重组微生物的制作方法

重组微生物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物，其被遗传修饰以i)通过发酵碳源合成烃单体，和ii)使至少由其能够合成的烃单体构成的聚合物解聚。本发明还涉及使用这种类型的遗传修饰的微生物来生产烃单体的方法，以及这种微生物与能够合成关注的聚合物的另一种微生物的共培养物。
【专利说明】重组微生物 发明领域
[0001] 本发明涉及用于生产在聚合物合成中使用的烃单体的重组微生物。更准确地，本 发明涉及这样的微生物，其已被遗传修饰以生产以从碳源，而且通过培养基中存在的聚合 物的解聚生产这种类型的单体。本发明还涉及使用这种类型的重组微生物用于生产单体的 方法，以及从所生产的单体合成聚合物的方法。 现有技术
[0002] 聚合物用于大量【技术领域】，尤其是以塑料材料的形式，从食品包装至医药领域，经 由服装、汽车工业等。作为一个实例，聚酰胺，并且更具体地尼龙被用于制造鞋子的鞋底并 且为用于手术缝合的微丝形式。类似地，某些聚酯（例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯-PET，聚 乳酸-PLA等）被用于制造衣服和包装，而且为用于制造汽车或其他部件的热固性树脂的 形式。
[0003] 直至最近，用于大部分工业中的聚合物才获自不可再生化石能源如油。然而，与循 环这样的聚合物材料相关的困难和不可再生化石能源的日益增加的缺乏使得利用它们更 成问题。
[0004] 因此，多年来，从可再生原料或从生物质制造聚合物已处于开发中。例如，聚乳酸 (PLA)是从乳酸生产的生物可降解聚合物，其具有可与获自石油化学工业的聚合物相当的 机械性能。微生物已被分离和/或开发，因其从适合可再生碳源生产烃单体和/或聚合物 的能力。
[0005] 作为实例，各种微生物已被开发以从碳源如淀粉、戊糖等生产乳酸。尤其是，表达 乳酸脱氢酶的重组酵母菌已被生产以在恰当培养基中合成乳酸（W003102152)。
[0006] 类似地，酵母菌已被遗传修饰以表达富马酸还原酶以及从富马酸生产琥珀酸 (W02009065778) 〇
[0007] 通常，这样的微生物（重组的或其他形式的）必须在包含昂贵基质（葡萄糖、蔗糖 等）的合适培养基中培养。为了改善这样的微生物的生产性能，还必需优化培养条件（温 度，搅拌，碳源的性质等），这趋于进一步增加生产成本。
[0008] 为了降低生产成本，已尝试从不能直接升级的生物质如甜菜汁 (W02008000699)、麥汁（Boudjelal et al. - Rev.Energ. Ren, :Production et Valorisation-Biomasse [Biomass - Production and Upgrading] (2001) 41-46)等直接生 产这些代谢物。然而，生物质促进其中的微生物生长的预处理复杂并且冗长，这意味着生产 成本不可能以满意方式降低。
[0009] 而且，通过微生物生产的烃单体的量在困难的情况下仅超过30g/升，即使在最佳 培养条件下。
[0010] 另外，通过微生物生产的烃单体和/或相关聚合物的量仍然较低并且相关成本对 其成为用于聚乙烯（PE)和其他石油化学聚合物的实际替代方案来说太高。尽管从可再生 源生产聚合物的想法有吸引力，但是目前没有用于通过发酵生产的系统，其克服成本和/ 或收率的问题并且其可以满意地响应于需求。


【发明内容】

[0011] 本发明的目的是通过提供能够生产在聚合物合成中使用的大量烃单体的重组微 生物至少部分地克服所述问题中的至少一个。
[0012] 为此，本发明提供一种微生物，尤其是细菌、酵母菌或真菌，其被遗传修饰以能够 通过碳源发酵而合成一种或多种单体并且同时或其他地使培养基中存在的聚合物解聚以 释放组成其的单体。通过该相同微生物由此产生的单体来源于两种不同且独立的来源。此 夕卜，这种类型的本发明微生物的使用意味着聚合物可以循环，并且因此塑料废物聚集的问 题可以被克服。事实上，能够通过本发明微生物解聚的聚合物可以被整合到制造自塑料材 料的产物而且也可以在培养基中以溶液或其他方式直接可用。有利地，本发明的微生物能 够将高分子量聚合物不仅解聚成具有低分子量的低聚物，而且直接解聚成前段或单体。
