免疫原性肿瘤蛋白和肽及其使用方法

专利名称：：免疫原性肿瘤蛋白和肽及其使用方法
技术领域：
：本发明的领域是肿瘤病人选择性免疫原性的肿瘤特异性抗原、蛋白质或肽。这些免疫原性蛋白质或肽可根据肿瘤病人血清中特异于那些蛋白质和/或肽的抗体的出现来识别。本发明还涉及从其它肿瘤识别和分离对患那些肿瘤的病人为选择性免疫原性的细胞内蛋白质和/或肽的方法。本发明还涉及在个体肿瘤病人中预见哪一种蛋白质或肽最适于产生用于继承性免疫治疗或用于配制特异性疫苗之效应T细胞的方法。发明背景肿瘤免疫学中已经描述了分离和扩增对自体肿瘤反应性的和具有阳性治疗效果的人T淋巴细胞的方法。参见Greenberget.al.，AdoptiveTCellTherapyofTumorsMechanismOperativeintheRecognitionandEliminationofTumorCells，ADV.inImmunol.V.49，281(AeademicPress，Inc.1991)。Greenberg和Cheever描述了在小鼠肿瘤模型中过继性T细胞治疗的进展，还同时，甚至更早地描述了对人肿瘤类似功能的治疗进展。对小鼠模型的一种Friend病毒诱导的红白血病(FBL)的最初研究说明，播散的抗原性肿瘤可以被对肿瘤有特异反应性的T细胞的过继性转移而根除。Cheever，MA.，etal.，J.Immunol.1261318-1322(1981)；Cheever，M.A.，etal.，LBiol.ResponseMod，3(5)462-7(1984)；Cheever，M.A.，etal.，J.Biol.ResponseMod，3(2)113-27(1984)；Cheever，M.A.，etal.，Immunol.132(5)2259-65(1984)；Cheever，M.A.，etal.，J.Immunol.134(6)3895-900(1985)；Cheever，M.A.，etal.，Prog.Clin.Biol.Res.24449-58(1987)；Cheever，M.A.，etal.，J.Exp.Med.163(5)110-12(1986)；Cheever，M.A.，etal.Immunobiology172(3-5)365-82(1986)；Chen，W.，etal.，J.Immunol.144(10)3659-66(1990)；Chen，W.，etal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA89(4)1468-72(1992)；Crossland，K.D.，etal.，J.Immunol.146(12)4414-20(1991)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Immunol.123(2)515-22(1979)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Exp.Med.154(3)952-63(1981)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Immunol.1262100-2103(1981)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Biol.ResponseMod.3(5)455-61(1984)；Greenberg，P.D.，etal.J.Immunol.133(6)3401-7(1984)；Greenberg，P.D.，etal.，Surv.Immunol.Res.40283-96(1985)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Exp.Med161(5)1122-34(1985)；Greenberg，P.D.，etal.，Prog.Clin.Biol.Res.244127-35(1987)；Greenberg，P.，etal.，Symp.PrincessTakamatsuCancerRes.Fund19287-301(1988)；Greenberg，P.D.，etal.，Prog.Exp.TumorRes.32104-27(1988)；Greenberg，P.，etal.，Int.Symp.PrincessTakamatsuCancerRes.Fund19287-301(1988)；Kern，D.E.，etal.，J.Immunol.136(11)4303-10(1986)；Kern，D.E.，etal.，J.Immunol.141(8)2824-30(1988)；Kern，D.E.，etal.，CancerRes.50(19)6256-63(1990)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Immunol.1384012-4017(1987)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Immuno1.142(7)2187-91(1989)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Exp.Med.169(2)457-67(1989)；Peace，D.J.