在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其鉴定方法【专利摘要】本发明提供了组合物，其可作为用于创建极为稳定且可溶的单链Fv抗体片段的构架。这些构架经胞内性能选择，因而可理想地适用于创建scFv抗体片段或scFv抗体文库，以用于其中稳定性和可溶性为抗体片段性能的限制因素的应用，例如在细胞的还原环境中。此类构架也可用于鉴定表现出增强的可溶性和稳定性的高度保守残基及共有序列。【专利说明】在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其鉴定方法[0001]本申请是分案申请，其直接母案申请是申请号为201010575786.1、申请日为2003年5月21日的同名发明专利申请；其原始母案申请是申请号为03814626.6、申请日为2003年5月21日的同名发明专利申请。发明领域[0002]本发明涉及蛋白质化学、分子生物学以及免疫学。[0003]相关【
技术领域：
】背景[0004]抗体能以高度的特异性和亲和力识别并靶向几乎任何分子。这个特点已被开发，以便将这些天然蛋白转变为用于诊断和治疗应用的强有力的工具。重组DNA技术的进展已推动了抗体基因在广泛种类的非淋巴细胞中的操作、克隆和表达(Skerra,1988;Martineau，1998;Verma，1998)。已经构建了许多不同的抗体片段，以便最佳地满足各种应用。保留整个母体免疫球蛋白全部抗原结合能力的最小实体是单链Fv片段(scFv)(Bird,1988)。该抗体片段包含由柔性肽接头连接起来的重链和轻链可变区，这使得该蛋白能够由单个基因表达。[0005]抗体片段较之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的优势。由于分子小，它们在多种表达宿主细胞如大肠杆菌细胞中的表达得以易化、且产量得以提高(Pliickthun,1996)。而且,抗体片段允许在体内应用中改善肿瘤穿透力(Yokota,1992),并且它们能够与多种用于治疗途径的效应分子共价连接。[0006]天然存在的抗体是由浆细胞分泌的，已进化至能够在胞外氧化环境中行使功能。为获得其功能性折叠结构，它们通常需要在不同结构域内形成二硫键，这对于免疫球蛋白折叠是至关重要的。与全长抗体形成对照，scFv或Fab抗体片段原则上能够在任何细胞内部的还原环境中功能性地表达，并定向到任何区室，以靶向胞内蛋白，从而引发特定的生物学效应(Biocca,1991)。的确`,有些称之为内体(intrabodies)的胞内单链抗体片段，已被成功地用于调节不同的生物系统中胞内靶蛋白的功能。从而，针对病毒侵染的抗性已在植物生物技术中得到展示(Tavladoraki,1993;Benvenuto,1995),内体与HIV蛋白的结合业已证明(Rondon,1997),并且与癌基因产物的结合(Biocca,1993;Cochet,1998;Lener,2000)也已有描述。而且胞内抗体在表征目前通过人类基因组测序鉴定到的大量基因的功能方面有希望成为有价值的工具(Richardson,1995;Marasco,1997)。例如，它们可在功能基因组途径中用于封闭或调节新近鉴定的蛋白的活性，由此促成对其功能的了解。最后，内体具有诊断和治疗应用的潜力，例如在基因治疗环境中。[0007]尽管存在极大的前景，功能性内体的产生仍然受限于其不稳定性和不可溶性或者聚集的倾向。胞浆的还原环境防止形成保守的链内二硫桥，从而使得高百分比的抗体片段不稳定，因此在细胞内无功能(Biocca,1995;Proba,1997)。抗体片段的稳定性和可溶性因此构成了内体在体内作为潜在的蛋白功能调解剂的应用的主要障碍。迄今为止，尚不可预言使得抗体片段在胞内环境中具备功能的序列要求。[0008]因此，急需在广范围的不同细胞类型中性能良好的抗体片段，从而可作为用于多种结合特异性的构架。此类构架可用于构建用于胞内筛选的文库，或者可作为既有抗体结合部分的受体。[0009]除了独特地满足胞内应用之外，在众多的胞外和体外应用中，基于极为稳定的可变结构域构架的此类抗体片段或完整抗体相比于其它抗体也具有独特的优势。当此类构架在氧化环境中产生时，其二硫桥能够形成，进一步增强其稳定性，并使得它们高度抵抗聚集和蛋白酶降解。体内半衰期(及针对聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了亲和力和特异性之外的、使抗体在治疗或诊断应用中成功的唯一最为重要的因素(Willuda，1999)。抗体片段的半衰期可通过共价连接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而进一步得以提高(Weir,2002)。