一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽分离纯化方法。本发明公开的一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1；再将所得的上清液1调节pH至4.5-5.5，静置，得酸性沉淀后的样品；将酸性沉淀后的样品离心得上清液2；将上清液2滤膜过滤，得过滤液。采用本发明公开的方法可以分离纯化得到纯度99.5％以上的枯草菌素抗菌肽。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗菌肽分离纯化方法；特别涉及一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方 法，属于生物【技术领域】。 一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法
【背景技术】
[0002] 随着社会的进步和人民生活质量的提高，食品安全性问题越来越受到人们的关 注。特别是近年来国内外发生的，如禽流感、口蹄疫、瘦肉精、多宝鱼、溶血性大肠杆菌及水 饺中金黄色葡萄球菌等诸多食品安全事件，再一次警示我们，动物性产品的安全已经到了 必须解决的时刻。而抗生素及药物在动物性产品中的残留和耐药性是引起动物性食品安全 的主要原因之一。世界卫生组织（WHO) 2002年即提出"在食用动物中减少抗生素使用的全 球原则"。欧盟、日本、韩国等发达国家已经禁止抗生素在饲料中使用，对动物治疗用抗生素 也有严格的限制。美国已经提出2014年将全面禁止饲料中使用抗生素。国内江苏、辽宁等 省市已经率先提出禁止在饲料中添加抗生素的试点。
[0003] 抗菌肽（AMP)是一类由动植物和微生物机体经诱导产生的、具有杀菌活性并与机 体先天性免疫紧密相关的特定功能的小分子多肽。经过近四十年的研究，已有1500种肽被 证实具有高效的抗菌活性和免疫调节活性，并在医药、食品、农业等领域得到广泛应用。在 国外，医药上有多黏菌素（主要是多黏菌素 B和E)和短杆菌肽S (gramicidin S)(治疗耐 药铜绿假单胞菌和不动杆菌引起的感染）、达托霉素（治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、 链球菌以及肠球菌引起的皮肤感染）、Glut 〇Xim/N0V-002 (治疗结核病和非小细胞肺癌）和 恩夫韦地（治疗艾滋病）四种药品进入市场，另有十几个药品进入临床试验阶段。作为食 品防腐剂的乳链菌肽（Nisin)已经在50多个国家被广泛应用；将抗菌肽基因转入农作物， 是培育作物抗病新品种的有效途径。该技术已在马铃薯、水稻和烟草等育种中得到应用。
[0004] 1998年，美国人Paik等（J. Biol. Chem.)从枯草芽孢杆菌中分离到一种对金黄 色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，錯样芽抱杆菌（Bacillus cereus)和化胺链球菌 (Streptococcus pyogenes)有很好抗菌作用的物质，该物质含有37个氨基酸，耐热，对酸 碱较稳定，其结构与Nisin非常相似，命名为sublancinl68,并认为是一种新的羊毛硫抗生 素。目前，分离该枯草芽孢杆菌发酵液中的抗菌肽，一般采用高效液相色谱法、反相液相色 谱等，目前还没有产业化分离纯化枯草菌素抗菌肽的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗菌肽分离纯化方法。
[0006] 本发明提供一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆 菌发酵液离心得上清液1 ;再将所得的上清液1调节pH至4. 5-5. 5,静置，得酸性沉淀后的 样品；将酸性沉淀后的样品离心得上清液2 ;将上清液2滤膜过滤，得过滤液；将过滤液进 行阴离子交换层析，得穿透液和平衡液，将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析，280nm检 测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1 ;将样品1进行阳离子 交换层析，280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品2 ;将 样品2进行第二次疏水层析，280nm检测并收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱 峰，得到样品3,将样品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽；
[0007] 所述枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司。
[0008] 上述方法中，所述发酵液离心的条件为15000-18000rpm，30-45min，连续离心2-3 次，具体为12000rpm，连续离心2次。
[0009] 上述任一所述的方法中，所述上清液1调节pH至5. 0 ;
[0010] 所述pH用冰醋酸调节；
[0011] 所述静置的时间为l_2h，具体为lh。
[0012] 上述任一所述的方法中，所述酸性沉淀后的样品离心的条件为15000-18000rpm， 20-30min，连续离心2-3次，具体为12000rpm，连续离心2次。
[0013] 上述任一所述的方法中，所述滤膜为0. 45um滤膜。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述阴离子交换层析的柱填料为Capto Q ;
[0015] 所述阴离子交换层析的层析柱为BPG140/500 ;
[0016] 所述阴离子交换层析的方法为：用含有50mM Tris、lMNaCl的水溶液和50mM Tris 的水溶液交替处理层析柱，再上样过滤液，收集穿透液，上样完毕后，用50mM Tris水溶液平 衡，得平衡液，将平衡液与穿透液合并；
[0017] 所述过滤液具体是按照3g/L的载量进行上样；
