新抗体抗-sPLA2-IIA及其用途

新抗体抗-sPLA2-IIA及其用途
【专利摘要】本发明涉及抗体抗-sPLA2-IIA及其用途。CNCM I - 458720111213CNCM I - 458820111213
【专利说明】新抗体抗-SPLA2-IIA及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗人IIA组分泌型磷脂酶A2(sPLA2-IIA)的新抗体及其在诊断和治疗 方法中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 分泌型磷脂酶A2(sPLA2)形成结构上相关的、催化磷脂的sn-2脂酰键的水解以 释放游离脂肪酸和溶血磷脂的酶家族。通过催化此反应，sPLA2酶在多个生物学过程中起 关键作用，所述生物学过程包括细胞膜的稳态、脂质消化、宿主防御、信号转导和脂质介质 诸如类花生酸和溶血磷脂衍生物的生成（Valentin等人2000, Bioch. Biophys. Act. 59-70 ; Lambeau, G.，和 Gelb, M. H. 2008, Annu. Rev. Biochem. 77, 495-520)。此家族包括 11 个成员 / 同工型，它们被命名为 sPLA2-IB, sPLA2-IIA, sPLA2-IIC, sPLA2-IID, sPLA2-IIE, sPLA2-I IF, SPLA2-III, SPLA2-V, SPLA2-X, SPLA2-XIIA 和 sPLA2-XIIB〇
[0004] 已经证明难以在蛋白水平对特定同工型定量，因为酶活性相似且缺少同工型特异 性sPLA2抗体。
[0005] Nevalainen等人（Biochimica et Biophysica Acta 1733 (2005) 210-223)开发了 一种用于时间分辨荧光免疫分析（TR-FIA)中的抗sPLA2-IIA抗体。此多克隆抗体通过用 重组人SPLA2-IIA蛋白免疫兔子获得。TR-FIA的分析灵敏度被记载为lng/ml。
[0006] Cayman chemical提供了一种参考号SCACC353的单克隆抗体。根据该发明人获得 的实验结果，SCACC353抗体结合人SPLA2-IIA的Kd为约InM(参见实施例）。
[0007] 目前存在着对能够更准确和灵敏地检测生物学样品诸如血清样品中SPLA2-IIA 的抗SPLA2-IIA的抗体的需求。


【发明内容】

[0008] 本发明由此涉及一种抗人SPLA2-IIA的分离的抗体，其中所述抗体的结合人 SPLA2-IIA 的 Kd 小于 9. 1(T10M。
[0009] 在本发明的一个实施方案中，重链的可变区包含下面⑶R中的至少一种：
[0010] VH-CDR1:GYTFTS(SEQ ID N0:1);
[0011] VH-CDR2:WIFP⑶GSTE(SEQ ID N0:2);和
[0012] VH-CDR3:WGITAFPLFDY(SEQ ID N0:3)，
[0013] 或具有与所述SEQ ID NO: 1-3具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R，或 轻链的可变区包含下面⑶R中的至少一种：
[0014] VL-CDR1:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4);
[0015] VL-CDR2:AASNLES(SEQ ID N0:5);和
[0016] VL-CDR3:LQSNEAPWT(SEQ ID N0:6)，
[0017] 或具有与所述SEQ ID NO: 4-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，重链的可变区包含如上文所定义的⑶R中的至少一 种，并且轻链的可变区包含如上文所定义的⑶R中的至少一种。
[0019] 在本发明的一个实施方案中，重链的可变区包含下列CDR:GYTFTS(SEQ ID NO:l)，WIFP⑶GSTE(SEQ ID NO:2)和 WGITAFPLFDY(SEQ ID NO:3)，并且轻链的可变区包含 下列 CDR:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)，AASNLES(SEQ ID NO:5)和 LQSNEAPWT(SEQ ID NO:6)或具有与所述SEQ ID NO: 1-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
[0020] 在本发明的一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO: 13并且 编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO: 14,或具有与所述SEQ ID NO: 13-14具有至少 60 %同一性的氨基酸序列的任何序列。
[0021] 本发明还涉及包含如上文所述的抗人SPLA2-IIA的抗体的组合物。
[0022] 本发明还涉及如上文所述的抗人SPLA2-IIA的抗体，其用于治疗SPLA2-IIA相关 的病症。
[0023] 本发明还涉及如上文所述的抗人SPLA2-IIA的抗体，其用于检测生物学样品中的 sPLA2-IIA〇
[0024] 本发明还涉及一种体外诊断或预后分析法，其用于使用本发明的抗人SPLA2-IIA 的抗体确定生物学样品中SPLA2-IIA的存在。
[0025] 在本发明的一个实施方案中，所述分析法是夹心ELISA，所述夹心ELISA使用如上 文所述的抗体作为包被抗体并且使用如下的抗体作为显示抗体，其中：
[0026]-重链的可变区包含下面⑶R中的至少一种：
[0027] VH-CDR1:GFTFSS(SEQ ID N0:7);
[0028] VH-CDR2:AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8);和
[0029] VH-CDR3:QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)，
[0030] 或具有与所述SEQ ID N0:7-9具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R，或
[0031] -轻链的可变区包含下面⑶R中的至少一种：
[0032] VL-CDR1:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10);
[0033] VL-CDR2:RVSNRFS(SEQ ID N0:11);和
[0034] VL-CDR3:FQGTHVPRT(SEQ ID N0:12)，
[0035] 或具有与所述SEQ ID NO: 10-12具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何CDR。
[0036] 在本发明的一个实施方案中，显示抗体的重链可变区包含如上文所定义的CDR中 的至少一种（SEQ ID N0:7-SEQ ID N0:9)且显示抗体的轻链可变区包含如上文所定义的 CDR 中的至少一种（SEQ ID N0:10-SEQ ID N0:12)。
[0037] 在本发明的一个实施方案中，显示抗体的重链可变区包含下列⑶R:GFTFSS(SEQ ID N0:7)、AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8)和 QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)并且显示抗体的轻 链可变区包含下列 CDR:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10)、RVSNRFS(SEQ ID N0:11)和 FQGTHVPRT (SEQ ID NO: 12)或具有与所述SEQ ID NO: 7-12具有至少60%同一性的氨基酸 序列的任何CDR。
