制备重组肽的方法

制备重组肽的方法
【专利摘要】公开了制备重组肽如血管扩张肽(VSDL)的方法，包括涉及表达包含所述肽的串联重复的融合多肽的特殊方法，其中所述肽侧翼是肽切割位点，用裂解剂在肽切割位点切割融合多肽，使得从融合多肽释放所述肽。还公开了用于制备融合多肽的表达构建体和宿主细胞以及用于重组肽的纯化方法。
【专利说明】制备重组肽的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及制备肽特别是重组肽的方法。在特殊的应用中，该方法涉及包含肽的 串联拷贝的融合多肽的切割。
[0002] 引用参考
[0003] 本专利申请要求2012年3月19日递交的美国专利申请No 61/612817的优选权。 该申请全部内容在此引作参考。
[0004] 发明背景
[0005] 重组制备的肽对于工业和临床都越来越重要。在各种表达系统，例如细菌、酵母、 昆虫、植物或哺乳动物细胞中重组产生的真核蛋白质代替合成肽制备，提供低成本。但是， 重组表达是不可预期的并且经常有问题，因为很多重组表达肽不足够溶解性，不稳定，错折 叠或没有活性，和/或以低产率表达，因此不经常以足够高的质量或有商业价值的产率制 备。表达重组表达的有低分子量的肽能是特别困难的。操作上将肽与合适的肽融合配偶体 融合能增强稳定性和溶解性；但是，一般不期望为了治疗应用的肽中存在有融合配偶体。
[0006] 通过大量的肽裂解剂包括酶促裂解剂（即蛋白酶）以及化学裂解剂能将肽裂解。 许多肽裂解剂在肽内的特定氨基酸序列或基序处识别并切割肽。肽通常包含许多不同肽 切割位点的多个拷贝。例如，成熟的人白细胞介素（IL)-I β肽（153个氨基酸的肽，参见 Genbank登录号ΑΑΑ74137. 1)，据预计被至少20种不同的肽裂解剂裂解。成熟IL-I β肽序 列包括三个预测的Arg-C蛋白酶切割位点，8个预测的Asp-N内肽酶切割位点，6个预测的 溴化氰切割位点，8个预测的甲酸切割位点，3个预测的梭菌蛋白酶切割位点，17个预测的 胰蛋白酶切割位点等。因此，在重组制备肽的过程中通常不使用肽裂解剂，因为肽常常会被 裂解成更小的片段，这是不希望的。
[0007] 本发明人已经认识到，某些肽是不寻常的，在于它们缺乏特定的肽的切割位点，或 包含位于肽的末端的特定的肽的切割位点的单一拷贝。例如，本发明人已经认识到天然血 管扩张（VSDL)肽异常地包含单一的胰蛋白酶切割位点，其位于所述VSDL肽的C-末端。
[0008] 血管扩张肽（VSDL)是一种天然存在的37个氨基酸（aa)的肽，这是在126氨基酸 心房钠尿肽（ANP，也称为心房利钠因子（ANF))激素原（ANP原的；Ve Sely，2003)处理后在 体内产生的。VSDL由ANP激素原的氨基酸31-67组成。VSDL的主要生物活性是通过调节 排钠利尿剂、利尿剂和血液动力学效应（Vesely，2003)来调节血压和维持健康个体内血浆 容积。通过临床前和人体临床研究两种已经对VSDL用于治疗心脏疾病，例如充血性心脏衰 竭（CHF)的用途进行了研究。已经证明VSDL能显著提高排钠利尿剂、利尿剂和血液动力学 参数而没有任何症状副作用。VDSL被认为对于调节有益血液动力学效果是安全和有效的治 疗，带有另外的有益排钠利尿剂、利尿剂和肾脏作用，同时在临床上可接受的范围内调节血 浆体积和血压（BP)而没有严重的副作用。因此，已经提出了对急性代谢失调充血性心脏衰 竭（ADCHF)的患者施用VSDL。此外，VDSL也被发现具有抗癌作用（Skelton等，2011)，并已 被证明允许在急性肾功能衰竭的治疗中（Vesely等，2003年）。因此，可以理解，VSDL是用 于各种疾病治疗的有用候选者。基于天然VSDL序列的合成产生的VSDL已被用于临床试验， 并已被有利地证明可用于治疗疾病；但是，多肽的合成制备是一个昂贵的过程，特别是对于 在工业规模上所需要的肽。
