通过阳离子交换层析进行的抗体纯化的制作方法

通过阳离子交换层析进行的抗体纯化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及通过阳离子交换层析进行的抗体纯化。描述了一种通过阳离子交换层析来纯化抗体的方法，其中在使用电导率升高的洗脱缓冲液来洗脱期望抗体之前使用高pH清洗步骤来清除污染物。
【专利说明】通过阳离子交换层析进行的抗体纯化
[0001]本申请是申请日为2008年10月29日、中国申请号为200880119331.X、发明名称为“通过阳离子交换层析进行的抗体纯化”的发明申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2007年10月30日提交的美国临时专利申请N0.60/983825的权益， 通过述及将其公开内容完整收入本文用于所有目的。
发明领域
[0004]一般而言，本发明涉及蛋白质纯化。具体而言，本发明涉及一种使用阳离子交换层析自包含抗体和至少一种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，其中在使用电导率升高的洗脱缓冲液来洗脱期望抗体之前使用高PH清洗步骤来清除污染物。
[0005]发明背景
[0006]大规模的、经济的蛋白质纯化日益成为生物技术产业的重要问题。一般而言，通过细胞培养来生产蛋白质，使用通过插入含有感兴趣蛋白质的基因的重组质粒而改造成生成该蛋白质的真核或原核细胞系。由于通常所使用的细胞是活的有机体，因此必须给它们进料含有糖、氨基酸、和生长因子(通常自动物血清的制备物来供应)的复合生长培养基。将期望的蛋白质与进料给细胞的化合物混合物及与细胞自身的副产物分开至足以用作人治疗剂的纯度提出了艰难的挑战。
[0007]用于自细胞碎屑纯化蛋白质的规程首先取决于蛋白质表达的部位。一些蛋白质能自细胞直接分泌入周围的生长培养基中，其它蛋白质是胞内制备的。对于后一类蛋白质，纯化过程的第一步涉及裂解细胞，这可以通过多种方法来进行，包括机械剪切、渗压震扰、或酶处理。此类破坏将细胞的整个内含物释放入匀浆中，而且另外生成由于尺寸小而难以清除的亚细胞碎片。这些一般通过差速离心或通过过滤来清除。由于蛋白质生成运行的过程中细胞的天然死亡和胞内宿主细胞蛋白质的释放，直接分泌的蛋白质存在同样的问题，只是程`度较小。
[0008]一旦获得含有感兴趣蛋白质的澄清溶液，通常使用不同层析技术的组合来试图将它与细胞生成的其它蛋白质分开。这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度、或大小将蛋白混合物分开。这些技术每一种可利用数种不同层析树脂，从而容许为所涉及的具体蛋白质精确剪裁纯化方案。这些分离方法每一种的本质是能使蛋白质以不同速率沿长柱向下移动，从而实现随它们沿柱进一步向下移动时增大的物理分离，或者是能使蛋白质选择性粘附至分离介质，然后用不同溶剂差异洗脱。在一些情况中，当杂质特异性粘附至柱而感兴趣蛋白质不粘附至柱时，将期望蛋白质与杂质分开，也就是说，感兴趣的蛋白质存在于“流出液”中。
[0009]离子交换层析是常用于纯化蛋白质的一种层析技术。在离子交换层析中，溶质表面上带电荷的部分(patch)受到附着于层析基质的相反电荷的吸引，前提是周围缓冲液的离子强度低。一般通过提高缓冲液的离子强度(即电导率)以与溶质竞争离子交换基质带电荷的位点来实现洗脱。改变PH，由此改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方式。电导率或pH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或逐步的(分步洗脱)。在过去，这些变化是渐进的；即，pH或电导率以单一方向升高或降低。
[0010]美国专利N0.6，339，142 ;6，417，355 ;6，489，447 ;和 7，074，404 (Basey et al.)记载了用于纯化多肽的离子交换层析。美国专利N0.6，127, 526 ;6，333，398 ;和
6,797, 814 (Blank, G.)记载了通过蛋白A层析来纯化蛋白质，诸如抗HER2抗体。美国申请公开N0.2004/0082047中记载了通过离子交换层析来纯化蛋白质(诸如抗体)的方法。
[0011]美国专利N0.5，110, 913涉及通过于第一 pH4.6使抗体结合至离子交换树脂， 于第二 pH5.5清洗，并于pH6.5洗脱抗体来纯化水溶液中的抗体，其中这三个步骤的溶液的离子强度保持恒定。Zhang et al.涉及人抗体的Q膜、阴离子交换层析(Zhang et al.“Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process,，，Poster presented at BioProduction, Oct.26-27.Munich, Germany, 2004)。 其它关注蛋白质纯化的出版物包括:Barnthouse et al.J.Biotech.66:125-136 (1998)
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[0012]发明概述
[0013]本文中的发明关注一种用于抗体阳离子交换层析的改良方法，其中在洗脱期望抗体产物之前使用高PH清洗步骤来清除污染物。过程结果导致中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP) 污染物的清除得到改进等。
[0014]依照第一个方面，本发明提供了一种用于自包含抗体和至少一种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，该方法包括下述按序步骤: [0015](a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于第一 pH ；
[0016](b)用pH大于(a)中所述组合物的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述第一清洗缓冲液的PH为约6.8至约9.0 ；
[0017](c)用pH小于所述第一清洗缓冲液的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料； 并[0018](d)用电导率显著(substantially)大于所述第二清洗缓冲液的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0019]优选的是,所述抗体结合人⑶20,诸如利妥昔单抗(rituximab),或结合人血管内皮生长因子(VEGF),诸如贝伐单抗(bevacizumab)。
[0020]依照一个优选的实施方案中，本发明关注一种用于自包含结合人CH20的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组:中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、浸出的(leached)蛋白A、DNA、和聚集的CD20抗体，该方法包括下述按序步骤: [0021](a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4.0至约6.0 的pH ；
[0022](b)用pH约6.8至约9.0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述第一清洗缓冲液的PH为约6.8至约9.0 ；
[0023](c)用pH约5.0至约6.0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并
[0024](d)用pH约5.0至约6.0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0025]优选的是，所述⑶20抗体是利妥昔单抗。
[0026]一种另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种用于自包含结合人血管内皮生长因子(VEGF)的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组:细胞培养基成分、硫酸庆大霉素(Garamycin)、中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、DNA、病毒污染物、和聚集的VEGF抗体，该方法包括下述按序步骤:
[0027](a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4.0至约6.0 的pH ；
[0028](b)用pH约6.8至约8.0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；
[0029](c)用pH约5.0至约6.0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并
[0030](d)用pH约5.0至约6.0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0031 ] 优选的是，所述VEGF抗体是贝伐单抗。
[0032]本发明还关注一种组合物，其在包含约25mM HEPES, pH约7.8的缓冲液中包含利妥昔单抗。
[0033]另外，本发明提供了一种组合物，其在包含约25mM MOPS、pH约7.0的缓冲液中包含贝伐单抗。
[0034]本发明涉及下述各项。
[0035]1.一种用于自包含抗体和至少一种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，该方法包括下述按序步骤:
[0036](a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于第一 pH ；
[0037](b)用pH大于(a)中所述组合物的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述第一清洗缓冲液的PH为约6.8至约9.0 ；
[0038](c)用pH小于所述第一清洗缓冲液的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料； 并[0039](d)用电导率显著大于所述第二清洗缓冲液的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0040]2.项I的方法，其中所述第二清洗缓冲液的pH和所述洗脱缓冲液的pH大致相同。
[0041]3.项I的方法，其中所述抗体结合人⑶20。
[0042]4.项I的方法，其中所述抗体结合人血管内皮生长因子(VEGF)。
