三功能抗凝血酶和抗血小板的肽的制作方法

专利名称：：三功能抗凝血酶和抗血小板的肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型肽，它们是有用的抗凝血剂和抗血小板剂。抗凝血剂在例如急性深度静脉血栓形成、肺栓塞、急性末端动脉栓塞、心肌梗塞形成、中风和播散性血管内凝固的治疗中是有用的治疗剂。认为抗凝血剂的预防用药能防止风湿性或动脉硬化性心脏病病人栓塞的复发，防止某些外科血栓栓塞性并发症。抗凝血剂用药已用于冠状动脉和脑血管疾病的治疗中。动脉血栓形成，特别是给心肌和脑供血的动脉，是主导死因。血小板介导的动脉血栓形成是前段中所列疾病的主要致病机理。因此，血小板凝聚和凝血酶的联合抑制提出一种设计抗血栓剂的有用途径。血纤维蛋白原通过Arg—Gly—Asp(RGD)序列与活化的血小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体(整合蛋白(integrin)族的一员)结合，是各种主动肌诱发的血小板凝聚的基本步骤。F.A.Mar-guerie等，J.Biol.Chem.254,5357—5363(1979)；D.Collen等，ThrombolysisinCardiovascularDisease，D.Julian，等(编)，MarcelDekker，Inc.，NewYork(1989)；pp45—67。含直链和环状RGD的合成肽抑制这种结合。E.F.Plow等，Prog.Hemostas.Thromb.9，117—156(1989)；E.F.Plow等，Proe.Natl.Acad.Sci.，USA82，8057—8061(1985)。近期研究表明，在单杂交肽中结合凝血酶抑制和血小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa(结合)受体阻断导致抗凝血剂和抗血小板的活性。F.C.Church等，J.Biol.Chem.266，11975—11979(1991)。另外，近期报道了结合催化和阴离子外部结合序列抑制剂成分的肽凝血酶抑制剂。J.M.Maraganore等，Biochemistry，29，7095—710l(1990)和J.DiMaio等，J.BiolChem.，265，21698—21703(1990)。确定这些肽的活性的关键特征是通过适宜长度的间隔区结合到凝血酶活性部位和外部的两组分的分离。这些研究表明，在催化部位抑制剂和阴离子外部结合序列间含有最少4个氨基酸残基的肽是最大凝血酶抑制所必需的。这些报道支持交联研究所得出的结果，交联研究表明，结合到凝血酶上阴离子外部结合部位的水蛭素类似物的NH2末端和凝血酶催化袋中Ser—195的羟基之间的距离约为18—20。B.Fu-rie等，J，Biol.Chem.，257，3875—3882(1982)和W.Bode等，EM-BOJ.，8，3467—3475(1989)。1992年6月25日公开的专利合作条约申请公开号WO92/10575特别公开了血小板活化和凝血酶的三功能抑制剂。这些抑制剂包括糖蛋白IIb/IIIa抑制部分和凝血酶抑制部分，凝血酶抑制部分包括结合到并抑制凝血酶活性部位的指向催化部位的部分。指向催化部位的部分通过带有计算长度约在18和42之间的主链的连接基团结合到阴离子外部结合部位缔合部分。申请人已发现，当凝血酶催化部位抑制剂(例如，(D)Phe—Pro—Arg，或其类似物)通过环状Arg—Gly—Asp—X“桥接”序列与阴离子外部结合部位缔合部分(水蛭素55-65类似物)结合时，得到结合了凝血酶的催化和阴离子外部结合部位抑制以及血小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体抑制的三功能肽。另外当提供连接凝血酶催化部位抑制剂和水蛭素55-65类似物的二硫键的半胱氨酸残基是(D)构型时，发现肽的抑制血小板凝聚和抗凝血剂活性显著提高。当正亮氨酸代替了环状Arg—Gly—Asp—X“桥接”序列中的苯丙氨酸时，活性还可提高。这种新型化合物由于双重作用方式和能力提高，将提供有效的辅助治疗。下式化合物X—A—B—C—Y(1)式中，X是一种氨基端残基，选自氢、一种或两种1至6个碳原子的烷基、一种或两种2至10的碳原子的酰基、羰苄氧基、H2NC(＝NH)—或叔丁氧基羰基；A是一种下式肽类似物A1—A2—A3(2)式中，A1是(D)Phe，(D)phg，(D)1—Tiq，(D)3—Tiq，N—Me—(D)Phe，(D)Cha，(D)Chg，(D)Nag，或(D)Thg；A2是Pro，Pip或Azt；A3是Arg，Lys，Orn，或hArg；B是下式肽类似物或式中，B1是Gly，Ala，(D)Ala，Val，(D)Val，或Gly—Gly；B2是Gly，Gly—Gly，Gly—Gly—Gly，Gly—Gly—Gly—Gly或任何(D)氨基酸；B2′是Arg—Ile—Pro或Lys—Ile—Pro；B3是Arg，hArg，N—Me—Arg或Lys；B4是Nle，Phe，Met或Cha；C是下式肽类似物Asp—C1—C2—C3—C4—C5—C6—C7—C8—C9(5)式中，C1是Phe，pClPhe，pNO2Phe，Tha，Npa，Tyr或Trp；C2是Glu或Asp；C3是任何氨基酸；C4是Ile，Val，Leu或Phe；C5是Pro，Hyp，Sar，NMePgl或D—AlaC6是任何氨基酸；C7是任何氨基酸；C8是Tyr，Glu，Pro，Ala—Cha，Tur—Cha，Tur—Leu和Ala—Tyr；C9是一种键或是Glu，(D)Glu，Gln，Pro，Leu—Gln，Asp—Glu，或Leu—Pro；以及Y是羧基端残基，选自OH，C1—C6烷氧基、氨基、单或双(C1—C4)烷基取代的氨基，或苄氨基；或其药学上可接受的盐是有用的抗凝血剂。本发明还涉及将上述化合物用于血管成形术后的急性闭塞、体外循环诱发的血细胞减少症、进行性心肌梗塞形成和血纤维蛋白溶解疗法后的闭塞。图1以条线图形式表明在鼠中肽2对FeCl3动脉闭塞时间的影响。用没画阴影的条线表示对照，用画阴影的条线表示肽2。图中，p表示概率，n表示被测试动物的数量。图2以条线图形式表示在鼠中肽2d(不属于本发明对FeCl3动脉闭塞的影响。用没画阴影的条线表示对照，用画阴影的条线表示肽2。图中，p表示概率，n表示被测试动物的数量。图3表示肽1对凝血酶增强的全血凝聚的影响。(▲)代表人血样，(+)代表鼠血样。图4表示在麻醉的狗中，肽1输注对凝血酶时间的影响。(▲)代表5nmol/Kg/nin的速率，(+)代表1nmol/Kg/min的速率，()代表输注期。图5表示在麻醉的狗中，肽1对aPTT的影响。(▲)代表5n-mol/Kg/min的速度，(+)代表1nmol/Kg/min的速率，()代表输注期。图6表示在狗中肽1输注对凝血酶—血小板凝聚的影响。(▲)代表5nmol/Kg/min速率，(+)代表1nmol/Kg/min的速率，()代表输注期。图7表示在麻醉的狗中肽1对出血时间的影响。(▲)代表5nmol/Kg/min的速率，(+)代表1nmol/Kg/min的速率，()代表输注期。图8表示在麻醉的狗中肽1输注对血小板计数的影响。(▲)代表5nmol/Kg/min的速率，(+)1nmol/Kg/min的速率，()代表输注期。图9表示在麻醉的狗中肽1对平均血压的影响。(▲)代表5nmol/Kg/min的速率，(+)1nmol/Kg/min的速率，()代表输注期。图10表示在麻醉的狗中，肽1输注对心率的影响。(▲)代表5nmol/Kg/min的速率，(+)1nmol/Kg/min的速率，()代表输注期。图11以条线图形式表示在鼠中肽1对FeCl3动脉闭塞时间的影响。用没画阴影的条线代表对照，用画阴影的条线代表肽1，图中，p代表概率，n表示被测试动物的数量。本说明书全文中，使用如下氨基酸以及氨基和羧基末端基团的常用缩写Gly(或G)——甘氨酸Ala(或A)——丙氨酸Val(或V)——缬氨酸Leu(或L)——亮氨酸Ile(或I)——异亮氨酸Pro(或P)——脯氨酸Phe(或F)——苯丙氨酸Trp(或W)——色氨酸Ser(或S)——丝氨酸Met(或M)——蛋氨酸Thr(或T)——苏氨酸Cys(或C)——半胱氨酸Tyr(或Y)——酪氨酸Gln(或Q)——谷氨酰胺Asn(或N)——天冬酰胺Asp(或D)——天冬氨酸Glu(或E)——谷氨酸Lys(或K)——赖氨酸Arg(或R)——精氨酸His(或H)——组氨酸Nle——正亮氨酸Chg——环己基甘氨酸Cha——β—环己基丙氨酸Pip——2—哌啶酸、2—哌啶酸、或2—哌啶羧酸Azt——2—氮杂环丁烷羧酸Orn——鸟氨酸hArg——高精氨酸N—Me—Arg——N—甲基精氨酸N—Me—(D)Phe——N—甲基—D—苯丙氨酸Thg——3—噻吩甘氨酸Nag——萘基甘氨酸1—Tiq——1，2，3，4—四氢异喹啉—1—羧酸3—Tiq——1，2，3，4—四氢异喹啉—3—羧酸Phg——苯甘氨酸pClPhe——对氯苯丙氨酸pNO2Phe——对硝基苯丙氨酸Tha——3—(2—噻吩丙氨酸)Npa——β—(2—萘基)丙氨酸Hyp——羟脯氨酸Sar——肌氨酸(N—甲基甘氨酸)N—Me—Phg——N—甲基—苯甘氨酸Pen——青霉胺Cys′——当两个或多个氨基酸结合形成肽时，水单元被除去，每种氨基酸的残余部分在本申请中被称作残基。因此，“残基”是缺少末端氨基的氢原子，和/或缺少末端羧基的羟基的氨基酸。用接受的术语，氨基酸或氨基酸衍生物的三字母代码之前(指缺少氢)和/或之后(指缺少羟基)的破折号(—)是指残基。