，etal.J.Exp.Med.169(1)161-73(1989)。后来的研究说明，少量肿瘤反应性T细胞的有限的治疗活性能够通过在体外培养出大量T细胞并用大量细胞处理而大大增强(Cheever，M.A.，etal.，Prog.Clin.Biol.Res，24449-58(1987)；Cheever，M.A.，etal.，J.Exp.Med，163(5)110-12(1986)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Immunol.1384012-4017(1987))。而且，大量成功的研究确定了产生CD4+和CD8+抗肿瘤效应细胞的要求，因为个体要求对于两种细胞类型是完全不相同的。到目前为止，各种研究已表明对自体肿瘤特异性的人效应T细胞可被分离并可在体外扩充(Ioannides，C.G.，etal.，J.Immunol.146(5)1700-7(1991)；Mukherji，B.，etal.，Immunol.Rev.11633-62(1990)；Viale，M.，etal.，Tumori76(5)488-94(1990))。然而，在能够将从FBL模型获得的所有知识经验用于人体上仍然存在很大的限制。要克服的主要障碍是(1)鉴定肿瘤蛋白质抗原，所述抗原由肿瘤细胞合成并能被病人T细胞识别(免疫原性蛋白质)，但最低限度地被或完全不被对照受实验者T细胞识别；(2)具有足够的免疫原性蛋白质(潜在的免疫原性蛋白质库)以提供大多数细胞的足够识别物，所述细胞构成个体肿瘤，因为每个病人的肿瘤由单个细胞亚型组成，该亚型可能合成或可能不合成任何一种给定的蛋白质抗原；(3)确定包含在免疫原性蛋白质库中的哪一种抗原真正是由各病人的肿瘤合成的；(4)确定免疫原性蛋白质库中的哪一种蛋白质或肽可由个体病人拥有的MHC分子给出并且因此对该病人是免疫原性的，因受MHC的限制，不是所有病人的T细胞都能对任何给定的蛋白质抗原或其组成肽表位作出相同的反应。迄今，已报导了很少几种抗原的针对共同肿瘤的高特异性体液和或细胞免疫反应。针对肿瘤的体液免疫反应的文献记载的例子有Davidoff，A.M.，Iglehart，J.D.，Marks，J.R.，SocialSciences893439-3442(1992)描述了对由乳腺癌过度表达的p53蛋白质的人血清抗体反应，并且Ben-Maharez，K.Thierry，D.，Sorokine，Danna-Muller，A.，Kohiyama，M.，Br.J.Cancer57529-534(1988)和其他文献描述了针对患有乳腺癌和结肠直肠癌的病人体内c-myb和c-myc蛋白质的循环抗体。就Davidoff的研究来说，由于没有试验与年龄和性别相配合的对照血清，因而难以确定肿瘤病人相对于正常受试者的免疫原特异性。就Ben-Maharez，Sorokine和其他人所作的描述来说，则缺乏在肿瘤病人和正常受试者之间表现出绝对定性的免疫原性特异性。定量特异性也太低以致不能在诊断或治疗上应用。针对人肿瘤抗原的细胞免疫反应的文献报导的例子有Finn描述了上皮粘蛋白的核心蛋白质，vanderBruggen，P.，Traversari，C.，Chomez，P.，Lurquin，C.，DePlaen，E.，vandenEynde，B.，Knuth，A.，Boon，T.，Science2541643-1647(1991)描述黑素瘤、乳腺癌和其它肿瘤的MAGE抗原。上皮粘蛋白是一种正常上皮细胞中的细胞内抗原和某些肿瘤细胞中的细胞外抗原。尚未描述MAGE抗原的细胞定位，而且该抗原也远不是由所有黑素瘤或乳腺癌细胞系合成的。在每一种情况下，描述的细胞免疫反应都是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。虽然粘蛋白的CTL反应不是MHC限制性的，但针对MAGE的CTL反应仅限于HLA-A1单元型。没有试验过MAGE或粘蛋白在产生体液免疫反应中的实用性。发明概述一方面，本发明提供了一种经包含下列步骤的方法制备的肿瘤特异性抗原(a)鉴定存在于肿瘤细胞中的选择性免疫原性蛋白质；和(b)分离和纯化该蛋白质。优选的鉴定方法包括筛选对照和肿瘤病人血清以确定哪一种蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应。所述抗体可以是IgA、IgE、IgG和IgM免疫球蛋白。本发明也注意到可由这种方法制备的肿瘤特异性抗原。在一个优选的实施方案中，肿瘤特异性抗原是SCC抗原，例如SCC抗原3.3、16.116.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。在另一个优选的实施方案中，肿瘤特异性抗原是乳腺癌特异性抗原例如磷酸化的dbl，该dbl优选地包括SEQIDNO2的氨基酸残基序列。