[0043]5.项I的方法，其中(a)中所述组合物的pH为约4.0至约6.0，所述第一清洗缓冲液的PH为约6.8至约8.0，所述第二清洗缓冲液的pH为约5.0至约6.0，而所述洗脱缓冲液的pH为约5.0至约6.0。
[0044]6.项I的方法，其中所述洗脱缓冲液的电导率为约10mS/cm至约100mS/cm。
[0045]7.项I的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约100至约300mM NaCl。
[0046]8.项I的方法，其中所述阳离子交换材料包括经磺丙基官能化多羟基化聚合物包被的交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通颗粒。
[0047]9.项I的方法，其中所述污染物选自下组:中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、浸出的蛋白A、DNA、聚集的抗体、细胞培养基成分、硫酸庆大霉素、和病毒污染物。
[0048]10.项I的方法，进一步包括在步骤(a)至⑷之前、期间、或之后将包含所述抗体的组合物进行一个或多个进一步的纯化步骤以获得所述抗体的均质制备物。
[0049]11.项10的方法，进一步包括将纯化的抗体与异源分子偶联。
[0050]12.项10或11的方法，进一步包括通过组合所述抗体的均质制备物或所述偶联的抗体与医学可接受载体来制备药物组合物。
`[0051]13.一种用于自包含结合人CH20的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组:中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、浸出的蛋白A、DNA、和聚集的CD20抗体，该方法包括下述按序步骤:
[0052](a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4.0至约6.0 的pH ；
[0053](b)用pH约6.8至约9.0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述第一清洗缓冲液的PH为约6.8至约9.0 ；
[0054](c)用pH约5.0至约6.0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并
[0055](d)用pH约5.0至约6.0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0056]14.项13的方法，其中所述抗体是利妥昔单抗。
[0057]15.项13的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约100至约300mM NaCl。
[0058]16.一种用于自包含结合人血管内皮生长因子(VEGF)的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组:细胞培养基成分、硫酸庆大霉素、 中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、DNA、病毒污染物、和聚集的VEGF抗体，该方法包括下述按序步骤:
[0059](a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4.0至约6.0 的pH ；
[0060](b)用pH约6.8至约8.0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；
[0061](c)用pH约5.0至约6.0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并[0062](d)用pH约5.0至约6.0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0063]17.项16的方法，其中所述抗体是贝伐单抗。
[0064]18.项16的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约100至约300mM NaCl。
[0065]19.一种组合物，其在包含约25mM HEPES、pH约7.8的缓冲液中包含利妥昔单抗。
[0066]20.一种组合物，其在包含约25mM MOPS、pH约7.0的缓冲液中包含贝伐单抗。
[0067]附图简述
[0068]图1A和IB提供了利妥昔单抗的重链(SEQ ID N0.1)和轻链(SEQ ID N0.2)的氨基酸序列。鉴定了每个可变区中的每个框架区(FR1-4)和每个⑶R区(⑶R1-3)，正如人伽马I重链恒定序列和人卡帕轻链恒定序列。重链可变区(VH)在SEQ ID N0.3中。轻链可变区(VL)在 SEQ ID N0.4 中。CDR 的序列标识符为:CDR Hl (SEQ ID N0.5), CDR H2 (SEQ ID N0.6)，CDR H3(SEQ ID N0.7)，CDR LI(SEQ ID N0.8)，CDR L2(SEQ ID N0.9)，和 CDR L3 (SEQ ID N0.10)。
[0069]图2A和2B提供了贝伐单抗的重链(SEQ ID N0.11)和轻链(SEQ ID N0.12)的氨基酸序列。每个可变区的末端以I标示。重链可变区(VH)在SEQ ID N0.13中。轻链可变区(VL)在SEQ ID N0.14中。每个可变区中的三个⑶R均标有下划线。⑶R的序列标识符为:CDR Hl (SEQ ID N0.15)，CDR H2 (SEQ ID N0.16)，CDR H3 (SEQ ID N0.17)，CDR LI (SEQ ID N0.18)，CDR L2 (SEQ ID N0.19)，和 CDR L3 (SEQ ID N0.20)。
[0070]图3提供了改良 的利妥昔单抗工艺与最初的工艺相比，阳离子交换层析过程对宿主细胞蛋白质的清除的并行比较。用新的工艺实现了卓越的CHOP清除。
[0071]发明详述
[0072]定义
[0073]在本文中，术语“约”之后的数值范围或量明确包括精确的范围或精确的数值量。
[0074]本文中要纯化的“组合物”包含感兴趣的抗体和一种或多种污染物。所述组合物可以是“部分纯化的”(即已经进行过一个或多个纯化步骤)或者可以是自生成抗体的宿主细胞或生物体直接获得的(例如所述组合物可以包含收获的细胞培养液)。
[0075]在用于本文时，“多肽”通常指具有多于约十个氨基酸的肽和蛋白质。优选的是， 所述多肽是哺乳动物蛋白质，其例子包括:肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；a -1-抗胰蛋白酶；胰岛素A 链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，诸如蛋白C ;心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物 (t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-a和-0 ;脑啡肽酶；RANTES(在激活后受到调节，正常情况下由T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-a );血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原； 小鼠促性腺素相关肽；微生物的蛋白质，诸如P -内酰胺酶；DNA酶；IgE ;细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4;抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF);激素的或生长因子的受体；蛋白A或D ;类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生的神经营养因子 (BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4, NT-5或NT_6)，或神经生长因子，诸如NGF-^ ;血小板衍生生长因子(I3DGF);成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF ;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)，诸如 TGF- a 和 TGF- ^，包括 TGF- ^ UTGF- ^ 2、TGF- 3 3、 TGF-3 4 或 TGF-3 5 ;胰岛素样生长因子-1 和-1I (IGF-1 和 IGF-1I )；des (1-3)-1GF-1 (脑 IGF-1)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP) ;CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20 ; (促)红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP);干扰素，诸如干扰素- a、- @和-Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ;白介素(IL)，例如 IL-1至IL-1O ;超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如AIDS被膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，诸如⑶11a、 CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ;肿瘤相关抗原，诸如 HER2、HER3 或 HER4 受体；及任何上文所列多肽的片段和/或变体，以及结合任何上文所列多肽的抗体，包括抗体片段。 一种优选的多肽是结合人CD20的完整抗体或抗体片段，例如利妥昔单抗；或者结合人血管内皮生长因子(VEGF)的完整抗体或抗体片段，例如贝伐单抗。
[0076]“污染物”指与期望的抗体产物不同的物质。污染物包括但不限于:宿主细胞物质，诸如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP);浸出的蛋白A;核酸；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分(例如硫酸庆大霉素； GENTAMYCIN? 等。