Cys′残基用式(5)表示，它表示在R基侧链上不带硫基的半胱氨酸。如式(3)和(4)所示，(D)Cys′残基通过二硫键连接。如式(6)所示，二硫基通过(D)Cys′的亚甲基结合到(D)Cys′上注意，式(5)和(6)可表示D—或L—残基。本说明书全文中，使用如下的各种保护性基团的常用缩写Boc＝叔丁氧羰基Bzl＝苄基Mbz＝对甲苄基Chx＝环己基Tos或Tosyl＝对甲苯磺酰Cbz＝苄氧羰基Brz＝溴苄氧羰基Suc＝琥珀酰Ac＝乙酰PAM＝苯基乙酰氨基甲基烷基和烷氧基的烷基部分包括直链、支链或环烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和环戊甲基。2至10个碳原子的酰基包括直链、支链、环状、饱和和不饱和酰基，每个酰基含有1或2个羰基，例如，乙酰基、苯甲琥珀酰、马来酰和戊二酰。卤代基是氟、氯、溴或碘基。此处所用术语“任何氨基酸”包括自然发生的氨基酸以及肽化学领域技术人员制备自然发生的肽的类似物时常用的“非蛋白质”α—氨基酸。自然发生的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。“非蛋白质”α—氨基酸的例子是正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、高精氨酸、硫脯氨酸、脱氢脯氨酸、羟脯氨酸(Hyp)、高丝氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、α—氨基正丁酸(Aba)、环己基丙氨酸(Cha)、氨基苯丁酸(Pba)，下面—种或两种基团在苯的邻位、间位或对位取代的苯丙氨酸，(C1—C4)烷基、(C1—C4)烷氧基、卤基、或硝基，或被亚甲二氧基取代的苯丙氨酸，β-2—和3—噻吩丙氨酸，β—2—和3—呋喃丙氨酸，β—2—，3—，和4—吡啶丙氨酸，β—(苯并噻吩—2—和3—基)丙氨酸，β—(1—和2—萘基)丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸的O—烷基化衍生物，S—烷基化半胱氨酸，酪氨酸的S—硫酸酯，3，5—二碘酪氨酸和自然发生氨基酸的D异构体。除甘氨酸以外的天然氨基酸含有手性碳原子。除另有明确说明外，此处所指旋光活性的氨基酸是L—构型的。带R取代基的碳原子在立体化学上或是D—构型或是L—构型。为本公开的目的，D—构型的氨基酸表示为D—氨基酸，(D)氨基酸，或在采用一字母命名系统时用小写字母表示，例如表示苯丙氨酸时D—Phe，(D)Phe或f都是可接受的表示形式。按习惯，这里的肽结构是这样写出的，氨基末端写在链的左侧，羧基末端写在链的右侧。式1多肽可与任何无毒的有机或无机酸形成药学上可接受的酸加成盐。形成合适的酸加成盐的无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、磺酸和磷酸以及金属酸盐如磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的有机酸的例子包括单、双和三羧酸。这些酸的例子有，例如，乙酸、三氟乙酸、二醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2—苯氧基苯甲酸以及磺酸如甲磺酸和二羟基乙磺酸。羧基末端氨基酸部分的盐包括与任何合适的无机或有机碱形成的无毒羧酸盐。这些盐包括与碱金属如钠和钾；碱土金属如钙和镁；包括铝的IIIA族轻金属；以及有机伯胺、仲胺和叔胺，例如三烷基胺(包括三乙胺、普鲁卡因、二苄胺、1—乙烯胺，N，N′—二苄乙烯二胺、二氢枞胺、N—(低级)烷基哌啶和其它合适的胺)形成的盐。式1化合物是新型肽，它们结合了凝血酶抑制和单杂交肽中血小板糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体的拮抗作用。本发明的每种肽含有通过含有连接“桥”和作为血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物的连接部分(即B区)结合到凝血酶阴离子外部结合抑制剂(即C区)上的凝血酶催化部位抑制剂(即A区)。A区描述针对凝血酶催化部位的抑制剂。这种针对催化部位的基团结合到凝血酶的活性部位并抑制或阻碍凝血酶的活性。C区描述凝血酶抑制剂，其特征是作为阴离子外部结合部位缔合基团。既然C区的互换在结构上类似于水蛭素的羧基末端部分，可以推断，C区容易结合到凝血酶上的阴离子外部结合部位上。B区含有两个功能区——催化部位抑制剂(A区)与阴离子外部结合部位抑制剂(C区)间的连接“桥”和环状RGD—X糖蛋白IIb/IIIa抑制基团。催化部位抑制剂(A区)与阴离子外部结合部位抑制剂(C区)间的连接“桥”是环状RGD—X序列的基础。认为这种含有B1基团的残基、Pro、(D)Cys′和连接B区两(D)Cys′残基的二硫键的桥充当催化部位抑制序列和阴离子外部结合识别序列间的适宜间隔区。由于以比其它氨基酸残基的酰胺键低得多的速率切割A3和Pro间天然发生的酰亚胺键，这种连接“桥”在B1和A3基团间含有脯氨酸残基。理论上认为(尽管本发明不受此理论约束)酰亚胺键的存在是针对催化部位的基团的抑制作用的原因。当然，可以设想，其它酰胺键取代的氨基酸也能起功能等效物的作用，例如，还原的酰胺、酯、酮和硫醚。B区的环状RGD—X糖蛋白IIb/IIIa抑制基团，即B区两D—Cys残基间的那些氨基酸残基，抑制血纤维蛋白原和其受体(糖蛋白IIb/IIIa)间的相互作用。B区的环状RGD—X糖蛋白IIb/IIIa抑制基团可含有式(3)和(4)所示的6至11个氨基酸。优选B区的环状RGD—X糖蛋白IIb/IIIa抑制基团是式(3)并含有式(3)所示的6至11个氨基酸。为本发明之目的，应该理解，A1结合到氨基末端基团(X)上，而A3结合到基团B的N末端或左侧的Pro残基上。基团C的N末端或左侧的Asp残基结合到基团B的C末端或右侧的B1残基上。正如任何化合物基团一样，某些基团是优选的。发明人优选那些式(1)肽衍生物，其中，X是氢，乙酰基，琥珀酰、或叔丁氧基羰基；A1是(D)Phe，(D)Chg，(D)Cha，(D)Phg，(D)1—Tiq，(D)Tiq，或N—Me—(D)Phe；A2是Pro；A3是Arg或Lys；B是式(3)或式(4)；B1是Gly，Ala或Gly—Gly；B2是Gly，Gly—Gly或任何(D)氨基酸(当B为式(3)时)；B′2是Arg—Ile—Pro或Lys—Ile—Pro(B为式(4)时)；B3是Arg或N—Me—Arg；B4是Nle，Phe，Cha，Met；C1是Phe，Npa或Tyr；C2是Glu或Asp；C3是任何氨基酸；C4是Ile或Val；C5是Pro，Hyp，或(D)Ala；C6是任何氨基酸；C7是Glu，Asp或Ala；C8是Tyr，Glu，Tyr—Leu，Tyr—Cha或Ala—Cha；C9是一种键，(D)Glu，Glu，Gln，Leu—Gln或Leu—Pro；以及Y是OH，C1—C6烷氧基，或者单或双—(C1—C4)烷基取代的氨基。那些式(1)化合物也是优选的，其中，X是氢，乙酰基或正丁氧基羰基；A1是(D)Phe，(D)Phg，(D)3—Tiq或N—Me—(D)Phe；A2是Pro；A3是Arg；B是式(3)或式(4)；B1是Gly；B2是Gly，(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro(当B是式(3)时)；B′2是Arg—Ile—Pro(当B是式(4)时)；B3是Arg或N—Me—Arg；B4是Nle或Phe，但当B2是(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro时B4是Nle；C1是Phe或Tyr；C2是Glu；C3是Glu或Pro；C4是Ile；C5是Pro或(D)Ala；C6是Glu或Ala；C7是Glu；C8是Tyr，Tyr—Leu，Tyr—Cha或Ala—Cha；C9是一种键或(D)Glu；以及Y是OH，C1—C6烷氧基，或者单或双(C1—C4)烷基取代的氨基。特别优选的是那些式(1)肽衍生物，其中，X是氢，乙酰基或丁氧基羰基；A1是(D)Phe，(D)Phg，(D)3—Tiq或N—Me—(D)Phe；A2是Pro；A3是Arg；B是式(3)；B1是Gly；B2是Gly，(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro；B3是Arg；B4是Nle或Phe，但当B2是(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro时，B4是Nle；C1是Phe；C2是Glu；C3是Pro；C4是Ile；C5是Pro；C6是Glu或Ala；C7是Glu；C8是Tyr，Tyr—Cha或Ala—Cha；C9是一种键或(D)Glu；以及Y是OH，C1—C6烷氧基可通过本领域熟练技术人员已知的各种程序制备本发明的肽。这些程序包括(但不局限于)固相顺序程序，它是运用已建立的自动方法例如借助自动肽合成仪进行的。此程序中，α—氨基保护的氨基酸结合到树脂载体上。所用树脂载体可以是多肽固相制备技术中常用的任何适宜的树脂，优选与0.5％到约3％二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，它或是氯甲基化的或是羟甲基化的，提供与初始加入的α—氨基保护的氨基酸形成酯的位点。羟甲基树脂的一个例子如Bodanszky在Chem，Ind.(London)38，1597—98(1966)中所述。