在各种不同实施方案中，磷酸化的dbl包括一个或多个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基时，该残基优选位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上。在磷酸化的dbl包括至少两个磷酸化的丝氨酸残基时，所述残基优选位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上。在磷酸化的dbl包括至少三个磷酸化的丝氨酸残基时，所述残基优选位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3和9或者436、438和442上。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的苏氨酸残基时，该残基优选位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号38、263、380、403或406上。在磷酸化的dbl包括至少两个磷酸化的苏氨酸残基时，所述残基优选位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的酪氨酸残基时，该残基优选位于SREQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上。磷酸化的dbl也可以包括多于一种类型的磷酸化的氨基酸残基。在一个实施方案中，磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的苏氨酸残基，优选的是，其中(a)两个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号23和25上，并且一个磷酸化的苏氨酸残基位于氨基酸残基位置编号38上；(b)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2氨基酸残基位置编号402上，并且两个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上或者(c)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，并且一个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403或406上。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的酪氨酸残基时，所述残基优选的位置为其中一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号202上，且一个磷酸化的酪氨酸残基位于位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上。在另一个实施方案中，磷酸化的dbl包括位于SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、3536、37或38的氨基酸残基序列。另一方面，本发明提供了一种鉴定肿瘤细胞功能性蛋白质的方法，该方法包括鉴定存在于肿瘤细胞中对肿瘤病人选择性免疫原性的蛋白质。在一个实施方案中，肿瘤细胞是SCC细胞或乳腺癌细胞。在一个优选的实施方案中，所述功能性蛋白质对肿瘤细胞是选择性功能性的。另一方面，本发明提供了一种制备肿瘤细胞功能性蛋白质的方法，该方法包括以下步骤(a)鉴定存在于肿瘤细胞中的蛋白质，该蛋白质是对肿瘤病人选择性免疫原性的和(b)分离和纯化该蛋白质。本发明也注意到由这种方法制造的蛋白质。在另一个实施方案中，制备肿瘤细胞功能性蛋白质的方法进一步包括以下步骤(c)对分离和纯化的蛋白质测序(d)制备编码所述已测序之蛋白质的多核苷酸(e)用包含所述多核苷酸的表达载体转化宿主细胞；(f)在足以表达所述蛋白质的条件下培养转化的宿主细胞；和(g)收集所述的蛋白质。另一方面，本发明提供了一种增加肿瘤相关抗原之免疫原性特异性的方法，该方法包括磷酸化处理肿瘤相关抗原。优选的肿瘤抗原是乳腺癌抗原，例如包含SEQIDNO2之氨基酸残基序列的dbl。另一方面，本发明提供了一种检测对肿瘤特异性抗原有免疫反应性之抗体存在的检测试剂盒，该试剂盒包含足够量的至少用于一次试验的肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原较好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3或者磷酸化的dbl。该试剂盒还包括用于检测与肿瘤特异性抗原发生免疫反应之抗体的工具。所述抗体是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。