[0013] 因此，本发明涉及一种微生物，其被遗传修饰以
[0014] i)通过碳源发酵而合成烃单体，和
[0015] ii)使至少由其能够合成的烃单体构成的聚合物解聚。
[0016] 本发明还涉及一种用于生产烃单体的方法，包括以下步骤：
[0017] -使根据本发明的微生物与碳源并且与能够由所述微生物解聚的聚合物接触，和 任选地
[0018] -回收所产生的烃单体。
[0019] 本发明还设计了微生物的共培养物，其包含根据本发明的至少第一微生物和至少 第二微生物，任选地被遗传修饰，其能够合成至少由通过所述第一微生物产生的单体构成 的聚合物。
[0020] 本发明还涉及一种使用根据本发明的微生物的共培养物的用于合成聚合物的方 法，包括以下步骤：
[0021] -使微生物的共培养物与碳源并且与能够通过第一微生物降解的聚合物接触，和 任选地
[0022] -回收通过第二微生物产生的聚合物。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1 :在四种浓度水平的蛋白酶K存在下PLA至乳酸的降解（+ 125夂_2_58/" 3 75夂 ? 5g/L) 〇
[0024] 图2 :乳酸杆菌（L. lactis) IL 1403在没有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和 3. 75g/L的蛋白酶K( )或具有20g/L的PLA(a)的CDM中的生长速率（A)和生物质（B) 的变化。
[0025] 图3 :乳酸杆菌IL 1403在没有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和3. 75g/L的 蛋白酶K( )或具有20g/L的PLA(a)的CDM中的葡萄糖的浓度（A)和特定葡萄糖消耗速 率⑶的变化。
[0026] 图4 :乳酸杆菌IL 1403在没有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和3. 5g/L的蛋 白酶K( )或具有20g/L的PLA( A)的CDM中的乳酸盐（A)的浓度的变化以及在没有PLA 的条件和具有PLA的条件之间的乳酸盐差（B)的计算。
[0027] 图5 :乳酸杆菌IL 1403在没有任何添加（?)、具有20g/L的PLA和3. 75g/L的 蛋白酶K( )或具有20g/L的PLA( ▲)的⑶M中的乳酸盐的特定生产速率的变化。

【具体实施方式】
[0028] 在本发明的上下文中，术语"微生物"是指任何单细胞真核有机体如酵母菌、微藻 和真菌，或原核有机体如细菌。
[0029] 优选地，所述微生物是来自选自以下的属的微生物：曲霉属（Aspergillus),贪 铜菌属（Cupriavidus),梭菌属（Clostridium),棒状杆菌属（Corynebacterium),埃希氏 菌属（Escherichia),假单胞菌属（Pseudomonas),子囊菌酵母属（Yarrowia),气单胞菌 属（Aeromonas),念珠菌属（Candida),伯霍尔德杆菌属（Burkholderia) ,Thermobifida, 镰刀菌属（Fusarium),毕赤氏酵母（Pichia),酵母菌属（Saccharomyces)和芽孢杆菌 属（Bacillus)。