[0038] 在本发明的一个实施方案中，编码显示抗体的重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO: 15并且编码显示抗体轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO: 16,或是具有与所述SEQ ID NO: 15-16具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何序列。
[0039] 本发明还涉及一种试剂盒，其包含至少一种本发明的抗人SPLA2-IIA的抗体。
[0040] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含本发明的抗体和本发明的显示抗体。
[0041] 本发明还涉及一种表达载体，其包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19 和SEQ ID N0:20中的至少一种，或包含具有与所述SEQ ID NO: 17-20具有至少60%同一性 的核酸序列的任何序列。
[0042] 本发明还涉及保藏号为CNCM 1-4587和CNCM 1-4588的产生抗人SPLA2-IIA的抗 体的杂交瘤细胞系。

【具体实施方式】
[0043] 本发明人开发出了抗人SPLA2-IIA的新抗体，如实施例中所示，其显示出比现 有抗体更高的对SPLA2-IIA的亲和性，并且能够更准确和灵敏地检测生物学样品中的 sPLA2-IIA〇
[0044] 另外，本发明人提供了抗人SPLA2-IIA的单克隆抗体，其表现出以下的优势：（i) 比多克隆抗体更特异，和（ii)由于具有与其单克隆性质相关的结果可重复性，所述抗体能 够工业应用。
[0045] 定义
[0046] SPLA2-IIA是sPLA2家族的一个同工型。人SPLA2-IIA蛋白的完整氨基酸序列 (SEQ ID N0:21) (GenBank 登录号 NP_000291)为：
[0047] MKTLLLLAVMIFGLLQAHG (信号肽）
[0048] NLVNFHRMIKLTTGKEAALSYGFYGCHCGVGGRGSPKDATDRCCVTHDCCYKRLEKRGCGTKFLSYKFS NSGSRITCAKQDSCRSQLCECDKAAATCFARNKITYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC(成熟蛋白）。
[0049] 在一个实施方案中，SPLA2-IIA是突变体SPLA2-IIA,优选N1A SPLA2-IIA突变体， 其具有序列SEQ ID NO:22:
[0050] MKTLLLLAVMIFGLLQAHG (信号肽）
[0051] ALVNFHRMIKLTTGKEAALSYGFYGCHCGVGGRGSPKDATDRCCVTHDCCYKRLEKRGCGTKFLSYKFS NSGSRITCAKQDSCRSQLCECDKAAATCFARNKITYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC(成熟蛋白）。
[0052] 如本文所用的术语"抗体"（Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例 如，双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。在本文中术语 "免疫球蛋白"（Ig)与"抗体"可互换使用。
[0053] "分离的抗体"是已经从其天然环境的成分分离和/或回收的抗体。其天然环境的 污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素、和其他蛋白质或 非蛋白质成分。在优选的实施方案中，抗体：（1)如通过Lowry法测定被纯化至抗体的大于 95%重量比，最优选大于99%重量比；（2)通过使用转杯式测序仪被纯化至足以获得N-末 端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或（3)如通过SDS-PAGE在还原或非还原条 件下并使用考马斯蓝（或优选地，通过银染色）显示被纯化至均一。分离的抗体包括在重 组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一个成分将不存在。然而，一般地，分离 的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
[0054] 基本的四链抗体单元是由两个相同的轻链（L)和两个相同的重链（H)组成的异 四聚糖蛋白。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于它们的恒定区（CL)的氨基酸序列归 属于称为kappa([K])和lambda([A])的两种明显不同的类型之一。取决于它们的重链 的恒定区（CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归属于不同的类型或同种型。存在五种类型 的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，重链分别被命名为alpha ([ a ])、delta ([ A ])、 epsilon([ e ])、gamma([ y ])和mu([ y ])。[ y ]和[a ]类型基于CH序列和功能的相对 微小差异进一步分成亚类，例如，人表达下列亚类：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。 每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接，这 取决于H链同种型。每个H和L链还具有规则隔开的链内二硫键桥。每个H链在N-末端 处具有可变结构域（VH)，对于[a]和[Y]链中的每一个紧接着三个恒定结构域（CH)，而 对于[U ]和[e ]同种型则紧接着4个CH结构域。每个L链在N-末端处具有可变结构域 (VL)，在其另一端紧接着恒定结构域（CL)。VL与VH对齐，而CL与重链的第一个恒定结构 域（CH1)对齐。据信特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。VH和VL 的配对一起形成单一抗原结合位点。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的额 外多肽组成，并且因此含有10个抗原结合位点，而分泌型IgA抗体可以聚合形成多价组装 体，其包含2-5个基本4链单元以及J链。在IgG的情况下，4链单元通常约150, 000道尔 顿。对于不同类型的抗体的结构和特性，参见，例如，Basic and Clinical Immunology(基 础和临床免疫学），第8版，〇311161?.31：；^68,41^3 1.161'1'和1'1'181：四1116.?3181〇￥(编）， Appleton&Lange, Norwalk, Conn.，1994，第 71 页，和第 6 章。
[0055] 术语"可变的"是指V结构域的某些节段的序列在抗体与抗体之间存在广泛差异。 V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，在可变结构域的 110个氨基酸范围内可变性并不是均匀分布的。而是，V区由被称为"高变区"的具有高度 可变性的较短区域分开的相对不变的15-30个氨基酸的称为框架区（FR)的序列段组成，所 述高变区每个的长度为9-12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR， 大部分采取[0 ]_折叠构型，由三个高变区连接，形成环连接，并且在一些情况下，形成部 分的[0]_折叠结构。每条链中的高变区通过FR与来自另一条链的高变区一起紧密地保 持靠近，促成了抗体的抗原结合位点的形成（参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列），第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991))。恒定结构域不直接参与 抗体与抗原的结合，但表现出多种效应器功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性（ADCC)。