这类稳定分子代表了抗体应用的显著进步，尤其但并不仅当不期望Fc功能时。[0010]抗体片段文库极大的实践重要性激发了该领域的研究。Winter(EP0368684)提供了抗体可变区基因的初始克隆和表达。由这些基因出发，他建立了在互补决定区(CDR)以及构架区具有高度多样性的巨大抗体文库。不过，Winter未披露不同构架用于文库构建的用途。[0011]另一方面，Pliickthun(EP0859841)教导试图通过将构架限于有限数目的合成共有序列而改进文库设计。包括引入大量合理设计的突变的蛋白质工程的努力以前就提示针对相应共有序列的突变是提高分离的可变免疫球蛋白结构域稳定性的合适手段(Ohage1999;Ohage1999以及US5，854，027，特此并入作为参考)。[0012]Pliickthun(EP0859841)公开了基于这些共有序列进一步优化结合亲和力的方法。Pliickthun专利也承认正在发生着的有关抗体的知识的增长，因此意欲包括此类文库设计的远景发现。然而，未建议合成共有构架可能的进一步改善。[0013]因而Winter、Pliickthun及他人(如Soderlind,WO0175091)的教导试图以CDR·的高度多样性为焦点建立巨大的抗体文库，用于选择并在氧化条件下应用所选scFv。然而，所有这些文库未进行胞内应用优化，因而不能用于还原环境或对所表达的抗体片段的稳定性和可溶性提出特殊要求的其它条件下的选择和应用。[0014]抗体片段在还原环境如原核和真核细胞的胞浆中表现良好所需的性质尚不清楚。因此胞内抗体或“内体”的应用目前受限于其在还原条件下(可影响其稳定性和可溶性能)不可预测的行为(Biocca,1995;Worn,2000)。现有专利申请(EP1040201、EP1166121和W00200729)及出版物(Visintin，1999)涉及以筛选技术为焦点的内体的胞内筛选，但是未公开在真核细胞特别是酵母中有功能、从而可用于本上下文的文库构建的具体抗体序列。[0015]Visintin和Tse独立地描述了所谓的胞内共有序列(ICS)的分离(Visintin，2002;Tse，2002)。该序列来自于已从酵母抗原-抗体相互作用筛选中分离出的许多序列。然而，由于现有噬菌体展示选择，胞内筛选的输入是有严重偏差的。因而，在Visintin等的例子中，只有一个输入序列属于VH3亚群。公开的共有序列ICS与由Knappik(2000)和EP0859841描述的人类VH3亚群的共有序列完全相同。ICS的62个氨基酸中的60个也与由Steipe以构建具有增强的稳定性的可变结构域为基础而提出的一般人类VH-结构域共有序列相同(美国专利号N0.6，262，238，特此并入作为参考)。这些工作依次建立在早期的序列收集(即Kabat,1991)和可变结构域亚群及结构决定簇的定义(Tomlinson,1992;Williams,1996;Chothia,1989和Chothia,1987)的基础上。然而，由于所述内体选择的输入是有严重偏差的(即在Visintin等例子中，只有一个VH结构域为VH3)，由胞内筛选分离VH3序列并不是特别令人惊讶。由于其输入文库的严重偏差，Tse等和Visintin等的工作未能提供对人类可变结构域所有组成部分的全面评价，而这将会由无偏差的查询提供，并且这是鉴定存在于人类所有组成部分中的有用内体构架所必需的。[0016]我们以前曾描述过不依赖于其抗体-结合特异性而允许在酵母中选择稳定且可溶的内体的系统(AufderMaur(2001),WOO148017)。这个途径允许有效地筛选scFv文库和分离特定构架，它们在酵母细胞的还原环境中是稳定且可溶的。目的仍然是实际分离构架序列，并且使用的模式是，第一步中预测何种序列类型将会在还原环境中最稳定，而第二步中通过分析、重组以及进一步的体内和体外实验鉴定最佳序列。[0017]发明的简要概述[0018]本发明填补了抗体产生领域缺失的环节。它提供了就稳定性和可溶性而言具有优异特性的抗体可变结构域构架序列。这些对许多相关应用，例如在诊断、治疗或研究中是关键特点。这些构架可用于移植既有的结合特异性或者用于产生具有高稳定性和可溶性的抗体文库。[0019]ScFv文库被用来分离在酵母细胞的还原环境中稳定且可溶的构架。分离构架的性能随后在人类细胞系和体外实验中表征。所述构架可直接作为既有结合特异性的受体主链，或者通过一个或多个高变环的随机化构建CDR文库用于还原或其它挑战性的环境。分离的可变结构域序列进一步通过对比进行分析，以鉴定优选的序列家族。从那些优选的可变结构域序列家族中，根据结构分析选择最佳序列，该结构分析可排除含干扰免疫球蛋白折叠的构架残基的序列。