[0009] 本发明人设计了一种一流的重组制备系统，其利用从融合多肽切割肽。


【发明内容】

[0010] 因此，在第一个方面，本发明提供了一种制备重组肽的方法，所述方法包括以下步 骤：
[0011] 表达包含所述肽的融合多肽，其中所述肽侧翼是一个或多个肽切割位点，并且其 中所述肽另外不存在所述肽切割位点；和
[0012] 用在肽切割位点切割的裂解剂在肽切割位点切割融合多肽；
[0013] 其中切割融合多肽的步骤从融合多肽释放所述肽。
[0014] 在第二方面，本发明提供了一种制备重组肽的方法，所述方法包括以下步骤：
[0015] 表达包含所述肽的串联拷贝的融合多肽，其中所述肽侧翼是一个或多个肽的切割 位点，并且其中所述肽特征在于所述肽另外不存在所述肽的切割位点；和
[0016] 用在肽切割位点切割的裂解剂在肽切割位点切割融合多肽。；
[0017] 其中切割融合多肽的步骤从融合多肽释放所述肽。
[0018] 在一种实施方案中，所述融合多肽包含2至20个（或更多）肽的串联拷贝。在一 种实施方案中，所述融合多肽包含3个肽的串联拷贝。在进一步的实施方案中，所述融合多 肽包含10个肽的串联拷贝。
[0019] 在一种实施方案中，所述肽在其一个末端包含肽的肽切割位点。
[0020] 在进一步的实施方案中，肽包含C-末端精氨酸（R)残基。
[0021] 在另一种实施方案中，所述肽包含根据式X1-X2--X lri-Xn-(R/K) (SEQ ID NO: 1)的 氨基酸序列；其中X是除了精氨酸或赖氨酸的任何氨基酸，R/K为精氨酸或赖氨酸，和η是 氨基酸的任何合适的数目。在一个实施例中，所述肽具有天然序列。
[0022] 在另一种实施方案中，肽包括血管扩张（VSDL)肽或其变体。
[0023] 在一个具体的实施方案中，VSDL肽包含根据SEQ ID NO :2的氨基酸序列或其变 体。
[0024] 在一种实施方案中，所述融合多肽包括具有C-末端肽切割位点的先导融合配偶 体。
[0025] 在一个优选实施例中，先导融合配偶体包含C末端精氨酸残基。
[0026] 在一个特定实施方案中，先导融合配偶体包括根据SEQ ID NO :3的氨基酸序列。
[0027] 在一种实施方案中，所述肽的切割位点是胰蛋白酶切割位点。在一种实施方案中， 裂解剂是胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶。
[0028] 在第三方面，本发明提供了一种制备重组血管扩张（VSDL)肽（或其变体或其修饰 的肽）的方法，所述方法包括以下步骤：
[0029] 表达包含至少一种VSDL肽（或其变体或其修饰的肽）的融合多肽，其中所述肽侧 翼是一个或多个肽的切割位点，并且其中所述肽特征在于另外不存在胰蛋白酶切割位点； 和
[0030] 用在胰蛋白酶切割位点切割的裂解剂在胰蛋白酶切割位点切割融合多肽。；
[0031] 其中切割融合多肽的步骤从融合多肽释放所述肽。
[0032] 在另一个方面，本发明提供包含与编码具有C-末端胰蛋白酶切割位点的VSDL肽 (或其变体或其修饰的肽）的至少一个核苷酸序列操作融合的先导融合配偶体（具有C-末 端胰蛋白酶切割位点）的核苷酸序列的表达构建体。
[0033] 在一种实施方案中，编码先导融合配偶体的核苷酸序列可操作地融合到编码具有 C-末端胰蛋白酶切割位点的VSDL肽（或其变体或其修饰的肽）的核苷酸序列的2 - 20个 (或更多）串联拷贝。