优选地，所述微生物选自黑曲霉菌（Aspergillus Niger),钩虫贪铜 菌（Cupriavidus necator),丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum),谷氨酸 棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum),大肠杆菌（Escherichia coli),铜绿假单 胞菌（Pseudomonas aeruginosa),恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida),虫媒假单胞 菌（Pseudomonas entomophila),食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans),解脂子囊 菌酵母（Yarrowia Iipolytica),嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila),热带念珠菌 (Candida tropicalis)，南极假丝酵母（Candida antartica)，Burkholderia xenovorans， 鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei),类鼻疽伯霍尔德杆菌（Burkholderia pseudomallei)，嗜高温放线菌（Thermobifida fusca),爺病鎌刀菌（Fusarium solani), 毕赤酵母（Pichia pastoris),酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae),枯草杆菌 (Bacillus subtilis)和巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium) 〇
[0030] 术语"遗传修饰的"微生物是指所述微生物的基因组已以以下方式被修饰，即所述 微生物表现出合成和解聚的两种路径。作为实例，所述微生物可以是天然能够由碳源合成 关注的单体并且被遗传修饰以表达对于所期望的解聚所需的一种酶或多种酶，反之亦然。 所述微生物也可以不是天然表现出所期望的合成和解聚路径中的任一个，并且被遗传修饰 用于这两种路径。所述微生物也可以天然地具有这些路径中的一个和/或另一个，并且被 遗传修饰以促进和/或增强所涉及基因的表达。根据本发明，微生物的基因组被修饰以整 合编码在用于生物合成烃单体的路径中和/或在聚合物的解聚中涉及的至少一种酶，或编 码其生物学活性片段的至少一个核酸序列。所述核酸序列可以使用任何合适的分子克隆方 法已被引入到所述微生物或其原种之一的基因组中。在本发明的上下文中，"微生物的基因 组"是指在所述微生物中含有的所有遗传物质，包括例如在质粒、游离体（印isome)、合成的 染色体等中所含有的染色体外遗传物质。所引入的核酸序列可以是异源序列，即它不以天 然状态存在于所述微生物中，或者同源序列。有利地，转录单位被引入到包含微生物的基因 组中，其包含关注的核酸序列，在一个或多个启动子的控制下放置。
[0031] 由本发明的微生物利用的碳源优选包括精制糖如葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖等， 而且植物或动物起源的任何有机物质，或生物质，其能够通过所述微生物降解以产生可发 酵糖。因此，碳源可以包括半纤维素、纤维素、木质纤维素等，生物质例如糖蜜和/或蔗渣， 制糖废水或废液，糖结晶母液等。所述碳源也可以包括甘油或油（甘油三酯）。在所有情况 下，碳源不包括通过解聚本发明的聚合物所产生的单体。
[0032] 本发明的同时发酵和解聚特性由以下事实定义，即在相同生理-化学条件（例如， 温度、PH和/或培养基）下，使微生物同时（或在极短时间内，例如最多约15分钟内）与 碳源并且与聚合物接触。因此，由所述两种路径（发酵和解聚）产生的烃单体可以在培养 基中同时回收。
[0033] 术语"烃单体"是指基本上由碳原子和氢构成的脂肪族或芳香族单体。其通常包 含1至8个碳原子，优选2至6个碳原子。烃单体也可以包含至少一个杂原子如氮或氧，通 常以酸、醇、胺官能等的形式。
[0034] 本发明的烃单体可以尤其是为二羧酸或其衍生物之一如酸二酐，二醇，羟基酸如 α -羟基酸，二酯、内酯、环状二酯（乙交酯，丙交酯等），二胺或羟胺。