[0056] 术语"高变区"当在本文中使用时是指负责抗原结合的抗体氨基酸序列。高 变区通常包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基（例如，当根据Kabat编号 系统编号时在VL中的约残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)周围，和在VH中的 约 31-35(H1)、50_65(H2)和 95-102(H3)周围；Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫学感兴趣的蛋白的序列），第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991));和 / 或来自"高变 环"的那些残基（例如，当根据Chothia编号系统编号时在VL中的残基24-34(LI)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)，和在 VH 中的 26-32(H1)、52-56(H2)和 95-101(H3) ;Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917(1987));和 / 或来自"高变环"/CDR 的那些残基（例 如，当根据頂GT编号系统编号时在VL中的残基27-38(Ll)、56-65(L2)和105-120(L3)， 和 VH 中的残基 27-38 (HI)、56-65 (H2)和 105-120 (H3) ;Lefranc, M. P?等人 Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M?等人 Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000))。任选地，抗体 在下列点中的一个或多个处具有匀称的插入：当根据AHo编号时在VL中的28、36(L1)、63、 74-75(L2)和 123(L3)，以及 VH 中的 28、36(H1)、63、74-75(H2)和 123(H3) (Honneger, A?和 Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)) 〇
[0057] 术语"单克隆抗体"当在本文中使用时是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体， SP，该群体中包含的单个抗体是相同的，除了可能微量存在的可能的天然发生的突变以外。 单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同的决定簇（表 位）的不同抗体的多克隆抗体相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们 的特异性，单克隆抗体是有优势的，在于它们可以不受其他抗体污染地合成。修饰语"单克 隆"不应被解释为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。例如，可用于本发明中的单克 隆抗体可以通过由Kohler等人，Nature, 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备， 或可以使用在细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA法来制备（参见，例如，美国专利号 4, 816, 567)。"单克隆抗体"还可以使用例如在 Clackson 等人，Nature, 352:624-628 (1991) 和Marks等人，J. Mol. Biol. ,222:581-597(1991)中记述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
[0058] 在本文中单克隆抗体包括"嵌合抗体"，在嵌合抗体中重和/或轻链的一部分与 衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而剩余的 链与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及 此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可（参见，美国专利号4, 816, 567 ; 和 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本发明提供了衍生 自人抗体的可变结构域抗原结合序列。因此，本文中主要感兴趣的嵌合抗体包括具有一条 或多条人抗原结合序列（例如，⑶R)并且包含衍生自非人抗体的一条或多条序列，例如， FR或C区序列的抗体。另外，本文中主要感兴趣的嵌合抗体包括包含一种抗体类型或亚类 的人可变结构域抗原结合序列和衍生自另一抗体类型或亚类的另一序列，例如，FR或C区 序列的那些。本文中感兴趣的嵌合抗体还包括含有与本文中所述的或衍生自不同的物种， 诸如非人灵长目动物（例如，旧大陆猴（Old World Monkey)、猿等）的那些相关的可变结 构域抗原结合序列的那些。嵌合抗体还包括灵长类源化和人源化抗体。此外，嵌合抗体可 以包含在受体抗体或在供体抗体中不存在的残基。做出这些修饰以进一步改善抗体性能。 对于进一步细节，参见 Jones 等人，Nature 321:522-525 (1986) ;Riechmann 等人，Nature 332:323-329(1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
[0059]"抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗 体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段；双价抗体；线性抗体（参见美国专利号 5, 641，870 ;Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 [1995]);单链抗体分子；和由抗 体片段形成的多特异性抗体。短语抗体的"功能片段或类似物"是具有在性质上与全长抗 体一样的生物学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能片段或类似物是这样的一种功能 片段或类似物，即其可以以阻止或基本上降低此类分子结合高亲和力受体Fc[ e ]RI的能 力的方式结合IgE免疫球蛋白。抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段（称 为"Fab〃片段）和剩余的〃Fc〃片段（这是反映出容易结晶能力的名称）。Fab片段由整个 L链连同H链的可变区结构域（VH)，以及一条重链的第一恒定结构域（CH1)组成。在抗原 结合方面，每个Fab片段是单价的，S卩，它具有单个抗原结合位点。抗体经胃蛋白酶处理得 到单个大的F(ab'）2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个通过二硫键连接的 Fab片段并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧 基末端处具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab' -SH在 本文中是用于其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab'的名称。 F(ab'）2抗体片段最初作为Fab'片段对产生，在Fab'片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体 片段的其他化学偶联也是已知的。
