缓激肽b1受体配体的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明公开提供可以特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体。本公开也提供药物组合物，及编码抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体的核酸，用于制备此类抗体或其片段的重组载体及宿主细胞。本发明也提供利用公开的抗体，在体内或体外调节胰激肽或脱-Arg10-胰激肽活性，或检测胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的方法。本公开进一步提供制备可特异性结合脱-Argg-缓激肽和脱-Arg10-胰激肽样多肽抗体的方法。
【专利说明】缓激肽B1受体配体的抗体
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月28日提交的美国临时申请61/616, 845及2013年2月4 日提交的法国专利申请1350953的权益。这些申请的内容通过提及完整并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 缓激肽Bl受体涉及炎性疾病和慢性疼痛的发病机理。通过调节组织炎症和肾纤 维化，Bl受体也与急性肾损伤及慢性肾脏疾病的发病机理相关，慢性肾脏疾病是终末期肾 功能衰竭的主要原因。
[0005] 在人类，缓激肽Bl受体的主要激动剂是激肽。激肽是由激肽原蛋白经蛋白水 解裂解产生的生物活性肽。缓激肽Bl受体的主要激肽激动剂是十肽胰激肽，和九肽 脱-ArglO-胰激肽（通过蛋白水解裂解胰激肽的C端精氨酸形成）。因此，可以抑制胰激肽 和脱-ArglO-胰激肽结合缓激肽Bl受体的制剂，具有潜力治疗或预防缓激肽Bl受体介导 的病理过程。
[0006] 相应地，有必要在本领域利用可以抑制胰激肽和脱-ArglO-胰激肽结合缓激肽Bl 受体新型制剂，来治疗缓激肽Bl受体介导的人类病理过程。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供的抗体或其片段，可以特异性结合胰激肽和脱-ArglO-胰激肽，并 可阻止胰激肽和脱-ArglO-胰激肽与缓激肽Bl受体的结合。这类抗体对治疗胰激肽和 脱-ArglO-胰激肽相关疾病或失调（例如，疼痛或纤维化）特别有效。本发明也提供药 物组合物，以及可以制备这类抗体或其片段的编码抗胰激肽和脱-ArglO-胰激肽抗体的 核酸，重组表达载体和宿主细胞。利用本发明所述抗体或其片段检测或调节胰激肽和 脱-ArglO-胰激肽活性的方法，也包含在本发明中。本发明还提供制备可特异性结合 脱-Arg9-缓激肽和脱-ArglO-胰激肽样肽的抗体的方法。
[0009] 相应地，一方面本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其：
[0010] a)特异性结合胰激肽或脱-Argio-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；
[0011] b)特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，其KD值小于IxKTiqM;
[0012] c)特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，其Ktjff小于IXIO45T1 ;或
[0013] d)特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽并抑制其结合缓激肽Bl受体。
[0014] 在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合至胰激肽或脱-ArglO-胰激肽 N-末端赖氨酸残基。
[0015] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段抑制胰激肽或脱-ArglO-胰激肽 结合缓激肽-1受体。
[0016] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合小鼠胰激肽样肽 (KLP)。
[0017] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个重链可变区，该重链可 变区包含选自下组的HCDR3氨基酸序列：
[0018]a)SEQIDNO:7 [X1YX2X3DX4HAMX5Y],其中
[0019]
[0020] X2是R，D，A，V，L，I，M，F，Y或W，
[0021] X3是Y，F，W或H，
[0022] X4 是D，E或Y，和，
[0023] X5是D或E ;
[0024] b)SEQIDNO:63[X1EyDGX2YX 3X4LDX5]，其中
[0025] X1是W或F
[0026] X2是N或无氨基酸；
[0027] X3是Y或S，
[0028] X4是D或P，和
[0029] X5 是F或Y ;
[0030] c)SEQIDNO：13 ；
[0031] d)SEQ ID NO：32 ；
[0032] e)SEQIDNO：40 ；
[0033] f)SEQ ID NO:47;和
[0034] g)SEQIDNO:55。
[0035] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组中的HCDR2氨基酸 序列：
[0036]a)SEQ ID NO:8[YFXfXAGNTGYNQKFRG]，其中
[0037] I，M，F，Y或W，和
[0038] X2 是丫，D，E，N或Q ;
[0039] b) SEQ ID NO AdDVX1DPENGDX2X3YAPKFQG],其中
[0040] X1是I或V，
[0041]父2是1'或S，和
[0042] X3为G或D ;
[0043] c)SEQIDNO：14
[0044] d)SEQ ID NO：33 ；
[0045] e)SEQIDNO：41 ；
[0046] f)SEQ ID NO:48;和
[0047] g)SEQIDNO:56。
