玉米钙调磷酸酶B类似蛋白ZmCBL10基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种玉米钙调磷酸酶B类似蛋白ZmCBL10基因，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述基因编码序列的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明ZmCBL10基因通过基因调控来参与植物耐盐过程，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。
【专利说明】玉米钙调磷酸酶B类似蛋白ZmCBLIO基因及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及玉米钙调磷酸酶B类似蛋白ZmCBLIO基 因及其应用。 【背景技术】
[0002] 植物生长在不断变化的环境之中，环境是影响植物生长发育的重要因素，其中逆 境是植物所必须面对的胁迫。植物为了感知并适应逆境胁迫在分子、细胞和生理水平上发 展出一套复杂的逆境感知、信号传导及逆境响应的精细调控机制。而众多研究表明，一些非 生物胁迫和生物胁迫所引起的生理生化反应均与Ca 2+信号转导有关。其中，Ca2+浓度在时 空上的变化代表了某种特殊的胁迫信号，称之为钙信号；而能够感知Ca 2+这种浓度变化的 蛋白称之为钙离子感受器。
[0003] Ca2+感受器在监测Ca2+浓度瞬间变化的同时与Ca2+结合并发生构象上的变化，而 这种构象上的变化又会与其下游蛋白互作从而进行信号的传递。目前，在高等植物中研究 较为广泛及深入的Ca 2+感受器主要包括三类：钙依赖型蛋白激酶（CDPK)、钙调素（CaM)和 钙调磷酸酶B类似蛋白（CBL)。其中研究较为深入的是CDPK家族，该家族的蛋白既可以结 合Ca 2+，又具有蛋白激酶活性；在与Ca2+结合之时构想即刻变化，通过调控自身分子内作用 而实现其功能。而另外两个钙离子感受器，CaM和CBL则不具备酶活性，它们在感受到钙 离子信号变化后需要与下游的蛋白激酶发生作用才能将信号传递下去。因此，又可将既能 结合1丐离子又具有激酶活性的这类感受器称之为响应型感受器（sensor responders),而 与之相对的只能结合钙离子而没有激酶活性的钙离子感受器称为依赖型感受器（sensor relays)〇
[0004] 近年来，对CBL家族的研究逐渐兴起，CBL含有4个能够直接结合Ca2+的典型的 EF-hand结构域，在结合钙离子活化后，会与下游的一类特殊蛋白激酶结合，并激活其活 性。这类可以与CBL特异结合的激酶称为CBL互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinases，CIPKs)。CIPK在N端含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区，并通过其特有的C末端区 域（C-terminal region)与CBL互作。通过对已知的基因组数据（包括EST)的扫描分析 发现，CBL和CIPK只存在于植物中，说明他们可能是植物所特有的一类基因家族，可能出现 于植物的早期进化中。
[0005] 研究表明，在许多植物中均已找到CBLs基因家族的存在；其中，在拟南芥、水稻、 玉米和杨树中发现10个CBLs，在高粱和葡萄中分别发现6个和8个CBLs基因。近年来对 CBL基因家族的研究主要集中在模式植物拟南芥中，并且已报道的CBL基因大多参与了拟 南芥对逆境胁迫的响应。AtCBL4/S0S3是最早报道的在拟南芥应对盐胁迫时起重要功能的 基因，该基因主要在根中表达并与AtCIPK24/S0S2互作，后者可以磷酸化NHX7/S0S1将Na+ 运出细胞，减少体内Na+含量；AtCBL10/SCaBP8主要在茎和叶片中表达，参与了对Na+区隔 化，降低高盐对植物的损害；AtCBLl和AtCBLIO通过参与不同的信号通路对植株响应逆境 尤其是在对K+和N0 3_的吸收过程中起着重要的作用。AtCBL2和AtCBL3可被光照诱导，并 在维持细胞内离子平衡中起着重要的作用。此外AtCBL5在应对高盐及渗透胁迫中也起着 重要的作用。而AtCBL6、AtCBL7和AtCBL8的功能则未有报道。对于玉米CBLs基因的研究 仅发现ZmCBL4在应对高盐胁迫中起着重要的作用。
[0006] 因此，目前对于植物CBL基因的研究正是一个方兴未艾的领域，仅有的一些研究 结果只是对这一领域的初步探索，这方面的研究工作基本上是在模式植物拟南芥上进行 的。对于重要作物（如水稻、玉米、小麦等）的此类基因的研究还鲜有报道，特别是有关玉 米CBL基因的功能研究尚未见应用。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种玉米钙调磷酸酶B类 似蛋白ZmCBLIO基因及其应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种玉米钙调磷酸酶B类似蛋白ZmCBLIO 基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] 作为优选，所述基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0010] 本发明还提供了用于扩增ZmCBLIO基因编码序列的引物对，所述引物对包括：
[0011] 正向引物 F :5,-atgccacgagccactgaggcggctt-3' ；
[0012] 反向引物 R :5' -ctaatcttccaccgccgtgttg-3'。
[0013] 本发明还提供了含有前述基因的载体。
[0014] 本发明还提供了含有前述基因的工程菌。
[0015] 本发明还提供了前述基因在改良植物抗盐胁迫中的应用。