氯甲基化树脂可从BioRadLaborato-ries，Richmond，California购得，Stewart等描述了这种树脂的制备，“SolidPhasePeptideSynthesis”(Freeman&amp;Co.，SanFrancisco1969)，Chapter1，PP.1—6。被保护的氨基酸可通过Gisin，Helv.ChemAeta.56，1476(1973)所述程序结合到树脂上。例如，为制备多肽(其中，羧基末端是(D)Glu残基)，在约50℃下Boc—D—Glu(Bzl)偶联到氯甲基化聚苯乙烯上，作为其钯盐。α—氨基酸偶联到树脂载体上之后，用任何适宜程序除去保护性基团，例如采用亚甲基氯中的三氟乙酸，单独使用三氟乙酸，或者二氧六环中的HCl。在0℃和室温间的温度下进行去保护。可使用用于除去特定α—氨基保护性基团的其它标准切割试剂和条件。除去α氨基保护性基团后，其它α—氨基保护的氨基酸按所需顺序逐步偶联。与树脂支持的氨基酸序列偶联之前，可选用溶液方法偶联多个氨基酸基团。引入多肽序列的每种氨基酸所用α—氨基保护性基团可以是本技术中已知的任何保护性基团。α—氨基保护性基团中，可考虑的类型有(1)酰基类保护性基团，例如，甲酰，三氟乙酰，邻苯二甲酰，甲苯磺酰，苯磺酰，硝基苯硫基，三苯甲游基硫基，邻硝基苯氧基乙酰和α—氯丁酰；(2)芳尿烷类保护性基团，如苯氧基羰基和取代的苯氧基羰基，如对氯苄氧基羰基，对硝基苄氧基羰基，对溴苄氧基羰基，对甲氧基苄氧基，1—(对二苄基)—1—甲基乙氧基羰基，α，α—二甲基—3，5—二甲氧基苄氧基羰基和二苯甲氧基羰基；(3)脂族尿烷保护性基团，如叔丁氧基羰基(Boc)，二异丙基甲氧基羰基，异丙氧基羰基，乙氧基羰基和烯丙氧基羰基；(4)环烷基尿烷类保护性基团，例如环戊氧基羰基，金刚烷氧基羰基和环己氧基羰基；(5)硫代尿烷类保护性基团，例如，苯硫代羰基；(6)烷基保护性基团，例如，三苯甲基和苄基；以及(7)三烷基硅烷基，例如，三甲基硅和苄基；以及(7)三烷基硅烷基，例如，三甲基硅烷基。优选的α—氨基保护性基团是叔丁氧基羰基。合适的偶联剂的选择属于本领域的技术。要加入的氨基酸是Glu，Asn或Arg时，特别合适的偶联剂是N，N′—二异丙基碳化二亚胺和1—羟基苯并三唑。这些试剂的使用防止了腈和内酰胺的形成。其它偶联剂有(1)碳化二亚胺(例如，N，N′—二环己基碳化二亚胺和N—乙基—N′—(Y—二甲基氨基丙基碳化二亚胺)；(2)氨腈(例如，N，N—二苄基氨腈)；(3)烯酮亚胺；(4)异噁唑鎓盐(例如，N，N′—乙基—5—苯基—异噁唑鎓—3′—磺酸盐)；(5)单环的含氮芳香杂环酰胺，环上含有1至4个氮，例如咪唑化物，吡唑化物和1，2，4—三吡咯化物。有用的特殊杂环酰胺包括N，N′—羰基二咪唑和N，N′—羰基—二—1，2，4—三吡咯；(6)烷氧化乙炔(例如乙氧基乙炔)；(7)与氨基酸的羧基(例如，氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯)或要偶联的氨基酸(例如，Boc—Ala—O—Ala—Boc)形成混合酐或对称酐的试剂以及(8)一个环上氮带羟基的含氮杂环化合物(例如，N—羟基苯邻二甲酰亚胺，N—羟基琥珀酰亚胺和1—羟基苯并三唑。Kapoor在J.Pharm.Sci.，59，PP.1—27(1970)中描述了其它活化剂及其在肽的偶联中的应用。对除Arg，Asn和Gln外的所有氨基酸，申请人优选对称酐作为偶联剂。将过量约2倍至约4倍的每种被保护的氨基酸或氨基酸序列加入固相反应器。在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)或只有二甲基甲酰胺或只有二氯甲烷的基质中进行偶联。在发生不完全偶联的情形中，在固相反应器中偶联下一个氨基酸之前，要在除去α—氨基保护性基团前重复进行偶联程序。如E.Kaiser等在Analyt.Biochem.34.595(1970)中所述，用茚三酮反应监测每一合成步骤中偶联反应的完成。得到所需氨基酸序列后，在本技术中已知的条件下将肽从树脂上除去。例如，用无水氢氟酸中的5％茴香醚溶液处理结合到树脂上的多肽可完成此步骤。如固相肽合成技术中所知的那样，许多氨基酸具有链制备过程中需要保护的功能。合适的保护性基团的使用和选择是技术熟练人员能力所及的，它决取于要保护的氨基酸以及肽上其它被保护的氨基酸残基的存在。选择这种侧链保护性基团的关键是，它必须是一种在切割α—氨基的保护性基团过程中不被切掉的基团。例如，天冬氨酸和谷氨酸的羧羟基可用苄基或环己基保护。优选的保护性基团是苄基。可用本技术中已知方法除去这些基团。通常，保护性基团的除去是在肽链合成完成之后进行的。例如，伴随着用无水氢氟酸中的5％茴香醚溶液从树脂上除去肽进行肽，的去保护。也可以在其它合适的时间除去保护性基团。本发明肽类似物的抗凝血剂和抗血小板剂量是0.2mg/Kg至250mg/Kg病人体重/天，这取决于病人、要治疗的血栓形成疾病的严重性以及所选用的肽类似物。可以很容易地确定对一特定病人的合适剂量。优选每天服用1至4次，通常每次剂量含5mg至100mg活性化合物。抗凝血剂疗法用于各种血栓疾病，特别是冠状动脉和脑血管疾病的治疗和预防，还用于例如通过溶解存在的血块治疗冠状动脉闭塞。抗血小板疗法用于预防心肌血栓形成和中风的复发。那些本领域熟练人员很容易意识到需要抗凝血剂和抗血小板疗法的情况。认为，本发明的肽在血管成形术后的冠状动脉血栓形成的预防中、在体外循环中血小板减少症的预防中，在血纤维蛋白溶解疗法后的闭塞的预防中，阻止或推延进行性心肌梗塞形成中有独特优点。此处所用术语“病人”是指哺乳动物，例如，灵长目，包括人、羊、马、牛、猪、狗、猫、鼠或小鼠。尽管口服后肽衍生物中有一些经过肠道能存留下来，但发明人优选非口服用药，例如，皮下、静脉内、肌内或腹膜内给药；通过积存注射给药；通过植入制剂；或通过粘膜，如鼻粘膜、喉粘膜和支气管粘膜，例如，在气雾剂中含有喷雾剂或干粉末形式的本发明的肽衍生物。对非肠道给药，可以化合物在含有药物载体的生理上可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液的注射剂量用药。该载体可以是灭菌的液体如水和油，可以加入或不加入表面活性剂和其它药学上可接受的佐剂。可用于这些制品的油的例子是那些来源于石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油，豆油和矿物油。一般说来，水、盐水，含水右旋糖和有关的糖溶液，乙醇或乙二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液态载体，对注射液而言尤为如此。实施例实施例l—12表示式1肽的典型的合成。这些实施例仅作为例子，而不以任何形式限制本发明。对本技术熟练人员而言，实施例1—12的试剂和原材料都是容易得到的。实施例1—12中所用下列术语的意义是指“DCM”指二氯甲烷，“DIEA”指二异丙基乙胺，“MeOH”指甲醇，“DCC”指N，N′—二环己基碳化二亚胺，“DMF”指N，N′—二甲基甲酰胺，“HOBt”指1—羟基苯并三唑，“TFA”指三氟乙酸，“eq”指当量，“meq”指毫克当量，“g”指克、“mg”指毫克，“mmol”指毫摩尔，“ml”指毫升，“℃”指摄氏度，“TLC”指薄层色谱，“Rf”指保留因子，“μl”指微升，“μg”指微克，“μM”指微摩尔浓度，“mmHg”指毫米汞柱，“δ”指四甲基硅烷低场百万分数。实施例1(SEQIDNO1)的制备。根据下表，用Dupont250半自动肽合成仪通过后面的Boc—氨基酸的逐步去保护和偶联，使Boc—(D)Glu(Bzl)—Pam—树脂(PeninsulaLaboratories，Belmont，California)延长。试剂/溶剂时间(秒)#重复DCM301MeOH302DCM303TFA∶茴香醚∶DCM(48∶2∶50)601TFA∶茴香醚∶DCM(48∶2∶50)12001DCM303DIEA∶DCM(10∶90)603DCM302Boc-氨基酸18001DMF301DCM301DIEA∶DCM(10∶90)301DCM302所有Boc—氨基酸以它们过量2倍预先形成的对称酐形式被偶联(Arg除外，它以过量4倍，其HOBt酯的形成被偶联)。以如下方法制备对称酐。将Boc—氨基酸(4eq)溶解于DCM，再加入0.5MDCC/DCM(eq)。搅拌，反应5分钟，对称酐的形成导致二环乙基脲的沉淀，沉淀经过滤除去。向肽树脂加入滤液，用等体积DMF稀释偶联混合物。类似地形成Arg的HOBt酯，将Boc—Arg(Tos)(4eq)溶解于DCM中。加入0.5MHOBt/DMF(4eq)和0.5MDCC/DCM(4eq)。用过滤除去二环己基脲，向肽树脂加入滤液，用等体积DMF稀释偶联混合物。每次偶联后，用本技术中已知的Kaiser茚三酮法检验任何游离胺的存在。如果需要，氨基酸被再次偶联。经上述步骤之后，Boc—D—Glu(Bzl)—Pam—树脂(8.06g，0.31meq/gm，2.5mmol，购自PeninsulaLaboratories，Belmont，Cali-fornia)的延长得到肽—树脂(D)Phe′—Pro—Arg(Tos)—Pro—Gly5—(D)Cys(Nbz)—Gly—Arg(Tos)—Gly—Asp(Chx)10—Nle—Pro—(D)Cys(Mbz)—Gly—Asp(Chx)15—Tyr(Brz)—Glu(Bzl)—Pro—Ile—Pro20—Glu(Bzl)—Glu(Bzl)—Ala—Cha—(D)Glu(Bzl)—Pam—树脂(19.4g肽树脂)。