鉴定的可变结构域序列候选物随后以所有可能的变化重组，并通过分析其在酵母、哺乳动物细胞和体外的性能挑选最佳的轻链和重链可变结构域组合。[0020]这些优化的scFv及组成它们的可变结构域构架，以及其它抗体片段或由其衍生的全抗体，举例来说，可理想地作为既有结合特异性的受体主链，或通过一个或多个高变环的随机化构建CDR文库用于还原或其它挑战性的环境。适于胞内应用的抗体从定义上来讲更为稳定且可溶。从而，它们在胞内环境外界的应用中的用途也将具有优势。[0021]本发明提供了包括抗体可变结构域构架和单链Fv抗体(ScFv)片段的组合物，其可掺入到多种抗体片段或全抗体中。提供了最稳定且可溶种类的抗体可变结构域片段，因而最适于胞内应用。也提供了在胞内测定中表现出最高性能的抗体可变结构域和scFv抗体片段的具体构架序列。本发明也提供了抗体可变结构域和scFv片段中轻链和重链可变结构域的人造组合的具体构架序列，举例来说，它们可最理想地用于胞内应用，并且就稳定性和可溶性而言在体外表现出最佳性能。[0022]本发明提供具有如下通式结构的单链构架试剂:[0023]NH2-VL-接头-VH-COOH或[0024]NH2-VH-接头-VL-C00H。[0025]在本发明的另一个实施方案中，所述单链构架可融合于第二蛋白成分，以产生具有如下通式结构的融合构建体:[0026]NH2-VL-接头-VH-第二蛋白-C00H[0027]NH2-第二蛋白-VL-接头-VH-COOH[0028]这些融合构建体中VH和VL区的取向可以颠倒。[0029]在本发明的另一个实施方案中，可变结构域可掺入到Fab片段中，其可融合于第二蛋白成分，以产生具有如下通式结构的融合构建体:[0030]NH2-VH-CH-第二蛋白-C00H及NH2-VL-CL-C00H[0031]第二蛋白可融合于重链或轻链的N-端或C-端。[0032]在优选的实施方案中，单链或Fab构架融合构建体的第二蛋白是直接或通过转录激活为胞内测定提供读出的蛋白。[0033]本发明的另一个目的是提供抗体可变结构域的构架类型以及可变结构域和scFv序列，举例来说，它们适于从既有抗体上移植高变环，以便获得在还原或者其它挑战性环境中具有功能的抗体。[0034]本发明的另一个目的是提供抗体可变结构域的构架类型以及可变结构域和scFv序列，举例来说，通过随机化此类构架的一个或多个高变环，它们适于建立文库用在还原或者其它挑战性环境中。[0035]本发明的另一个目的是所公开的序列在鉴定保守残基和共有序列中的应用。[0036]因利用所公开的构架而得的抗体或抗体片段可用作靶确认以及人类、动物和植物疾病的治疗、预防和诊断中的试剂。所述抗体可以蛋白或编码该蛋白的DNA的形式应用，而且不限于胞内应用。[0037]附图简述[0038]图1显示了在啤酒糖酵母中进行质控筛选后的胞内性能。图1显示了通过IacZ表达的激活而测定的典型的酵母中`的“质控”筛选(例如参见实施例1)。在若干不同的筛选中鉴定到所选的阳性菌落(黑色)，并且阳性菌落的相应序列可见于图12和13。所选序列与阳性对照极为稳定的λ-移植物(深灰)进行了比较。[0039]图2显示了在哺乳动物Hela细胞系中所选构架的胞内性能。图2显示了通过与极为稳定的λ-移植物(深灰)相比的由荧光素酶表达的激活而测定的由典型的酵母“质控”筛选分离的构架(黑色)在人类细胞系Hela中的性能。阳性对照Gal4-VP16(白色)给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。[0040]图3显示了在啤酒糖酵母中新构架的胞内性能。图3显示了在酵母中通过IacZ表达的激活而测定的优良构架组合的体内性能。构架序列(黑色)与阳性对照(极为稳定的λ-移植物(深灰))进行了比较。构架的编号如图16所述。[0041]图4显示了新构架在Hela细胞系中的胞内性能。图4显示了在人类细胞系Hela中通过荧光素酶表达的激活而测定的优良构架组合的体内性能，并通过与极为稳定的λ-移植物(深灰)的比较进行图解说明。阳性对照Gal4-VP16(白色)给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。[0042]图5显示了在啤酒糖酵母的细胞质中可溶性表达产物。图5显示了通过酵母菌株酿酒酵母(S.cerevisiae)JPY9胞衆中产生的可溶蛋白的量测定的优良构架组合的体内性倉泛。[0043]图6显示了在E.coli中的表达行为。图6显示了所选构架组合在大肠杆菌(E.coli)周质中的表达行为。箭头标示对应于这些scFv构架的条带位置。[0044]图7显示了所选构架在不同哺乳动物细胞系中的胞内性能。