[0048] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组中的HCDRl氨基酸 序列：
[0049] a)SEQIDNO:9 [GYSFTDYXJY]，其中 X1 为 N，W或Y;
[0050] b) seq id no :65[Gfnikdyyx1H]，其中 X1是L，或 M;
[0051] c)SEQIDNO：15 ；
[0052] d)SEQ ID NO：34 ；
[0053] e)SEQIDNO：42 ；
[0054] f)SEQ ID NO:49;和
[0055] SEQIDNO:57。
[0056] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个轻链可变区，该轻链可 变区包含选自下组的LCDR3氨基酸序列：
[0057]a)SEQIDNO:10[QQX1X2SX3PX4T],其中
[0058]X1 是Y，F或H，
[0059]X2 是Y，F，H或W，
[0060]X3 是Y，F，T或H，和，
[0061]X4 是W，Y，F，H或L:
[0062]b)SEQIDNO:66 [QX1X2X3SX4PX5T]，其中
[0063]X1 是Q或N，
[0064]X2 是Y，F，D或H，
[0065]X3 是Y，F，H或W，
[0066]X4 是Y，F，T或H，和
[0067]父5是1，丫，？，11或1;
[0068]c)seqidno:69[X1Qgthfpyt]，其中X1 为L或M;
[0069]d)SEQIDNO：16 ；
[0070]e)SEQIDNO：35 ；
[0071]f)SEQIDNO：43 ；
[0072] g)SEQIDNO:50;和
[0073]h)SEQIDNO:58。
[0074] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDR2氨基酸序 列：
[0075]a)SEQIDN0:11[WASTRXJ，其中X:是已^』或N;
[0076]b)SEQIDNOATK1ASTRx2]，其中
[0077]X1 是W或G和
[0078]父2是已，0,〇或心
[0079]c)SEQIDNO：17 ；
[0080]d)SEQIDNO：36 ；
[0081]e)SEQIDNO:51;和
[0082]f)SEQIDNO:59。
[0083] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDRl氨基酸序 列：
[0084]a)SEQIDNO:12[KSSQSLLX1SSNQKNX2LA],其中
[0085]父1是1，11，￥或卩，和
[0086]X2 是H或Y;
[0087]b)SEQIDNO:68 [KssqslLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
[0088]X1 是W，H，Y或F，
[0089]X2 是S 或G，
[0090]X3 是N 或D，
[0091]父4是1(或R，
[0092]父5是11或Y。
[0093] c) SEQ ID NO :70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中X1为K或E ;
[0094] b)SEQ ID NO : 18 ;
[0095] c)SEQ ID NO ：37；
[0096] d) SEQ ID NO :44 ;
[0097] e) SEQ ID NO : 52;和
[0098] f) SEQ ID NO :60。
[0099]在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个轻链可变区，该轻链可 变区包含选自下组的LCDR3氨基酸序列：
[0100] a) SEQ ID NO : 10 [QQ X1X2S X3P X4T],其中
[0101]父丨是丫"或札
[0102]父2是丫，卩，11或评，
[0103] X3是Y，F，T或H，和，
[0104] X4是W，Y，F，H或L:
[0105]b)SEQ ID NO:66 [QX1X2X3SX4PX5T]，其中
[0106]父1是〇或1
[0107]父2是丫，卩，0或11，
[0108] X3是Y，F，H或W，
[0109] X4是Y，F，T或H，和
[0110]父5是1，丫，卩，11或1; tom] c)seq id no :69[X1Qgthfpyt],其中X1为L或M;
[0112] d)SEQ ID NO ：16；
[0113] e)SEQ ID NO ：35；
[0114] f)SEQ ID NO ：43；
[0115] g)SEQ ID NO : 50;和
[0116] h) SEQ ID NO : 58。
[0117] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDR2氨基酸序 列：
[0118] a)SEQ ID N0:11[WASTRXJ，其中父丨是已，]』或N;
[0119] b)SEQ ID NO :67 [XIASTRx2]，其中
[0120] X1是W或G和
[0121]父2是已，0,〇或1
[0122] c) SEQ ID NO : 17 ;
[0123] d)SEQ ID NO ：36；
[0124] e)SEQ ID NO :51;和
[0125] f) SEQ ID NO : 59。
[0126] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDRl氨基酸序 列：
[0127] a) SEQ ID NO : 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA],其中
[0128]父1是1，11，￥或卩，和
[0129]父2是11或Y;
[0130]b)SEQIDNO:68 [KssqslLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
[0131]父1是评，11，￥或卩，
[0132]父2是3或6，
[0133]X3是N或D，
[0134]X4 是K或R，
[0135]父5是11 或Y。