[0077]短语“阳离子交换材料”指如下的固相，其带负电荷且有游离阳离子供与流过该固相的水溶液中的阳离子交换。所述电荷可以通过将一种或多种带电荷的配体附着至所述固相(例如通过共价连接)来提供。或者/另外，所述电荷可以是所述固相的内在特性 (例如在硅土的情况中，其具有总体负电荷)。商品化的阳离子交换材料包括羧甲基纤维素、 BAKERBOND ABX?、在琼脂糖上固定化的磺丙基(SP)(例如GE Healthcare的SP-SEPHAR0SE FAST FLOW?、SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL? 或 SP-SEPHAR0SE HIGH PERFORMANCE?)、 CAPTO S?(GE Healthcare)、FRACT0GEL-S03?、FRACT0GEL-SE HICAP?、和 FRACT0PREP?(EMD Merck)、和在琼脂糖上固定化的磺酰基(例如GE Healthcare的S-SEPHAR0SE FAST FLOW?)、 和SUPER SP?(Tosoh Biosciences)。本文中一种优选的阳离子交换材料包括经磺丙基官能化多羟基化聚合物包被的交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通颗粒(cross-linked poly(styrene-divinylbenzene)flow-through particles(solid phase)coated with a polyhydroxylated polymer functionalized with sulfapropyl groups)(固相)(例如 P0R0S50 HS?层析树脂)。
[0078]“固相”指一种或多`种带电荷的配体能粘附的非水性基质。固相可以是纯化柱(包括但不限于扩张床和填充床柱(expanded bed and packed bed columns))、离散颗粒的不连续相、膜、或滤器等。用于形成固相的材料的例子包括多糖(诸如琼脂糖和纤维素)和其它物理稳定的基质诸如硅土(例如受控孔径玻璃)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒及上述任一项的衍生物。
[0079]术语“载荷”在本文中指加载到阳离子交换材料上的组合物。优选的是，在加载要纯化的组合物之前用平衡缓冲液平衡阳离子交换材料。
[0080]“缓冲液”指通过其酸-碱成对成分的作用来抵抗pH变化的溶液。Buffers.A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed.Calbiochem Corporation (1975)中记载了取决于例如期望的缓冲液pH而可采用的多种缓冲液。
[0081]“平衡缓冲液”指用于在将包含感兴趣抗体和一种或多种污染物的组合物加载到阳离子交换材料上之前平衡阳离子交换材料的缓冲液。优选的是，本文中的平衡缓冲液的 pH在约5.0至约6.0的范围中，优选约5.5。优选的是，本文中的平衡缓冲液的电导率在约 I至约8mS/cm、优选约4至约8mS/cm、和最优选约5至约8mS/cm的范围中。任选的是,平衡缓冲液包含盐，诸如NaCl，例如约40mM至约80mM、优选约60mM NaCl的量。
[0082]术语“清洗缓冲液”在本文中用于指在加载组合物之后且在洗脱感兴趣蛋白质之前流过阳离子交换材料的缓冲液。清洗缓冲液可用于自阳离子交换材料清除一种或多种污染物，基本上不洗脱期望抗体产物。依照本文中发明的优选实施方案，使用“第一清洗缓冲液”和“第二清洗缓冲液”。
[0083]在本文中，表述“第一清洗缓冲液”指具有相对于加载缓冲液和/或平衡缓冲液的 PH升高的pH的清洗缓冲液。第一清洗缓冲液在本文中可用于自阳离子交换材料洗脱一种或多种污染物，基本上不自其洗脱感兴趣的抗体产物。术语“第一”不应解释为排除在加载缓冲液与第一清洗缓冲液之间使用一种或多种别的清洗或其它缓冲液。优选的是，本文中的第一清洗缓冲液的PH在约6.8至约9.0的范围中、优选约7.0至约8.0、和最优选pH约
7.0或pH约7.8。优选的是，本文中的第一清洗缓冲液的电导率在约0.01至约5mS/cm、优选约0.1至约3mS/cm、和最优选约0.2至约2mS/cm的范围中。任选的是，第一清洗缓冲液中基本上不含盐(诸如NaCl)。
[0084]表述“第二清洗缓冲液”就本申请而言指在第一清洗缓冲液之后用于使阳离子交换材料准备好洗脱感兴趣抗体的清洗缓冲液。术语“第二”不应解释为排除在第一清洗缓冲液与第二清洗缓冲液之间使用一种或多种别的清洗缓冲液或其它缓冲液。优选的是，本文中的第二清洗缓冲液的pH在约5.0至约6.0、优选约5.5的范围中、和最优选pH5.5。优选的是，本文中的第二清洗缓冲液的电导率在约0.01至约5mS/cm、优选约0.1至约3mS/cm、 和最优选约0.5至约3.0mS/cm的范围中。
[0085]“洗脱缓冲液”用于自固相洗脱感兴趣抗体。在本文中，洗脱缓冲液具有相对于第二清洗缓冲液显著(substantially)升高的电导率,使得期望抗体产物自阳离子交换材料洗脱。优选的是，洗脱缓冲液的电导率显著大于加载缓冲液和每一种在前缓冲液(即平衡缓冲液、第一清洗缓冲液、和第二清洗缓冲液)的电导率。“显著更大的”电导率意味着例如该缓冲液具有比与它比较的组合物或缓冲液的电导率大至少2、3、4、5或6个电导率单位(mS/ cm)的电导率。在一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH与平衡缓冲液和/或第二清洗缓冲液的pH基本上相同。优选的是，本文中的洗脱缓冲液的pH在约5.0至约6.0的范围中、优选约5.5、和最优选pH5.5。优选的是，本文中的洗脱缓冲液的电导率在约lOmS/cm至约IOOmS/ cm、优选约12mS/cm至约30mS/cm、和最优选约12至约20mS/cm的范围中。电导率升高可通过向洗脱缓冲液添加盐(诸如氯化钠、乙酸钠、氯化钾)来实现。优选的是，洗脱缓冲液包含约100至约300mM NaCl、优选约150mM至约200mM NaCl、例如约175mM NaCl或约160mM NaCl。
[0086]“再生缓冲液”可用于再生阳离子交换材料，使得它能再使用。再生缓冲液具有自阳离子交换材料清除基本上所有污染物和感兴趣抗体所要求的电导率和/或pH。
[0087]术语“电导率”指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子运输来流动。因此，随着水溶液中存在的离子的量越来越多，溶液会具有更高的电导率。电导率的度量的基本单位是西门子(或欧姆)、欧姆(mS/cm)，而且可以使用电导率计来测量，诸如各种型号的Orion电导率计。因为电解电导率是溶液中的离子携带电流的能力，所以溶液的电导率可以通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠、或氯化钾)的浓度来实现期望的电导率。优选的是，更改各种缓冲液的盐浓度来实现期望的电导率。
[0088]自包含抗体和一种或多种污染物的组合物“纯化”所述抗体指通过自所述组合物清除(完全地或部分地)至少一种污染物来提高所述抗体在所述组合物中的纯度。“纯化步骤”可以是产生“均质”组合物的整个纯化过程的一部分。“均质的”在本文中用于指包含至少约70% (以重量计)感兴趣抗体(基于组合物总重)、优选至少约80% (以重量计)、更优选至少约90% (以重量计)、甚至更优选至少约95% (以重量计)的组合物。
[0089]使某分子“结合”至阳离子交换材料指在适宜条件(pH和/或电导率)下将所述分子暴露于所述阳离子交换材料，使得所述分子依靠所述分子与所述阳离子交换材料的带电荷基团之间的离子相互作用在所述阳离子交换材料中或上可逆固定化。
[0090]“清洗”阳离子交换材料指使适宜的缓冲液流过阳离子交换材料。
[0091]自阳离子交换材料“洗脱”某分子(例如抗体或污染物)指自其清除所述分子。
[0092]在本发明的优选实施方案中，本文中要纯化的抗体是重组抗体。“重组抗体”指在经编码所述抗体的核酸转化或转染或者因同源重组而生成所述抗体的宿主细胞中生成的抗体。“转化”和“转染”可互换使用，指将核酸导入细胞中的过程。转化或转染后，该核酸可整合入宿主细胞基因组中，或者可作为染色体外元件存在。“宿主细胞”包括体外细胞培养物中的细胞以及宿主动物内的细胞。例如美国专利N0.5，534，615记载了用于重组生产多肽的方法，通过述及明确收入本文。
[0093]起始多肽的“变体”或“氨基酸序列变体”指包含与起始多肽不同的氨基酸序列的多肽。一般而言，变体会与天然多肽拥有至少80%序列同一性，优选至少90%序列同一性，更优选至少95%序列同一`性，和最优选至少98%序列同一性。百分比序列同一性在比对序列以提供最大同源性后通过例如Fitch et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:1382-1386 (1983)，Needleman et al., J.Mol.Biol.48:443-453 (1970)记载的算法版本来确定。多肽的氨基酸序列变体可以通过将适宜的核苷酸变化引入编码所述多肽的DNA或者通过肽合成来制备。此类变体包括例如感兴趣多肽的氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。进行删除、插入、和替代的任何组合来实现最终的构建物，前提是所述最终构建物拥有期望的特征。氨基酸变化还可改变多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰、苏氨酰或酪氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(Τ.Ε.Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman&C0.，SanFrancisco, pp.79-86(1983))。例如美国专利N0.5，534，615记载了用于生成多肽氨基酸序列变体的方法，通过述及明确收入本文。