图7显示了在三种人类细胞系(Hela(黑色)、Saos-2(深灰)及HEK293(白色))中通过荧光素酶表达的激活而测定的所选优良构架组合的体内性能，并通过与极为稳定的λ-移植物的比较进行图解说明。阳性对照Gal4-VP16给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。[0045]图8显示了在37°C对聚集的抗性。图8代表如在PBS-缓冲液中所示的通过温育前后存在的单体蛋白的量而定量的所选构架组合在37°C对聚集的抗性。图表A代表构架2.4和5.2，而图表B代表构架4.4,6.4和7.3。[0046]图9显示了在人血清中对聚集和蛋白酶降解的抗性。图9代表通过延长温育前后存在的可溶性全长蛋白的量而定量的所选构架组合在37°C人类血清中对蛋白酶降解聚集的抗性。[0047]图10显示了在酵母相互作用测定中通过IacZ表达的激活而测定的两个所选结合物对Fab-环境下新构架7.3的性能。Fab-链的表达始于位于ars/cen或2微米载体之上的双向半乳糖诱导型启动子。所述Fab载体的表达产生抗体轻链和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白。结合物定向于人类球样激酶l(hPLKl)。与该靶的结合和与无关抗原的非特异性结合以及未随机化的构架7.3的结合进行了比较。注意作为参照包括在内的相应scFv是由肌动蛋白启动子(2微米)表达的。[0048]图11显示了通过酵母菌株JPY9胞浆中产生的可溶蛋白的量测定的所述scFv构架在Fab-环境下的体内性能。Gal4-AD-scFv融合子(肌动蛋白/2微米)的表达与相应的Fab-构建体的表达并与作为Fab的母体构架7.3进行了比较，两者均来自两个不同的载体(Gal-诱导型、ars/cen和2微米)。Fab载体的表达产生抗体轻链和VH-CHl-Gal4_AD融合蛋白，它在该印迹中检测。[0049]图12显示了所选VH结构域序列的对比。图12显示了由多种酵母“质控”筛选挑选出的所有VH-结构域构架序列的对比。[0050]图13显示了所选VL结构域序列的对比。图13显示了由多种酵母“质控”筛选挑选出的所有VL-结构域构架序列的对比。[0051]图14显示了随机文库成员的对比。图14显示了从文库中随机挑取的序列的对比。[0052]图15显示了在质控系统中所选的性能良好的构架的亚类的统计分析(占全部所选序列的百分比)。图15显示了由“质控”系统分离到的序列中VH-和VL-结构域亚类频率的统计分析。只考虑随后在定量酵母测定中发现是阳性的那些序列。所选序列与由有限数目的随机序列(图14)确定的未选文库进行了比较。[0053]图16显示了用于进一步重组和评价最佳scFv组合的序列以及它们各自的缩写(abb.)、来源和亚家族。[0054]发明详述[0055]除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属【
技术领域：
】的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于实施或检验本发明，合适的方法和材料还是描述于下文。特此将文中提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献全文并入作为参考。如有冲突，将以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅用于举例说明，而并非旨在限制。[0056]如本文所用，“同一性”是指两多肽、分子或两核酸之间的序列相似性。当两相比序列的某位置都被同一碱基或氨基酸单体亚单位占据时(例如，两DNA分子中每一个的某位置都被腺嘌呤占据，或者两多肽中每一个的某位置都赖氨酸占据)，则相应分子在该位置上是一致的。两序列间的“百分比同一性”是两序列共有的匹配位置数目除以比较的位置数目XlOO的函数,例如，如果两序列10个位置中有6个匹配,则这两个序列具有60%的同一性。作为离子，DNA序列CTGACT和CAGGTT享有50%的同源性(总共6个位置上有3个匹配)。一般而言，当两序列比对可得出最大同源性时就进行比较。此类对比可利用例如Needleman等，J.MolBiol.48:443-453(1970)的方法提供,通过计算机程序例如Alignprogram(DNAstar,Inc.)方便地执行。[0057]“相似”序列是那些在比对时享有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似残基是比对的参照序列中相应氨基酸残基的保守取代或者“许可的点突变”。