下列氨基酸需用其1摩尔当量的对称酐进行第二次偶联Boc—Cha24，Boc—Glu(Bzl)21，Boc—Tyr(BrZ)16，Boc—Asp(Chx)15，Boc—(D)Cys(Mbz)6，Boc—Pro4，Boc—Pro2和Boc—(D)Phe1。Boc—Arg(Tos)2的偶联用其过量两倍的HOBt酯重复进行两次，随后用乙酸酐∶DIEA∶DCM(10∶5∶85)加帽。将上面制备的肽树脂，(D)Phe1—Pro—Arg(Tos)—Pro—Gly5—(D)Cys(Mbz)—Gly—Arg(Tos)—Gly—Asp(Chx)10—Nle—Pro—(D)Cys(Mbz)—Gly—Asp(Chx)15—Tyr(Brz)—Glu(Bzl)—Pro—Ile—Pro20—Glu(Bzl)—Glu(Bzl)—Ala—Cha—(D)Glu(Bzl)—Pam—树脂分成五份。在下述条件下，对每份树脂进行切割、去保护和环化处理。茴香醚(5％)存在下，将肽—树脂(3.88g)悬浮于无水氢氟酸(20ml)中。约0℃下搅拌反应物约30分钟。然后，在真空下除去氢氟酸，用50％乙酸(2×10ml)、乙酸(2×5ml)和水(3×10ml)提取残留物。用水将合并的提取物稀释至1升，用氢氧化铵调节pH至8.5。加入K3Fe(CN)6(1.0M，约55ml)15分钟以上直至保持黄色，并于室温下搅拌30分钟。用乙酸调节pH至4.0。加入阴离子交换树脂(AG3×4A，Bio—Rad)并搅拌，直至黄色消失。经过滤收集树脂，将滤液冷冻干燥，得到粗肽。将粗肽溶解于50％乙酸中，加到SephadexG—10柱(2.5×70cm)上。用50％乙酸在约10.5ml/h下洗脱。约70—150ml时洗脱出肽。用水稀释洗脱液，冷炼干燥，得到6.17g总产物。通过反相制备HPLC(DynamaxC18，21.4×250mm，Rainin)，在约40ml/min下，以0.1％含水TFA/乙腈的梯度，用BeckmanPrep350系统进—步纯化脱盐原料，得到纯品(1.3g)。(SEQIDNo1)可用相同或类似方法制备下面实施例的肽。实施例2(SEQIDNO2)实施例3(SEQIDNO20)实施例4(SEQIDNO11)实施例5(SEQIDNO12)实施例6(SEQIDNO15)实施例7(SEQIDNO16)实施例8(SEQIDNO18)实施例9(SEQIDNO19)实施例10(SEQIDNO21)实施例11(SEQIDNO22)实施例12(SEQIDNOl0)生物学如上所述，本发明的化合物具有显示显著的凝血酶抑制的性质，表明这些化合物是有效的抗凝血剂，可用于预防静脉和动脉血栓形成疾病以及不稳定的心绞痛，预防冠状动脉血管成形术后的血管突然闭合，血栓形成的辅助治疗和整形外科手术后的深度静脉血栓形成。由于本发明的化合物还含有位于B区连接基团中的环状RGD—X序列，它们还能充当血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物。实施例2的肽的抗凝血和抗血栓形成效果由通过环状的血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物(RGD—X)偶联到水蛭素55-65类似物上的催化部位凝血酶抑制剂(fPR)组成的实施例2的肽(肽2)(SEQIDNO2)与其自身成份的肽作对比。注意，下述实验设备只是推荐使用的，但不以任何形式约束或限制本发明。实验动物可从SpragueDawley，Inc.(Indianapolis，IN46229)购买雄性Sprague—Dawley鼠，并将其用于研究。采血可将血样抽入含有3.8％柠檬酸三钠(1∶10)的塑料注射器中。通过2,000g—力下离心10分钟制备血浆。从健康、未用药、男性志愿者采集用于体外研究的静脉血。凝血分析用DadeDiagnostics，Inc.(Aguada，PuertoRico00602)的试剂和方法进行激活部分促凝血酶原激酶的时间(aPTT)的测定。通过0.1ml鼠血浆与0.1ml0.1MTris缓冲液(pH7.5)于37℃下保温30秒，测定凝血酶凝血时间。用0.1ml牛凝血酶(SigmaDiagnostics，St.Louis，MO63178)溶液(12NIH单位/ml)开始凝血。用MLA—Electra750自动凝血计时器MLA，Inc(Pleasantville，NY10570)半自动地测定全部凝血时间。用简单的线性回归计算加倍凝血时间(ID2)所需的浓度。体外血小板凝聚通过于室温下200g—力下离心10分钟，制备人血小板富集血浆(PRP)。通过2,000g—力下离心10分钟，制备血小板缺乏的血浆(PPP)。PRP仅暴露于塑料实验器具。所有实验在采血3小时内完成。用双路集合度计(Chrono—logCorp.，Haverstown，PAl9083)测定血小板凝聚。用自身PPP定义百分之百的透光率。加入ADP(1μM)或凝血酶后，从PRP测定透光率百分数的最大变化。凝血酶(0.2—2.0单位/ml)引起的血小板凝聚依赖于浓度，最大浓度的一半用于抑制研究。加入ADP或凝血酶之前，肽2(SEQIDNO2)与PRP(0.45ml)保温30秒。测定0.5ml总体积中的凝聚。当与对照值相比时，用抑制百分数表示抑制反应。用简单的线性回归计算造成50％凝聚抑制的浓度(IC50)。鼠中FeCl3动脉血栓形成模型(体内)肽2(SEQIDNO2)在鼠中的体内抗血栓形成效果同样用于评价。例如，在根据R.J.Broersma等，Thromb.Res.64，405—412(1991)的依赖于血小板的凝血酶介导FeCl3引发的鼠颈动脉血栓形成模型中，肽2(SEQIDNO2)用于评价抗血栓形成的活性。如果提出的话，该文献结合入本文，作为参考。结果本研究的结果表明，在血浆凝血和血小板凝聚分析中，肽2(SEQIDNO2)是比其自身成分更有力的抗凝血剂和抗凝血酶。关于表，除一些被修饰的氨基酸和/或保护性基团可用三字母命名系统命名并置于括号中之外，用一字母命名系统命名肽序列中的氨基酸序列。同样，通过在两个(D)Cys′残基和在B区环部分中的所有残基下面划线表示连接(D)Cys′残基的二硫键。表I肽2在人血浆中的抗凝血活性(与其成分相比)</tables>ID2值是使对照的凝血时间加倍所需浓度(测定三次)。aPTT，激活部分促凝血酶原激酶的时间。参考表I，在正常人血浆中的激活部分促凝血酶原激酶的时间(aPTT)和凝血酶时间的分析中，将肽2(SEQIDNO2)的抗凝血活性与其成份——肽2a(SEQIDNO3)，肽2b(SEQIDNO4)，肽2c(SEQIDNO5)和肽2d(SEQIDNO6)——作对比。肽2a—2d(SEQIDNOS3—6)不属于本发明。肽2(SEQIDNO2)分别于约60和24nM下使aPTT和凝血酶时间加倍(ID2)。肽2(SEQIDNO2)活性至少比2b(SEQIDNO4)或2d(SEQIDNO6)(稳定的催化部位抑制剂Me—fPR)高20倍，而2c(SEQIDNO5)(fPRPG五肽)只在高得多的浓度下才有抗凝血活性。肽2a(SEQIDNO3)(环状的RGD—X肽)没有作为抗凝血剂的活性。表II肽2对鼠和人凝血和血小板分析的影响ID2值是使对照的凝血时间加倍所需浓度(测定三次)。aPTT，激活部分促凝血酶原激酶的时间。参照表II，在鼠血浆中进行肽2(SEQIDNO2)的抗凝血研究。对aPTT和凝血酶时间的ID2分别约为181和116nM。因此，与在人血浆中的情况相比，肽2(SEQIDNO2)在鼠血浆中作为抗凝血剂的活性要低3—5倍。表III人血小板凝聚的抑制ID50值是使PRP中的血小板凝聚抑制到对照凝聚的50％所需浓度(测定三次)。如表III中所示，由ADP和凝血酶引起的人血小板凝聚受肽2(SEQIDNO2)的抑制。将ADP引起的血小板凝聚抑制50％的浓度(IC50)约为19μM。这与环状RGD—X肽(IC50＝20μM)，肽2a(SEQIDNO3)相似。抗凝血酶肽2b(SEQIDNO4)和2d(SEQIDNO6)基本不具有作为ADP引起的血小板凝聚的抑制剂的活性(IC50分别＝895和＞1,000μM)。肽2(SEQIDNO2)抑制凝血酶引起的血小板凝聚，IC50值为60nM，比其成分——肽2b(SEQIDNO4)(IC50＝2μM)，肽2d(SEQIDNO6)(IC50＝200nM)和肽2a(SEQIDNO3)(IC50＝13μM)——活性更高。与此对比，由ADP和凝血酶引起的鼠血小板凝聚受肽2(SEQIDNO2)的抑制，分别为IC50＝65μM和14nM(参见表II)。因此，与在人血小板富集的血浆中相比，肽2(SEQIDNO2)在鼠血浆中的活性要低3—4倍。表IV肽2对鼠中动脉血栓形成的影响<a输注60min，自FeCl3损伤前15min开始。b闭塞时间＞90min(n＝4)；*与对照比较，P＜0.05；**与对照比较，P＜0.01评价了肽2(SEQIDNO2)在FeCl3引起的鼠颈动脉血栓形成模型中的抗血栓形成的活性。通过在动脉注入FeCl3前15分钟开始的、以10，25和50nmol/kg/min速率连续1小时的静脉注入肽2(SEQIDNO2)，血栓闭塞依赖于剂量而降低(参见图1)。在50nmol/kg/min的剂量下，4/5的鼠防止了闭塞。在25和10nmol/kg/min速率下，分别有3/5和1/6的鼠防止了闭塞。在50，100和200nmol/kg/min的注入速率下，催化部位抗凝血酶(肽2d)(SEQIDNO6)按剂量延长闭塞时间(参见图2)。表V肽2和其成分对鼠中动脉血栓形成的影响a输注60min，自FeCl3损伤前15min开始。