[0136]c)SEQIDNO:70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中X1 为K或E;
[0137]b)SEQIDNO：18 ；
[0138]c)SEQIDNO:37;
[0139]d)SEQIDNO：44 ；
[0140]e)SEQIDNO:52;和
[0141]f)SEQIDNO:60。
[0142] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区 含有HCDR3,HCDR2和HCDRl区，HCDR3,HCDR2和HCDRl的氨基酸序列分别如SEQIDNOs 13, 14,和15所示，且根据Kabat，其有一个或多个选自下列位点的氨基酸取代：Hl，H5，H9， Hll，H12,H16,H38,H40,H41，H43,H44,H66,H75,H79,H81，H82A，H83,H87,和H108。
[0143] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区 含有LCDR3,LCDR2和LCDRl区，LCDR3,LCDR2和LCDRl区的氨基酸序列分别如SEQIDNOs 16, 17,和18所示，且根据Kabat，其有一个或多个选自下列位点的基酸取代选自L5,L9， L15,L18,L19,L21，L22,L43,L63,L78,L79,L83,L85,L100 和L104。
[0144] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个重链可变区氨基酸序 列，该序列与包含SEQIDNOs: 19, 20, 21，22, 24, 25, 38,45, 53,和61的组的任何序列具有 至少90 % -致性。
[0145] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个轻链可变区氨基酸序 列，该序列与包含SEQIDNOs:26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的组的任何序列具 有至少90 % -致性。
[0146] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个轻链可变区氨基酸序 列，该序列与包含SEQIDNOs:26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的组的任何序列具 有至少90 % -致性。
[0147] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个重链可变区氨基酸序 列，其选自包含SEQIDNOs:19,20,21，22,24,25,38,45,53，和61的组。
[0148] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个轻链可变区氨基酸序 列，其选自包含SEQID勵8:26,27,28,29,29,30,31，39,46,54，和62的组。
[0149] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一段选自SEQIDNOs:26， 27,28,29,29,30,31，39,46,54，和62的氨基酸序列。
[0150] 在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含的重链和轻链可变区氨基酸 序列分别如SEQIDNO:19 和 26，SEQIDNO:20 和 27;SEQIDNO:21 和 28;SEQIDNO:22 和 28;SEQIDN0:23 和 29;SEQIDN0:24 和 30;SEQIDN0:25 和 31;SEQIDN0:38 和 39;SEQIDNO:45 和 46,SEQIDNO:53 和 54,或SEQIDNO:61 和 62 所示。
[0151] 在另一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，可特异性结合胰激肽或 脱-ArglO-胰激肽，上述抗体或其抗原结合片段，与含重链和轻链可变区氨基酸序列分别 如SEQIDNO: 19 和 26,SEQIDNO:38 和 39,SEQIDNO:45 和 46,SEQIDNO:53 和 54,或 SEQIDNO:61和62所示的抗体，竞争性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽。
[0152] 在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，与前述 任一权利要求所述的抗体竞争结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，并且不结合缓激肽或 脱-Arg9_缓激肤。
[0153] 在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，可特异性结 合胰激肽（KD)或脱-ArglO-胰激肽（DAKD)的一个构象表位，其中KD或DAKD采用一个包括 在4位脯氨酸II型紧密转角的Pr〇4结节构象。在一个实施例中，KD或DAKD的Pro4结节构 象进一步包含一个S形的氨基酸重复，其将氨基酸链的疏水性侧链排成空间堆积模式。在 另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：(a)特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰 激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；(b)特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，KD 值小于IxKTwM; (c)特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，Ktjff小于IXIO4jT1 ;或⑷特 异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽并抑制其结合缓激肽Bl受体。