就这点而言，参照序列残基的“保守取代”是被与对应参照残基物理上或功能上类似，如具有相似大小、形状、电荷、化学特性，包括形成共价键或氢键的能力等的残基取代。因而，“保守取代修饰”的序列是与参照序列或野生型序列的差异在于存在一个或多个保守取代或许可的点突变的序列。两序列间的“阳性百分比”是含两序列共有的匹配残基或保守取代的位置数目除以比较的位置数目X100的函数。例如,如果两序列10个位置中有6个匹配,且10个位置中有2个含保守取代，则这两个序列具有80%的阳性同源。[0058]“VH结构域”是指免疫球蛋白分子重链的可变部分。[0059]“VL结构域”是指免疫球蛋白分子轻链的可变部分。[0060]VH或VL“亚型”是指通过如Knappik(2000)中所定义的相应共有序列所定义的亚型。术语“亚家族”或“亚类”作为“亚型”的同义词使用。如本文所用的术语“亚型”是指与代表其亚型的相应共有序列享有高度同一性和相似性的序列。某一可变结构域序列是否属于某“亚型”是通过将该序列与相应结构域的所有已知人类生殖系区段、或者定义的共有序列比对，并随后鉴定最大同源性确定的。确定同源性和通过利用查询矩阵例如BLOSUM(Henikoff1992)对序列分类的方法是本领域技术人员众所周知的。[0061]如本文所用的“氨基酸共有序列”是指氨基酸序列，它可利用至少两个或优选更多比对的氨基酸序列矩阵产生，并且考虑到比对中的空缺，有可能确定各位置上最频繁的氨基酸残基。共有序列是包括了各位置上最频繁表示的氨基酸的序列。如果在单个位置上等同地表示两个或多个氨基酸，则共有序列包括两个或所有那些氨基酸。[0062]蛋白的氨基酸序列可在多种水平分析。例如，保守或变异可表现在单残基水平、多残基水平、具有空缺的多残基水平等。残基可表现出相同残基的保守或者可以在分类的水平上保守。氨基酸分类的实例包括极性但不带电荷的R基团(丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的R基团(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；带负电荷的R基团(谷氨酸和天门冬氨酸)；疏水R基团(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其它分类是本领域技术人员公知的，并且可利用结构决定簇或其它数据定义，以评估可取代性。就该意义而言，可取代氨基酸可以指能够被取代并维持该位置上的功能保守性的任何氨基酸。[0063]如本文所用的“多核苷酸共有序列”是指核苷酸序列，它可利用至少两个或优选更多比对的核酸序列矩阵产生，并且考虑到对比中的空缺，有可能确定各位置上最频繁的核苷酸。共有序列是包括了各位置上最频繁表示的核苷酸的序列。如果在单个位置上等同地表示两个或多个核苷酸，则共有序列包括两个或所有那些核苷酸。[0064]如本文所用的“结构亚-元件”是指蛋白或多肽内与该分子限定的结构或功能部分对应的一段氨基酸残基。这些可以是环(即抗体的CDR环)或者蛋白或多肽内任何其它二级或功能结构(即结构域、α-螺旋、β-片层、抗体构架区等)。结构亚元件可利用相似或同源多肽的已知结构或者通过利用上文提及的比对氨基酸序列的矩阵鉴定。这里各位置上的变异是确定属于某一结构亚元件(如抗体高变区)的一段氨基酸残基的基础。[0065]如本文所用的“亚序列”是指编码至少一个结构亚元件的基因模块。它未必一定与结构亚元件相同。[0066]如本文所用的“抗体⑶R”是指抗体的互补决定区，其由如Kabat等(1991)所定义的抗原结合环组成。例如，抗体Fv片段的两可变结构域中的每一个都含3个CDR。[0067]如本文所用的“抗体”是“免疫球蛋白”的同义词。根据本发明的抗体可以是完整免疫球蛋白或其片段，包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单可变结构域，Fv(Skerra,1988)、scFv(Bird,1988;Huston,1988)、Fab、(Fab')2或本领域技术人员众所周知的其它片段。[0068]如本文所用的“抗体构架”是指可变结构域VL或VH的一部分，它起着该可变结构域抗原结合环的支架的作用(Kabat等，1991)。[0069]合理设计的scFv片段已证明了scFv片段的热动力学稳定性与其体内性能之间清楚的关联(Wdrn，2000;AufderMaur,2001)0利用最近研发的命名为“质控”的系统(AufderMaur,2001),已分离到适于胞内应用的特定抗体可变结构域构架序列(图12和13)、描述了特征(图1和2)并进一步改善(图3至9及图14)。