一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用的制作方法
【专利摘要】一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用，属于微生物技术清洁生产天然产物领域，解决现有富含木质纤维素的天然产物生产过程中提取收率低、成本高、大量使用化学溶剂和环境污染难以治理的问题。本发明涉及到一种芽孢杆菌及其降解天然产物原料中木质纤维素等组成分离有效成分的应用。该方法代替常用的物理化学预处理方法处理富含木质纤维素的天然产物原料，促进存在于植物组织中被木质纤维素、果胶质、淀粉等包裹的天然产物有效成分的暴露与释放，以提高天然产物有效成分提取收率和效率、减少化学试剂用量及环境污染治理难度，降低生产成本，显著增加效益。
【专利说明】一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于利用微生物技术清洁生产天然产物领域。更具体的说，本发明涉及一 种芽孢杆菌，同时，还涉及到所述的芽孢杆菌在富含木质纤维素的天然产物清洁生产中的 应用。
【背景技术】
[0002] 天然产物活性成分是指从再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的化合物， 其中许多有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础。天然产物安全性高，已成为医药、食 品及饲料的重要来源。
[0003] 天然产物所含化学成分复杂，其有效成分包括黄酮、酚类、萜类等几百种，其相对 分子质量较低，从几百到几千，根据极性主要分为水溶性和脂溶性两种形式。
[0004] 天然产物中有效成分在天然植物资源中含量比较低，因此，分离纯化的第1步便 是将目标产物从大量的植物组织中提取出来，达到富集目标产物的目的。传统的天然产物 提取方法主要是采用水或有机溶剂提取有效成分，这种提取方法简便易操作，但存在处理 时间较长、部分有效成分易分解、收率和纯度偏低等缺点。
[0005] 为提高有效成分的提取收率，人们采用了自然发酵法、强酸强碱预处理、复合酶技 术、超声波及微波处理等多种方式在水或有机溶剂提取有效成分之前对原料进行预处理， 以提高提取收率。例如，在黄姜皂素生产过程中采用自然发酵法预处理黄姜原料，这样可 提高黄姜皂素的收率20%左右；早在20世纪50年代，人们就把超声波用于提取花生油和 啤酒花中的苦味素、鱼组织中的鱼油等；Ganzler在用溶剂法提取鹰爪豆碱前采用微波预 处理可将提取收率由52. 3 %提高到80. 3%。这些方法在一定程度上提高了有效成分提取 收率，但都不同程度地存在各种问题，如：自然发酵法存在处理时间偏长、收率偏低等问题； 强酸强碱预处理存在成本高、环境污染严重等问题；复合酶技术存在处理时间偏长、成本 高、效率偏低等问题；超声波及微波等物理处理存在能耗偏高、难以实现工业放大等突出问 题。
[0006] 当然，目前，也新兴发展起超临界萃取技术、动态逆流提取技术和半仿生提取技术 等天然产物提取分离新方法。这些技术设备造价偏高，运行成本较高，应用范围目前还有很 大的局限性。
【发明内容】
[0007] 本发明针对上述问题，提供了一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中应用的方法， 该方法利用芽孢杆菌发酵方法替代上述预处理，采用芽孢杆菌高效预处理天然产物原料， 促进存在于植物组织中被木质纤维素、果胶质、淀粉等包裹的天然产物中有效成分更充分 的提取与释放。进一步提高天然产物中有效成分的提取收率和效率、减少化学试剂用量及 环境污染治理难度，降低生产成本，显著增加效益。
[0008] 本发明提供的芽孢杆菌Bacillus SP.RBB55已于2014年保藏于中国典型培养物 保藏中心（简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山），保藏日期为2014年5月16日，保藏编 号为CCTCC NO:M 2014208。Bacillus sp.RBB55是一株革兰氏阳性细菌，其形态特征是：菌 株RBB55在37°C下，固体LB培养基上倒置培养12h后，生长为乳白色圆形菌落，菌落边缘整 齐，表面湿润光滑，通过革兰氏染色后再显微镜下，菌体呈短杆状，近乎椭球形，单个或呈短 链排列，长1. 7-2. 0 μ m，宽0. 7-0. 9 μ m。周生纤毛，能运动，芽孢椭圆形，中生或次端生，VP 反应呈阳性。