[0154] 在另一方面，本发明所述抗体或抗原结合片段结合到一种诊断或治疗试剂上。
[0155] 在另一方面，本发明提供一种分离的编码本发明所述抗体或其抗原结合片段的氨 基酸序列的核酸。
[0156] 在另一方面，本发明提供包含有本发明所述核酸的重组表达载体。
[0157] 在另一方面，本发明提供包含有本发明所述重组表达载体的宿主细胞。
[0158] 在另一方面，本发明提供一种生产可特异结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽的抗体 的方法，包括：在可让宿主细胞产生一种特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽的抗体的 条件下培养本发明所述的宿主细胞。
[0159] 在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述抗体或其抗原结合 片段，及一种或多种药学上可接受的载体。
[0160] 在另一方面，本发明提供一种用于治疗胰激肽或脱-ArglO-胰激肽相关的疾病或 失调的方法，其包括给需要的受试者施用本发明所述的药物组合物。
[0161] 在一个实施例中，所述疾病或失调是慢性疼痛。
[0162] 在另一方面，本发明提供一种产生特异性结合脱-Arg9_缓激肽和脱-ArglO-胰激 肽样肽的抗体的方法，包括：用包含肽的免疫原免疫动物，其中所述肽含有如SEQIDNo. 11 所示的氨基酸序列，并且其中所述肽的氨基末端的精氨酸通过连接体被间接偶联到一个载 体基团上，这样，动物的免疫系统可产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽，脱-ArglO-胰激肽和 脱-ArglO-胰激肽样肽的抗体。
[0163] 在另一个实施例中，本发明所述的方法进一步包括：从所述动物中，分离所述抗 体，分离编码该抗体的核酸，或表达该抗体的免疫细胞。
[0164] 在一个实施例中，所述载体基团是蛋白质。在另一个实施例中，上述蛋白质是匙孔 血蓝蛋白（KLH)。在另一个实施例中，其中所述连接体基团包含：[Gly-Gly-Gly]n，其中n至 少为1。
[0165] 附图简述
[0166] 图1示出了ELISA分析法验证EEl抗体与激肽结合的结果。
[0167] 图2示出了差示扫描量热法测量抗体F151的结果。
[0168] 图3示出了鼠和人源化F151抗体的可变区的氨基酸序列比对。所有相同的残基 列在直线上，同源性残基用" + "号标识，非同源残基被留为空白。
[0169] 图4示出了F151抗体/胰激肽复合物的抗原结合位点的电子密度图。
[0170] 图5示出了F151抗体/脱-ArglO-胰激肽复合物的抗原结合位点的电子密度图。
[0171] 图6示出了结合到胰激肽的F151的Fv亚基的一个条带球棍表示法。
[0172] 图7示出了本发明的示例性鼠抗胰激肽抗体的轻链可变区的一个氨基酸序列比 对。与胰激肽相互作用的氨基酸残基以星号标识。
[0173] 图8示出了本发明的示例性鼠抗胰激肽抗体的重链可变区的一个氨基酸序列比 对。与胰激肽相互作用的氨基酸残基以星号标识。
[0174] 图9示出了体内试验确定EEl抗体对福尔马林诱导的急性炎性痛的作用结果。
[0175] 图10示出了体内试验确定EEl抗体对弗氏完全佐剂（CFA)诱导的机械性超敏反 应的作用结果。
[0176] 图11示出了体内试验确定EEl抗体对弗氏完全佐剂（CFA)诱导的热超敏性的作 用结果。
[0177] 图12示出了体内实验确定EEl抗体对CCI诱导的机械性超敏性的作用结果。
[0178] 图13示出了体内试验确定EEl抗体对CCI诱导的热超敏性的作用结果。
[0179] 图14示出了用于产生人源化F151变种HC3a/LC3a的VL和VH表达构建体示意 图，构建体有限制性DNA的核酸内切酶位点，推导的酶切位点序列以粗体和下划线表示。图 A示出了轻链，图B示出了重链。
[0180] 图15示出了F151重链（A)和轻链⑶氨基酸序列与最接近的人源氨基酸序列的 比对。
[0181] 图16示出了F151重链（A)和轻链⑶与VHl亚家族的重链基因座（1-08&1-18) 和轻链基因座（VIV-B3)的比对。CDR区和游标区域表示为粗体，人源化突变表示为下划 线。
[0182] 图17示出了当胰激肽（KD)结合到F151抗体时，其主链多肽骨架构象的（A)二级 和（B)三级结构，F151抗体含有在4位脯氨酸处II型紧密转角（C)。
[0183] 发明详述
[0184] 本发明提供可特异性结合胰激肽和脱-ArglO-胰激肽并阻止胰激肽和 脱-ArglO-胰激肽与缓激肽Bl受体结合的抗体。这类抗体对治疗胰激肽和脱-ArglO-胰 激肽相关的疾病或失调特别有效（例如，疼痛）。本发明也提供药物组合物，及用于制备 这类抗体或其抗原结合片段的编码抗胰激肽和脱-ArglO-胰激肽抗体的核酸，重组表达载 体及宿主细胞。本发明也包括：利用本发明所述抗体在体外或体内检测或调节胰激肽和 脱-ArglO-胰激肽活性的方法。
[0185]I.定义
[0186] 便于本发明更好地被理解，首先定义一些术语。
[0187] 本文所用术语"胰激肽"，指包含或由氨基酸序列KRPPGFSPFR(SEQIDNO. 1)构成 的多肽。
[0188] 本文所用术语"脱-ArglO-胰激肽"，指包含或由氨基酸序列KRPPGFSPF(SEQID NO. 2)构成的多肽。
[0189] 本文所用术语"小鼠胰激肽"或"胰激肽样肽"，指包含或由氨基酸序列 RRPPGFSPFR(SEQIDNO. 3)构成的多肽。
[0190] 本文所用术语"小鼠脱-ArglO-胰激肽"或"脱-ArglO-胰激肽样肽"，指包含或由 氨基酸序列RRPPGFSPF(SEQIDNO. 4)构成的多肽。
[0191] 本文所用术语"缓激肽"，指包含或由氨基酸序列RPPGFSPFR(SEQIDNO. 5).构成 的多肽。
[0192] 本文所用术语"脱-Arg9-缓激肽"，指包含或由氨基酸序列RPPGFSPF(SEQID NO. 6)构成的多肽。