如同我们以前的实验中所观察到的那样，在胞内测定中所选的性能良好的构架表现出高的体外稳定性，如通过其37°C抗聚集和蛋白酶降解所证明的那样(图8和9)。而且，形成了允许在更广基础上根据其构架亚家族(图15)选择用于胞内应用的构架的模式。文中公开了可用于胞内应用的特定抗体可变结构域，还有通用模式。一方面，这允许利用这些序列作为移植实验的构架供体以获得保留了环供体的结合特异性的功能性内体。另外，可利用公开的序列作为构架构建抗体文库。此类文库适用于还原条件下的胞内选择系统，例如原核和真核细胞系统。另外，所公开的序列可用于鉴定例如保守序列或残基或基序。结构亚元件的移植，例如抗体结合环的移植(如Jung,1997)，还有抗体或其片段文库的制备(如Vaughan,1996;Knappik,2000)已有详细描述，并且是本领域技术人员众所周知的。[0070]由于胞内应用将抗体片段暴露于极为不利的条件下(即升高的温度、还原环境)，而本发明公开的序列获得了使之抵抗最不利条件的特点。因此，当与“普通”序列相比时，这里公开的序列具有出色的稳定性和可溶性，如通过其对聚集和蛋白酶降解的抗性所证明的那样(图8和9)。这些特点，连同其优良的表达产率，使得所公开的抗体构架序列独特地不仅适于胞内应用，而且尤其适于所有其中极需关注长半衰期、耐用性和制备的容易性的治疗和诊断应用。[0071]本发明使得可能设计包括至少抗体的可变部分、可用于还原或其它挑战性环境下的应用的多肽序列。在第一实施方案中，本发明提供了可用于胞内应用的抗体构架序列集合(图12和13)。在第一步中，利用酵母质控系统不依赖于结合亲和力地筛选多种序列的文库。分离的序列可在酵母和哺乳动物细胞中评价其胞内性能(图1和2)。[0072]在本发明的一个实施方案中，对分离序列的集合通过比对进行分析，以鉴定抗体可变结构域亚类和适用于胞内应用的共有序列。[0073]在本发明另一优选的实施方案中，对上述抗体构架序列的集合进一步通过相互比对和亚家族分类进行分析。属于一个亚型的所有构架就其在酵母和在哺乳动物细胞中的胞内性能进行比较(图1和2，作为实例)，并就其氨基酸序列中相对于各亚型共有序列所发生的阴性、中性或阳性交换进行比较。本领域技术人员能够根据免疫球蛋白结构域中特定交换残基的结构环境区别阳性、中性和阴性变化。随后，选择表现出最佳胞内性能的可变抗体结构域构架序列，并且其与相应亚型共有序列相比没有阴性交换。优选地，挑选进一步含有据认为是阳性氨基酸交换的序列。[0074]在另一优选的实施方案中，所选的重链和轻链抗体可变结构域随后以所有可能的组合重组为scFv片段，以鉴定具有最高稳定性和可溶性的组合。为了这个目的，对新的重组scFv片段进行有关在酵母(图3)和在哺乳动物细胞系(图4和7)的胞内相互作用测定中还原条件下的性能以及有关在酵母中的可溶性胞内表达(图5)的评价。对有希望的组合进一步通过分析大肠杆菌中的周质表达(图6)、升高的温度下对聚集的抗性(图8)以及在人类血清中于37°C延长温育后对聚集和蛋白酶降解的抗性(图9)进行有关氧化条件下的行为的评价。这些数据被用来鉴定最适于胞内或氧化条件下的任何特定应用的scFv构架。[0075]本文公开的所选且优化了的构架序列不仅在胞内应用中，而且在所有可得益于scFv提高的稳定性和/或可溶性的应用中都具有显著的优势。实例有在诊断应用中需要以高浓度长期贮存，以及37°C血清中延长的功能半衰期(例如象治疗应用中所需的那样)。[0076]根据本发明的一个方面，提供了包括具有如下通式结构的单链构架的内体构架:[0077]NH2-VL-接头-VH-COOH;或[0078]NH2-VH-接头-·VL-COOH[0079]其中VH构架为la、Ib或3亚型。[0080]在另一个实施方案中，上述单链构架中VH和VL区的取向颠倒。[0081]根据本发明的一个方面，提供了包括具有如下通式结构的单链构架的内体构架:[0082]NH2-VL-接头-VH-COOH;或[0083]NH2-VH-接头-VL-COOH[0084]其中VH构架为la、Ib或3亚型，且VL构架为λ?、λ3或κI亚型。[0085]在另一个实施方案中，本发明提供了融合于第二蛋白成分的单链构架，以产生具有如下通式结构的融合构建体:[0086]NH2-VL-接头-VH-第二蛋白-C00H;或[0087]NH2-第二蛋白-VL-接头-VH-COOH[0088]其中VH构架为la、Ib或3亚型，且VL构架为λ?、λ3或κI亚型。[0089]在另一个实施方案中，这些融合构建体中VH和VL区的取向可以颠倒。[0090]在另一个实施方案中，可变结构域可掺入到Fab片段中，所述片段可另外融合于第二蛋白成分，以产生具有如下通式结构的融合构建体:[0091]NH2-VH-CH-第二蛋白-C00H和NH2-VL-CL-C00H[0092]所述第二蛋白可融合于重链或轻链的N-端或C-端。