b与对照相比，P＜0.05；**与对照相比，P＜0.01A--50nmol/kg/min，i.v.B--100nmol/kg/min，i.v.C--500nmol/kg/min，i.v.D--200nmol/kg/min，i.v.在50nmol/kg/min的剂量下，有4/5的鼠防止了闭塞。在此模型中，无论是500nmol/kg/nin的水蛭素类似物(肽2b)(SEQIDNO4)，还是100nmol/kg/min的环状RGD—X(肽2a)(SEQIDNO3)，都没有防止对这些鼠的闭塞。表VI静脉内的肽2对凝血分析a的影响a在鼠中FeCl3引起的动脉闭塞研究结束时采集血样baPTT，激活部分促凝血酶原激酶的时间(n＝鼠)实施例1的肽的抗凝血和抭血栓形成的效果类似于肽2(SEQIDNO2)的实施例1的肽(肽1)(SEQIDNO1)，是由通过环状的血小板GPIIb/IIIa受体拮抗物(RGD—X)偶联到水蛭素55-65类似物上的催化部位凝血酶抑制剂(fPR)组成的，它与其自身成分的肽作对比。然而，肽1(SEQIDNO1)是肽2(SEQIDNO2)的类似物，其中，肽2(SEQIDNO2)的环状RGD—X序列中苯丙氨酸(Phe)被正亮氨酸(Nle)取代。本研究中，将肽1(SEQIDNO1)与肽2(SEQIDNO2)，肽3(SEQIDNO7)(肽1的类似物，其中，阴离子外部结合缔合基团(C区)被切掉)和肽4(SEQIDNO8)(肽1的类似物，其只含天然L—氨基酸)作对比。另外，为阐明RGD—X环的取向作用对本发明的肽的活性的影响，将肽5(SEQIDNO9)(肽1(SEQIDNO1)的类似物，具有l0个氨基酸的RGD—X环，仅含天然L—氨基酸)与肽6(实施例12的肽)(SEQIDNO10)(肽1的类似物，具有10个氨基酸的RGD—X环)作对比。肽1，2和6(SEQIDNOS1，2和10)属于本发明，而肽3—5(SEDIDNOS7—9)不属于本发明。注意，仅推荐使用下述实验设备，但不以任何形式约束或限制本发明。实验动物可从SpragueDawley，Inc.(Indianapolis，IN46229)购买雄性Sprague—Dawley鼠(300—400gm)，这些研究中使用两种性别的杂交猎狗(6—11kg)。用戊基巴比妥钠(30mg/kh，iv)麻醉狗。分开股动脉和两股静脉，插管以记录血压(GouldP23ID，GouldInc.，MedicalProductsDivision，Oxnard，CA93030)，采血和给药。将肢体导联置于皮下，以监测导联IIECG。记录血压和ECG测定(Gould440recorder，GouldINc.，InstrumentSystemsDivision，Cleveland，OH441l4)。采血血样被抽入含有3.8％柠檬酸三钠(1∶10)的塑料注射器。通过2,000g—力下离心10分钟，制备血浆。从健康、未用药、男性志愿者采集用于体外研究的静脉血。凝血分析、样本出血时间和血液学用DadeDiagnostics，Inc.(Aguada，PuertoRico00602)的试剂和方法进行激活部分促凝血酶原激酶的时间(aPTT)的测定。通过0.1ml鼠血浆与0.1ml0.1MTris缓冲液(pH7.5)于37℃下保温30秒，测定凝血酶凝血时间。用0.1ml牛凝血酶(SigmaDiagnostics，St.Louis，MO63178)溶液(12NIH单位/ml)开始凝血。用MLA—Electra750自动凝血计时器MLA，Inc(Pleasantville，NY10570)半自动地测定全部凝血时间。用简单的线性回归计算加倍凝血时间(ID2)所需的浓度。t1/2的确定是用于计算1和5nmol/kg/min速率注入肽1(SEQIDNO1)后的抗凝血酶活性(凝血酶时间)。用反应数据对时间的线性回归估计t1/2。除去毛发后(Nair，Carter—Wallace，Inc.，NewYork，NY10105)，用Surgicutt出血时间设备(InternationalTechnidyneCorp.，Edison，NJ08820)在左腿中部皮肤上进行样品出血时间的测定。给药前60和30分钟，给药后15，30，60，120，180和240分钟测定样本出血时间。用血液分析仪(TechniconH1，MilesTechnicon，TarrytownNY10591)对用EDTA阻凝的140μL血样进行全血细胞计数和血红蛋白含量分析。给药前60和30分钟，给药后15，30，60，120，180和240分钟取样。血小板凝聚试验通过于室温下200g—力下离心10分钟，制备人血小板富集血浆(PRP)。通过2,000g—力下离心10分钟，制备血小板缺乏的血浆(PPP)。PRP仅暴露于塑料实验器具。所有实验在采血3小时内完成。用Chrono—log双路集合度计(Chrono—logCorp.，Haverstown，PAl9083)测定血小板凝聚。用自身PPP定义百分之百的透光率。加入ADP(1μM)或凝血酶后，从PRP测定透光率百分数的最大变化。凝血酶(0.2—2.0单位/ml)引起的血小板凝聚依赖于浓度，最大浓度的一半用于抑制研究。加入ADP或凝血酶之前，肽2(SEQIDNO2)与PRP(0.45ml)保温30秒。测定0.5ml总体积中的凝聚。当与对照值相比时，用抑制百分数表示抑制反应。用简单的线性回归计算造成50％凝聚抑制的浓度(IC50)。用全血集合度计(Chrono—log，model540—VS)进行柠檬酸盐稀释(1∶2)的血中的血小板凝聚。稀释的等分血样置于塑料小杯中，于37℃下保温15分钟。用加入ADP(2μM)或凝血酶(0.4U/ml)来引起凝聚，电阻的变化记录在条带记录器上。在1.0ml总血体积中测定凝聚。当与对照值相比时，用抑制百分数表示抑制反应。用简单线性回归计算造成50％凝聚抑制的浓度(IC50)。鼠中FeCl3动脉血栓形成模型(体内)肽1(SEQIDNO1)在鼠中的体内抗血栓形成效果同样用于评价。例如，在根据R.J.Broersma等，Thromb.Res.64，405—412(1991)的依赖于血小板的凝血酶介导FeCl3引发的鼠颈动脉血栓形成模型中，肽1(SEQIDNO1)用于评价抗血栓形成的活性。如果提出的话，该文献结合入本文，作为参考。结果本研究的结果表明，作为凝血酶引发的血小板凝聚的抑制剂，肽l(SEQIDNO1)出乎意利地比肽3(SEQIDNO7)，肽4(SEQIDNO8)甚至肽2(SEQIDNO2)更具潜力。表VII与肽2、3和4相比，肽1在人血浆中的抗凝血活性aID2值(平均值±标准偏差)是使对照的凝血时间(以秒计)加倍所需浓度(测定三次)。aPTT，激活部分促凝血酶原激酶的时间。参考表VII，肽1(SEQIDNO1)是肽2(SEQIDNO2)的类似物，其中，用正亮氨酸(Nle)代替了肽2(SEQIDNO2)的环状RGD—X序列中的苯丙氨酸(Phe)。肽3(SEQIDNO7)是肽2(SEQIDNO2)的类似物，其中，阴离子外部结合缔合基团(C区)被切掉。肽4(SEQIDNO8)是肽4(SEQIDNO4)的类似物，其只含有天然L—氨基酸。虽然肽1(SEQIDNO1)和2(SEQIDNO2)属于本发明，但肽3(SEQIDNO7)和4(SEQIDNO8)不属于本发明。肽1(SEQIDNO1)分别以12和5nM浓度使aPTT和凝血酶时间加倍(ID2)。与肽2(SEQIDNO2)相比，这相当于使抗凝血活性的值提高5倍。表VII表明，肽3(SEQIDNO7)和4(SEQIDNO8)比肽2的抗凝血活性低。表VIII与肽2、3和4相比，肽1对人血小板凝聚的抑制aID50值(平均值±标准偏差)是使PRP中的血小板凝聚抑制到对照凝聚的50％所需浓度(测定三次)。凝血酶引起的血小板凝聚表VIII表明肽1—4(SEQIDNOS1，2，7和8)的依赖于剂量的对人血小板凝聚的抑制。肽1(SEQIDNO1)最有效地抑制凝血酶引起的血小板凝聚，IC50值为399±76pM，效果比肽2(SEQIDNO2)(IC50＝60±26nM)高150倍。与肽1相比，肽4(SEQIDNO8)(全为天然L—氨基酸的类似物)和肽3(SEQIDNO7)(被切掉COOH端的类似物)的活性低约1,000倍。ADP引起的血小板凝聚通过ADP引起的人血小板凝聚的依赖于剂量的抑制确定整合蛋白分解(disintegrin)活性，并示于图表VIII中。表明，肽1(SEQIDNO1)(IC50＝32μM)和肽2(SEQIDNO2)(IC50＝l9μM)具有相似的活性。在整合蛋白分解活性上，肽4(SEQIDNO8)(全为天然L—氨基酸的类似物)和肽3(SEQIDNO7)(COOH端被切掉的类似物)大约与肽1相当。全血血小板凝聚由ADP(0.5μM)和凝血酶(0.025U/ml)共同引起的人和鼠全血血小板凝聚被肽1抑制，IC50分别为2.9和42.5nM(参见图3)。因此，肽1(SEQIDNO1)在人血中的活性比在鼠血中高约15倍。而且，肽1(SEQIDNO1)在人血中完全抑制凝聚，而在鼠血中仅有约50％平稳抑制。肽1在狗中的静脉给药在麻醉的狗中注入1小进时，肽1(SEQIDNO1)显示出对凝血酶和血小板凝聚的抑制作用。而且，注入结束后，肽1(SEQIDNO1)的作用是短期的。1和5nmol/kg/min的注入速率使凝血酶时间(图4)和aPTT(图5)按剂量而延长。凝血酶时间比aPTT分析对注入肽1(SEQIDNO1)造成的抑制更敏感。图2中的总结数据表明，15—30分钟内达到最大抑制。注入停止后(60分钟)，凝血酶活性恢复，对1和5nmol/kg/min的注入速率而言，药效学t1/2分别为17±0.1和26±3.2分钟。