[0018] 所述阴离子交换层析中平衡的体积为1-2个柱体积，具体为1. 5个柱体积。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述第一次疏水层析的柱填料为Butyl HP ;
[0020] 所述第一次疏水层析的层析柱为BPG100/500 ;
[0021] 所述第一次疏水层析的方法为：用超纯水洗脱，再用pH 5.0的含有50mM NaAc-HAcU. 5M NaCl的水溶液平衡，平衡完毕，再将阴离子交换层析得到的穿透液和平衡 液上样，上样完毕，用pH 5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1.5M NaCl的水溶液继续平衡，平衡完 毕，用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc的水溶液进行洗脱，280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有 目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1 ;
[0022] 所述超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体积；
[0023] 所述第一次疏水层析中用pH 5. 0的含有50mM NaAc-HAc、l. 5M NaCl的水溶液平 衡的体积为3-5个柱体积，具体为5个柱体积；
[0024] 所述阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液具体是按照10g/L的载量进行上样。
[0025] 上述任一所述的方法中，所述阳离子交换层析的柱填料为Capto Sp impres ;
[0026] 所述阳离子交换层析的层析柱为BPG100/500 ;
[0027] 所述阳离子交换层析的方法为：用pH 5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的 水溶液洗脱，再用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕，将样品1上样，分段收 集穿透，检测其是否含有目的抗菌肽，继续用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完 毕，用pH 5. 0的含有50mM NaAc-HAc，1M NaCl的水溶液洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定 含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品2 ;
[0028] 所述阳离子交换层析中用pH 5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的水溶液洗 脱的体积为3-5个柱体积，具体为5个柱体积；
[0029] 所述阳离子交换层析中再用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡的体积为3-5 个柱体积，具体为5个柱体积；
[0030] 所述样品1具体是按照l〇mg/ml的载量进行上样。
[0031] 上述任一所述的方法中，所述第二次疏水层析的柱填料为Butyl HP ;
[0032] 所述第二次疏水层析的层析柱为BPG100/500 ;
[0033] 所述第二次疏水层析的方法为：超纯水洗脱，再用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc， 1. 5MNaCl水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc， 1. 5M NaCl水溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含 有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3 ;
[0034] 所述第二次疏水层析中超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体积；
[0035] 所述第二次疏水层析中再用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc，1. 5M NaCl水溶液平衡体 积为3-5个柱体积，具体为5个柱体积；
[0036] 所述样品2具体是按照10g/L的载量进行上样。
[0037] 上述任一所述的方法中，所述超滤换液是利用Cenetramate超滤系统进行的，具 体是用1KD的超滤膜包将样品3浓缩一倍，之后用吐温-20补足至原体积，继续浓缩一倍， 重复数次；
[0038] 所述鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰的方法为高效液相色谱法，是将洗脱峰和枯草 菌素抗菌肽标准品在相同的条件下进行高效液相检测，根据保留时间是否一致进行鉴定；
[0039] 所述枯草菌素抗菌肽标准品是将枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为 201110392455. 9的发明公开的方法分离得到。
[0040] 所述高效液相的检测条件具体如下：
[0041] 高效液相色谱柱型号：Z0RBAX 300SB-C8(4. 6*150mm，5um)，保护柱芯： Z0RBAX300SB-C8 4Pack(4.6*12.5mm，5um);
[0042] 检测波长：280nm ;
[0043] 柱温：25 °C ;
[0044] 流动相：A :体积百分含量为0. 1 % TFA的水溶液；B:含有体积百分含量80 %乙腈、 0. 085% TFA的水溶液；
[0045] 流速：lml/min;