[0035] 这些单体的非限制性例举由以下构成：乳酸，乙醇酸，3-羟基丁酸，4-羟基戊酸， 丁二醇，丙二醇，乙二醇，琥珀酸，戊二酸，己二酸，对苯二甲酸，呋喃二甲酸，己内酯，己内酰 胺，腐胺，尸胺、己二胺，酯，酯酰胺等。
[0036] 术语"低聚物"是指包含多于一种单体，并且比供给微生物的聚合物更少的单体的 一系列根据本发明的单体。
[0037] 能够通过本发明的微生物解聚的聚合物是主链基本上由碳原子构成的聚合物，并 且尤其是聚酯和/或聚酰胺。本发明的聚合物可以是均聚物或共聚物，其可以是支化的。 聚酯可以是脂肪族和/或芳香族的。可以列举的脂肪族的实例是聚乳酸（PLA)，聚羟基链 烷酸酯（PHA)，聚（琥珀酸丁二醇酯）（PBS)，聚（琥珀酸-共-己二酸丁二醇酯）（PBSA)或 聚-β-己内酯（PCAPA)。可以特别例举的脂肪族聚酯是聚（对苯二甲酸乙二醇酯）（ΡΕΤ)， 聚（三亚甲基对苯二甲酸乙二醇酯）（PTT)，聚（对苯二甲酸丁二醇酯）（PBT)或聚（己二酸 酯对苯二甲酸酯丁二醇酯）（PBAT)。可以特别例举的聚酰胺包括聚（己内酰胺）或尼龙-6 ; 聚（i^一酰胺）或尼龙-11 ;聚（己二胺-己二酸酯）或尼龙_6, 6。
[0038] 本发明特别设计了脂肪族聚酯的解聚和所述聚酯的所有或部分的酯化中间体酸 和/或醇的合成，如，例如，聚乳酸（PLA)的解聚和乳酸的合成；聚（3-羟基丁酸酯）（PHB) 的解聚和3-羟基丁酸的合成；聚（3-羟基丁酸酯-共-4-羟基戊酸酯）（PHBV)的解聚和 3_羟基丁酸和/或4-羟基戊酸的合成；聚（琥珀酸丁二醇酯）（PBS)的解聚和1，4- 丁二 醇和/或琥珀酸的合成；聚（琥珀酸酯-共-己二酸丁二醇酯）（PBSA)的解聚和1，4- 丁二 醇和/或琥珀酸和/或己二酸的合成。
[0039] 本发明还设计了芳香族聚酯的解聚和所有或部分的相关单体的合成，如，例如，聚 (对苯二甲酸乙二醇酯）（PET)的解聚和乙二醇和/或对苯二甲酸的合成；聚（三亚甲基对 苯二甲酸乙二醇酯）（PTT)的解聚和1，3-丙二醇和/或对苯二甲酸的合成；聚（对苯二甲 酸丁二醇酯）（PBT)的解聚和1，4- 丁二醇和/或对苯二甲酸的合成；聚（己二酸对苯二甲 酸丁二醇酯）的解聚和1，4- 丁二醇和/或己二酸和/或对苯二甲酸的合成。
[0040] 本发明还设计了聚酰胺的解聚和所有或部分的相关单体的合成，如，例如，聚（己 内酰胺）或尼龙-6的解聚和己内酰胺或6-氨基-己酸的合成；聚^一酰胺）或尼龙-11 的解聚和i^一酰胺的合成；聚（己二胺-己二酸）或尼龙_6, 6的解聚和己二胺和/或己二 酸的合成。
[0041] 根据本发明，相同的微生物能够合成至少一种烃单体并且能够解聚至少由相同单 体构成的聚合物。根据本发明，所述微生物能够以从其回收关注的单体的方式解聚所述聚 合物。在其中聚合物包含其他单体的情况下，所述聚合物可以仅被部分地解聚以释放关注 的单体，其他单体可以可能地以低聚物的形式在最终解聚形式中。
[0042] 在本发明的特别实施方式中，微生物也被遗传修饰以减弱用于其能够合成的烃单 体降解的至少一种路径。
[0043] 事实上，在一些情况下，本发明的微生物可以天然地能够利用其合成的单体作为 用于其生长的碳源。然而，这些单体可以是特别工业上感兴趣的，特别是用于随后的聚合物 合成，并且它可以有利地防止它们的降解。为此，根据本发明，使用适当的重组/缺失方法， 可以缺失编码在关注的单体的降解中涉及的一种酶或多种酶的所有或部分基因。还可以减 弱在关注的单体的降解中涉及的所有或一部分基因的表达。为此，例如，可以引入一个或多 个编码调控子如转录因子、RNA、siRNA等的核酸序列，其能够减弱这些基因的表达。类似地， 可以修饰在关注的单体的降解中涉及的基因的至少一个的启动子序列，以减弱/防止其中 的转录。
[0044] 为了防止合成的单体降解，还可能的是，代替或作为上述遗传修饰的补充，定期地 使用于微生物的培养基富含可以易于由所述微生物吸收的基质，以使其优先利用那些基质 而不是所合成的单体。