血小板凝聚抑制证实了肽1(SEQIDNO1)对凝血实验的效果。肽1(SEQIDNO1)的注入在15分钟抑制凝血酶引起的血小板凝聚(图6)。在2/3的狗中，在1小时注入期内抑制作用得到保持。1nmol/kg/min注入结来后，血小板活性恢复，药效学t1/2为12.8±1.1mm。在每一剂量速率下，在1/3狗中，ADP引起血小板凝聚受到抑制。在体外，ADP引起的血小板凝聚受到μM级的抑制。据认为(但本发明不受此理论的束缚)，在全血血小板凝聚中，用盐稀释血(1∶2)可降低有效抑制ADP引起的血小板凝聚所需的肽1(SEQIDNO1)浓度。在接受肽1(SEQ1DNO1)的狗中，出血时间(图7)和血小板计数(图8)保持稳定。血压(图9)和心率(图10)以依赖于剂量的形式稍有升高。注入结束后2小时，这些参数回到基准的对照值。表IX肽1对鼠中动脉血栓形成的影响a输注60min，自FeCl3损伤前15min开始。**与对照比较，P＜0.01评价了肽1(SEQIDNO1)在FeCl3引起的鼠颈动脉血栓形成模型中的抗血栓形成的活性。通过在使用FeCl3前15分钟开始的、以10，25和50nmol/kg/min速率连续1小时的静脉注入肽2(SEQIDNO2)，血栓闭塞依赖于剂量而延长(参见表IX和图11)。在25nmol/kg/min剂量速率下，注入过程中有4/5的鼠防止了闭塞。在10和5tmol/kg/min速率下，分别有4/7和0/6的鼠防止了闭塞。用FeCl3后使闭塞时间加倍所需的肽1(SEQIDNO1)剂量速率为19.3nmol/kg/min，而对前面观察到的肽2(SEQIDNO2)而言，则为33.7mol/kg/min。表X人血小板凝聚的抑制“(L)CYS环”与“(D)CYS环”比较aIC50值(平均值±标准偏差)是使PRP中的血小板凝聚抑制到对照凝聚的50％所需浓度(测定三次)。表X表示两立体异构体间的区别，它们是由于催化部位抑制剂和阴离子外部结合部位识别序列之间的连接“桥”中的(D)Cys被(L)Cys残基取代而形成的。肽5(SEQIDNO9)和6(SEQIDNO10)代表肽1(SEQIDNO1)的类似物，它们在环状RGD中含有其它残基。肽5(SEQIDNO9)还有不同，它在连接“桥”中含有(L)Cys，而不是(D)Cys。给环状RGD序列的不同空间取向作用导致(D)Cys类似物，肽6(SEQIDNO10)对凝血酶引起的人血小板凝聚的更大抑制。注意到两立体异构体之间在凝血酶活性上有10倍的差别。然在，在对ADP引起的血小板凝聚的抑制和抗凝血活性上没有差别。注意，为产生仅含天然L—氨基酸的类似物(肽4(SEQIDNO8))而修饰肽1(SEQIDNO1)将加大两立体异构体之间的差别。实际上，肽1(SEQIDNO1)具有大约高于肽4(SEQIDNO8)1000倍的对凝血酶引起的血小板凝聚的抑制作用。在对ADP引起的血小板凝聚的抑制作用上，两立体异构体之间没有差别。然而，就抗凝血活性而言，含(D)Cys的类似物(肽1(SEQIDNO1))比全为天然氨基酸的类似物(肽4(SEQIDNO8))活性高。肽1类似物对肽1的相对活性表XI—XIV表示肽1(SEQIDNO1)的类似物对已知的IC50血小板抑制和ID2抗凝血数据的比值。为便于比较，肽1(SEQIDNO1)样品具有下述活性凝血——ID2(aPTT＝27.9nM；凝血酶时间＝15nM)；凝聚——IC50(凝血酶＝5.8nM；ADP＝11.4μM)。表XI—XIV中的肽7—18(SEQIDNOS11—22)的aPTT，凝血酶时间，凝血酶和ADP值仅代表相对值，不用来表示肽的真实浓度，因而不带单位。例如，肽7(SEQIDNO11)的aPTT值为0.99，表示肽7(SEQIDNO11)在正常人血浆中的激活部分促凝血酶原激酶的时间的分析中，活性为肽1(SEQIDNO1)的99％。表XI相对活性B4取代的类似物与肽1比较</tables>表XI表明肽1(SEQIDNO1)的两种类似物——肽7(SEQIDNO11)和8(SEQIDNO12)之间的差别，它们都是本发明的化合物。肽7(SEQIDNO11)是肽1(SEQIDNO1)的类似物，其中，B4基团上的Nle被Met代替；肽8(SEQIDNO12)是肽1(SEQIDNO1)的类似物，其中，B4基团的Nle被Cha代替。aPTT分析中，肽8(SEQIDNO12)比肽1(SEQIDNO1)活性大约低1/3，但肽7(SEQIDNO11)的aPTT值与肽1(SEQIDNO1)基本相同。就凝血酶时间值而言，每种肽的值各不相同——肽7(SEQIDNO11)活性仅为肽1(SEQIDNO1)的19％，而肽8(SEQIDN012)实际上比肽1(SEQIDNO1)高。注意到肽1(SEQIDNO1)与两种类似物之间在凝血酶活性上有10倍的差别。至于ADP活性，肽9(SEQIDNO12)效果约为肽1(SEQIDNO1)的1/2，而肽7(SEQIDNO11)约为肽1(SEQIDNO1)的3/4。表XII相对活性B3取代的青霉胺与肽1的比较表XII表示肽1(SEQIDNO1)的两种青霉胺类似物——肽9(SEQIDNO13)和10(SEQIDNO14)之间的差别，二者都不是本发明的肽。提供此表是为表明B3基团上的Arg与Me-Arg之间的互换性。青霉胺的引入大大降低了肽9(SEQIDNO13)在各项目上的活性。至于肽10(SEQIDNO14)，注意到其在凝血酶活性上有与肽9(SEQIDNO13)相同的降低。然而，与肽1(SEQIDNO1)相比，凝血酶时间仅略有降低，而ADP活性提高了6倍。表XIII相对活性B2取代的类似物与肽1的比较表XIII表明B2上Gly残基与各种D-氨基酸残基的互换性。肽11(SEQIDNO15)，12(SEQIDNO16)，14(SEQIDNO18)和15(SEQIDNO19)是肽1(SEQIDNO1)的类似物，其中，B2基团被各种D-氨基酸取代，这些类似物都是本发明的肽。肽13(SEQIDNO17)(不是本发明的肽)是肽1(SEQIDNO1)的类似物，其中，B2上的Gly残基缺失。表XIV相对活性A1取代的类似物与肽1的比较表XIV表明A1基团上(D)Phe残基的互换性。肽16—18(SEQIDNOS20-22)都是本发明的肽。肽16(SEQIDNO20)显示出与肽1(SEQIDNO1)基本相同的凝血酶活性和凝血酶时间。肽17(SEQIDNO21)显示出与肽1(SEQIDNO1)基本相同的凝血酶时间值，具有更高的ADP值，但凝血酶活性值低10倍。对比显示，肽18(SEQIDNO22)比肽1(SEQIDNO1)aPTT值显著提高，但凝血酶时间仅为肽1(SEQIDNO1)的77％，而凝血酶活性和ADP值仅为肽1(SEQIDNO1)的一半。序列一览表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称MerrellDowPharmaceuticalsInc，(B)街道2110E.GalbraithRoad，P.O.Box156300(C)城市辛辛那提(D)州俄亥俄(E)国家美国(F)邮政编码45215-6300(G)电话513/948-6566(H)电传513/948-7961或4681(I)电报214320(ⅱ)发明名称三功能抗凝血酶抗血小板的肽(ⅲ)序列数目22(ⅳ)机器可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(ⅵ)在先申请资料(A)申请号US08/076,066(B)申请日1993年6月11日(2)SEQIDNO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/mote＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位13上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位1l上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNOlXaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位13的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO2XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspPheProXaaGlyAspTyrl51015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位8上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置8(D)其它信息/note＝“位8上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位1上的D-Cys上”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO3XaaGlyArgGlyAspPheProXaa15(2)SEQIDNO4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是琥珀酰基取代的Tyr”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置9(D)其它信息/note＝“位9上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置10(D)其它信息/note＝“位10上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO4XaaGluProIleProGluGluAlaXaaXaa1510(2)SEQIDNO5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO5XaaProArgProGly15(2)SEQIDNO6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度3个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸，由甲基取代”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO6XaaProArg1(2)SEQIDNO7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位13上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”。