[0094]术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的结合特异性。[0095]本文中的抗体针对感兴趣的“抗原”。优选的是，所述抗原是在生物学上重要的多肽，而且对患有疾病或病症的哺乳动物施用所述抗体能在该哺乳动物中产生治疗好处。然而，还涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见美国专利5，091，178)的抗体。在抗原是多肽的情况中，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体(诸如生长因子)。例示性的抗原包括上文讨论的那些多肽。本发明所涵盖的抗体的优选分子靶物包括CD多肽，诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20 和 CD34 ；HER 受体家族的成员，诸如 EGF 受体(HER1)、HER2、HER3 或HER4 受体；细胞粘附分子，诸如 LFA-1、Macl、pl50、95、VLA-4、ICAM-l、VCAi^P av/b3 整联蛋白包括其a或b亚基(例如抗⑶11a、抗⑶18或抗⑶Ilb抗体)；生长因子，诸如VEGF ；IgE ；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA_4 ;多肽C等。可以使用可溶性抗原或其片段(任选偶联至其它分子)作为免疫原来生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，可以使用这些的片段(例如受体的胞外域)作为免疫原。或者，可以使用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)或者可以是已经通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。 [0096]本文中要纯化的抗体的例子包括但不限于:HER2抗体，包括曲妥珠单抗(trastuzumab) (HERCEPTM?) (Carter et al., Proc.Nat 1.Acad.Sc 1.USA, 89:4285-4289(1992),美国专利 N0.5，725，856)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARG?) (W001/00245) ；CD20 抗体(见下文)；IL_8 抗体(St John etal., Chest, 103:932(1993),及国际公开 N0.W095/23865) ;VEGF 或 VEGF 受体抗体，包括人源化的和/或亲和力成熟的VEGF抗体，诸如人源化VEGF抗体huA4.6.1贝伐单抗(AVASTTN?)和拦你单抗(ranibizumab) (LUCENTIS?) (Kim etal., Growth Factors, 7:53-64 (1992),国际公开 N0.W096/30046,及 W098/45331, 1998年10月15日公布)；PSCA抗体(W001/40309) ；CDlla抗体，包括依法利珠单抗(efalizumab) (RAPTIVA K )(美国专利 N0.5，622，700，W098/23761, St印pe etal., Transplant Intl.4:3-7 (1991),及 Hourmant et al.,Transplantation58:377-380 (1994));结合IgE的抗体，包括奥玛珠单抗(omalizumab) (XOLAIR?) (Prestaet al., J.1mmunol.151:2623-2632 (1993),及国际公开 N0.TO95/19181;美国专利N0.5，714，338，1998年2月3日公告或美国专利N0.5，091, 313，1992年2月25日公告，TO93/04173, 1993 年 3 月 4 日公布，或国际申请 N0.PCT/US98/13410, 1998 年 6 月 30日提交，美国专利N0.5，714，338) ；CD18抗体(美国专利N0.5，622，700，1997年4月22日公告，或W097/26912，1997年7月31日公布);Apo_2受体抗体抗体(W098/51793, 1998年11月19日公布);组织因子(TF)抗体(欧洲专利N0.0420937B1, 1994年11月9日授权)；α 4-α 7整联蛋白抗体(W098/06248, 1998年2月19日公布);EGFR抗体(例如嵌合的或人
源化的 225 抗体，西妥昔单抗(cetuximab)，ERBUTIX?, W096/40210, 1996 年 12 月 19 日
公布);CD3抗体，诸如0KT3(美国专利N0.4，515，893，1985年5月7日公告);CD25或Tac抗
体,诸如 CH1-621 (SIMULECT?)和ZENAPAXfJ (参见美国专利 N0.5，693，762，1997
年 12 月 2 日公告)；Q)4 抗体，诸如 cM-7412 抗体(Choy et al.ArthritisRheum39(l):52-56(1996)) ；CD52 抗体，诸如 CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann etal.Nature332:323-337 (1988)) ;Fc 受体抗体，诸如针对 Fe Y RI 的 Μ22 抗体(Graziano etal.J.1mmunol.155(10):4996-5002(1995));癌胚抗原(CEA)抗体，诸如 hMN-14(Sharkeyet al.Cancer Res.55 (23Suppl): 5935s_5945s (1995));针对乳房上皮细胞的抗体，包括 huBrE-3、hu-Mc3 和 CHL6(Ceriani et al.Cancer Res.55(23):5852s-5856s (1995);及 Richman et al.Cancer Res.55 (23Supp): 5916s_5920s (1995));结合结肠癌细胞的抗体，诸如 C242 (Litton et al.Eur J.1mmunol.26 (I): 1-9 (1996)) ;CD38 抗体，例如 AT13/5(Ellis et al.J.1mmunol.155 (2): 925-937 (1995)) ;CD33 抗体，诸如 HuM195 (Jurcic et al.Cancer Res55 (23Suppl): 5908s_5910s (1995))和 CMA-676 或 CDP771 ;EpCAM 抗体，诸如 17-1A (PANOREX?)； GpIIb/IIIa 抗体，诸如阿昔单抗(abciximab)或 c7E3Fab (REOPRO?)； RSV 抗体，诸如 MED1-493 (SYNAGIS?)； CMV 抗体，诸如PROTOVIR?； HIV抗体，诸如PR0542 ;肝炎抗体，诸如H印B抗体OSTAVIR?; CA125抗体 OvaRex ;独特型 GD3 表位抗体 BEC2 ; α ν β 3 抗体(例如 V11Λ XIN ； Medimmune )；人肾细胞癌抗体，诸如ch-G250 ；ING-1 ;抗人17-lAn抗体(3622W94);抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33);针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24 ;抗人鳞状细胞癌(SF-25)；人白细胞抗原(HLA)抗体，诸如Smart IDlO和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1) ;Q)37抗体， 诸如 TRU016(Trubion) ;IL_21 抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk);抗 B 细胞抗体(Impheron) ;B 细胞革巴向单抗(Immunogen/Aventis) ； 1D09C3(Morphosys/GPC)；LymphoRadl31 (HGS) ；Lym-1 抗体，诸如 Lym-lY-90(USC)或抗 Lym-lOncolym(USC/Peregrine) ；LIF226 (Enhanced Lifesc1.) ；BAFF 抗体(例如 W003/33658) ；BAFF 受体抗体(参见例如 W002/24909) ；BR3 抗体；Blys 抗体，诸如 belimumab ；LYMPHOSTAT-B? ；ISF154 (UCSD/Roche/Tragen) ；gomilixima (I dec 152; Biogen Idee) ;IL_6 受体抗体，诸如atlizumab (ACTEMRA?; Chugai/Roche) ;IL_15 抗体，诸如 HuMax_Il_15 (Genmab/Amgen);趋化因子受体抗体，诸如CCR2抗体(例如MLNl202; Mi 11 ieneum);抗补体抗体，诸如C5抗体(例如eculizumab, 5G1.1;Alexion);人免疫球蛋白口服配制剂(例如IgPO;ProteinTherapeutics) ;IL_12 抗体，诸如 ABT-874 (CAT/Abbott) ；Teneliximab (BMS-224818; BMS)；CD40 抗体，包括 S2C6 及其人源化变体(W000/75348)和 TNXlOO (Chiron/Tanox) ；TNF- α抗体，包括 cA2 或英夫利昔单抗(infliximab) (REMICADE⑧)、CDP571、MAK-195、阿达木单抗(adalimumab) (HUMIRA?)、PEG 化 TNF-α 抗体片段，诸如 CDP-870 (Celltech)、D2E7 (Knoll)、抗 TNF-α 多克隆抗体(例如 PassTNF; Verigen) ;CD22 抗体，诸如 LL2 或依帕珠单抗(epratuzumab) (LYMPHOCIDE⑩；Immunomedics)，包括依帕珠单抗 Y-90 和
依帕珠单抗 1-131、Abiogen 的 CD22 抗体(Abiogen, Italy)、CMC544(ffyeth/Celltech)、combotox (UT Soutwestern)、BL22 (NIH)、和 LympoScan Tc99 (Immunomedics)。优选的是本文中纯化的抗体是结合人CD20的裸的、完整的抗体或结合人VEGF的裸的、完整的抗体。
[0097]人“⑶20”抗原或“⑶20”是在超过90%来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上找到的约35kDa非糖基化磷蛋白。⑶20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上，但在干细胞上不表达。⑶20在文献中的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。⑶20抗原记载于例如 Clark et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 82:1766 (1985)。[0098]“CD20抗体拮抗剂”在本文中指在结合B细胞上的CD20后破坏或消减受试者中的B细胞和/或干扰一项或多项B细胞功能的抗体,例如通过降低或阻止B细胞引发的体液应答。抗体拮抗剂优选能够消减用它治疗的受试者中的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这样的消减可通过多种机制来实现，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(⑶C)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过凋亡)。