[0060] "人源化"或"人"抗体是指其中一个或多个人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与 动物免疫球蛋白的结合区，例如，CDR融合的抗体。此类抗体被设计成保持从其获得结合区 的非人抗体的结合特异性，但避免针对该非人抗体的免疫反应。此类抗体可以获自转基因 小鼠或其他动物，所述转基因小鼠或其他动物已经被"工程化"以响应于抗原激发产生特异 性人抗体（参见，例如，Green 等人（1994)Nature Genet 7:13 ;Lonberg 等人（1994)Nature 368:856 ;Taylor等人（1994) Int Immun 6:579，它们的全部教导内容通过引用合并于本文 中）。完全人抗体也可以通过基因或染色体转染法，以及噬菌体展示技术来构建，它们都是 本领域中已知的（参见，例如，McCafferty等人（1990)Nature 348:552-553)。人抗体也可 以通过体外激活的B细胞来产生（参加，例如，美国专利号5, 567, 610和5, 229, 275,它们 整体地通过引用并入）。因此，"灵长类源化"抗体是指其中一个或多个灵长类动物免疫球 蛋白的恒定和可变框架区与非灵长类动物免疫球蛋白的结合区，例如，CDR融合的抗体。
[0061] "嵌合抗体"是这样的抗体分子，其中（a)恒定区或其部分被改变、替换或交换使得 抗原结合位点（可变区）连接至不同或改变的类型、效应器功能和/或物种的恒定区，或连 接至赋予所述嵌合抗体以新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物， 等；或（b)可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。
[0062] "Fc"片段包括由二硫键连在一起的两条H链的羧基-末端部分。抗体的效应器功 能由Fc区中的序列决定，该区也是由某些类型细胞上发现的Fc受体（FcR)所识别的部分。
[0063] "Fv"是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由一个重链可变 区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体以紧密的、非共价缔合的方式组成。从这两个 结构域的折叠产生6个高变环（3个环各自来自于H链和L链），其促成用于抗原结合的氨 基酸残基并且赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域（或包含仅三个对 抗原特异的CFR的Fv的一半）就具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和性比完整的结合位 点低。
[0064] "单链Fv"也缩写为"sFv〃或"scFv"，其是包含连接形成单条多肽链的VH 和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含 多肽接头，其使得sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。对于sFv的综述，参见， Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113,Rosenburg 和 Moore 编，Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) ;Borrebaeck 1995，见上。
[0065] 术语"双价抗体（diabody) "是指通过下述方式制备的小抗体片段：构建在VH和 VL结构域之间具有短接头（约5-10个残基）的sFv片段（参见上一段），从而获得V结构 域的链间配对而非链内配对，得到二价片段（即，具有两个抗原结合位点的片段）。双特异 性双价抗体是两个"交叉" sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不 同的多肽链上。双价抗体更详细地描述于，例如，EP 404,097 ;W0 93/11161 ;和Holliger等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 〇
[0066] 当在本文中使用时，如果抗体以可检测的水平与抗原反应，优选地以大于或等于 约⑴言1，或大于或等于约lo5]^1，大于或等于约lo 6]^1，大于或等于约lOl1，或大于或等 于108M'，或大于或等于KAT1，或大于或等于lO^T1的亲合常数Ka反应，则该抗体被称 为对该抗原"是免疫特异的"、"特异的"或与该抗原"特异性结合"。抗体对其同族抗原的亲 和性也通常表示为解离常数Kd，并且在某些实施方案中，如果抗体以小于或等于1(T 4M，小 于或等于约1(T5M，小于或等于约1(T6M，小于或等于1(T 7M，或小于或等于1(T8M，或小于或 等于5. 10_9M，或小于或等于10_9M，或小于或等于5. 10_、，或小于或等于10_、的Kd结合， 则该抗体与该抗原特异性结合。抗体的亲合力可以容易地使用常规技术来确定，例如，由 Scatchard等人（Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51:660(1949))所述的那些。抗体与抗原、细胞或 其组织的结合特性通常可以使用免疫检测法来测定和评估，所述免疫检测法包括，例如，基 于免疫荧光的测定，诸如免疫组织化学（IHC)和/或荧光激活细胞分选（FACS)。
[0067] "分离的核酸"是与其他基因组DNA序列以及蛋白或复合物诸如核糖体和聚合酶 (它们天然地伴随天然序列）基本上分离的核酸。该术语包括已经从其天然存在的环境移 出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物，和化学合成的类似物或通过异源系统 生物学合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指如最初分离的 核酸并且不排除以后通过人工添加至分离的核酸的基因或序列。术语"多肽"以其常规含 义使用，即，作为氨基酸序列使用。多肽不限于特定长度的产品。肽、寡肽和蛋白质包括在 多肽的定义内，并且此类术语可以在本文中互换使用，除非以其他方式具体指明。此术语也 不是指或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的其 他修饰，两者均为天然存在的和非天然存在的。多肽可以是完整蛋白，或其子序列。在本发 明的语境中感兴趣的特定多肽是包含CFR并且能够结合抗原的氨基酸子序列。"分离的多 肽"是已经被鉴定和从其天然环境的成分中分离和/或回收的多肽。在优选的实施方案中， 分离的多肽将（1)如通过Lowry法测定被纯化至多肽的大于95%重量比，最优选大于99% 重量比；（2)通过使用转杯式测序仪被纯化至足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15 个残基的程度；或（3)如通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝（或优选地， 通过银染色）被纯化至均一。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为多肽的天然环 境的至少一种成分将不存在。然而，一般地，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