再一方面，本发明还提供了一种检测存在于生物体液中的对肿瘤特异性抗原有免疫反应活性的抗体的方法，该方法包括以下步骤(a)用体液的样品和肿瘤特异性抗原制成混合物；(b)在生物反应条件下将混合物保留一段足够时间，以足以使存在于样品中的抗体与肿瘤特异性抗原之间形成结合物(conjugate)(c)检测结合物的存在。所述肿瘤特异性抗原优选是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述抗体是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。本发明还提供了一种制备对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞的方法，该方法包括以下步骤(a)分离含有纯净的非抗原致敏的T细胞的自体T细胞群(b)鉴定免疫原性肿瘤特异性抗原；和(c)用免疫原性肿瘤特异性抗原致敏非抗原致敏的T细胞。所述肿瘤特异性抗原优选是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述T细胞优选的是T辅助淋巴细胞或特异性细胞毒性T细胞。在另一个实施方案中，提供一种制备对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞群的方法，包括以下步骤(a)分离对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞；和(b)诱导致敏的T细胞大量扩增。诱导较好是于肿瘤特异性抗原，以及如果必要时于抗原呈现细胞存在下完成。用于这一方法的T细胞较好是从循环淋巴细胞、淋巴结或肿瘤中分离的。该方法还可以进一步包括如下步骤(c)继代培养T细胞，以鉴定对特定肿瘤特异性表位敏感的T细胞。所述免疫原性肿瘤特异性抗原较好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。本发明还进一步提供了建立肿瘤特异性体液抗原的肽文库的方法。该方法包括以下步骤(a)从肿瘤细胞中分离一种或多种选择性免疫原性蛋白质；(b)在每一种选择性免疫原性蛋白质中鉴别对肿瘤病人为选择性免疫原性的一个或多个表位；(c)就每一个表位制备含有该表位的肽，其中没有单个肽含有被非肿瘤受试者识别的表位；(d)形成肽文库。在一个实施方案中，分离包括以下步骤(a)从肿瘤细胞中提取蛋白质；(b)筛选对照和肿瘤病人血清，以确定哪一种蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应；和(c)分离并纯化选择性免疫原性蛋白质。鉴定较好包括以下步骤(a)限定蛋白质中的潜在表位；(b)合成含有所述蛋白质之一部分的肽，该部分含有一个表位；和(c)筛选对照和肿瘤病人血清，以确定哪一种蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应，并且由此鉴定对肿瘤病人为选择性免疫原性的蛋白质中的表位。选择性免疫原性蛋白质可以是磷酸化的蛋白质。本发明也涉及到由这一方法制备的文库。另一方面，本发明进一步提供一种建立乳腺癌特异性体液抗原之肽文库的方法，该方法包括以下步骤(a)鉴定存在于乳腺癌细胞中的，对乳腺癌病人为选择性免疫原性的蛋白质；(b)限定该蛋白质的潜在磷酸化位点；(c)合成包含该蛋白质之一部分的肽，该部分含有至少一个磷酸化位点并且其中至少一个磷酸化位点是磷酸化的；(d)筛选所述肽，以鉴定对乳腺癌病人为选择性免疫原性的磷酸化的肽；(e)形成磷酸化的选择性免疫原性肽的文库。在这一方法的一个实施方案中，所述蛋白质是dbl，并且潜在的磷酸化位点包括(a)一个在位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、426、438或442上的磷酸化的丝氨酸残基；(b)至少两个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上的磷酸化的丝氨酸残基；(c)至少三个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3和9或者436、438和442上的磷酸化的丝氨酸残基；(d)一个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号38、263、380、403或406上的磷酸化的苏氨酸残基(e)至少两个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上的磷酸化的苏氨酸残基；(f)至少一个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上的磷酸化的酪氨酸残基；(g)至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的苏氨酸残基，其中(i)磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号23和25上，且一个磷酸化的苏氨酸残基位于氨基酸残基位置编号38上；