[0193] 本文所用术语"抗体"，指包括四条多肽链的免疫球蛋白分子及其多聚体（例如Ig M)，免疫球蛋白分子的两条重（H)链和两条轻（L)链通过二硫键相互连接。每条重链包含 一个重链可变区（简写为Vh或VH)和一个重链恒定区（简写为Ch或CH)。重链恒定区包含 三个结构域，CH1，CH2,CH3。每条轻链包含一个轻链可变区（简写为VJ和一个轻链恒定区 (简写为Q或CL)。轻链恒定区包含一个结构域（Ql)。V1^P'可进一步细分为高变区，称 为互补决定区（CDRs)，及散布的更加保守的，称为骨架区（FR)。每个'包含三个CDRs 和四个FRs，从N端至C端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
[0194] 本文所用术语抗体的"抗原结合片段"包括：任何天然存在的、酶法制得的、合成的 或遗传工程制备的多肽或糖蛋白，这些多肽或糖蛋白可特异性结合抗原形成复合物。抗体 的抗原结合片段可以源自，例如，通过使用任何适宜的标准技术从全抗体分子获得，如蛋白 水解消化或重组基因工程技术，该技术涉及操纵和表达编码抗体可变区和可选的恒定结构 域的的DNA。非限制性的抗原结合部分的实施例包括：（i)Fab片段；（ii)的F(ab'）2片段； (iii)Fd片段；（iv)Fv片段；（v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和（vii)模仿抗体 高变区（例如，分离的互补决定区（CDR))的氨基酸残基构成的最小识别单位。"抗原结合 片段"的表述中也包括其它工程分子，如双体，三体，四体和微体。
[0195] 本文所用术语"⑶R"或"互补决定区"，指从重链和轻链多肽链可变区中所发现 的不连续的抗原结合位点。Kabat等?J.Biol.Chem. 252, 6609-6616 (1977)和Kabat等 Sequencesofproteinofimmunologicalinterest. (1991),及Chothia等.J.Mol. Biol. 196:901-917(1987)和MacCallum等?J.Mol.Biol. 262:732-745(1996)中已经描述过 这些具体区域，相互比较起来，其中的定义包含一定的重叠及氨基酸残基亚群。根据以上引 用的参考文献定义所确定的构成CDR的氨基酸残基，展示用于比较。在本发明的一个实施 例中，术语"⑶R"是根据Kabat的定义，即基于序列比较所确定的一个⑶R。
[0196] 本文所用术语"框架（FR)氨基酸残基"，指在Ig链框架区的氨基酸。本文所用的 术语"构架区"或"FR区"，包含的氨基酸残基：是可变区的一部分，但不是CDR(例如，根据 Kabat定义的⑶Rs)的一部分。因此，可变区框架长度约为100-120个氨基酸之间，但它仅 包括⑶R外的那些氨基酸。
[0197] 本文所用术语"特异性结合"，指抗体或其抗原结合片段结合抗原的能力表示为 平衡解离常数（Kd)，至少约IX10 - 6M,IX10_7M，IX10_8M，IX10_9M，IX10_1QM，IX10_nM，IXKT12M,或者更高。该术语也包括指：抗体或其抗原结合片段结合所述抗原的亲和力至少 在非特异性抗原的两倍以上。应当理解，然而，抗体或其抗原结合片段能够特异性结合两个 或更多的抗原，这些抗原与序列相关（例如，胰激肽或脱-ArglO-胰激肽和小鼠胰激肽或 脱-ArglO-胰激肽）。
[0198] 本文所用术语"抗原"，指被抗体或其抗原结合片段识别的结合位点或表位。
[0199] 本文所用术语"载体"，意指一个可以转运与其相连的另一个核酸分子的核酸分 子。一种类型的载体是"质粒"，指的是可以把另外的DNA片段连接到它上边的环状双链DNA 环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些 载体可以在它们所导入的宿主细胞中自主复制（例如，具有复制原点的细菌性载体和附加 型哺乳动物载体）。其他载体（例如，非附加型哺乳动物载体）导入宿主细胞时可以被整 合到宿主细胞的基因组中，因而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们 可操作连接的基因的表达。此类载体，在本文中称为"重组表达载体"（或简称为"表达载 体"）。一般来说，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒。术语"质粒"和"载体"可以 互换使用。然而，本发明也意图包括此类其他形式的表达载体，如病毒载体（例如复制缺陷 型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒），它们可以发挥与质粒等效的功能。
[0200] 本文所用术语"宿主细胞"，意指导入了重组表达载体的细胞。但是应当理解的是， 这个术语不仅意指特定的主细胞，还指这种细胞的子代。因为在随后的传代中由于突变或 环境影响可以发生某些修饰，此种后代细胞实际上不等同于亲本细胞，但仍包括在本文所 用术语"宿主细胞"的范围之内。
[0201] 本文所用术语"治疗"（〃treat〃），"治疗"（"treating")和"治疗"（"treatment") 是指本文所述的治疗性或预防性措施。"治疗" ("treatment")的方法采用给具有胰激肽或 脱-ArglO-胰激肽相关的疾病或失调（例如炎性疾病）或倾向于患这类疾病或失调的受试 者施用本发明的抗体或其抗原结合片段，来预防，治愈，延迟该疾病或失调、或复发性疾病 或失调，降低其严重程度，或改善其一种或多种症状，或延长受试者在无此类治疗情况下预 期的存活期。
[0202] 本文所用术语"胰激肽或脱-ArglO-胰激肽相关疾病或失调"，包括疾病状态和/ 或疾病状态相关症状，在其发现胰激肽或脱-ArglO-胰激肽水平或活性变化。示例性胰激 肽或脱-ArglO-胰激肽相关疾病或失调包括，但不限于，疼痛和纤维化。
[0203] 本文所用术语"有效量"，指施用与受试者时，结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽的 抗体或其抗原结合片段的量，足以对如本文所述的胰激肽或脱-ArglO-胰激肽相关疾病或 失调，产生治疗，预防或诊断的效果。治疗有效量根据受试者和用于治疗的疾病情况，受 试者体重和年龄，疾病状况的严重程度，给药方式等不同而变化，可由本领域普通技术人 员容易地确定。本发明所述抗体或其抗原结合片段的施用剂量范围，例如，从约Ing到约 10,OOOmg,约Iug到约5,OOOmg,约Img到约1，OOOmg,约IOmg到约100mg。剂量方案可进 行调整以提供最佳治疗反应。有效量也指抗体或其抗原结合片段的毒性或有害作用（即副 作用）最小或受益效果更明显时的量。