[0034] 在另一个方面，本发明提供用于重组表达VSDL肽（或其变体或其修饰的肽）的 宿主细胞，其中所述宿主细胞包含表达构建体，表达构建体包含编码与具有C-末端胰蛋白 酶切割位点的VSDL肽（或其变体或其修饰的肽）的至少一个核苷酸序列操作融合的具有 C-末端胰蛋白酶切割位点的先导融合配偶体的核苷酸序列。

【专利附图】

【附图说明】
[0035] 图1提供了包含指定为B72R的先导融合配偶体的VSDL肽的氨基酸序列和VSDl - 链节和3-链节融合蛋白的氨基酸序列；斜体序列代表先导融合配偶体（B72R)并且箭头指 示胰蛋白酶切割位点；
[0036] 图2提供了 B72R和B72 (Q) R-VSDL基因融合体的核苷酸序列，包括侧翼的限制性 内切酶切割位点的核苷酸序列；蛋白质编码区以粗体表示，其中斜体序列代表先导融合配 偶体的核苷酸序列。每个基因融合体的长度示于括号内；
[0037] 图3提供了用于表达包含3，6，8和10个VSDL串联重复的以B72R-VSDL和B72R-为 基础的融合多肽的质粒的简明示意图。质粒的功能是复制（ColElori)起源，Iac阻遏基因 (IacI)，TRC和tac启动子，VSDL基因融合体，转录终止子（rrnBTlT2)和卡那霉素抗性标记 (Km)；
[0038] 图4提供了 B72R-VSDL和B72R-(VSDL)3表达的SDS-PAGE分析的图像；分级培养 样品（P :沉淀球/不溶部分，WCL:全细胞溶胞产物和S :上清液/可溶性级分在减少4-12% 的NuPAGE MES凝胶公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德，美国）上分析，并用SimplyBlue? Safe(Invitrogen), SecBluc?预先染色蛋白质标准物（Invitrogen)被用作分子量标记；
[0039] 图5提供的B72 (Q) R-VSDL融合多肽表达的SDS-PAGE分析的图像；将指定培养样 品进行归一化并且溶胞产物在用SimplyBlue? Safe染色的减少4-12% NuPAGE MES凝胶 上分析，用SecBlue?预先染色蛋白质标准物作为分子量标记；
[0040] 图6提供分批加料培养之后的B72R-VSDL和B72R- (VSDL) 3表达的SDS-PAGE分 析的图像；将指定培养样品进行归一化并且溶胞产物在用SimplyBlue? Safe染色的减少 4-12% NuPAGE MES凝胶上分析，用SecBluc?顼先染色蛋白质标准物作为分子量标记；
[0041] 图7提供显示室温下消化过夜后对从B72R- (VSDL) 3溶胞产物（3g/L融合多肽）产 生的一定量VSDL加入TrypZean? (Sigma-Aldrich Co,圣路易斯，Mo,美国）的作用的图形 结果；
[0042] 图8提供了一个显示来自消化的溶胞产物的重组VSDL的色谱分离（Amberchrom CG300C;Rohm and Haas Company,宾夕法尼亚州费城，美国）的示踪图；实线=UV 280吸收 和虚线=导电性；
[0043] 图9提供显示来自消化的溶胞产物的重组VSDL的色谱分离（Fractogel TME ;默 克公司，新泽西州怀特豪斯站，美国）的示踪图；实线=UV 280吸收和虚线=导电性；
[0044] 图10显示根据加里50分光光度计（瓦里安公司，帕洛阿尔托加利福尼亚州，美 国）测定的合成VSDL肽和重组VSDL (右）的UV 280吸收曲线；
[0045] 图11提供显示来自消化的溶胞产物的重组VSDL的色谱分离（改进的Amberchrom CG300C方案）的示踪图，方框代表汇集的洗脱级分；和
[0046] 图12提供显示Chromasorb膜过滤之后的来自消化的溶胞产物的重组VSDL的分 离的示踪图，其中方块代表不同的汇集的洗脱级分。

【具体实施方式】