(ii)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2氨基酸残基位置编号402上，以及两个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上；或者(iii)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，以及一个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403或406上；或(h)至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的酪氨酸残基，其中磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号202上，且磷酸化的酪氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上。上述方法中蛋白质部分较好包括SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸残基序列。在一个优选的实施方案中，所述蛋白质是一种癌基因转录的蛋白质、一种细胞周期蛋白质、受体、转录因子或其它调节蛋白质或底物蛋白质。本发明还涉及用该方法制得的文库。再一方面，本发明提供一种用于诊断受检者体内肿瘤存在的试验试剂盒，该试剂盒包含足够用于至少一次试验量的肿瘤特异性体液抗原的肽文库。在肿瘤是SCC时，该文库优选地包括下列的两种或多种SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。在肿瘤是乳腺癌时，该文库较好包括下列的两种以上的肽SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38。附图简要说明图1显示出31/65头和颈肉瘤病人(SCCPts)和40/65对照受试者(对照)的鳞状上皮细胞癌(SCC)细胞内蛋白质特异性IgE值的分布。用于该试验系统的来源抗原是从SCC细胞中提取的所有细胞内蛋白质的混合物。图2表明病人(17/65)较年龄和性别配对的对照(1/65)表现出更高优势的结合到SCC细胞内蛋白质上的血清IgA。标绘图说明头和颈肉瘤病人(SCCPts)和对照组受试者(对照)的SCC细胞内蛋白质特异性IgA的分布。来源抗原与附图1中所使用者相同。图3A显示个别病人血清IgE对IgA的作图。更具体地说，该图说明SCC病人在对由SCC细胞内蛋白质引起的免疫刺激发生反应时产生IgE的能力和他们产生IgA和/或IgG的能力之间的反比关系。来源抗原如附图1中所使用者相同。图3B显示个别病人血清IgE对IgG的作图。来源抗原如附图1中所使用者相同。图4显示由异型特异性抗原抑制研究证实的结合到SCC胞质蛋白质上的血清免疫球蛋白的特异性。使用随机免疫球蛋白阳性血清检测每类异型。IgE阳性血清用8％人血清白蛋白稀释至1∶2。IgA和IgG阳性血清用纯净的羊血清稀释至1∶2。相应于每一稀释度的等分样掺加2.5mg/mlSCC细胞内蛋白质。所有待检血清的免疫球蛋白信号均经掺加特异性抗原而被抑制。作图说明在一个病人样品中，与未掺加稀释液(空心方块)者相比较，掺加抗原的稀释样品(实心方块)的特异性IgE信号全部消失。图5A显示对SCC胞质蛋白质组分进行Western印迹分析以鉴定高特异性肿瘤抗原(HSTA)。图解说明了针对14个SCC病人的24份待试HSTA和10份年龄与性别匹配的对照血清的IgA结合特征。图5B表示对SCC胞质蛋白质组分进行蛋白质印迹分析，借以鉴定高特异性肿瘤抗原(HSTA)。图解说明了针对14个SCC病人的24份待试HSTA和10份年龄与性别匹配的对照血清的IgA结合特征。图6显示了p66dbl体液免疫原性。用来源于患有I和II期乳腺癌之病人的血清试验IgA反应性，同时试验患有良性乳腺损伤的年龄相当的女性受试者的血清。图7显示了p66dbl与乳腺癌病人血清而不是与对照血清的IgG反应性。dbl和IgA＋IgG之间的反应性定量也显示乳腺癌病人血清也较对照血清显著。图8显示与非磷酸化的样品(FT)比较，用磷酸化的p66dbl(2＋3)时乳腺癌特异性IgA反应性。使用FTdbl作为掺加抗原和2＋3作为印迹抗原进行的抗原抑制研究，其中显示出对肿瘤病人血清的绝对特异性。图9显示用抑制型p66试验检测的大量乳腺癌病人血清和对照血清的敏感性和特异性。在所有乳腺癌阶段均显示有良好的试验敏感性。图10显示带有潜在的可磷酸化丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的p66dbl氨基酸序列的滚动总数分析。划下线部分为表面肽序列。潜在的可磷酸化残基用黑体标示。图11显示许多具有细胞内部分的胞内蛋白质和受体蛋白质经历磷酸化过程。给出了210个分子的部分序列表。发明的详细描述发明迄今为止，肿瘤相关蛋白质的鉴定和分离仅通过使用四或五种困难的方法来完成转染分析；癌基因产物复合物形成；DNA/RNA探针杂交单克隆抗体产生和筛选以及DNA文库产生和筛选。