[0016] 进一步地，将前述基因通过载体或工程菌转化到植物植株中，得到转基因植物植 株，从而改良植物盐胁迫的抗性。
[0017] 具体为：
[0018] 1)以玉米cDNA为模板，利用前述引物对扩增ZmCBLIO基因序列，在序列末尾添 加 HA标签后与pGWC-T载体连接，经过测序确定所获得的序列与目的片段一致后命名为 pGffC-ZmCBL10-HA ；
[0019] 2)将pGWC-ZmCBL10-HA载体及植物表达载体pEarleyGatelOO通过LR酶进行重组 连接，然后转化DH5 α感受态细胞，获得重组克隆，经过PCR检测后，将单克隆送测序，测序 正确的克隆命名为 pEarley Gatel00-ZmCBL10-HA ;
[0020] 3)将制备的载体转化农杆菌GV3101菌株；
[0021] 4)利用农杆菌GV3101菌株转化植物植株、获得纯合的转化阳性苗株系；
[0022] 5)将转基因株系分别在含有OmM、125mM、150mM NaCl的MS培养基上培养，获得耐 盐碱的转基因植株。
[0023] 本发明的有益效果在于：
[0024] 本发明首次发现ZmCBLIO编码的蛋白通过调控下游相关基因参与植物耐盐碱过 程。进一步使得本发明ZmCBLIO基因通过基因调控来参与植物耐盐过程成为可能，对于培 育高产的转基因农作物具有重要意义。 【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1中植物表达载体示意图。
[0026] 图2为本发明实施例3中ZmCBLIO转基因株系目的基因的PCR检测及western检 测；
[0027] 图2A中，1-10 :ZmCBL10不同转基因株系目的基因扩增结果；WT :负对照（以拟南 芥野生型Col的DNA为PCR模板）；+ :正对照（以ZmCBLIO超表达载体为PCR模板）；gene : 为ZmCBLIO的扩展片段；Bar :为Bar基因的扩展片段。
[0028] 图2B中，WT :负对照（以拟南芥野生型Col的总蛋白为上样对象）；L1_L10 : ZmCBLIO不同转基因株系（以不同转基因株系的总蛋白为上样对象）；HA抗体：与目的蛋白 特异结合的抗体;Actin抗体：为与拟南芥Actin蛋白结合的抗体。
[0029] 图3为本发明实施例4中转基因拟南芥与野生型植株在含有不同胁迫条件的培养 基上生长情况比较。
[0030] 图4为本发明实施例5中转ZmCBLIO基因拟南芥能够互补拟南芥S0S3突变体在 不同胁迫条件下的敏感表型。
[0031] 转ZmCBLIO基因的互补株系的种子点播在不同胁迫处理条件的MS培养基上，4°C 春化3天后，置于22°C培养，10天后观察生长状况互补株系及突变体在不同处理条件平板 上的生长情况，互补株系（C0M-sos3)长势明显优于sos3突变体。 【具体实施方式】
[0032] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0033] 实施例1含有ZmCBLIO基因的表达载体的构建
[0034] 1、依据已知目的基因的序列（如SEQ ID No.2所示），设计带有HA标签尾端的引 物，从玉米cDNA扩增ZmCBLIO基因序列，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段。
[0035] 2、将回收的片段与pGWC-T载体连接，然后转化DH5a感受态细胞，获得阳性单克 隆，送测序，经过序列比对，获得与原序列一致的单克隆，摇菌并提取该单克隆质粒，将其命 名为 pGWC-ZmCBL10-HA。
[0036] 3、将pGWC-ZmCBL10-HA和pEarleyGatelOO质粒混合后添加 LR酶，通过LR反应后 获得重组载体pEarleyGatel00-ZmCBL10-HA(如图1所示）。之后转化DH5a感受态细胞， 将获得的阳性单克隆送测序，经过序列比对确认无误。
[0037] 实施例2含有CBL10基因的转化与筛选
[0038] 1、构建好的ZmCBLIO超表达载体转入农杆菌GV3101。
[0039] 2、用沾花浸染（floral dipping)的方法转化拟南芥野生型。
[0040] 3、将转化后得到的T1代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长 约两周后，用0. 5%。的PPT(phosphinothricin)喷洒T1代拟南芥筛选转化植株。
[0041] 4、由于所用的植物超表达载体带有抗PPT(phosphinothricin)的Basta基因，它 在转化时能随目的基因一起转入植物体，所以在喷施PPT (phosphinothricin)后大部分未 转化植株死亡，而转化植株仍然能够正常生长。转化植株按照不同株系分别收获T2代种 子。
[0042] 5、收获各转基因株系T2代种子后，用0. 5%的NaCIO对种子进行消毒处理。然后 点种于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培养基平板中（每个转基因株系需要约 50粒种子），以野生型为负对照。
[〇〇43] 6、春化三天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野 生型在含〇· 5%。的PPT(phosphinothricin)的MS培养基中无法存活；T2代杂合体转 基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无 PPT (phosphinothricin)抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转基因株系的种子能全部在 含PPT (phosphinothricin)抗性的MS培养基中存活。