[0046] 洗脱方法：从第Omin到第lmin，流动相中A的体积百分含量为80%，流动相中B 的体积百分含量为20% ;从第lmin到第15min，流动相中A的体积百分含量由80%线性下 降至47%，流动相中B的体积百分含量由20%线性上升至53%;从第15min到第17min，流 动相为B ;从第17min到第23min，流动相中A的体积百分含量为80%，流动相中B的体积 百分含量为20%。
[0047] 采用本发明提供的方法可以分离纯化得到纯度99. 5%以上的枯草菌素抗菌肽。
【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图1为pH沉淀实验路线图。
[0049] 图2为实施例2中发酵液滤膜过滤前后的280nm高效液相检测图谱。
[0050] 图3为实施例2中pH梯度沉淀后上清的280nm高效液相检测图谱。
[0051] 图4为实施例2中发酵液pH5. 0沉淀前后样品的变化。
[0052] 图5为实施例2中Capto Q纯化图谱。
[0053] 图6为实施例2中Capto Q 280nm高效液相检测图谱。
[0054] 图7为实施例2中过滤液经capto Q纯化前后样品的变化。
[0055] 图8为实施例3中Capto S纯化图谱。
[0056] 图9为实施例3中Butyl HP纯化图谱。
[0057] 图10为实施例4中Capto Sp impres中间纯化图谱。
[0058] 图11为实施例4中Capto Sp impres中间纯化高效液相检测图谱。
[0059] 图12为实施例4中Capto S中间纯化图谱。
[0060] 图13为实施例4中Capto S中间纯化高效液相检测图谱。
[0061] 图14为实施例5中Butyl HP精制纯化图谱。
[0062] 图15为实施例5中Butyl HP精制高效液相检测图谱。
[0063] 图16为实施例6中发酵液离心后的上清的高效液相色谱检测。
[0064] 图17为实施例6中过滤液的高效液相色谱检测。
[0065] 图18为实施例6中Capto Q穿透液的高效液相色谱检测。
[0066] 图19为实施例6中Butyl HP捕获纯化图谱。
[0067] 图20为实施例6中Butyl HP洗脱峰高效液相色谱检测。
[0068] 图21为实施例6中Capto Sp impres中间纯化图谱。
[0069] 图22为实施例6中Capto Sp impres洗脱峰高效液相色谱检测。
[0070] 图23为实施例6中Butyl HP精制纯化图谱。
[0071] 图24为实施例6中Butyl HP精制洗脱峰高效液相色谱检测。
[0072] 图25为实施例6中枯草菌素抗菌肽的分离纯化工艺。
【具体实施方式】
[0073] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0074] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0075] Cenetramate超滤系统购自pall公司。
[0076] BPG140/500 购自 GE Healthcare。
[0077] BPG100/500 购自 GE Healthcare。
[0078] 枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司，由200L发酵罐按照常规 方法发酵枯草芽孢杆菌菌株BF168(枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BF168已于2013 年01月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为 CGMCC No. 7200)获得。
[0079] Capto S、Buytl HP、Capto Sp impres、Capto Q 购自 GE Healthcare。
[0080] 实施例1、层析纯化工艺参数的优化
[0081] 一、Capto S纯化工艺参数的优化
[0082] 利用D0E(Design of Experiment)的设计，实验得到不同pH、cond的组合测定 Capto S动态载量值，然后用分析软件（uniC〇rn6. 2)预测此种填料在设计的参数范围内是 否可以达到预期的载量。
[0083] 设计方案如表1所示。
[0084] 表1 D0E设计方案
[0085]
【权利要求】
1. 一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液离心 得上清液1 ;再将所得的上清液1调节pH至4. 5-5. 5,静置，得酸性沉淀后的样品；将酸性沉 淀后的样品离心得上清液2 ;将上清液2滤膜过滤，得过滤液；将过滤液进行阴离子交换层 析，得穿透液和平衡液，将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析，280nm检测并收集洗脱峰， 将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1 ;将样品1进行阳离子交换层析，280nm检 测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品2 ;将样品2进行第二次 疏水层析，280nm检测并收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3,将样 品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽； 所述枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵液离心的条件为 15000-18000rpm，30-45min，连续离心2-3次，具体为12000rpm，连续离心2次。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述上清液1调节pH至5. 0 ; 所述pH用冰醋酸调节； 所述静置的时间为l_2h,具体为lh。
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述酸性沉淀后的样品离心的条 件为15000-18000rpm，20-30min，连续离心2-3次，具体为12000rpm，连续离心2次。