[0047] 本发明人已经认识到，有利地，某些肽的氨基酸序列不同寻常地缺乏特定肽切割 位点，除了位于所述肽的一个末端的单一肽切割位点，或能被工程化成具有这样的序列。本 发明人还认识到，通过表达融合多肽前后的肽，可以在肽的另一末端提供另一个肽切割位 点，以使得所表达的融合多肽的切割从融合多肽释放肽。这样的制备系统能够有利地提供 足够数量和质量的治疗应用的重组产生感兴趣的肽的方法。
[0048] 因此，在第一个方面，本发明提供了一种制备重组肽的方法，所述方法包括以下步 骤：
[0049] 表达包含所述肽的融合多肽，其中所述肽侧翼是一个或多个肽切割位点，并且其 中所述肽另外不存在所述肽的切割位点；和
[0050] 用在肽切割位点切割的裂解剂在肽切割位点切割融合多肽。；
[0051] 其中切割融合多肽的步骤从融合多肽释放所述肽。
[0052] 本领域技术人员理解术语"重组"是指包含或由多于一种起源的遗传材料产生的 生物材料，例如，重组肽通常被理解为是从编码第一来源的肽的多核苷酸分子产生，所述第 一来源的肽在第二来源的合适的宿主细胞中被表达或制备。能产生重组肽的宽范围的表 达系统是已知的，例如，在适合于特殊肽表达的条件下的细胞培养物。宿主细胞能包括细 菌细胞（例如大肠杆菌（Escherichia coli)，链霉菌属（Streptomyces sp·)，芽孢杆菌 属（Bacillus sp·)，假单胞菌属（Pseudomonas sp·)，葡萄球菌属（Staphylococcus sp.) (例如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium)等）等），真菌细胞，如酵母细胞（例如酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)等），霉菌或丝状 真菌（例如曲霉（Aspergillus sp.))，昆虫细胞（例如果蝇S2和草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)(例如夜蛾Sf9细胞），并包括杆状病毒辅助系统），哺乳动物细胞（适合的大 量细胞系包括中国仓鼠卵巢（CHO)细胞，猴肾（COS)细胞，人胚胎肾（HEK)细胞，幼仓鼠肾 (BHK)细胞，鼠黑素瘤细胞等），和植物细胞。重组多肽或者也可以在转基因植物和动物中 表达。在本发明中，优选的是表达融合多肽的步骤是使用大肠杆菌作为表达宿主进行的。
[0053] 本领域技术人员理解术语"肽"是指通过肽键键合在一起的氨基酸的单一线性聚 合物链，第一个氨基酸是在氨基（N)端和最后一个氨基酸是在羧基（C)末端。在本发明的 上下文中，应当理解本文所用的术语"肽"是为了指感兴趣的肽，其要被表达，并在融合多肽 裂解之后从融合多肽释放。肽可以是全长肽（即如本领域技术人员理解的从编码核苷酸序 列转录的全长肽）。但是肽还可以从较大的肽或多肽衍生，例如，肽可以是前蛋白原的成熟 肽部分，或者是能被加工成很多较小肽的多肽的一部分，或者是较大的肽的片段，等。优选 地，肽可从编码核苷酸序列翻译成它的最终形式，即，肽不经历任何附加的翻译后加工只是 被根据本发明的裂解剂裂解。但是，本发明并不打算排除实施方案，其中肽是一个较大肽 的一部分，如前蛋白原或多肽，其包含能够被加工成许多较小的肽的氨基酸序列（例如通 过表达后处理（例如裂解）去除较大肽的部分，其中所述处理是除根据本发明的裂解之外 的）。肽可以是天然肽或如下所述的其经修饰的肽。
[0054] 本领域技术人员理解的是，与肽相关联使用时的术语"氨基端"或"氨基方向"指 的是朝向肽的N-末端方向，同样地，与肽相关联使用时的术语"羧基端"或"羧基方向"指 的是朝向肽的C-末端方向。