[0068] "天然序列"多核苷酸是具有与来源于自然的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核 苷酸。"天然序列"多肽是具有与来源于自然（例如，来源于任何物种）的多肽（例如，抗 体）相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列多核苷酸和多肽可以从自然分离或可以通 过重组或合成手段产生。多核苷酸"变体"，当该术语在本文中使用时，是与在本文中具体 公开的多核苷酸典型地有一个或多个置换、缺失、添加和/或插入的不同的多核苷酸。此类 变体可以是天然存在的或可以合成产生，例如，通过修饰本发明的一个或多个多核苷酸序 列，并如本文所述评价所编码的多肽的一种或多种生物学活性和/或使用本领域中熟知的 多种技术中的任一种。多肽"变体"，当该术语在本文中使用时，是与在本文中具体公开的 多肽典型地有一个或多个置换、缺失、添加和/或插入的不同的多肽。此类变体可以是天然 存在的或可以合成产生，例如，通过修饰本发明的一个或多个上述多肽序列，并如本文所述 评价所述多肽的一种或多种生物学活性和/或使用本领域中熟知的多种技术中的任一种。 修饰可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构中做出，并且仍然可以获得编码具有所需特征 的变体或衍生多肽的功能分子。当需要改变多肽的氨基酸序列以形成本发明的多肽的变 体或部分的等效物，或甚至改良的本发明的多肽的变体或部分时，本领域专业技术人员将 典型地改变一个或多个编码DNA序列的密码子。例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可以被 置换为其他的氨基酸而不显著地丧失其结合其他多肽（例如，抗原）或细胞的能力。由于 限定蛋白质生物学功能活性的是蛋白质的结合能力和性质，因此可以在蛋白质序列中（并 且当然可以在其基础的DNA编码序列中）做出某些氨基酸序列置换，并且尽管如此仍获得 具有相似性质的蛋白质。因此考虑可以在公开的组合物的肽序列中，或编码所述肽的相应 DNA序列中做出多种变化，而不显著地丧失它们的生物学效用或活性。在许多情况下，多肽 变体将含有一个或多个保守置换。"保守置换"是其中氨基酸被置换为具有相似性质的另 一氨基酸，使得肽化学领域中的专业技术人员将预期所述多肽的二级结构和疏水性质将基 本上不会改变的置换。如上所述，氨基酸置换因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似 性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。考虑到多种前述特征的示例性置换是本领 域技术人员所熟知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷 氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。氨基酸置换可以进一步基于残基的极 性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性做出。例如，带负电荷的氨基酸 包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；和具有相似的亲水性值 的带有不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸； 天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守变化的其 他组氨基酸包括：（1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr ; (2) cys, ser, tyr, thr ; (3) val，ile，leu, met, ala, phe ; (4) lys，arg，his ;和（5)phe，tyr，trp，his〇 变体还可以，或可 选地，含有非保守变化。在优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的不同为置换、缺失或 添加5个或更少的氨基酸。变体还可以（或可选地）通过，例如，缺失或添加对多肽的免疫 原性、二级结构和疏水性质具有最小影响的氨基酸来修饰。
[0069] 术语"同一性"或"相同的"，当用于两个或多个多肽的序列之间的关系时，是 指多肽之间的序列关联性程度，如通过多串两个或更多个氨基酸残基之间的匹配数目 来确定。"同一性"测量两个或多个序列中的较小者与由特定数学模型或计算机程序 (即，"算法"）所找到的空位比对（如果有的话）之间的相同匹配的百分比。相关多肽 的同一性可以容易地通过已知方法计算。此类方法包括，但不限于，在Computational Molecular Biology (计算分子生物学），Lesk, A. M.，编辑，Oxford University Press, New York, 1988 ;Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物计算：信息学和基 因组计划），Smith, D.W.,编辑，Academic Press, New York, 1993 ;Computer Analysis of Sequence Data (序列的计算机分析），第 1 部分，Griff in, A. M?，和 Griff in, H.G.,编辑， Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物 学中的序列分析），von Heinje，G.，Academic Press，1987;Sequence Analysis Primer (序 列分析引物），Gribskov，M?和 Devereux，J.，编辑，M.Stockton Press，New York，1991 ;和 Carillo等人，SIAM J. Applied Math. 48,1073(1988)中描述的那些。优选的用于确定同 一性的方法被设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法记述于可公 共获得的计算机程序中。优选的用于确定两条序列之间的同一性的计算机程序方法包括 GCG 程序包，包括 GAP (Devereux 等人，Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984) ;Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)、BLASTP、BLASTN，和 FASTA(Altschul 等 人，J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心（NCBI)和 其他来源（BLAST Manual, Altschul 等人 NCB/NLM/NIH Bethesda，Md. 20894 ;Altschul 等 人，见上）公开获得。熟知的Smith Waterman算法也可以用于确定同一*性。
[0070]"哺乳动物"当在本文中使用时，是指任何哺乳动物，包括人、家畜和农场动物，以 及动物园动物、运动动物或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔，等。优选地，哺 乳动物是人。在一个实施方案中，哺乳动物是雄性的。在另一个实施方案中，哺乳动物是雌 性的。
[0071]"治疗"或"缓解"是指治疗性治疗和预防或预后性措施两者；其中目的是防止或减 缓（减轻）目标的病理状况或病症。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及易于患 有病症的那些或待预防病症的那些。如果根据本发明的方法在接受治疗量的抗体后，患者 显示出可观察到的和/或可测量到的下列一项或多项的减少或缺少下列一项或多项，则成 功地"治疗"了受试者或哺乳动物的感染：致病细胞数目的减少；总细胞中致病性细胞百分 比减少；和/或与具体疾病或病况相关的一种或多种症状一定程度地缓解；降低的发病率 和死亡率，以及生活质量问题的改善。用于评估成功治疗和改善疾病的上述参数容易通过 临床医生熟悉的常规规程来测量。
[0072] 术语"治疗有效量"是指有效"治疗"受试者或哺乳动物中的疾病或病症的抗体或 药物的量。
[0073] 发明
[0074] 本发明涉及分离的抗SPLA2-IIA的抗体。
[0075]抗体抗-SPLA2-IIA
[0076] 本发明的一个目的是抗人SPLA2-IIA的抗体，其中所述抗体的结合人SPLA2-IIA 的 Kd 小于 9. lO'M,优选小于 8. lO'M, 7. lO'M, 6. lO'M, 5. lO'M, 4. lO'M,更优选小于 3. 10_、且甚至更优选小于2. l〇-1QM。
[0077] Kd可以在试验A的条件下测定：