[0099]在用于本文时，“B细胞消减”指一般在药物或抗体治疗后，动物或人体中B细胞水平与治疗前水平相比的降低。B细胞消减可以是部分的或完全的。B细胞水平可使用众所周知的技术来测量，诸如Reff et al.，Blood83:435-445 (1994)或美国专利N0.5，736，137 (Anderson et al.)中所记载的。举例而言,可以用各种剂量的抗体或免疫粘附素处理哺乳动物(例如正常的灵长类动物)，并可以测定外周B细胞浓度，例如通过对B细胞计数的FACS方法。
[0100]CD20抗体的例子包括:“C2B8”，现在称作“利妥昔单抗”(rituximab) (RITUXAN?)(美国专利 N0.5，736，137) ;?乙[90]标记的 2B8 鼠抗体，称作 “Y2B8” 或 “ Ibritumomab Tiuxetan ” (ZEVALIN?)，可以从 I DEC Pharmaceuticals
公司购买(美国专利N0.5，736，137 ；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388)；鼠 IgG2a “BI”，也称作 “Tositumomab”，任选用 1311 标记以产生“ 1311-B1 ”或“碘131 tositumomab”抗体(BEXXAR?),可以从Corixa购买(还可参见美国专利N0.5，595，721);鼠单克隆抗体“ 1F5”(Press et al.，Blood69 (2): 584-591 (1987))及其变体，包括“框架修补的”或人源化的1F5 (W02003/002607，Leung, S.; ATCC保藏物HB-96450)；鼠 2H7 和嵌合 2H7 抗体(美国专利 N0.5，677，180);人源化 2H7 (W02004/056312, Lowman etal.及下文所列)；2F2 (HuMax-⑶20)，一种完全人的高亲和力抗体，靶向B细胞细胞膜中的 CD20 分子(Genmab, Denmark;参见例如 Glennie and van de ffinkel, Drug DiscoveryToday8:503-510(2003);Cragg et al.，BloodlOl:1045-1052(2003);W02004/035607;US2004/0167319) ;TO2004/035607 和 US2004/0167319 (Teeling et al.)中所列出的人单克隆抗体；US2004/0093621(Shitara et al.)中所记载的Fe区结合有复杂N-糖苷连接的糖链的抗体；诸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的与CD20结合的单克隆抗体和抗原结合片段(W02005/000901，Tedder et al.);诸如AME系列抗体的CD20结合分子，例如 W02004/103404 和 US2005/0025764(Watkins et al.,Eli Lilly/Applied MolecularEvolution, ΑΜΕ)中所列出的 AME33 抗体；诸如 US2005/0025764(Watkins et al.)中所记载的CD20结合分子；A20抗体或其变体，诸如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20和 hA20)或 IMMU-106(US2003/0219433, Immunomedics) ;CD20 结合抗体，包括表位消减的 Leu-16、1H4 或 2B8，任选偶联有 IL-2，如 US2005/0069545A1 和 W02005/16969 (Carr etal.)中的;与CD22和CD20结合的双特异性抗体，例如hLL2xhA20 (W02005/14618, Changet al.);单克隆抗体L27、G28-2、93_1B3、B-Cl或NU-B2，可以从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(Valentine et al.,于:LeukocyteTyping 111, McMichael 编，ρ.440，Oxford University Press (1987) ；1H4(Haismaet al., Blood92:184(1998))；抗 CD20auristatin E 偶联物(Seattle Genetics)；抗CD20-1L2 (EMD/Biovation/City of Hope)；抗 CD20 单抗疗法(EpiCyte)；抗 CD20 抗体TRUO15 (Trubion)。本文中优选的CD20抗体是嵌合的、人源化的或人的CD20抗体，更优选利妥昔单抗、人源化2H7、2F2(Hu-Max-CD20)人CD20抗体(Genmab)和人源化A20抗体或IMMUN-106 抗体(Immunomedics)。
[0101]为了本文中的目的，本文中的术语“利妥昔单抗” (rituximab)、“RITUXAN?”、和“C2B8”指一种结合人CD20抗原的重组嵌合抗体，如美国专利N0.5，736，137，Andersonet al中所记载的。此类抗体优选包含如下的重链和轻链，所述重链包含⑶R Hl (SEQ IDN0.5)、CDR H2 (SEQ ID N0.6)、CDR H3 (SEQ ID N0.7)，其中所述轻链优选包含 CDR LI (SEQID N0.8)、CDR L2 (SEQ ID N0.9)、和 CDR L3 (SEQ ID N0.10);优选的是，所述重链包含如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID N0.3，而所述轻链可变区包含SEQ ID N0.4;且最优选包含如下的重链和轻链，所述重链包含SEQ ID N0.1 (有或无C端赖氨酸残基)，其中所述轻链优选包含SEQ ID N0.2。这些术语明确包括变体形式，诸如 Moorhouse et al.J.Pharm Biomed.Anal.16:593-603 (1997)中所记载的。
[0102]术语“人VEGF”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，及相关的121个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung etal., Science246:1306 (1989);及Houck et al., Mol.Endocrin.5:1806 (1991)所述，及那些生长因子的天然存在等位形式和加工形式。
[0103]本发明提供了能够抑制VEGF的一项或多项生物学活性(例如其促有丝分裂或血管发生活性)的抗VEGF拮抗性抗体。VEGF的拮抗剂通过干扰VEGF结合细胞受体、通过使已经被VEGF激活的细胞没有能力或杀死已经被VEGF激活的细胞、或通过干扰VEGF结合细胞受体后血管内皮细胞激活来起作用。为了本发明的目的，VEGF拮抗剂的所有这些干扰点应当视为等同的。
[0104]为了本文中的目的，本文中的术语“贝伐单抗”(bevacizumab)、“AVASTIN?”、“F(ab)-12”和“rhuMAb VE`GF”指一种结合人血管内皮生长因子(VEGF)抗原的重组人源化单克隆抗体(rhuMAb VEGF),如美国专利N0.7，169，901，Presta et al中所记载的。此类抗体优选包含如下的重链和轻链，所述重链包含⑶R Hl (SEQ ID N0.15)、⑶R H2 (SEQID N0.16)、CDR H3 (SEQ ID N0.17)，其中所述轻链优选包含⑶R LI (SEQ ID N0.18)、CDRL2 (SEQ ID N0.19)、和CDR L3 (SEQ ID N0.20);最优选的是，所述重链包含如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID N0.13，而所述轻链可变区包含SEQ ID N0.14 ;且优选包含如下的重链和轻链，所述重链包含SEQ ID N0.11(有或无C端赖氨酸残基)，其中所述轻链优选包含SEQ ID N0.12。这些术语明确包括重组抗体产物生产期间形成的变体形式。
[0105]术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature256:495 (1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利N0.4，816，567)来制备。在又一个实施方案中，可以从使用McCafferty et al., Nature, 348:552-554(1990)所记载的技术构建的卩遼菌体抗体库分离“单克隆抗体”。Clackson et al.，Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology, 10:779-783 (1992)),以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al., Nuc.Acids.Res.，21:2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits et al., Nature, 362:255-258(1993);Bruggermann etal., Year in Tmmunο., 7:33 (1993);及 Duchosal et al.Nature355:258(1992)。
[0106]单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利N0.4，816，567;Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855(1984))。
[0107]术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“⑶R”的氨基酸残基(即轻链可变域中的残基24-34(Ll)、50-56 (L2)和 89-97 ( L3)及重链可变域中的残基 31-35 (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3)；Kabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest,第5版，PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))和 / 或那些来自“高变环”的残基(即轻链可变域中的残基26-32(Ll)、50-52(L2)和91_96(L3)及重链可变域中的残基 26-32 (HI)、53-55(H2)和 96_101(H3) ；Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。