[0009] 上述芽孢杆菌Bacillus sp. RBB55保藏编号为M2014208菌株的16S rDNA序列 的V3可变区序列如下所示，片段长度为249bp，该序列与Genbank中己知序列进行比对， 所述序列与芽孢杆菌的16S rDNA序列有99 %?100 %的相似性，因此命名为Bacillus sp. RBB55。
[0010]
【权利要求】
1. 一种芽孢杆菌，其特征在于：其分类命名为芽孢杆菌Bacillus SP.RBB55,于2014年 5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏编号为M2014208。
2. 权利要求1所述的芽孢杆菌在天然产物提取中的应用。
3. 权利要求2所述的应用，其特征在于，所述天然产物为富含木质纤维素的天然产物 原料。
4. 权利要求2所述的应用，其特征在于，所述天然产物为黄姜皂苷、金银花绿原酸、桂 花精油、紫苏酚类物质或甘草黄酮物质。
5. 权利要求1所述的芽孢杆菌在天然产物清洁生产中应用的方法，包括下述步骤： 第1步制备芽孢杆菌种子液步骤： 挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌（Bacillus Sp.RBB55)，保藏编号 为M2014208菌株1-2环，接种在装有灭菌液体LB培养基的容器中，置于摇床上，在30°C? 38°C条件下，以120?180rpm的转速培养8h?16h，得所述菌株的种子液； 第2步芽孢杆菌处理天然产物浆料释放活性成分步骤： 所述的天然产物按照干重与水的质量比为1:5?1:10混合均匀制成浆液，在浆液中接 种第1步中芽孢杆菌种子液进行微生物处理，得到发酵混合物；其中微生物处理条件为：接 种量10?20%，处理温度30°C?38°C，以120?180rpm的转速处理3?10h，自然pH ; 第3步从第2步得到的发酵混合物中分离提取天然产物中的有效成分。
6. 权利要求5所述芽孢杆菌在天然产物提取中应用的方法，其特征在于， 第3步中所述的分离提取是根据发酵混合物有效成分的水溶性和脂溶性特点选择对 应的方式进行处理的： 针对水溶性强的有效成分，先采用固液分离法分离上述发酵混合物得到富含有效成分 的发酵液，再根据有效成分的分子量和极性，采用膜分离技术等手段富集发酵液中的有效 成分；对于同时富含木质纤维素及淀粉的天然产物原料，先采用双酶法处理上述发酵混合 物进一步释放有效成分，再先后采用固液分离法和膜分离技术等手段富集发酵液中的有效 成分； 针对既可水溶又可脂溶的有效成分，可在第2步的发酵混合物中按照最佳提取剂配比 添加有机溶剂用量提取相应有效成分； 针对脂溶性强的有效成分，先采用固液分离法分离得到富含有效成分的固体成分，再 根据有效物质的极性选择相应的有机溶剂提取精制即可得到产品。
7. 权利要求5所述芽孢杆菌在天然产物提取中应用的方法，其特征在于，所述天然产 物原料为鲜料或者干料，鲜料经洗净去杂后，在温度120?130°C、压力0. IMPa?0. 2MPa条 件下，蒸汽膨化处理15min?20min，冷却至室温后使用；干料由天然产物原料干燥后粉碎 至30目?100目得到，或进一步采用与鲜料相同条件的蒸汽膨化处理后得到。
8. 权利要求5所述芽孢杆菌在天然产物提取中应用的方法，其特征在于，所述的天然 产物主要包括黄姜皂苷、金银花绿原酸、桂花精油、紫苏酚类物质或甘草黄酮物质，但不仅 限于此，对富含木质纤维素的天然产物原料均适用。
【文档编号】C07G99/00GK104109644SQ201410234768
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】余龙江, 魏蜜, 敖明章, 金文闻, 赵春芳, 付春华 申请人:华中科技大学