按照转染分析方法，用从肿瘤细胞分离和纯化的DNA转染成纤维细胞(例如，3T3成纤维细胞)。用肿瘤细胞DNA中的转化基因(例如，致癌基因)转化那些被转染的成纤维细胞(初级转染体)。初级转染体的DNA可用于产生也由转化DNA转化的第二和第三代转染体。从被转化的细胞中分离DNA/RNA并鉴定那些负责转化的核酸。然后，测定那些转化核酸的序列，并鉴定所编码的肿瘤相关蛋白质。已使用转染分析法鉴定了B细胞淋巴瘤致癌基因(Eva&Aaronson，IsolationofNewhumanoncogenefromadiffuseB-celllymphoma，Nature，1985316273-275)、来源于化学转化之细胞的转化基因(Cooperetal.，Molecularcloningofanewtransforminggenefromachemicallytransformedhumancellline，Nature，1984，31129-33)、恶性黑素瘤(Paduaetal.，Anoveltransforminggeneinahumanmalignantmelanomacellline，Nature，1984，311671-673)、淋巴瘤(Takahashietal.，ActivationofaNovelHumanTransformingGene，ret，byDNARearrangement，Cell，1985，42581-588)、乳腺癌(Fasanoetal.，NewHumanTransformingGeneDetectedbyaTumorigenicityAssay，MolecularandCellular.Biology.1984.4(9)1695-1705)及各种其他致癌基因(CooperandLane，CellularTransformingGenesandOncogenesis，BiochimicaetBiophysicaActa，1984，7389-20；Schechteretal，Theneuoneogeneanerb-B-relatedgeneencodinga185，000-Mrtumourantigen，Narure，1984，312513-516；Martin-Zanca，Ahumanoncogeneformedbythefusionoftruncatedtropomyosinandproteintyrosinekinasesequences，Nature，1986，319743-748；Shimizuetal.，Molecularcloningofanactivatedhumanoncogene，homologoustov-raf，fromprimarystomachcancer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，825641-5645；Landetal.，CellularOncogenesandMultistepCarcinogenesis，Science，1983，222771778)。肿瘤相关蛋白质也可以通过确定肿瘤细胞中的哪一种蛋白质与免疫复合物中的已知肿瘤细胞蛋白质共沉淀的方法来鉴定。已用这一方法鉴定了两种与劳斯肉瘤病毒转化的细胞相关的磷酸化的蛋白质(Oppermannetal.，TwoCellularProteinsthatImmunoprecipitatewiththeTransformingProteinofRousSarcomaVirus，Virology，1981，113736-751)。在第三种建立的方法中，肿瘤相关蛋白质是通过使用DNA/RNA杂交探针而鉴定的。制备已知与转化病毒(例如，逆转录病毒)相关的标记(例如32P)的DNA或RNA分子。然后使该标记的多核苷酸与来自正常或被转化细胞的DNA/RNA接触。鉴定杂交的多核苷酸并测定其序列。这一方法已被用于鉴定鸟髓细胞瘤(myelocytomatosis)病毒之推定的转化基因的脊椎动物同源性(Sheinessetal.，TheVertebrateHomologofthePutativeTransformingGeneofAvianMyelocytomatosisVirusCharacteristicsoftheDNALocusandItsRNATranscript，Virology，1980，105415-424)；一种与鸟肉瘤病毒转化基因相关的RNA分子(Spectoretal.，UninfectedAvianCellContainRNARelatedtotheTransformingGeneofAvianSarcomaViruses，cell，1978，13371-379)和V-raf(Rappetal.，StructureandbiologicalactivityofV-raf，auniqueoncogenetrasducedbyaretrovifus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，804218-4222)。