[0108]非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。
[0109]用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR) (Sims et al., J.Tmmunol.151:2296 (1993) ; Chothia et al., J.Mol.Biol.196:901(1987))。
[0110]另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:4285(1992);Presta et al., J.1mmunol.151:2623(1993))。 [0111]更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
[0112]“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F (ab’)2和Fv片段；双抗体(diabody);线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al., Journal of Biochemicaland Biophysical Methods24:107-117(1992);Brennan et al.，Science229:81 (1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab’ -SH片段并化学偶联以形成F (ab’) 2片段(Carter et al.，Bio/TechnologylO: 163-167 (1992))。在另一个实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4以促进F(ab’)2分子的装配来形成F(ab’)2。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。
[0113]在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见W093/16185。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在Vh与\结构域之间进一步包含多肽接头，其使得sFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,于《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》，第 Il3 卷，Rosenburg 和 Moore 编，Springer-Verlag, New York,第 269_；315页，1994。
[0114]术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(Vh-Vl)中包含相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(')。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP404，097;W093/11161;HOllinger等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。
[0115]表述“线性抗体”在遍及本申请使用时指Zapata et al., PolypeptideEng, 8 (10):1057-1062(1995)中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(Vh-Ch1-Vh-ChI)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
[0116]“多特异性抗体”具有对至少两种不同表位的特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只会结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。BsAb的例子包括一个臂针对肿瘤细胞抗原而另一个臂针对细胞毒性触发分子的BsAb，诸如抗Fe Y RI/抗⑶15、抗pl85HEK2/FcyRIII (CD16)、抗 CD3/ 抗恶性 B 细胞(IDlO)、抗 CD3/ 抗 pl85臓2、抗 CD3/ 抗 p97、抗 CD3/抗肾细胞癌、抗⑶3/抗OVCAR-3、抗⑶3/L-D1 (抗结肠癌)、抗⑶3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMAl、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3 ;一个臂特异性结合肿瘤抗原而另一个臂结合毒素的BsAb，诸如抗皂草素/抗Id-Ι、抗⑶22/抗皂草素、抗⑶7/抗皂草素、抗⑶38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素-α (IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱类；用于转变酶活化的前体药物的BsAb，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化磷酸丝裂霉素前体药物转变成丝裂霉素醇)；可用作溶纤剂的BsAb，诸如抗血纤维蛋白/抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA);用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb，诸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fe受体(例如Fe YRI或Fe Y RIII);用于传染病治疗的BsAb，诸如抗⑶3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体:CD3复合物/抗流感、抗Fe Y R/抗HIV ;用于体外或体内肿瘤检测的BsAb，诸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85HEK2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb ;及作为诊断工具的BsAb，诸如抗家兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP) /抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β -半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括抗⑶3/抗⑶4/抗⑶37、抗⑶3/抗⑶5/抗⑶37和抗⑶3/抗⑶8/抗⑶37。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
[0117]涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.1mmunol.147:60(1991)。
[0118]为了本文中的目的，“裸抗体”或“裸露的抗体”指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
[0119]“完整抗体”在本文中指包含两个抗原结合区及Fe区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fe区。`
[0120]“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。
[0121 ] “病症”指任何会受益于如本文所述纯化的抗体治疗的疾患。这包括慢性和急性这两类病症和疾病，及那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。
[0122]术语“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
[0123]术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
[0124]本发明的实施方式[0125]本文中的发明提供了用于自包含抗体和一种或多种污染物的组合物(例如水溶液)纯化所述抗体的方法。所述组合物一般是源自抗体重组生产的组合物，但是可以是源自通过肽合成(或其它合成手段)进行的抗体生产的组合物，或者可以自抗体的天然来源纯化所述抗体。优选的是，所述抗体结合人CD20抗原，诸如利妥昔单抗，或者结合人VEGF抗原，诸如贝伐单抗。
[0126]抗体的重组生产
[0127]为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一项或多项:信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列(例如美国专利5，534，615中所记载的，通过述及明确收入本文)。
[0128]适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) >沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266，710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294 (ATCC31, 446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31，537)和大肠杆菌W3110 (ATCC27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