5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述滤膜为0. 45um滤膜。
6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述阴离子交换层析的柱填料为 Capto Q ； 所述阴离子交换层析的层析柱为BPG140/500 ; 所述阴离子交换层析的方法为：用含有50mM Tris、lMNaCl的水溶液和50mM Tris的水 溶液交替处理层析柱，再上样过滤液，收集穿透液，上样完毕后，用50mM Tris水溶液平衡， 得平衡液，将平衡液与穿透液合并； 所述过滤液按照3g/L的载量进行上样； 所述阴离子交换层析中平衡的体积为1-2个柱体积，具体为1. 5个柱体积。
7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述第一次疏水层析的柱填料为 Butyl HP ； 所述第一次疏水层析的层析柱为BPG100/500 ; 所述第一次疏水层析的方法为：用超纯水洗脱，再用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、 1.5M NaCl的水溶液平衡，平衡完毕，再将阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液上样，上 样完毕，用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的水溶液继续平衡，平衡完毕，用pH5. 0 的50mM NaAc-HAc的缓冲液进行洗脱，280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的 洗脱峰合并，得到样品1 ; 所述超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体积； 所述第一次疏水层析中用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的水溶液平衡的体 积为3-5个柱体积，具体为5个柱体积； 所述阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液按照l〇g/L的载量进行上样。
8. 根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述阳离子交换层析的柱填料为 Capto Sp impres ； 所述阳离子交换层析的层析柱为BPG100/500 ; 所述阳离子交换层析的方法为：用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、l. 5M NaCl的水溶液 洗脱，再用PH5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕，将样品1上样，分段收集穿透，检 测其是否含有目的抗菌肽，继续用PH5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕，用pH5. 0 的含有50mM NaAc-HAc，lM NaCl的水溶液洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌 肽的洗脱峰，得到样品2; 所述阳离子交换层析中用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的水溶液洗脱的体 积为3-5个柱体积，具体为5个柱体积； 所述阳离子交换层析中再用PH5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡的体积为3-5个柱体 积，具体为5个柱体积； 所述样品1按照l〇mg/ml的载量进行上样。
9. 根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述第二次疏水层析的柱填料为 Butyl HP ； 所述第二次疏水层析的层析柱为BPG100/500 ; 所述第二次疏水层析的方法为：超纯水洗脱，再用PH5. 0的50mM NaAc-HAc，1. 5MNaCl 水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用pH5. 0的50mM NaAc-HAc，1. 5M NaCl水 溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽 的洗脱峰，得到样品3; 所述第二次疏水层析中超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体积； 所述第二次疏水层析中再用PH5.0的50mM NaAc-HAc，1.5M NaCl水溶液平衡体积为 3-5个柱体积，具体为5个柱体积； 所述样品2按照10g/L的载量进行上样。
10. 根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述超滤换液是利用 Cenetramate超滤系统进行的，具体是用1KD的超滤膜包将样品3浓缩一倍，之后用吐 温-20补足至原体积，继续浓缩一倍，重复数次； 所述鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰的方法为高效液相色谱法，是将洗脱峰和枯草菌素 抗菌肽标准品在相同的条件下进行高效液相检测，根据保留时间是否一致进行鉴定； 所述枯草菌素抗菌肽标准品是将枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为201110392455. 9 的发明公开的方法分离得到。
【文档编号】C07K1/30GK104109191SQ201410312268
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】谯仕彦 申请人:北京龙科方舟生物工程技术有限公司