[0093]如本文所公开的，胞内应用中存在着对亚型为3及Ia和Ib的VH构架极强的偏好。至于轻链可变结构域(VL)，κI构架在数量上具有清楚的偏好，但λI和3也被富集。因此，这些构架亚型，即与κ1、λ3VL结构域相组合的VHlaUb和3最适合用于胞内应用以及需要scFv折叠性质的其它应用。因此，为了降低还原环境中无功能分子的数量，用于胞内筛选系统的文库应当优选由这些构架亚型的混合物构建。[0094]在优选的实施方案中，本发明抗体片段的VH结构域为la、lb或3亚群。[0095]在优选的实施方案中，本发明抗体片段的VL结构域为κ1、λI或3亚群。[0096]在优选的实施方案中，用作为构架的抗体片段选自如图16所示的1.1,2.1,3.1、4.1,5.1,1.2,2.2,3.2,4.2,5.2,1.3,2.3,3.3,4.3,5.3,7.3,1.4,2.4,3.4,4.4,5.4和6.4。[0097]在本发明的一个实施方案中，至少两个并且优选多个构架被鉴定然后予以分析。当蛋白序列彼此比对时，可建立蛋白序列的数据库。则该比对可用于定义例如在序列和结构排列上(如果该信息可用的话)都表现出高度相似性的残基、亚元件、亚序列或构架序列亚群。[0098]亚元件的长度优选，但并非仅在I个氨基酸(例如酶活性位点中的一个残基或结构决定残基)和150个氨基酸(例如完整蛋白结构域)的范围之内。最优选的是，长度范围在3和25个氨基酸之间，例如最常见于抗体CDR环中的。[0099]在另一个实施方案中，合成了由分析推测的共有核酸序列。这可通过本领域熟练从业人员众所周知的多种方法中的任何一种，例如通过全基因合成或通过以PCR为基础的途径实现。[0100]在另一个实施方案中，所述核酸序列被克隆到载体中。载体可以是测序载体、表达载体或展示(如噬菌体展示)载体，所有这些都是本领域技术人员众所周知的。载体可包含一个核酸序列或在不同或同一操纵子中的两个或多个核酸序列。在最后一种情况下，它们可单独或作为连续的序列克隆。[0101]在一个实施方案中，多肽具有特定物种的模式特征。例如，这可通过由仅仅一个种类的同源蛋白的集合，优选由人类蛋白集合推断共有序列而实现。[0102]本发明另一实施方案涉及通过提供编码如上所述的多肽和附加成分的DNA序列而得的融合蛋白。[0103]在另一实施方案中，本发明提供了核酸序列、含所述核酸序列的载体、含所述载体的宿主细胞以及根据本文所述方法可获得的多肽。[0104]在另一实施方案中，本发明提供了合成或以其它方式在本发明的核酸序列末端安置限制性位点，以使其能够克隆到合适的载体中。[0105]在另一优选的实施方案中，本发明提供了与编码所述多肽的核酸序列相容的载体系统。所述载体包括限制性位点，这将是，举例来说，在该载体系统中独一无二的，并且就掺入到编码所述多肽的核酸序列中的限制性位点而言基本上是唯一的，除了例如该核酸序列克隆到载体中所必需的限制性位点之外。[0106]在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，包括一个或多个核酸序列、重组载体、多肽和根据上述方法的载体，以及例如用于产生所述多肽的合适的宿主细胞。[0107]所有上述本发明的实施方案可利用本领域技术人员公知的分子生物学标准技术完成。[0108]在另一个实施方案中，核酸序列是能够编码本发明的多肽的任何序列。[0109]在另一个实施方案中，本发明的核酸用于基因治疗。[0110]在另一个实施方案中，单链构架是(图16)中1.1,2.1,3.1,4.1,5.1,1.2,2.2、3.2,4.2,5.2,1.3,2.3,3.3,4.3,5.3、7.3,1.4,2.4,3.4,4.4,5.4、6.4任一序列的变体，其中如本文所用的“变体”是指表现出90%或更大的同一性、同时又保持增强的稳定性的序列。[0111]在另一个实施方案中，单链构架是(图16)中1.1,2.1,3.1,4.1,5.1,1.2,2.2、3.2,4.2,5.2,1.3,2.3,3.3,4.3,5.3,7.3,1.4,2.4,3.4,4.4,5.4,6.4任一序列的衍生物，其中如本文所用的“衍生物”是指仅保持了对于该分子功能和稳定性至关重要的那些氨基酸的序列。如实施例3中所述的构架中孤立的中性或阳性交换不被认为是与本发明的抗体构架相关的变化。[0112]在本发明优选的实施方案中，所述单链构架融合于第二蛋白，其中该蛋白为胞内测定提供了读出。所述读出可以是直接的，例如以与可检测的蛋白如可通过荧光观察的GFP(绿色荧光蛋白)、增强的蓝色荧光蛋白、增强的黄色荧光蛋白、增强的青色荧光蛋白或者具有不同检测方法的其它融合伴侣融合的形式。