`[0129]在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.1actis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis) (ATCC12, 424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus) (ATCC16, 045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii) (ATCC24, 178)、K.waltii (ATCC56, 500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum) (ATCC36, 906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotoIerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus);亚罗酵母属(Yarrowia)(EP402, 226);巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (EP183, 070);假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP244, 234);粗糖脉抱菌(Neurospora crassa);许旺酵母属(Schwanniomyces),诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis);和丝状真菌,诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
[0130]适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda (毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti (蚊子)、白纹伊蚊 Aedes albopictus (蚊子)、黑腹果妮 Drosophila melanogaster (果妮)和家香 Bombyxmori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染,例如苜猜尺蠖Autographa californicaNPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm_5株,而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
[0131]然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子包括但不限于用SV40转化的猴肾CVl细胞(C0S-7，ATCC CRL1651);人胚肾细胞(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al., J.Gen Virol.36:59 (1977));幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216 (1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4, Mather, Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVI, ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA, ATCC CCL2);犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A, ATCC CRL1442);人肺细胞(W138, ATCC CCL75);人肝细胞(Hep G2, HB8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT060562, ATCC CCL51) ；TRI 细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sc1.383:44-68(1982) ;MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤细胞(Hep G2)。通常，CHO细胞优选用于表达抗体，而且可有利地用于生成依照本发明纯化的抗体。
[0132]用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
[0133]可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如 Ham 氏 FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM, Sigma)、RPM1-1640 (Sigma)、和 Dulbecco 氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基:Ham et al.，Meth.Enz.58:44(1979) ;Barneset al., Anal.Biochem.102:255 (1980);美国专利 N0.4，767，704 ;4，657，866 ;4，927，762 ；4，560，655 ;或 5，122，469 ；W090/03430 ；W087/00195 ;或美国专利复审 30，985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如硫酸庆大霉素；GENTAMYCIN⑩)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、PH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
[0134]在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解细胞的微粒碎片(例如源自匀浆)。如果将抗体分泌到培养基中，那么可以使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。
[0135]本发明的阳离子交换层析方法
[0136]在本发明的优选实施方案中，要进行本文中纯化方法的组合物是由中国仓鼠卵巢(CHO)重组宿主细胞培养物表达的重组生产的抗体，优选完整抗体。任选的是，所述组合物在阳离子交换层析之前已经进行过至少一个纯化步骤。所述组合物含有感兴趣的抗体和一种或多种污染物，诸如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP);浸出的蛋白A;核酸；期望抗体的变体、片段、聚集物或衍生物；其它多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分(例如硫酸庆大霉素；(」FNTAMVC:1NA),等。
[0137]可以在阳离子交换层析方法之前、期间、或之后实施的别的纯化规程的例子包括在疏水性相互作用层析(例如在PHENYL-SEPHAROSE?)上分级分离、乙醇沉淀、等电聚焦、反相HPLC、在硅土上层析、在HEPARIN SEPHAR0SE?上层析、阴离子交换层析、别的阳离子交换层析、混合模式离子交换、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、hydrophic电荷诱导层析、和亲和层析(例如使用蛋白A、蛋白G、抗体、或特异性底物、配体或抗原作为捕捉试剂)。
[0138]依照本发明，阳离子交换纯化方案通常包括按序实施的下列步骤:(I)平衡阳离子交换材料；(2)将要纯化的组合物加载到阳离子交换材料上；(3)第一清洗步骤；(4)第二清洗步骤；和(5)洗脱感兴趣的抗体。
[0139]通过在阳离子交换纯化方案中包括至少两个清洗步骤，其中至少第一个在高pH(约pH6.8或更大)进行，能显著提高纯化功效。具体而言，使用pH在约6.8至约9.0范围中(例如约7.0至8.0)、诸如例如约pH7.8或约pH7.0的清洗缓冲液实施第一清洗步骤，比使用约5.0至约5.5的常规的更低的pH范围，更加有效地清除上文所述污染物。结果，自阳离子交换材料洗脱的包含抗体的组合物中宿主细胞蛋白质含量通常低约200ppm，在使用pH约5至5.5的一个清洗步骤实现的大约500ppm的水平以下。
[0140]在本发明的优选 实施方案中，所述阳离子交换材料包含经磺丙基官能化多羟基化聚合物包被的交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通颗粒(固相)，例如自Applied Biosystems可得的 P0R0S50 Π SiR.柱。
[0141]通常，在将包含感兴趣的抗体和一种或多种污染物的组合物加载到阳离子交换材料上之前，使平衡缓冲液流过所述材料。在本发明的优选实施方案中，平衡缓冲液具有约5.0至约6.0的pH，例如约pH5.5。一种例示性的平衡缓冲液包含19mM MES, 60mMNaCl, pH5.50。另一种例示性的平衡缓冲液包含23mM MES, 60mM NaCl, pH5.50。
[0142]平衡后，将包含感兴趣的抗体和一种或多种污染物的水溶液加载到阳离子交换材料上。任选的是，载荷的pH在约4.0至约6.0的范围中，例如约pH5.0或约pH5.5。在一个优选的实施方案中，加载来自在先纯化步骤的条件化产物集合。在一个实施方案中，将来自在先蛋白A层析的蛋白A集合pH5.0加载到阳离子交换材料上。在另一个实施方案中，将条件KQ-SHPIIAROSn__K:集合PH5.5加载到阳离子交换材料上。例示性的载荷密度在约10至约100g/L树脂的范围，优选约10至约60g/L树脂，最优选约15至约45g/L树脂。作为此加载步骤的结果，感兴趣的抗体结合至阳离子交换材料。
[0143]加载后，在第一清洗步骤中用第一清洗缓冲液清洗阳离子交换材料。在清洗过程中，清洗缓冲液流过阳离子交换材料。清洗缓冲液的组成一般选择成自树脂洗脱尽可能多的污染物，不洗脱实质量的感兴趣抗体。第一清洗缓冲液的PH —般高于平衡缓冲液和/或所加载组合物的PH，例如高约2至约3个pH单位。优选的是，第一清洗缓冲液的pH在约pH6.8至约9.0的范围中，优选约pH6.8至约8.0,例如约pH7.8或约pH7.0。在此pH范围中缓冲的缓冲液的例子包括但不限于HEPES、MES、乙酸钠、TRIS/HC1、盐酸三乙醇胺/NaOH、Bicine/HCl、Tricine/HCl 等。优选的第一清洗缓冲液包含(l)25mM HEPES, ρΗ7.8 或(2) 25mM MOPS, ρΗ7.0,或者由(I) 25mM HEPES, pH7.8 或(2) 25mMM0PS, pH7.0 组成。
[0144]在这点上，本发明提供了在25mM HEPES, pH7.8中包含重组嵌合⑶20抗体(诸如利妥昔单抗)的组合物。本发明还提供了在25mM MOPS, pH7.0中的重组人源化VEGF抗体，诸如贝伐单抗。此类组合物作为在这些产物的纯化中使用的中间组合物等是有用的。