[0204] 本文所使用术语"受试者"，包括任何人或非人类动物。
[0205] 本文所用术语"表位"，指抗原决定簇，其可与被称为互补位的抗体分子的可变区 特异性的抗原结合位点相互作用。一个单一的抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同 的抗体可结合到一个抗原上不同的区域，并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象 的或线性的。构象表位是由线性多肽链上不同片段在空间上靠近的氨基酸所产生的。线性 表位是由多肽链的相邻氨基酸残基产生的。
[0206] 这里应当注意的是，本说明书和所附权利要求书中所用单数形式〃a，〃〃an，〃及 "the〃包括相关复数，除非上下文另有明确说明。
[0207] II.抗胰激肽或脱-ArglO-胰激肽抗体
[0208] -方面，本发明提供抗体或其片段，可以特异性结合胰激肽和脱-ArglO-胰激肽。 本发明的示例性的抗体的VH，VL和CDR列于表1
[0209] 表1.代表性抗胰激肽或脱-ArglO-胰激肽抗体的VH，VL和⑶R氨基酸序列
[0210]
【权利要求】
1. 一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其： a) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽； b) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，KD值小于lxlO^M ; c) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，K#小于1 X 10Y1 ;和/或 d) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽并抑制其结合缓激肽B1受体。
2. 前述任一权利要求所述抗体或其抗原结合片段，结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽的 N-末端赖氨酸残基。
3. 前述任一权利要求所述抗体或抗原结合片段，抑制胰激肽或脱-ArglO-胰激肽结合 缓激肽-1受:体。
4. 前述权利要求所述抗体或其抗原结合片段，特异性结合小鼠胰激肽样肽（KLP)。
5. 前述任一权利要求所述抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，该重链可变区 包含选自下组的HCDR3氨基酸序列： a) SEQ ID NOJKJ X2X3D X4HAM X5Y]，其中 父2是1?，0，八，V，L，I，M，F，Y 或 W， 乂3是丫，卩，1或11， 乂4是0，￡或￥，和， X5是D或E ; b) SEQ ID NOASD^EYDGXJXALDXJ，其中 Xi是W或F X2是N或无氨基酸； 父4是0或P，和 X5是F或Y ; c) SEQ ID NO ：13 ； d) SEQ ID NO ：32 ； e) SEQ ID NO ：40 ； f) SEQ ID NO :47 ;和 g) SEQ ID NO ：55 〇
6. 前述任一权利要求所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的HCDR2氨基 酸序列： a) SEQ ID NOAEYFXiPXWGNTGYNQKFRG]，其中 V，L，I，M，F，Y 或 W，和 b) SEQ ID NOAdDWXiDPENGDXJJAPKFQG]，其中 父1是1或乂， &是1'或5，和 X3为G或D ; c) SEQ ID NO ：14 d) SEQ ID NO ：33 ； e) SEQ ID NO ：41 ； f) SEQ ID NO :48 ;和 g) SEQ ID NO ：56 〇
7. 前述任一权利要求所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的HCDR1氨基 酸序列： a) SEQ ID NO :9 [GYSFTDYXJY]，其中 Xi 为 N，W 或 Y ; b) SEQ ID NO :65 [GFNIKDYYX^]，其中 Xi 是 L，或 M ; c) SEQ ID NO ：15 ； d) SEQ ID NO ：34 ； e) SEQ ID NO ：42 ； f) SEQ ID NO :49 ;和 g) SEQ ID NO :57。
8. 前述任一权利要求所述抗体或其抗原结合片段，进一步包括轻链可变区，该轻链可 变区包含选自下组的LCDR3氨基酸序列： a) SEQ ID N0:10[QQ X&S X3P X4T]，其中 父2是丫，？，11或1， X4 是 W，Y，F，H 或 L: b) SEQ ID NOAetQXAXsSX^XJ]，其中 Xi是Q或N， 父2是丫，卩，0或11， 乂4是￥，？，1'或11，和 父5是1，丫，？，11或1; c) SEQ ID NO :69 [XiQGTHFPYT]，其中 Xi 为 L 或 M ; d) SEQ ID NO :16 ; e) SEQ ID NO :35 ; f) SEQ ID NO ：43 ； g) SEQ ID NO :50 ;和 h) SEQ ID NO :58。
9. 前述任一权利要求所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的LCDR2氨基 酸序列： a) SEQ ID NOdUMSTRXj，其中 X :是已』』或N; b) SEQ ID NOjTD^ASTRXj，其中 Xi是1或G，和 父2是￡，0,〇或心 c) SEQ ID NO ：17 ； d) SEQ ID NO ：36 ； e) SEQ ID NO :51 ;和 f) SEQ ID NO ：59 〇
