一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法
【专利摘要】一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，属于生物化工【技术领域】。本发明以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原。本发明成功的合成甲羟孕酮人工抗原，合成过程简单，抗原产物暴露了孕激素共同结构，为以后筛选群选性甲羟孕酮单克隆抗体奠定基础，得到的群选性单克隆抗体可以满足国内对孕激素多重检测的需求。
【专利说明】一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，属于生物化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002]甲轻孕酮(Medroxyprogesterone, MP)属于孕激素,是人工合成的黄体酮衍生物，作用和天然黄体酮类似，又称为安宫黄体酮。其是促孕剂的一种，医学方面主要是用于痛经、功能性闭经、习惯性流产等，大剂量可以用作长效的避孕针。养殖方面主要用来促进动物生长。但是在动物体内代谢较慢，易残留，容易引起性功能紊乱，精神状态不良，严重的还会造成肝肾脏损害，诱发肿瘤等潜在危害。现有的检测甲羟孕酮方法是仪器检测，其中包括高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)、气质联用(GC-MS)等。这些方法检测结果准确，灵敏度高，但是整个过程需要专业技术人员操作，使用仪器昂贵，样品前处理过程繁琐，检测耗时，不能满足现场大批量快速检测的需求。相比较，随着免疫分析技术在兽药残留中的大量应用，酶联免疫分析技术(ELISA)成为检测的重要方法，可以在短时间内完成现场快速大批量检测。酶联免疫技术最关键的步骤就是免疫原的设计与合成，目前合成甲羟孕酮免疫原的方法都是改变留体A环3位碳氧双键，得到的多数是特异性抗体，针对多种孕激素的群选性抗体少并且效果不好，本发明改变留体D环17位碳上的羟基，暴露孕激素的共同结构，可以同时筛选甲羟孕酮和孕酮，使得筛选高效群选性甲羟孕酮单克隆抗体成为可能。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是避免改造孕激素共同结构，提供了一种新型的甲羟孕酮半抗原和人工抗原的合成方法，为制备群选性甲羟孕酮单克隆抗体奠定基础。
[0004]本发明的技术方案，以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原，用紫外鉴定结果。
[0005]甲羟孕酮人工抗原合成路线图如图4所示。
合成步骤如下:
Cl)甲羟孕酮半抗原的制备:甲羟孕酮34.4mg (0.1mmol)溶解于3mL无水二甲亚砜中为A液,二溴乙酸27.8mg (0.2mmol)溶解于1.4mL无水二甲亚砜中为B液,A液中加入氢氧化钾粉末208.5mg (1.5mmol),室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，溴取代甲羟孕酮17位羟基上的H键，成为带有羧基的甲羟孕酮半抗原，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原(MP-2CME)粉末。产物溶解于甲醇后用LC-MS鉴定。
[0006](2)甲轻孕酮人工抗原的制备:称取甲轻孕酮半抗原4.02mg (0.01mmol, Mw=402)溶解于600 μ L无水N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，置于4°C冰浴中搅拌，溶液预冷后加入
5.94 μ L (0.025mmol,Mw=185.35，P =0.78)三正丁胺，冰浴条件搅拌 30min，加入 3.24 μ L(0.025mmol,Mw-136.6，P =1.053)氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌I小时，得活化后小分子溶液C液。称取载体蛋白BSA 10.6mg (Mw=64000)溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，得蛋白溶液。在冰浴条件下，将C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8小时。反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮人工抗原混合液。
[0007]剪取透析袋约8.0 cm，煮沸消毒约lOmin，用去离子水冲洗多次，将甲羟孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析三天,期间每天换液三次，透析结束后取出甲羟孕酮人工抗原分装在ImL的无菌的离心管，在-20°C保存，备用。该甲羟孕酮人工抗原作为免疫原，将载体蛋白换为OVA，方法不变，合成的完全抗原为包被原。
[0008](3)甲羟孕酮人工抗原鉴定:紫外分光光度法对甲羟孕酮人工抗原鉴定。原理是利用不同分子有各自不同的紫外吸收峰，在偶联的过程中，根据光谱叠加原理，偶联产物会有二种偶联物质的吸收峰，由此比较得出偶联是否成功。
[0009]酶标板法鉴定是用间接ELISA方法检测血清效价:
1)包被:将包被抗原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100 μ L/孔，37°C孵育
2h ；
2)洗涤:将板内溶液倾去,每孔注入200μ L PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次。以下洗涤方法相同；
3)封闭:拍干后，加入200μ L/孔封闭液，37°C孵育2h，洗涤后烘干备用；
4)加样:酶标板上半部分加入PBS，50μ L/孔(上半部分称为O标)，下半部分加入不同浓度的甲羟孕酮或者孕酮标准品(用PBS稀释)，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50 μ L/孔(下半部分成为加标)，上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37°C孵育30min ;充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG,100yL/孔，37°C孵育30min,洗涤后拍干；
5)显色:将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μ L的显色液(TMB与底物液比例
I: 5)，37°C避光反应 15min ;
6)终止和测定:取出酶标板,每孔加入50μ L终止液(2mol/L的硫酸)终止反应,然后用酶标仪测定各孔的吸光值A45tlt5
[0010]7)结果判读:以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为O标一半的即是所加的标准品浓度。
[0011]本发明的有益效果:本发明成功的合成甲羟孕酮人工抗原，合成过程简单，抗原产物暴露了孕激素共同结构，为以后筛选群选性甲羟孕酮单克隆抗体奠定基础，得到的群选性单克隆抗体可以满足国内对孕激素多重检测的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是甲羟孕酮半抗原色谱图。