[0145]本文中的发明一般需要使用第二清洗缓冲液的至少另一或第二清洗步骤。第二清洗缓冲液的PH优选低于第一清洗缓冲液的pH，例如低约2至约3个pH单位。因此，例如，第二清洗缓冲液的pH可以在约pH5.0至约pH6.0的范围。优选的是，第二清洗缓冲液的pH为约5.5。在此pH范围中缓冲的缓冲液的例子包括但不限于MES、乙酸/乙酸钠或NaOH、NaH2P03/Na2HP04、Bis.Tris/HCl。MES, pH5.5是第二清洗的优选缓冲液。在一个实施方案中，第二清洗缓冲液包含 19mM MES, IOmM NaCl, pH5.50 或由 19mM MES, IOmM NaCl, pH5.50组成。在另一个实施方案中，第二清洗缓冲液包含23mMMES，IOmM NaCl，pH5.50或由23mMMES, IOmM NaCl, ρΗ5.50 组成。
[0146]虽然在洗脱期望抗体之前可采用别的清洗步骤，但是优选只实施第一和第二清洗步骤。在第一和/或第二清洗步骤期间自阳离子交换材料清除污染物(诸如上文所讨论的那些)。优选的是，第一清洗步骤清除大多数污染物。
[0147]上文所述清洗步骤后，自阳离子交换材料洗脱期望的抗体。抗体的洗脱可以通过提高电导率或离子强度来实现。想要的是，洗脱缓冲液的电导率大于约lOmS/cm。升高的电导率可通过在洗脱缓冲液中包括相对较高的盐浓度来实现。用于此目的的例示性的盐包括但不限于乙酸钠、氯化钠(NaCl)、和氯化钾(KCl)。在一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含约100至约300mMNaCl。洗脱缓冲液一般会具有与第二清洗缓冲液大致相同的pH。一种优选的洗脱缓冲液包含19mM MES, 160mM NaCl，pH5.5。另一种优选的洗脱缓冲液包含23mMMES, 175mM NaCl，pH5.5。洗脱优选涉及逐步洗脱(与梯度洗脱不同)。
[0148]虽然洗脱步骤之后任选有再生步骤，但是依照本发明的优选实施方案，这不是必须的。`
[0149]虽然涵盖别的步骤，但是优选的是，本文中的阳离子交换纯化方法只由下列步骤组成:平衡(例如使用pH约5.5的平衡缓冲液)，加载包含抗体和污染物的组合物(例如其中所加载的组合物的PH为约5.0或约5.5)，用于洗脱污染物的第一清洗步骤(例如使用pH约7.8的第一清洗缓冲液或pH约7.0的第一清洗缓冲液)，第二清洗步骤(例如使用pH约5.5的第二清洗缓冲液)，和洗脱(例如使用PH约5.5且电导率相对于每一个在先步骤升高的洗脱缓冲液，用于洗脱抗体)。
[0150]如果必要，依照本文中的阳离子交换层析方法获得的抗体制备物可进行别的纯化步骤。上文已经讨论了例示性的进一步纯化步骤。
[0151]任选的是，根据需要将所述抗体偶联至一种或多种异源分子。所述异源分子可以是例如延长抗体的血清半衰期的(例如聚乙二醇，PEG)，或者它可以是标记物(例如酶、荧光标记物和/或放射性核素)、或细胞毒性分子(例如毒素、化疗药物、或放射性同位素等)。
[0152]包含抗体(任选偶联有异源分子的)的治疗用配制剂可以通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，0sol，A.编(1980))混合来制备，采取冻干配制剂或水溶液的形式。“药学可接受的”载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲?));低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA ;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN?、PLURONICS?或聚乙二醇(PEG)。
[0153]活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于Remington，s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol, A.编(1980)。
[0154]用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
[0155]可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体变体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利N0.3，773，919),L-谷氨酸和Y -乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEP0T?(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
[0156]然后将如本文所述纯化的抗体或包含所述抗体和药学可接受载体的组合物用于对此类抗体和组合物已知的各种`诊断、治疗或其它用途。例如，可以通过给哺乳动物施用有效量的所述抗体来使用所述抗体治疗哺乳动物中的病症。在CD20抗体(诸如利妥昔单抗)的情况中，可以用它来消减B细胞、治疗淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤，NHL)、或白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病，CLL)以及自身免疫性疾病诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、狼疮等。对于结合VEGF的抗体(诸如贝伐单抗)，可以用它来抑制血管发生、治疗癌症、及治疗黄斑变性、等。
[0157]为了例示而非为了限制，提供下列实施例。通过述及将说明书中所有引文的公开内容明确收入本文。
[0158]实施例1:⑶20抗体的纯化
[0159]此实施例描述用于纯化CD20抗体利妥昔单抗的改良阳离子交换层析工艺。利妥昔单抗用于治疗NHL、CLL、RA、MS、等。利妥昔单抗分子的结构披露于5，736，137，Andersonet al.(通过述及明确收入本文)以及本文中图1A-1B。利妥昔单抗可自Genentech, Inc购买得到。
[0160]使用阳离子交换层析来进一步降低CHOP、DNA、浸出的蛋白A、硫酸庆大霉素(GENTAMYCIN?)、利妥昔单抗聚集物、和潜在病毒的水平。使利妥昔单抗在加载条件下结合至柱。然后将柱清洗、洗脱、再生/清洁、并贮存，直至下次使用。可使用多个循环来加工整个批次的亲和集合(affinity pool)。阳离子交换集合可以于高至30°C的室温保持长达3天或于5°C保持长达7天。
[0161]将阳离子交换树脂(P0R0S50HS?, Applied Biosystems)装填入柱至 17_33cm
的床高度。在加载亲和集合之前，用平衡缓冲液对阳离子交换柱清除掉贮存液。平衡后，将亲和集合加载到柱上。使产物在这些条件下结合至柱。然后用清洗I缓冲液，接着用清洗2缓冲液清洗柱。使用高离子强度洗脱缓冲液自柱洗脱利妥昔单抗。
[0162]下表提供了与初始(对照)工艺相比本发明工艺的条件的比较。
[0163]表1:用于利妥昔单抗阳离子交换层析工艺的缓冲液的比较
[0164]
【权利要求】
1.一种用于自包含抗体和至少一种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，该方法包括下述按序步骤:(a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于第一pH ；(b)用pH大于(a)中所述组合物的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述第一清洗缓冲液的PH为约6.8至约9.0 ；(c)用pH小于所述第一清洗缓冲液的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并(d)用电导率显著大于所述第二清洗缓冲液的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
2.一种用于自包含结合人CH20的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组:中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、浸出的蛋白A、DNA、和聚集的 ⑶20抗体,该方法包括下述按序步骤:(a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4.0至约6.0的pH ；(b)用pH约6.8至约9.0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述第一清洗缓冲液的PH为约6.8至约9.0 ；(c)用PH约5.0至约6.0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并(d)用pH约5.0至约6.0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
3.一种用于自包含结合人血管内皮生长因子(VEGF)的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组:细胞培养基成分、硫酸庆大霉素、中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、DNA、病毒污染物、和聚集的VEGF抗体，该方法包括下述按序步骤:(a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4.0至约6.0的`pH ；(b)用pH约6.8至约8.0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；(c)用PH约5.0至约6.0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并(d)用pH约5.0至约6.0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
4.一种组合物，其在包含约25mM HEPES、pH约7.8的缓冲液中包含利妥昔单抗。
5.一种组合物，其在包含约25mM MOPS、pH约7.0的缓冲液中包含贝伐单抗。
【文档编号】C07K16/28GK103554215SQ201310495290
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2008年10月29日 优先权日:2007年10月30日
【发明者】贝内迪克特.A.勒布雷顿, 德博拉.A.奥康纳, 奥里莉亚.萨夫塔, 曼达基尼.夏尔马 申请人:健泰科生物技术公司