[0078] 微板孔用PBS pH 7. 5中的50ng重组人SPLA2-IIA在室温下包被过夜。然后用含 有0. 05% Tween 20的PBS洗涤样品孔三次。在最后的洗涤后，用含有在PBS缓冲液中的 1%牛血清白蛋白（BSA)的封闭溶液在室温下处理样品孔60分钟。在用含有0.05% Tween 20的PBS洗涤后，将增加量（0. Ing/mL直达10 y g/mL)的抗人PLA2-IIA的mAb添加至抗 原包被的孔，并且在室温下孵育120min。在用含有0. 05% Tween 20的PBS洗涤后，通过用 HRP-缀合的多克隆山羊抗鼠IgG(Abcam ab7068)在室温下处理60min来检测mAb的结合。 添加TMB，通过添加HC1终止反应，并在450nm测定吸光度。数据用单址饱和模型拟合，并从 该模型估算相对Kd值。
[0079] 本发明的一个目的是抗人SPLA2-IIA的抗体，其中重链可变区包含下列⑶R中的 至少一种：
[0080] VH-CDR1:GYTFTS(SEQ IDN0:1)或 GFTFSS(SEQ IDN0:7);
[0081] VH-CDR2:WIFP⑶GSTE(SEQIDN0:2)或AINSNGGSTY(SEQIDN0:8);和
[0082] VH-CDR3:WGITAFPLFDY(SEQ ID NO:3)或 QGYGNFFDY(SEQ ID NO:9)。
[0083] ⑶R编号和定义依照Chothia定义。
[0084] 本发明的另一个目的是抗人sPLA2-IIA的抗体，其中轻链可变区包含下列CDR中 的至少一种：
[0085] VL-CDR1:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)或 RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10);
[0086] VL-CDR2:AASNLES(SEQ ID NO:5)或 RVSNRFS(SEQ ID NO:ll);和
[0087] VL-CDR3:LQSNEAPWT(SEQ ID NO:6)或 FQGTHVPRT(SEQ ID NO:12)。
[0088] 在本发明的一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-IIA在其重链中包含GYTFTS(SEQ ID NO:l)或 GFTFSS(SEQ ID NO:7)中的一个 VH-CDR1，WIFP ⑶ GSTE(SEQ ID NO:2) 或 AINSNGGSTY(SEQ ID NO:8)中的一个VH-CDR2 和 WGITAFPLFDY(SEQ ID NO:3)或 QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)中的一个 VH-CDR3。
[0089] 在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-IIA在其轻链中包含 RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)或 RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10)中的一个 VL-CDR1， AASNLES(SEQ ID N0:5)或RVSNRFS(SEQ ID N0:11)中的一个VL-CDR2和LQSNEAPWT(SEQ ID N0:6)或 FQGTHVPRT(SEQ ID N0:12)中的一个 VL-CDR3。
[0090] 在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-IIA在其重链中包含3个⑶R :SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3。
[0091] 在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-IIA在其重链中包含3个⑶R :SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
[0092] 在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-IIA在其轻链中包含3个⑶R :SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。
[0093] 在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-IIA在其轻链中包含3个⑶R :SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11 和 EQ ID NO:12。
[0094] 根据本发明，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以表征为具有与在相应的 SEQ ID NO 中列举的特定的CDR或CDR组共享至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%的同一性的氨基酸序列。
[0095] 在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-SPLA2-IIA选自由下列各项组成的组：
[0096] -具有⑴分别如SEQ ID N0:l、2和3中所示的重链CDR 1、2和3(VH-CDR1、 VH-⑶R2、VH-⑶R3)氨基酸序列和（ii)分别如SEQ ID N0:4、5和6中所示的轻链⑶R 1、2 和3(VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列的抗体；
[0097] -具有⑴分别如SEQ ID N0:7、8和9中所示的重链CDR 1、2和3(VH-CDR1、 VH-⑶R2、VH-⑶R3)氨基酸序列和（ii)分别如SEQ ID N0:10、ll和12中所示的轻链⑶R 1、2 和 3(VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列的抗体；
[0098] 任选地，其中所述序列中任一个中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同 的氨基酸置换。
[0099] 在本发明的另一个实施方案中，抗体抗-sPLA2-IIA(6G2抗体）包含序列SEQ ID NO: 13的重链可变区和序列SEQ ID NO: 14的轻链可变区。
[0100] (SEQ ID NO: 13)
[0101] QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFP⑶GSTEYNEKFKGKAT LTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARWGITAFPLFDYWGQGTALTVSS
[0102] (SEQ ID NO: 14)
[0103] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYD⑶SYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCLQSNEAPWTFGGGTKLEIKR
[0104] 在本发明的另一个实施方案中，抗-SPLA2-IIA抗体（9C8抗体）包含序列SEQ ID NO: 15的重链可变区和序列SEQ ID NO: 16的轻链可变区。
[0105] (SEQ ID NO: 15)
[0106] DVELVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRFT ISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCARQGYGNFFDYWGQGTTLTVSS
[0107] (SEQIDNO: 16)
[0108] DWMTQTPLSLPVSL⑶QASISCRSSQSIVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDMGVYYCFQGTHVPRTFGGGTNLEIKR
[0109] 根据本发明，重链或轻链可变区的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的 氨基酸置换。