[0045] 本发明的微生物还可以被遗传修饰以能够合成完全或部分由其能够合成的单体 构成的聚合物。作为实例，微生物可以被遗传修饰以整合和表达编码特定聚合物合成酶的 核酸序列。因此，相同的微生物，依据本发明，可以在要循环/降解的聚合物的发酵和靶向 解聚的辅助下生产单体。在其中关注的聚合物是杂聚合物的情况下，可以使培养基富含所 述聚合物的其他一种组成单体或多种组成单体。
[0046] 特别地，本发明设计了脂肪族聚酯如聚乳酸（PLA)、聚羟基链烷酸酯（PHA)等的解 聚和所有或部分相关单体的合成。
[0047] 因此，在第一实施方式中，本发明的微生物被遗传修饰以解聚PLA并因此获得乳 酸，并且伴随地由碳源合成乳酸。
[0048] 解聚PLA的酶有利地选自丝氨酸蛋白酶、脂肪酶和PLA解聚酶。优选地，用于解 聚PLA的酶选自白色念球菌（Tritirachium album)的蛋白酶K、来自黑曲霉（Aspergillus niger)的脂肪酶、来自皱裙念珠菌（Candida rugosa)的脂肪酶AY、来自稻根霉菌 (Rhizopus oryzae)的脂肪酶F、来自伯克霍尔德菌属（Burkholderia sp.)的脂肪酶PS或 来自隐球菌属（Cryptococcus sp.)的S-2珠的脂肪酶角质酶样酶。类似地，用于合成乳酸 的酶有利地是乳酸脱氢酶。在一个特别实例中，微生物是乳酸微生物，例如，乳酸菌，天然分 泌乳酸脱氢酶，即处于野生状态。
[0049] 本发明还提供一种用于生产烃单体的方法，包括以下步骤：
[0050] -使根据本发明的微生物与碳源并且与能够通过所述微生物解聚的聚合物接触， 和任选地
[0051] -回收所产生的烃单体。
[0052] 通过发酵和通过解聚生产的烃单体有利地存在于培养基中。然后可以使用任何已 知技术处理富含这些单体的培养基，以分离它们和/或纯化它们。.
[0053] 根据本发明，可以生产所有种类的单体，简单地通过改变所使用的微生物和所引 入的遗传修饰。微生物的选择以及要提供的遗传修饰依照本申请的教导在本领域技术人员 能力范围内。
[0054] 用于使微生物与碳源和聚合物接触的条件，如温度、pH等可以由本领域技术人员 改变以优化或有利于通过聚合物解聚生产单体和通过由碳源开始的发酵生产单体。
[0055] 本发明还提出至少两种微生物的共培养物，例如在发酵罐中，其中的一种是本发 明的遗传修饰的微生物，第二种微生物本身能够合成由至少通过本发明的微生物生产的单 体构成的聚合物。
[0056] 因此，通过本发明的微生物生产和培养基中分泌的单体由第二种微生物使用来生 产关注的聚合物，其然后可以在任何类型的工业中被利用。本发明的方法因此可以用来彻 底循环聚合物，从它们解聚成可以再次使用的单体，至它们以可以以用于新应用的塑料形 式使用的新聚合物形式再利用。
[0057] 因此，例如，本发明的微生物是遗传修饰的乳酸菌，其表达至少一种乳酸脱氢酶和 至少一种能够解聚PLA的选自PLA解聚酶、蛋白酶和脂肪酶的酶。这种乳酸菌可以与另一 种微生物共培养，其可以被遗传修饰，其可以合成PLA。有利地，选择两种共培养的微生物以 使它们对于培养基中存在的碳源，优选糖类不发生竞争。在本发明的某些实施方式中，术语 "包括"可以表示"基本上由……构成"或"由……构成"。
[0058] 实施例
[0059] 根据以下实施例将更好地理解本发明，这些实施例通过完全非限制性的举例说明 本发明的方式给出。
[0060] 实施例1 :表汰PLA解聚酶的重纟目乳酸菌
[0061] 方法和装置
[0062] 用来制备重组质粒的克隆技术是与在由Sambrook等1989的出版物中描述的 技术一致的那些（"Molecular cloning:a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.，'）。
[0063] 将来自具有序列 SEQ ID N。I (Nakamura et al. 2〇01_Appl. Environ. Microbiol. 67:345-353)的拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.)K104_l 的 pld 基因通过同 源性重组引入到质粒 pNZ8048 中（Kuipers et al. 1998 -J. Biotechnol. 64:15-21)。整合 该pld基因的重组质粒称为"pNZ-pld"。