10. 前述任一权利要求所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含从下组中选出的 IXDR1氨基酸序列： a) SEQ ID N0:12[KSSQSLL XfSNQKN X2LA]，其中 X :是^札丫或F，和 X 2是11或Y; b) SEQ ID NOASKSSQSLLXASXsQXJXsLA]，其中 父1是1，11，￥或卩， X 2是S或G， X3是N或D， X 4是K或R， X 5是11或Y。 c) SEQ ID NO :70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中 Xi 为 K 或 E ; b) SEQ ID NO ：18 ； c) SEQ ID NO ：37 ； d) SEQ ID NO ：44 ； e) SEQ ID NO :52 ;和 f) SEQ ID NO :60。
11. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，该轻链可变区 含有选自下组的IXDR3氨基酸序列： a) SEQ ID N0:10[QQ X&S X3P X4T]，其中 父2是丫，？，11或1， X4 是 W，Y，F，H 或 L: b) SEQ ID NOAetQXAXsSX^XJ]，其中 Xi是Q或N， 父2是丫，卩，0或11， 乂4是￥，？，1'或11，和 父5是1，丫，？，11或1; c) SEQ ID NO :69 [XiQGTHFPYT]，其中 Xi 为 L 或 M ; d) SEQ ID NO :16 ; e) SEQ ID NO :35 ; f) SEQ ID NO ：43 ； g) SEQ ID NO :50 ;和 h) SEQ ID NO :58。
12. 权利要求11所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的LCDR2氨基酸序 列： a) SEQ ID NOdUWASTRXj，其中 X :是已』』或N; b) SEQ ID N0:67[X2ASTRX2]，其中 Xi是1或G，和 父2是￡，0,〇或心 c) SEQ ID NO ：17 ； d) SEQ ID NO ：36 ； e) SEQ ID NO :51 ;和 f) SEQ ID NO ：59 〇
13. 权利要求12所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的LCDR1氨基酸序 列： a) SEQ ID NOdSKSSQSLLXiSSNQKN X2LA]，其中 X :是^札丫或F，和 X 2是11或Y; b) SEQ ID NOASKSSQSLLXASXsQXJXsLA]，其中 父1是1，11，￥或卩， X 2是S或G， X3是N或D， X 4是K或R， X 5是11或Y。 c) SEQ ID NO :70 [KSSQSLLYSNGXJYLN]，其中 Xi 为 K 或 E ; b) SEQ ID NO ：18 ； c) SEQ ID NO ：37 ； d) SEQ ID NO ：44 ； e) SEQ ID NO :52 ;和 f) SEQ ID NO :60。
14. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，该重链可变区 含有HCDR3, HCDR2和HCDR1区，HCDR3, HCDR2和HCDR1区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 13, 14,和15所示，且根据Kabat，有一个或多个选自下列位点的氨基酸取代：H1，H5, H9， Hll，H12, H16, H38, H40, H41，H43, H44, H66, H75, H79, H81，H82A，H83, H87,和 H108。
15. 权利要求14所述抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区，该轻链可变 区含有LCDR3, LCDR2和LCDR1区，LCDR3, LCDR2和LCDR1区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 16, 17,和18所示，且根据Kabat，有一个或多个选自下列位点的氨基酸取代：L5, L9, L15， L18, L19, L21，L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 和 L104。
16. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，该轻链可变区 含有LCDR3, LCDR2和LCDR1区，LCDR3, LCDR2和LCDR1区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 16, 17,和18所示，且根据Kabat，有一个或多个选自下列氨基酸位点的取代：L5, L9, L15， L18, L19, L21，L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 和 L104。
17. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含一个重链可变区氨基酸序 列，该序列与包含3￡0 1〇勵8:19,20,21，22,24,25,38,45,53，和61的组的任何序列具有 至少90 % -致性。
18. 权利要求17所述抗体或其抗原结合片段，其进一步包含一个轻链可变区氨基酸序 列，该序列与包含SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的组中任何序列具 有至少90 % -致性。
19. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含一个轻链可变区氨基酸序 列，该序列与包含SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和62的组中的任何序列 具有至少90 % -致性。
20. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含一个重链可变区氨基酸序 列，其选自包含 SEQ ID NOs :19,20,21，22,24,25,38,45,53，和61的组。