[0055] 如本文所用的术语"融合多肽"意在指至少两个肽通过肽键键合在一起的氨基酸 单一线性聚合物链，使得第一肽的C-末端残基邻接第二肽的N-末端残基（任选被一个短 接头序列分隔）。本领域技术人员理解，一些肽能以这种方式融合在一起，在这种情况下，所 述第二肽的C-末端残基可以邻接第三肽的N-末端残基，等等。
[0056] 本领域技术人员明白术语"肽的切割位点"是指在那里裂解剂切割肽主链的位点， 其中那个位点与作为裂解剂的识别位点的特定氨基酸或氨基酸特定序列相关。在氨基酸的 特定识别序列的情况下，在那个序列中的一个位点，在序列的C-末端或N-末端，或在序列 的外部，裂解剂可以切割肽主链，即是，一些残基从序列的羧基或者氨基方向被去除。
[0057] 根据本发明，所述肽"侧翼是一个或多个肽的切割位点"。这个短语意指肽的切割 位点位于融合多肽内，在肽的至少一个末端，更优选地，在肽的两个末端（例如针对肽的每 个复制体位于一个N-末端和一个C-末端，使得用在肽的切割位点切割的裂解剂切割融合 多肽时，从融合多肽能释放所述肽。
[0058] 裂解剂可以是以特定方式即在与特定的氨基酸或氨基酸的特定序列相关联的特 定肽切割位点切割肽的本领域技术人员已知的任何合适的裂解剂。裂解剂可以是化学裂解 剂或酶促裂解剂。在本发明中可以使用的多种裂解剂列在表1中。
[0059] 表1.肽裂解剂和它们各自的肽切割位点

【权利要求】
1. 一种制备重组肽的方法，所述方法包括以下步骤： 表达包含所述肽的融合多肽，其中所述肽侧翼是一个或多个肽切割位点，并且其中所 述肽另外不存在所述肽切割位点；和 用在肽切割位点切割的裂解剂在肽切割位点切割融合多肽。； 其中切割融合多肽的步骤从融合多肽释放所述肽。
2. -种制备重组肽的方法，所述方法包括以下步骤： 表达包含所述肽的串联拷贝的融合多肽，其中所述肽侧翼是肽切割位点，并且其中所 述肽特征在于所述肽另外不存在所述肽的切割位点；和 用在肽切割位点切割的裂解剂在肽切割位点切割融合多肽。； 其中切割融合多肽的步骤从融合多肽释放所述肽。
3. 如权利要求1或2所述的方法，所述肽包括根据下式所述的氨基酸序列 Xi?X2 ?…Xn?i ?Xn?（R/K) (SEQ ID N0:1)； 其中X是除了精氨酸或赖氨酸的任何氨基酸，R/K是精氨酸或赖氨酸，以及n是氨基酸 的任何合适的数目。
4. 如权利要求1?3任一项所述的方法，其中所述肽具有天然序列。
5. 如权利要求1?3任一项所述的方法，其中所述肽包括血管扩张（VSDL)肽或者其变 体或其修饰的肽。
6. 如权利要求1?5任一项所述的方法，其中所述VSDL肽包含SEQ ID NO: 2的氨基酸 序列或者由根据SEQ ID N0:2的氨基酸序列构成。
7. 如权利要求1?6任一项所述的方法，其中所述肽切割位点是胰蛋白酶切割位点。
8. 如权利要求7所述的方法，其中所述裂解剂是胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶。
9. 一种制备重组血管扩张（VSDL)肽或者其变体或其修饰的肽的方法，所述方法包括 以下步骤： 表达包含至少一种VSDL肽或者其变体或其修饰的肽的融合多肽，其中所述肽侧翼是 一个或多个肽的切割位点，并且其中所述肽特征在于另外不存在胰蛋白酶切割位点；和 用在胰蛋白酶切割位点切割的裂解剂在胰蛋白酶切割位点切割融合多肽； 其中切割融合多肽的步骤从融合多肽释放所述肽。
10. 如权利要求9所述的方法，其中所述肽是包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列或者由根 据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的VSDL肽。