[0064] 野生型株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)MG1363使用由Ho等在1995年 描述的方法通过电穿孔通过引入到细胞中的质粒pNZ-pld转化（"Transformation of Lactococcus by electroporation''Methods Mol. Biol. 47:195-199)。整合 pNZ-pld 质粒 的重组细菌表示为"MG1363-pNZ-pld"。阴性对照"MG1363-pNZ8048"对应于通过空质粒 PNZ8048转化的野生型株乳酸乳球菌MG1363。
[0065] PLA解聚酶活性
[0066] MG1363-pNZ-pld 和 MG1363-pNZ8048 株在 30°C、在厌氧条件下在具有 CDM( "化学 成分确定的培养基"）的2L发酵罐中平行地培养。
[0067] 向培养基中加入葡萄糖以达到1%的最终浓度（重量/体积），并且通过自动添加 NaOH将pH保持在6. 5。
[0068] 培养物各自分成两个次培养物，每批次的次培养物（MG1363-pNZ-pld_l/ MG1363-pNZ8048-l 和 MG1363-pNZ-pld-2/MG1363-pNZ8048-2)被保持在相同条件下。
[0069] 仅第二批次（MG1363-pNZ-pld-2/MG1363-pNZ8048-2)接受摩尔质量为 220, OOODa 的PLA (Shimadzu Co. -Kyoto, Japan)，乳化到培养基中至0· 1% (重量/体积）。
[0070] 通过米用在 Nakamura 等 _2〇01 ( "Purification and characterization of an extracellular poly(L-lactic-acid)depolymerase from a soil isolate Amycolatopsis sp. Strain K104-1，'Appl. Environ. Microbiol. 67:345-353)中描述的方 法，PLA解聚酶活性在培养2天后测量。
[0071] 来自第一批次的培养物上清在培养两天后移出并通过质谱法（Varian Inova500) 分析以评价乳酸含量。
[0072] 对于两个样品（MG1363-pNZ-pld-l 和 MG1363-pNZ8048-l)，观察到在 90Da 的单个 峰，对应于通过发酵由细菌产生的乳酸。因此，该重组株MG1363-pNZ-pld良好适合于通过 存在于培养基中的葡萄糖发酵来生产乳酸。
[0073] 同时，来自第二批次的培养物上清移出并通过质谱法（Varian Inova 500)分析以 评价存在的乳酸低聚物（基本上为二聚体和三聚体）的量。
[0074] 对于两个样品（MG1363-pNZ-pld-2 和 MG1363-pNZ8048-2)，在 220, OOODa 观察 到峰，对应于在培养基中存在的PLA，和对应于乳酸的在90Da的峰。而且，对于对应于 MG1363-pNZ-pld-2的培养基的样品，观察懂啊具有中间分子量的多个峰存在，这些峰对于 MG1363-pNZ8048-l缺乏。这些中间峰对应于各自大小的乳酸低聚物，其证实培养基的PLA 确实已通过重组株MG1363-pNZ-pld-2降解。
[0075] 表达PLA解聚酶的重组株MG1363-pNZ-pld事实上能够通过发酵和解聚培养基中 存在的高分子量PLA而生产乳酸。
[0076] 实施例2 :乳酸牛产的评价
[0077] 实施例 1 的培养物上清，对应于批次 MG1363-pNZ-pld-l，MG1363-pNZ-pld-2, MG 1363-pNZ8048-l和MG1363-pNZ8048-2,通过HPLC分析以确定释放的乳酸的量。为此，将 Aminex HPX-87H柱，恒温在50°C并且用5mM硫酸溶液以0. 5mL/min洗脱，用于定量。