或者，所述读出可通过报告基因的转录激活实现，其中scFv-融合蛋白的融合伴侣是转录激活剂，例如Gal4激活结构域，或者DNA-结合蛋白，例如LexA或Gal4DNA-结合结构域，其激活酶例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰基转移酶等报告基因的转录，这转录提供了读出。提供读出的融合蛋白是本领域技术人员众所周知的。[0113]本发明的另一个实施方案是包括本文所述的构架的抗体。[0114]本发明的另一个实施方案是本发明抗体的应用。[0115]本发明另一优选的实施方案是抗体可变结构域的所述构架类别以及可变结构域和scFv序列用于从既有抗体上移植高变环的用途，以获得在还原或其它挑战性环境中有功能的抗体。[0116]本发明另一个进一步优选的实施方案是抗体可变结构域的所述构架类别以及可变结构域和scFv序列的用途，例如通过此类构架的一个或多个高变环的随机化，用于建立文库，应用于还原或或其它挑战性环境中。[0117]对本领域普通技术人员将会显而易见的是，文中所述的本发明的分子可用于诊断和治疗应用、靶确认以及基因治疗。[0118]本发明可通过如下实施例举例说明，其并不旨在以任何方式限制本发明的范围。[0119]参考文献[0120]Agatep,R.,Kirkpatrick,D.1,.,Parchaliuk,R.A.,Woods和Gietz,R.D.(1998)."TransformationofSaccharomycescerevisiaebylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyIeneglycolprotocol."Technical.TipsOnline(http://tt0.trends,corn).[0121]AufderMaur,A.,Escher,D.和Barberis,A.(2001)."Antigen-1ndependentselectionofstableintracellularsingle-chainantibodies."FEBSLett508:407-412.[0122]【权利要求】1.单链构架，具有如下通式结构:NH2-VL-接头-VH-COOH;或NH2-VH-接头-VL-COOH其中VL结构域如序列Seq.1d.N0.4所示并且VH结构域如序列Seq.1d.N0.11所示。2.融合于第二蛋白成分的权利要求1的单链构架，以产生具有如下通式结构的融合构建体:NH2-VL-接头-VH-第二蛋白-COOH;或NH2-第二蛋白-VL-接头-VH-C00H。3.权利要求2的单链构架，其中VH和VL区的取向颠倒。4.权利要求2的单链构架，其中所述第二蛋白为胞内测定提供读出信息。5.权利要求4的单链构架，其中所述第二蛋白选自GFP、增强的蓝色荧光蛋白、增强的黄色荧光蛋白、增强的青色荧光蛋白、转录激活剂或DNA-结合蛋白。6.权利要求5的单链构架，其中所述转录激活剂为Gal4激活结构域。7.权利要求5的单链构架，其中所述DNA-结合蛋白为LexA或Gal4DNA-结合结构域。8.权利要求1-7中任一项的单链构架在靶确认或文库构建中的用途。9.权利要求1的构架序列在鉴定保守构架残基种类中的用途。10.权利要求9的用途，其中保守构架残基种类选自下组:极性但不带电荷的R基团；带正电荷的R基团；带负电荷的R基团；疏水R基团；及特殊氨基酸，即，半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸。11.权利要求1的构架序列在鉴定至少一个保守构架序列中的用途。12.权利要求11的用途，其中保守构架序列为2-5个残基。13.权利要求11的用途，其中保守构架序列为5-10个残基。14.权利要求11的用途，其中保守构架序列为10-25个残基。15.权利要求11-12中任一项的用途，其中保守构架序列具有缺口。16.抗体，包括来自根据权利要求1-7中任一项的单链构架的VL和VH。17.抗体片段，包括来自根据权利要求1-7中任一项的单链构架的VL和VH。18.权利要求16的抗体或权利要求17的抗体片段在靶确认或文库构建中的用途。19.核酸，能够编码根据权利要求1-7中任一项的单链构架。20.载体，包含根据权利要求19的核酸。21.宿主细胞，包含根据权利要求19的核酸。【文档编号】C07K16/18GK103739706SQ201410031953【公开日】2014年4月23日申请日期:2003年5月21日优先权日:2002年5月22日【发明者】K·缇索特,S·艾沃特,A·奥弗德尔茂尔,A·巴伯里斯,D·艾施尔申请人:艾斯巴技术-诺华有限责任公司