11. 如权利要求9或10所述的方法，其中切割融合多肽的步骤包括用胰蛋白酶或胰蛋 白酶样酶切割融合多肽。
12. 如权利要求9?11任一项所述的方法，进一步包括步骤： 将切割的融合多肽的pH调节至低于5 ;和 利用至少一种阴离子交换技术从消化的融合多肽纯化所述肽。
13. 如权利要求12所述的方法，进一步包括喷雾或冻干干燥所述肽。
14. 如权利要求1?13任一项所述的方法，其中所述融合多肽包含所述肽的2?20个 串联拷贝。
15. 如权利要求1?13任一项所述的方法，其中所述融合多肽包含所述肽的3个串联 拷贝。
16. 如权利要求1?13任一项所述的方法，其中所述融合多肽包含所述肽的10个串联 拷贝。
17. 如权利要求1?15任一项所述的方法，其中所述肽在一个末端包含一个肽切割位 点。
18. 如权利要求1?17任一项所述的方法，其中所述肽包含一个C 一末端精氨酸或赖 氨酸残基。
19. 如权利要求1?18任一项所述的方法，其中所述融合多肽包含具有C 一末端肽切 割位点的先导融合配偶体。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述先导融合配偶体包含C 一末端精氨酸或赖氨 酸残基。
21. 如权利要求1?20任一项所述的方法，其中表达融合多肽的步骤是使用大肠杆菌 作为表达宿主进行的。
22. -种表达构建体，包含编码与编码具有C 一末端胰蛋白酶切割位点的肽的串联拷 贝的至少一个核苷酸序列操作融合的先导融合配偶体的核苷酸序列。
23. -种表达构建体，包含编码与编码具有C 一末端胰蛋白酶切割位点的VSDL肽或者 其变体或其修饰的肽的至少一个核苷酸序列操作融合的先导融合配偶体的核苷酸序列。
24. 如权利要求22或23所述的表达构建体，其中所述先导融合配偶体具有C 一末端胰 蛋白酶切割位点。
25. 如权利要求22?24任一项所述的表达构建体，其中编码先导融合配偶体的核苷酸 序列与编码所述肽的核苷酸序列的2?20个串联拷贝连接。
26. -种重组表达肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含如权利要求22?25任一项的 表达构建体。
27. 根据权利要求1?21任一项所述的方法制备的重组肽。
28. -种重组融合多肽，包含与具有C 一末端胰蛋白酶切割位点的肽的串联拷贝连接 的先导融合配偶体。
29. 如权利要求28所述的多肽，其中所述先导融合配偶体具有C 一末端胰蛋白酶切割 位点。
30. 如权利要求28或29所述的多肽，其中所述先导融合配偶体与所述肽的2?20个 串联拷贝连接。
31. -种重组多肽，包含或者由具有C 一末端胰蛋白酶切割位点的肽的串联拷贝构成。
32. 如权利要求31所述的多肽，包含所述肽的2?20个串联拷贝。
33. 如权利要求32所述的多肽，包含所述肽的3?10个串联拷贝。
34. 如权利要求28?33任一项所述的多肽，其中所述肽没有内部胰蛋白酶切割位点。
35. 如权利要求28?34任一项所述的多肽，其中所述肽是VSDL肽或者其变体或其修 饰的肽。
36. 如权利要求28?35任一项所述的多肽，其中所述肽是包含SEQ ID NO: 2的氨基酸 序列或者由根据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的VSDL肽。
【文档编号】C07K19/00GK104364378SQ201380025049
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2012年3月19日
【发明者】斯坦·巴斯蒂拉斯, 安吉洛·圭多林, 本·亨特, 赛义夫·莱希德, 雷扎·扎雷尔 申请人:麦德林制药私人有限公司