21. 权利要求20所述抗体或其抗原结合片段，其进一步包含一个轻链可变结构域氨区 基酸序列，其选自包含 SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和 62 的组。
22. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含的氨基酸序列选自包含SEQ ID NOs :26, 27, 28, 29, 29, 30, 31，39,46, 54,和 62 的组。
23. 权利要求1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含的重链和轻链可变区氨基 酸序列分别如 SEQ ID NO :19 和 26，SEQ ID NO :20 和 27 ;SEQ ID NO :21 和 28 ;SEQ ID NO : 22 和 28 ;SEQ ID NO :23 和 29 ;SEQ ID NO :24 和 30 ;SEQ ID NO :25 和 31 ;SEQ ID NO :38 和 39 ;SEQ ID NO :45 和 46, SEQ ID NO :53 和 54,或 SEQ ID NO :61 和 62 所示。
24. -种抗体或其抗原结合片段，可特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，其中所述 抗体或其抗原结合片段，与含重链和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO :19和26, SEQ ID NO :38 和 39, SEQ ID NO :45 和 46, SEQ ID NO :53 和 54,或 SEQ ID NO :61 和 62 所示的 抗体，竞争性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽。
25. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，与前述任一权利要求所述的抗体竞争 性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，并且不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽。
26. -种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，可特异性结合胰激肽（KD)或 脱-ArglO-胰激肽（DAKD)的一个构象表位，其中KD或DAKD采用一个包括在4位脯氨酸II 型紧密转角的Pro4结节构象。
27. 权利要求26所述抗体或抗原结合片段，其中KD或DAKD的Pro 4的结节构象还包 括一个S形的氨基酸重复，其将氨基酸链的疏水性侧链排成空间堆积模式。
28. 权利要求26或27所述的抗体或抗原结合片段，其 (a) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽； (b) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，KD值小于lXl〇-1QM ; (c) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽，K#小于1 X 10Y1 ;和/或 (d) 特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽并抑制其结合缓激肽B1受体。
29. 前述任一权利要求所述的抗体，结合至一种诊断性或治疗性试剂。
30. -种分离的核酸，其编码前述任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段的氨基 酸序列。
31. -种重组表达载体，其包含权利要求30所述的核酸。
32. -种宿主细胞，其包含权利要求31所述的重组表达载体。
33. -种生产可特异结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽的抗体的方法，包括：在可让宿主 细胞产生一种特异性结合胰激肽或脱-ArglO-胰激肽的抗体的条件下培养权利要求32所 述的宿主细胞。
34. -种药物组合物，其包含权利要求1-28任一所述抗体或其抗原结合片段，及一种 或多种药学上可接受的载体。
35. -种用于治疗胰激肽或脱-ArglO-胰激肽相关的疾病或失调的方法，包括给需要 的受试者施用权利要求34所述的药物组合物。
36. 权利要求35所述的方法，其中所述疾病或失调是慢性疼痛。
37. -种产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽和脱-ArglO-胰激肽样肽的抗体的方法，包 括：用包含肽的免疫原免疫动物，其中所述肽含有如SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列，并且 其中所述肽的氨基末端的精氨酸通过连接体被间接偶联到一个载体基团上，这样，动物的 免疫系统可产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽，脱-ArglO-胰激肽和脱-ArglO-胰激肽样肽 的抗体。
38. 权利要求37所述的方法，进一步包括从所述动物中，分离抗体，分离编码该抗体的 核酸，或表达该抗体的免疫细胞。
39. 权利要求37所述的方法，其中所述载体基团是蛋白质。
40. 权利要求39所述的方法，其中所述蛋白质是匙孔血蓝蛋白（KLH)。
41. 权利要求40所述的方法，其中所述连接体基团包含：[Gly-Gly-Gly]n，其中n至少 为1。
【文档编号】C07K16/26GK104334578SQ201380027405
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年3月28日
【发明者】H·李, D·科米诺斯, J·张, A·普里斯克, M·达文森, N·鲍林, G·萨布拉马尼安, X·陈 申请人:赛诺菲