细胞毒 性的化合物。例如憐酸化的核巧类似物人单纯瘤疹病毒胸巧激酶化SV-TK)与甘昔洛韦 (GCV)相互作用，其产物憐酸形式进入DNA作用于DNA聚合酶，导致链终止反应引发细 胞调亡。服V-TK/GCV也可通过CD95/CD95-L途径，使Fas死亡结构域相关蛋白（FA孤）和 caspase-8形成死亡诱导信号复合体诱导细胞调亡度lood. 2007 ; 110 (12) : 3842-52)。TK自 杀基因已经在异体淋己细胞输注的临床试验中得到证实，它能消除急性和慢性抗移植物宿 主病。
[0007] 2.调亡基因（如：半脫天冬酶）通过诱导调亡来清除细胞。iCasp9自杀基因包含 F邸P12-F36V结构域，可通过柔性Ser-Gly-Gly-Gly-Ser连接半脫氨酸天冬氨酸蛋白酶9， 后者不含募集结构域。FKBP12-F36V包含一个FKBP结构域，在第36个氨基酸残基位点上苯 丙氨酸替代了鄉氨酸。它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力，能够结合二聚合成配基，如其他 惰性小分子AP1903。AP1903的使用能激活iCasp9蛋白形成二聚体，从而介导T细胞调亡。 iCasp9基因表达载体系统已经在临床前和I期临床试验中展现出有效的诱导T细胞自杀 效果（N化邑1JMed2011 ;365:1673-83)。
[000引 3.细胞表面分子（如CD20)通过抗体介导的细胞毒作用（ADCC)与补体介导的细 胞毒作用（CDC)来清除细胞。将已上市的抗体（如美罗华，Rituxan)所识别的抗原祀标 (如CD20)与CAR基因共同导入T细胞，CD20与CAR基因作为两个独立的表达框，分别整 合到基因组中。使用美罗华抗体后，可W与外源表达细胞表面CD20分子结合，通过ADCC效 应与CDC效应清除CAR-T细胞。运种自杀基因策略已在临床前模型中得到验证（HumGene Ther. 2004Jan; 15 (1):63-76)。
[0009] 然而，CAR-T细胞脱祀引发的细胞因子"瀑布"效应速度非常快，运些自杀系统未必 能及时发挥作用。所W，非常有必要对CAR自身的反应体系上进行改造，提高CAR-T细胞治 疗的临床安全性。
【发明内容】
[0010] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，将抗原表位（下文中形象地称为"分 子刹车"）插入到嵌合抗原受体基因特定位置，并在此基础上得到了一种新的嵌合抗原受体W及表达该嵌合抗原受体（被编码该嵌合抗原受体基因所修饰）的CAR-T细胞。本发明人 惊奇地发现，在加入该抗原表位的活化剂（例如其抗体）之后，能快速中止CAR-T细胞对祀 细胞的杀伤作用（下文中形象地称为"急刹车"）。
[0011] 由此提供了下述发明：
[0012] 本发明的一个方面设及一种嵌合抗原受体，依次包含信号肤、单链抗体、胞外较链 区1、跨膜区和胞内信号区，
[0013] 其中，单链抗体包括轻链可变区（VJ、重链可变区（Vh)W及连接它们的较链区 1 (注：将单链抗体中连接\与VΗ的较链区称为较链区2,是为了与下面的嵌合抗原受体中 单链抗体与跨膜区之间的较链区1相区别），
[0014] 其中，所述单链抗体插入和/或连接有抗原表位；优选地，所述抗原表位不被所述 单链抗体所特异性识别；
[0015] 所述抗原表位的插入和/或连接并不降低或者阻断所述单链抗体与其所针对的 抗原的特异性结合；但是当所述抗原表位与其特异性抗体结合后，能够降低或者阻断所述 单链抗体与其所针对的抗原的特异性结合；
[0016] 所插入和/或连接的抗原表位为单拷贝或者多拷贝（例如2、3、4或5个拷贝）；
[0017] 所述抗原表位插入和/或连接的位置为一个或者多个（2、3、4或5个）；当所述位 置为多个时，不同位置的抗原表位相同或者不同。
[0018] 根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其包括轻链可变区、重链可变区W及连 接它们的较链区2，
[001引其中，所述单链抗体插入和/或连接有抗原表化插入和/或连接的位置选自如下 位置中的任意一个或者两个：
[0020] 轻链可变区和较链区2之间和较链区2和重链可变区之间；
[0021] 并且优选地，插入和/或连接的位置还包括选自如下位置中的任意一个或者两 个：
[0022] 单链抗体之前W及单链抗体之后；
[0023] 所插入和/或连接的抗原表位为单拷贝或者多拷贝（例如2、3、4或5个拷贝）； 当所述位置为2个、3个或4个时，不同位置的抗原表位相同或者不同；
[0024] 优选地，所述抗原表位不被所述单链抗体所特异性识别。
[0025] 根据本发明任一项所述的嵌合抗原受体，其中，单链抗体识别的抗原选 自CD19、CD20、CEA、G02(又称B4GALNT1，beta-l，4-N-acetyl-galactosaminy 1transferase1)、F民（Flavinreductase)>PSMA(Prostate-specificmembrane antigen)、gplOO(PMELpremelanosomeprotein)、CA9(carbonicanhydraseIX)、CD171/ Ll-CAM、比-13Ra2、MRT-1(又称melan-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAGIB，cancer/ testisantigenIB) >MAGE(Melanoma-associatedantigenEl)家方矣蛋白、BAGE(B melanomaantigenfamily)家方矣蛋白、GAGE(growthhormonereleasingfacto