[0044] 实施例3含有玉米CBL10基因的转基因植株核酸PCR分析
[0045] 1、以提取的阳性植株的总DNA为模板，用ZmCBLIO基因引物进行PCR扩增，阳 性植株能够扩增出642bp的条带，而野生型植株不能扩增出目的条带，如图2A所示。 Westernblot检测结果如图2B所示。
[0046] 2、收获各转基因株系T2代种子后，用0. 5%的NaCIO对种子进行消毒处理。然后 点种于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培养基平板中（每个转基因株系需要约 50粒种子），以野生型为负对照。
[0047] 3、春化三天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在 含0· 5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培养基中无法存活。
[0048] 4、T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合， 因此会有一部分无 PPT (phosphinothricin)抗性的种子出现；只有Τ2代为纯合体转基因株 系的种子能全部在含PPT (phosphinothricin)的MS培养基中存活。
[0049] 实施例4含有CBL基因的转基因植株与野生型植株抗逆性比较
[0050] 将ZmCBLIO转基因株系点种在含有OmM、125mM、150mM的NaCl的MS平板上，4°C春 化3天，置于22°C，16小时光/8小时黑暗的培养箱中，14天后拍照分析（如图3所示）。从 结果中可以看出，随着NaCl浓度的增加野生型在胁迫下子叶发育迟缓且绿苗率降低，而转 基因株系的长势则明显优于野生型植株。此外两者在正常MS培养基中表型无明显差别。
[0051] 实施例5玉米ZmCBLIO基因转化拟南芥sos3后能恢复其对不同胁迫处理时的敏 感表型
[0052] 1、将pEarleyGatelOO-ZmCBLIO超表达载体转入农杆菌GV3101，用沾花浸染 (floral dipping)的方法转化拟南芥sos3突变体。
[0053] 2、将转化后得到的T1代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长 约两周后，用0. 5%。的PPT (phosphinothricin)喷洒T1代拟南芥筛选转化植株。能够存活 的植株即为T1代植株。
[0054] 3、按照不同株系分别收获种子。用PPT筛选，统计存活株数，取符合3:1分离的株 系，即为单拷贝的T2代植株。
[0055] 4、将T2代存活的植株移至小花盆繁种，收获得到T3种子，将其继续在含有PPT 的MS培养基上筛选，获得能够完全存活的纯合体株系，收获其种子则为转基因互补株系 (C0M-sos3)。
[0056] 5、将转ZmCBLIO基因互补株系及突变体株系点播含有0mM、75mM、100mM和125mM 的NaCl的MS平板上，4°C春化3天，置于22°C，16小时光/8小时黑暗的培养箱中，10天后 观察表型并进行拍照分析（如图4所示）。从结果中可以看出，突变体在不同胁迫处理下子 叶发育迟缓甚至难以萌发，而互补株系则表现与野生型相当。
[0057] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0001]
[0002]
[0003]
【权利要求】
1. 玉米钙调磷酸酶B类似蛋白ZmCBLIO基因，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
2. 根据权利要求1所述的ZmCBLIO基因，其特征在于，其编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3. 扩增权利要求1或2所述ZmCBLIO基因编码序列的引物对，其特征在于，所述引物对 包括： 正向弓I物 F :5'-atgccacgagccactgaggcggctt-3' ； 反向引物 R :5' -ctaatcttccaccgccgtgttg-3'。
4. 含有权利要求1或2所述基因的载体。
5. 含有权利要求1或2所述基因的工程菌。
6. 权利要求1或2所述的基因在改良植物抗盐胁迫中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求1或2所述基因通过载体或工 程菌转化到植物植株中，经筛选，获得改良盐胁迫抗性的转基因植物植株。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤： 1) 以玉米cDNA为模板，利用权利要求3所述引物对扩增ZmCBLIO基因序列，在序列末 尾添加 HA标签后与pGWC-T载体连接，经过测序确定所获得的序列与目的片段一致后命名 为 pGWC-ZmCBL10-H A ; 2) 将pGWC-ZmCBL10-HA载体及植物表达载体pEarleyGatelOO通过LR酶进行重组连 接，然后转化DH5 α感受态细胞，获得重组克隆，经过PCR检测后，将单克隆送测序，测序正 确的克隆命名为 pEarleyG atel00-ZmCBL10-HA ; 3) 将制备的载体转化农杆菌GV3101菌株； 4) 利用农杆菌GV3101菌株转化植物植株、获得纯合的转化阳性苗株系； 5) 将转基因株系分别在依次增高盐浓度的MS培养基上培养，获得耐盐碱的转基因植 株。
【文档编号】C07K14/415GK104087598SQ201410249800
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】郑军, 张凡, 王国英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所