[0013]图2是甲羟孕酮半抗原质谱图，质谱图目标质核比402，负离子。
[0014]图3是甲羟孕酮人工抗原紫外光谱图。
[0015]BSA:牛血清白蛋白；OVA:鸡血清白蛋白；MP_2CME:甲羟孕酮半抗原；MP-2CME-0VA:包被原；MP-2CME_BSA:免疫原。
[0016]图4甲羟孕酮人工抗原合成路线图。
【具体实施方式】
[0017]实施例1:
(O甲羟孕酮半抗原的制备:
甲轻孕酮34.4mg (0.1mmol)溶解于3mL无水二甲亚砜中为A液，二溴乙酸27.8mg(0.2mmol)溶解于1.4mL无水二甲亚砜中为B液，A液中加入氢氧化钾粉末208.5mg(1.5mmol),室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，溴取代甲羟孕酮17位羟基上的H键，成为带有羧基的甲羟孕酮半抗原，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原(MP-2CME)粉末。产物溶解于甲醇后用LC-MS鉴定。
[0018](2)甲羟孕酮人工抗原的制备:
称取甲羟孕酮半抗原4.02mg(0.01mmol，Mw=402)溶解于600 μ L无水N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，置于4°C冰浴中搅拌，溶液预冷后加入5.94μ L(0.025mmol, Mw=185.35，P =0.78)三正丁胺，冰浴条件搅拌 30min，加入 3.24yL (0.025mmol, Mw-136.6, P =1.053)氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌I小时，得活化后小分子溶液C液。称取载体蛋白BSA 10.6mg(Mw=64000)溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，得蛋白溶液。在冰浴条件下，将C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8小时。反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮人工抗原混合液。
[0019]剪取透析袋约8.0 cm，煮沸约lOmin，用去离子水冲洗多次，将甲羟孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析三天，期间每天换液三次，透析结束后取出甲羟孕酮人工抗原分装在ImL的无菌的离心管，在_20°C保存，备用。该甲羟孕酮人工抗原作为免疫原，将载体蛋白换为OVA，方法不变，合成的完全抗原为包被原。
[0020](3)甲羟孕酮人工抗原鉴定:紫外分光光度法对甲羟孕酮人工抗原鉴定。原理是利用不同分子有各自不同的紫外吸收峰，在偶联的过程中，根据光谱叠加原理，偶联产物会有二种偶联物质的吸收峰，由此比较得出偶联是否成功。
[0021 ] 酶标板法鉴定是用间接ELISA方法检测血清效价:
1)包被:将包被抗原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100 μ L/孔，37°C孵育
2h ；
2)洗涤:将板内溶液倾去,每孔注入200μ L PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗洗涤3次。以下洗涤方法相同；
3)封闭:拍干后，加入200μ L/孔封闭液，37°C孵育2h，洗涤后烘干备用；
4)加样:酶标板上半部分加入PBS，50μ L/孔(上半部分称为O标)，下半部分加入不同浓度的甲羟孕酮或者孕酮标准品(用PBS稀释)，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50 μ L/孔(下半部分成为加标)，上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37°C孵育30min ;充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG,100yL/孔，37°C孵育30min,洗涤后拍干；
5)显色:将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μ L的显色液(TMB与底物液比例I: 5)，37°C避光反应 15min ;
6)终止和测定:取出酶标板,每孔加入50μ L终止液(2mol/L的硫酸)终止反应,然后用酶标仪测定各孔的吸光值A45tl ；
7)结果判读:以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为O标一半的即是所加的标准品浓度。
[0022]甲羟孕酮和孕酮测试结果如表1所示，甲羟孕酮IC5Q=5ng，孕酮IC5(l=20ng。
[0023]表1
【权利要求】
1.一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，其特征在于以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原； 具体合成步骤: (1)甲轻孕酮半抗原的制备:取甲轻孕酮0.1mmol溶解于3mL无水二甲亚砜中为A液，二溴乙酸0.2mmol溶解于1.4mL无水二甲亚砜中为B液，A液中加入氢氧化钾粉末1.5mmol,室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，溴取代甲羟孕酮17位羟基上的H键，成为带有羧基的甲羟孕酮半抗原，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原MP-2CME粉末； (2)甲轻孕酮人工抗原的制备:称取甲轻孕酮半抗原0.01mmol溶解于600 μ L无水N, N- 二甲基甲酰胺DMF中，置于4°C冰浴中搅拌，溶液预冷后加入0.025mmol三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入0.025mmol氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌lh，得活化后小分子溶液C液；称取载体蛋白BSA 10.6mg，溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液CBS中，得蛋白溶液；在冰浴条件下，将小分子溶液C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8h ;反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮人工抗原混合液； 剪取透析袋煮沸消毒，将甲羟孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液PBS透析三天，期间每天换液三次，透析结束后取出甲羟孕酮人工抗原分装在ImL的无菌的离心管，在_20°C保存，备用； 该甲羟孕酮人工抗原作为免疫原，将载体蛋白换为0VA，方法不变，合成的完全抗原为包被原。
【文档编号】C07K14/77GK104130325SQ201410313996
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】胥传来, 孔娜, 匡华, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:无锡杰圣杰康生物科技有限公司, 江南大学