(ⅹⅰ)序列描述SEQNO7XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGlu20(2)SEQIDNO8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”。(ⅹⅰ)序列描述SEQNO8XaaProArgProGlyCysGlyArgGlyAspXaaProCysGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaTyrAsp2025(2)SEQIDNO9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是正亮氨酸”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置28(D)其它信息/note＝“位26上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置29(D)其它信息/note＝“位29上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO9XaaProArgProGlyCysArgIleProArgGlyAspXaaProAlaAsp151015CysGlyAspTyrGluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位17上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置17(D)其它信息/note＝“位17上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置28(D)其它信息/note＝“位28上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置29(D)其它信息/note＝“位29上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO10XaaProArgProGlyXaaArgIleProArgGlyAspXaaProAlaAsp151015XaaGlyAspTyrGluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位13上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO11XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspMetProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位13上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO12XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D构型的半胱氨酸”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D构型的青霉胺”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO13XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D构型的半胱氨酸”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置8(D)其它信息/note＝“位8上的Xaa是甲基精氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D构型的青霉胺”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO14XaaProArgProGlyXaaGlyXaaClyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点、(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位13上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置7(D)其它信息/note＝“位7上的Xaa是D构型的缬氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO15XaaProArgProGlyXaaXaaArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位13上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置7(D)其它信息/note＝“位7上的Xaa是D构型的酪氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO16XaaProArgProGlyXaaXaaArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位12上的D-Cys上”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置10(D)其它信息/note＝“位l0上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置12(D)其它信息/note＝“位12上的Xaa是D-Cys，由硫键结合到位6上的D-Cys上”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置23(D)其它信息/note＝“位23上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO17XaaProArgProGlyXaaArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyrGlul51015ProIleProGluGluAlaXaaXaa20(2)SEQIDNO18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13上的D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置7(D)其它信息/note＝“位7上的Xaa是D构型的苏氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6上的D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO18XaaProArgProGlyXaaXaaArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置7(D)其它信息/note＝“位7上的Xaa是D构型的脯氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO19XaaProArgProGlyXaaXaaArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6上的D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO20XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的1，2，3，4-四氢3-羧酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D-Cys上的D-Cys”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6的D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO21XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa2025(2)SEQIDNO22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置1(D)其它信息/note＝“位1上的Xaa是D构型的N-甲基苯丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置6(D)其它信息/note＝“位6上的Xaa是由硫键结合到位13D-Cys上的D-Cys”。