[0110] 根据本发明，重链可变区涵盖与SEQ ID N0:13或15具有60%、70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99% 的同一性的序列。
[0111] 根据本发明，轻链可变区涵盖与SEQ ID勵：14或16具有60%、70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99% 的同一性的序列。
[0112] 在本发明的任一抗体中，例如，6G2和9C8,指定的可变区和⑶R序列可以包含保守 序列修饰。保守序列修饰是指不显著地影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特性的氨 基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域中已知的标准技术 将修饰引入至本发明的抗体中，诸如定向诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸置换典型地 是其中氨基酸残基被带有具有相似物理化学性质的侧链的氨基酸残基替换的那些。指定的 可变区和CDR序列可以包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或置换。在进 行置换的情况下，优选的置换将是保守修饰。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域 中已经被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸），具 有酸性侧链的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸），具有不带电荷的极性侧链的氨基酸（例 如，甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非极性 侧链的氨基酸（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸），具有 0-分支的侧链的氨基酸（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和具有芳香族侧链的氨基酸 (例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个 氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的测 定法测试改变的抗体的保留功能（即，本文所给出的特性）。
[0113] 在一个实施方案中，本发明还提供了一种抗体，其结合的表位与6G2或9C8抗体 基本上相同。在本发明中，结合与6G2或9C8抗体基本上相同的表位的抗体将分别称为 6G2-样或9C8-样抗体。
[0114] 本发明的另一目的是一种分离的核酸序列，其编码序列SEQ ID N0:13的重链可变 区。优选地，所述核酸序列是 SEQ ID N0:17(CAG GIT CAG CTG CAG CAG TCT GGA GCT GAA CTG GTA MG CCT GGG GCT TCA GTG MG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACA AGC TAT GAT ATA MC TGG GTG AGG CAG AGG CCT GAA CAG GGA CTT GAG TGG ATT GGA TGG ATT TTT CCT GGA GAT GGT AGT ACT GAG TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT ACA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGG CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCT GTC TAT TTC TGT GCA AGG TGG GGT ATT ACG GCT TTC CCC CTT TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC GCT CTC ACA GTC TCC TCA)〇
[0115] 本发明的另一目的是一种分离的核酸序列，其编码序列SEQ ID N0:14的轻链可变 区。优选地，所述核酸序列是 SEQ ID NO: 18 (GAC AIT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GM AGT GTT GAT TAT GAT GGC GAT AGT TAT ATG MC TGG TAC CM CAG AM CCA GGA CAG CCA CCG AM CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC MT CTA GAA TCT GGG ATC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC MC ATT CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CTG CAA AGT MT GAG GCT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GM ATC AAA CGG)〇
[0116] 本发明的另一目的是一种分离的核酸序列，其编码序列SEQ ID NO:15的重链可变 区。优选地，所述核酸序列是 SEQ ID NO: 19 (GAC GTG GAG CTC GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTA GTG MG CTT GGA GGG TCC CTA AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT TAC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCA GAG AAG AGG CTG GAG TTG GTC GCA GCC ATT MT AGT MT GGT GGT AGC ACC TAC TAT CCA GAC ACT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC MT GCC MG MC ACC CTG TAC CTG CM ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC TTG TAT TAC TGT GCA AGA CAG GGG TAT GGT AAC TTC TTT GAC TAC TGG GGC CM GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA)〇
[0117] 本发明的另一目的是一种分离的核酸序列，其编码序列SEQ ID N0:16的轻链可变 区。优选地，所述核酸序列是 SEQ ID NO: 20 (GAT GIT GTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGT AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAC AGT MT GGA MC ACC TAT TTA TAT TGG TAC CTG CAG AM CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AGG GTT TCC MC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC MG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT ATG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT ACA CAT GTT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAC TTG GM ATC AAA CGG)〇