[0078] 此分析可以证实，来自批次MG1363-pNZ-pld-2的上清中的乳酸的量高于3种其他 条件（MG1363-pNZ-pld-l，MG1363-pNZ8048-l 和 MG1363-pNZ8048-2)的乳酸的量。类似地， 仅在来自批次MG1363-pNZ-pld-2的培养物上清中观察到乳酸二聚体的存在。
[0079] 在C18柱上的互补分析使用过由Vu等2005描述的方法进行（"Oligomer distribution in concentrated lactic acid solutions，'，Fluid Phase Equilibria, 236, 125-135)。来自批次MG1363-pNZ-pld-2的培养物上清的分析确认高达6 的聚合度的乳酸低聚物的存在。
[0080] 实施例3 :在蛋白_ K存在下培养乳酸乳球菌IL 1403。
[0081] 以下实施例处理乳酸乳球菌IL 1403株和蛋白酶K的组合用于生产乳酸。该蛋白 酶K是来自白色念球菌的蛋白酶K，可以标号EU0090获自EUR0MEDEX。
[0082] 3. 1.菌株和培养基的选择
[0083] 使用的菌株是乳酸乳球菌IL 1403株。此株在补充有5g/L的葡萄糖并缓冲至pH 为8的化学成分确定的培养基（CDM培养基）上培养。不使用丰富培养基（含有蛋白胨、蛋 白质或寡肽的来源）以便不包括在将对蛋白酶K优选的培养基基质中，其可能与要降解的 PLA竞争。
[0084] 表I :pH 8的化学成分确定的培养基（CDM)的组成
[0085]
[0086] 3· 2.培养条仵的选择

【权利要求】
1. 微生物，其被遗传修饰以 i) 通过发酵碳源来合成烃单体，和 ii) 使至少由其能够合成的烃单体构成的聚合物解聚。
2. 根据权利要求1所述的微生物，其中所述单体包含至少一个选自氧和氮的杂原子， 优选为酸、醇和胺官能的形式。
3. 根据权利要求1或2所述的微生物，其被遗传改性以iii)减弱其能够合成的烃单体 的降解途径。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的微生物，其被遗传改性以 iv)合成至少由其能够合成的经单体构成的聚合物。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其被遗传改性以使聚酯解聚和合成所述 聚酯的酯化的中间体酸和/或醇。
6. 根据权利要求5所述的微生物，其被遗传改性以使聚乳酸（PLA)解聚并合成乳酸。
7. 根据权利要求6所述的微生物，其表达用于使PLA解聚的至少一种选自蛋白激酶K、 脂肪酶和PLA解聚酶的酶，和/或乳酸脱氢酶以合成乳酸。
8. 根据权利要求6或7所述的微生物，其中所述微生物是乳酸微生物，优选乳酸菌。
9. 用于生产烃单体的方法，包括以下步骤 -使根据权利要求1至8中任一项所述的微生物与碳源并且与能够被所述微生物解聚 的聚合物接触，和任选地 -回收所产生的烃单体。
10. 微生物的共培养物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的至少第一微生物和 至少第二微生物，任选地被遗传修饰，其能够合成至少由通过所述第一微生物产生的单体 构成的聚合物。
11. 用于合成聚合物的方法，其使用根据权利要求10所述的微生物的共培养物，所述 方法包括以下步骤 -使所述微生物的共培养物与碳源并且与能够被所述第一微生物降解的聚合物接触， 和任选地 -回收由所述第二微生物产生的聚合物。
12. 根据权利要求11所述的合成方法，用于生产PLA，其中所述第一微生物是根据权利 要求6至8中任一项所述的微生物并且所述第二微生物被遗传修饰以从乳酸单体合成PLA。
【文档编号】C07C2/00GK104364372SQ201380027534
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年3月27日 优先权日:2012年3月27日
【发明者】塞德瑞克·布瓦萨尔 申请人:卡拜耳公司