(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置11(D)其它信息/note＝“位11上的Xaa是正亮氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置13(D)其它信息/note＝“位13上的Xaa是由硫键结合到位6D-Cys上的D-Cys”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置24(D)其它信息/note＝“位24上的Xaa是环己基丙氨酸”(ⅸ)特点(A)名称/键修饰位点(B)位置25(D)其它信息/note＝“位25上的Xaa是D构型的谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQNO22XaaProArgProGlyXaaGlyArgGlyAspXaaProXaaGlyAspTyr151015GluProIleProGluGluAlaXaaXaa202权利要求1.下式化合物X-A-B-C-Y式中，X是一种氨基端残基，选自氢、一种或两种1至6个碳原子的烷基、一种或两种2至10个碳原子的酰基、羰苄氧基、H2NC(＝NH)-或叔丁氧基羰基；A是一种下式肽类似物A1-A2-A3式中，A1是(D)Phe，(D)Phg，(D)1-Tiq，(D)3-Tiq，N-Me-(D)Phe，(D)Cha，(D)Chg，(D)Nag，或(D)Thg；A2是Pro，Pip，或Azt；A3是Arg，Lys，Orn，或hArg；B是下式肽类似物或式中，B1是Gly，Ala，(D)Ala，Val，(D)Val，或Gly-Gly；B2是Gly，Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly或任何(D)氨基酸；B′2是Arg-Ile-Pro或Lys-Ile-Pro；B3是Arg，hArg，N-Me-Arg或Lys；B4是Nle，Phe，Met或Cha；C是下式肽类似物Asp-C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9(5)式中，C1是Phe，pClPhe，pNO2Phe，Tha，Npa，Tyr或Trp；C2是Glu或Asp；C3是任何氨基酸；C4是Ile，Val，Leu或Phe；C5是Pro，Hyp，Sar，NMePgl或D-Ala；C6是任何氨基酸；C7是任何氨基酸；C8是Tyr，Glu，Pro，Ala-Cha，Tyr-Cha，Tyr-Leu和Ala-Tyr；C9是一种键或是Glu，(D)Glu，Gln，Pro，Leu-Gln，Asp-Glu，或Leu-Pro；以及Y是羧基端残基，选自OH，C1-C6烷氧基、氨基、单或双(C1-C4)烷基取代的氨基，或苄氨基；或其药学上可接受的盐。2.权利要求l的化合物，其中，X是氢，乙酰基，琥珀酰基或叔丁氧基羰基。3.权利要求1的化合物，其中，A1是(D)Phe，(D)Chg，(D)Cha，(D)Phg，(D)1-Tiq，(D)3-Tiq或N-Me-(D)Phe；A2是Pro；A3是Arg或Lys。4.权利要求1的化合物，其中，B是下式的肽其中，B1是Gly，Ala或Gly-Gly；B2是Gly，Gly-Gly或任何(D)氨基酸；B3是Arg或N-Me-Arg；B4是Nle，Phe，Cha，Met。5.权利要求1的化合物，其中，B是下式的肽其中，B1是Gly，Ala或Gly-Gly；B′2是Arg-Ile-Pro或Lys-Ile-Pro；B3是Arg或N-Me-Arg；B4是Nle。6.权利要求1的化合物，其中C1是Phe，Npa或Tyr；C2是Glu或Asp；C3是任何氨基酸；C4是Ile或Val；C5是Pro，Hyp或(D)Ala；C6是任何氨基酸；C7是Glu，Asp或Ala；C8是Tyr，Glu，Tyr-Leu，Tyr-Cha或Ala-Cha；以及C9是一种键，(D)Glu，Glu，Gln，Leu-Gln或Leu-Pro。7.权利要求2的化合物，其中，A1是(D)Phe，(D)Chg，(D)Cha，(D)Phg，(D)1-Tiq，(D)3-Tiq，或N-Me-(D)Phe；A2是Pro；A3是Arg或Lys。8.权利要求7的化合物，其中，B是下式的肽或其中，B1是Gly，Ala或Gly-Gly；B2是Gly，Gly-Gly或任何(D)氨基酸；B′2是Arg-Ile-Pro或Lys-Ile-Pro；B3是Arg或N-Me-Arg；以及B4是Nle，Phe，Cha，Met。9.权利要求8的化合物，其中，C1是Phe，Npa或Tyr；C2是Glu或Asp；C3是任何氨基酸；C4是Ile或Val；C5是Pro，Hyp或(D)Ala；C6是任何氨基酸；C7是Glu，Asp或Ala；C8是Tyr，Glu，Tyr-Leu，Tyr-Cha或Ala-Cha；以及C9是一种键，(D)Glu，Glu，Gln，Leu-Gln或Leu-Pro。10.权利要求9的化合物，其中，Y是OH，C1-C6烷氧基，或者单或双(C1-C4)烷基取代的氨基。11.权利要求10的化合物，其中，B4是Nle。12.权利要求1的化合物，其中，X是氢，乙酰基或叔丁氧基羰基。13.权利要求12的化合物，其中，A1是(D)Phe，(D)Phg，(D)3-Tiq，或N-Me-(D)Phe；A2是Pro；A3是Arg。14.权利要求13的化合物，其中，B是下式的肽或其中，B1是Gly；B2是Gly，(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr，或(D)Pro；B′2是Arg-Ile-Pro；B3是Arg或N-Me-Arg；以及B4是Nle或Phe，但当B2是(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr或(D)Pro时，B4是Nle。15.权利要求14的化合物，其中C1是Phe或Tyr；C2是Glu；C3是Glu或Pro；C4是Ile；C5是Pro或(D)Ala；C6是Glu或Ala；C7是Glu；C8是Tyr，Tyr-Leu，Tyr-Cha或Ala-Cha；以及C9是一种键或(D)Glu。16.权利要求15的化合物，其中，Y是OH，C1-C6烷氧基，或者单或双(C1-C4)烷基取代的氨基。17.权利要求16的化合物，其中，B4是Nle。18.权利要求1的化合物，其中X是氢，乙酰基或叔丁氧基羰基；A1是(D)Phe，(D)Phg，(D)3-Tiq或N-Me-(D)Phe；A2是Pro；A3是Arg；B是下式的肽B1是Gly；B2是Gly，(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr，或(D)Pro；B3是Arg；B4是Nle或Phe，但当B2是(D)Tyr，(D)Val，(D)Thr，或(D)Pro时，B4是Nle；C1是Phe；C2是Glu；C3是Pro；C4是Ile；C5是Pro；C6是Glu或Ala；C7是Glu；C8是Tyr，Tyr-Cha或Ala-Cha；C9是一种键或(D)Glu；以及Y是OH或C1-C6烷氧基。19.权利要求18的化合物，其中，Y是OH或C1-C6烷氧基。20.权利要求19的化合物，其中，B4是Nle。21.权利要求1的化合物，即(SEQIDNO1)22.权利要求1的化合物，即(SEQIDNO2)23.权利要求1的化合物，即(SEQIDNO3)24.权利要求1的化合物，即(SEQIDNO10)25.一种治疗静脉或动脉血栓形成的病人的方法，它包括用治疗有效量的权利要求1的化合物给病人用药。26.如权利要求25所述的方法，其中，血栓形成疾病是血管成形术后的冠状动脉血栓形成。27.如权利要求25所述的方法，其中，血栓形成疾病是血管成形术后的急性闭塞。28.如权利要求25所述的方法，其中，血栓形成疾病是体外循环诱发的血细胞减少症。29.如权利要求25所述的方法，其中，血栓形成疾病是进行性心肌梗塞形成。30.如权利要求25所述的方法，其中，血栓形成疾病是血纤维蛋白溶解疗法后的闭塞。31.如权利要求25所述的方法，其中，血栓形成疾病是体外循环中的血小板减少症。或全文摘要下式化合物X-A-B-C-Y式中，X是一种氨基端残基，选自氢、一种或两种1至6个碳原子的烷基、一种或两种2至10个碳原子的酰基、羰苄氧基、HA是一种下式肽类似物A式中，AAAB是下式肽类似物式中，BBB′是Arg-Ile-Pro或Lys-Ile-Pro；BBC是下式肽类似物Asp-C式中，CCCCCCCCCY是羧基端残基，选自OH，C或其药学上可接受的盐是有用的抗凝血剂。本发明还涉及将上述化合物用于血管成形术后的急性闭塞、体外循环诱发的血细胞减少症、进行性心肌梗塞形成和血纤维蛋白溶解疗法后的闭塞。文档编号C07K5/00GK1124964SQ94192393公开日1996年6月19日申请日期1994年5月13日优先权日1993年6月11日发明者R·J·布罗尔斯马,T·J·奥文,J·L·克尔斯特南斯基申请人:默里尔药物公司