[0118] 本发明的另一目的是包含编码本发明的抗体抗-sPLA2-IIA的核酸序列的表达载 体。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19 和SEQ ID N0:20中的至少一个或具有与所述SEQ ID勵：17-20共享至少60%、70%、75%、 80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的核酸序列的任何序列。
[0119] 本发明的另一目的是包含所述载体的分离的宿主细胞。所述宿主细胞可以用于重 组生产本发明的抗体。
[0120] 本发明的另一目的是产生本发明的所述抗体的杂交瘤细胞系。
[0121] 根据本发明的优选杂交瘤细胞系保藏于法国国立微生物保藏中心（Collection Nationale de Culture de Microorganismes(CNCM))(Institut Pasteur, 25rue du Docteur Roux, 75014Paris):
[0122]

【权利要求】
1. 一种抗人SPLA2-IIA的分离的抗体，其中所述抗体的结合人SPLA2-IIA的Kd小于 9. KT10M0
2. 根据权利要求1所述的抗人SPLA2-IIA的分离的抗体，其中重链的可变区包含下面 ⑶R中的至少一种： VH-CDRl:GYTFTS(SEQ ID NO:1); VH-CDR2:WIFP⑶GSTE(SEQ ID N0:2);和 VH-CDR3:WGITAFPLFDY(SEQ ID N0:3)， 或具有与SEQ ID NO: 1-3具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R， 或其中轻链的可变区包含下面⑶R中的至少一种： VL-CDR1:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4); VL-CDR2:AASNLES(SEQ ID N0:5);和 VL-CDR3:LQSNEAPWT(SEQ ID N0:6)， 或具有与SEQ ID N0:4-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
3. 根据权利要求1-2中任一项所述的抗人SPLA2-IIA的分离的抗体，其中重链的可变 区包含如权利要求2中所定义的CDR中的至少一种且轻链的可变区包含如权利要求2中所 定义的⑶R中的至少一种。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的抗人SPLA2-IIA的分离的抗体，其中重链的可变 区包含下列 CDR:GYTFTS(SEQ ID N0:1)、WIFP⑶GSTE(SEQ ID N0:2)和WGITAFPLFDY(SEQ ID N0:3)并且轻链的可变区包含下列 CDR:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)、AASNLES(SEQ ID NO:5)和LQSNEAPWT (SEQ ID NO: 6)，或具有与所述SEQ ID NO:1-6具有至少60%同一性的 氨基酸序列的任何CDR。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的抗人SPLA2-IIA的分离的抗体，其中编码重链可 变区的氨基酸序列是SEQ ID NO: 13且编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO: 14,或具 有与所述SEQ ID NO: 13-14具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
6. 包含根据权利要求1-5中任一项所述的抗人SPLA2-IIA的抗体的组合物。
7. 根据权利要求1-5中任一项所述的抗人SPLA2-IIA的抗体，其用于治疗 SPLA2-IIA-相关的病况。
8. 根据权利要求1-5中任一项所述的抗人SPLA2-IIA的抗体用于检测生物学样品中的 SPLA2-IIA 的用途。
9. 一种体外诊断或预后分析法，其使用根据权利要求1-5中任一项所述的抗人 SPLA2-IIA的抗体确定生物学样品中SPLA2-IIA的存在。
10. 根据权利要求9所述的体外诊断或预后分析法，其中所述分析法是使用权利要求4 所述的抗体作为包被抗体并使用下列抗体作为显示抗体的夹心ELISA，在作为显示抗体的 抗体中： -重链的可变区包含下面⑶R中的至少一种： VH-CDRl:GFTFSS(SEQ ID NO:7); VH-CDR2:AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8);和 VH-CDR3:QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)， 或具有与SEQ ID N0:7-9具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R，或 -轻链的可变区包含下面⑶R中的至少一种： VL-CDRl:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID NO:10); VL-CDR2:RVSNRFS(SEQ ID N0:11);和 VL-CDR3:FQGTHVPRT(SEQ ID N0:12), 或具有与SEQ ID NO: 10-12具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
11. 根据权利要求10所述的体外诊断或预后分析法，其中所述显示抗体的重链可变区 包含如权利要求10中所定义的CDR中的至少一种，并且所述显示抗体的轻链可变区包含如 权利要求10中所定义的CDR中的至少一种。
12. 根据权利要求10或11所述的体外诊断或预后分析法，其中所述显示抗体的重链可 变区包含下列CDR:GFTFSS(SEQ ID N0:7)、AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8)和QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)并且所述显示抗体的轻链可变区包含下列CDR:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10)、 RVSNRFS(SEQIDN0:ll)和FQGTHVPRT(SEQIDN0:12)，或具有与所述SEQIDN0:7-12具 有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
13. 根据权利要求10-12中任一项所述的体外诊断或预后分析法，其中编码所述显示 抗体的重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO: 15,且编码所述显示抗体的轻链可变区的氨 基酸序列是SEQ ID NO: 16,或是具有与所述SEQ ID NO: 15-16具有至少60%同一性的氨基 酸序列的任何序列。
14. 一种试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1-5中任一项所述的抗人SPLA2-IIA的 抗体。
15. 根据权利要求14所述的试剂盒，其包含权利要求4所述的抗体和根据权利要求 10-12所述的显示抗体。
16. -种表达载体，其包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20 中的至少一种，或包含具有与所述SEQ ID NO: 17-20具有至少60%同一性的核酸序列的任 何序列。
17. 保藏号为CNCM 1-4587和CNCM 1-4588的产生抗人SPLA2-IIA的抗体的杂交瘤细 胞系。
【文档编号】C07K16/40GK104520332SQ201380026328
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年3月22日 优先权日:2012年3月23日
【发明者】G·朗博, E·瓦伦廷, M·雷恩诺 申请人:国家科学研究中心, 尼斯大学