多核苷酸探针也已被用于筛选DNA文库(Quintrelletal.，IdentificationofaHumanGene(HCK)ThatEncodesaProtein-TyrosineKinaseandIsExpressedinHemopoieticCells，MolecularandCellularBiology，1987，7(6)2267-2275)。单克隆抗体也已被用于鉴定肿瘤相关蛋白质。按照这一方法，破碎肿瘤细胞以产生含有肿瘤细胞蛋白质的组合物。用所述组合物免疫小鼠。从被免疫的小鼠分离和纯化脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合以产生永久化的杂交瘤细胞系，该细胞系产生和分泌抗特定抗原的单克隆抗体。然后用所述单克隆抗体筛选推定的肿瘤细胞抗原的群体。所述抗原与一种或多种上述抗体发生免疫反应。然后纯化以这一方法鉴定的肿瘤细胞抗原并确定其特征(例如测序)。已用单克隆抗体确定了肉瘤相关抗原p102的特征(Brownetal.，MonoclonalAntibodyCharacterizationofSarcoma-AssociatedAntigenp102，AnticancerResearch.1991，111565-1570)。与上述使用有许多且复杂步骤的方法相反，本发明提供了一种鉴定肿瘤特异性抗原的简单方法，这一方法依赖于由肿瘤受试者/病人产生抗所述抗原的抗血清。具体地说，本发明涉及在肿瘤病人血清中引起体液免疫反应的肿瘤特异性抗原蛋白质或肽。为了清楚说明而不是以任何方式限制本发明，将本发明的详细描述部分分为以下几个小部分(A)鉴定/制备肿瘤特异性抗原的方法和用这一方法制得的肿瘤特异性抗原。(B)鉴定/制备肿瘤细胞功能性蛋白质的方法和用这一方法制得的功能性蛋白质。(C)检测抗肿瘤特异性抗原之抗体的试剂盒和方法。(D)制造/制备对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞群体的方法。(E)增加肿瘤相关蛋白质之免疫特异性的方法。(F)制备肿瘤特异性抗原肽文库的方法。(G)检测受检者体内肿瘤细胞存在的试剂盒。A.肿瘤特异性体液抗原一方面，本发明提供了一种肿瘤特异性抗原，该抗原可由和优选地由包括以下步骤的方法制备(a)鉴定存在于肿瘤细胞中的选择性免疫原性蛋白质；(b)分离和纯化该蛋白质。优选的鉴定方法包括筛选对照和肿瘤病人血清，以确定哪一种蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应。所述抗体可以是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。抗原一词包括得自病人肿瘤样品，或合成的或重组产生的抗原片段。按照本发明，也可使用具有与抗原实质上的同源的抗原蛋白或其片段。此外，还试图包括抗原类似物。肿瘤一词包括癌、肉瘤、骨髓恶性肿瘤、淋巴恶性肿瘤和神经源恶性肿瘤。这样，术语肿瘤特异性抗原即包括能够诱导MHC限制性T细胞反应的实质上纯的组合物。这些肿瘤抗原与正常情况下发现的蛋白质或肽的不同在于它们是选择性免疫原性的。这些蛋白质或多肽是选择性免疫原性的，因为它们在肿瘤细胞中被特异性地表达，在肿瘤细胞中以异常高的数量被表达和/或在肿瘤细胞中它们是免疫学上被暴露的而在正常细胞中它们是避开免疫系统的。肿瘤抗原可以包括蛋白质或多肽，或其片段。肿瘤抗原较好衍生于与细胞生长和分化相关的胞质蛋白质p145abl，p105akf，p22arf，p160bcr，p33cdc2，p34cdc2，p25cdc42，p25cdc42GAP，P66db1，P45ERK4，p54MAPK，p42MAPK1(ERK2)，p44MAPK2(ERK1)，p39pim，p21rab1，p21rab2，p25rab3A，p74raf，p68raf-1，p74raf-1，p21ras(失活)，p120rasGAP，p295rasGAP，p35ras交换蛋白质，p160ras交换蛋白质，p100-160ras交换蛋白质，p53.内膜表面附着的分子srcgenefamily-p60src，p62yes，p60yrk，p56lck，p60fgr，p57Hck，p59fyn，p58lynandp55blk；abl基因家族-p145ablandp145arg；和Fps基因家族-p93fes.膜生长因子受体的内膜部分神经生长因子受体家族p140trk、p145trkB和p145trkC；肝细胞生长因子p195met；表皮生长因子受体家族p185erbB2、p160erbB3和p170erbB1(EGF-R)和成纤维细胞生长因子受体家族p150FGF-R1/flg、p150FGF-R2/bek、p125FGF-R3和p140FGF-R4。p32-src受体DNA合成的调节蛋白质p42细胞周期蛋白C、p34细胞周期蛋白D、p33cdk2、p60细胞周期蛋白A、p45细胞周期蛋白E、p34cdc2、p33mos、p62细胞周期蛋白B1/B2和p34细胞周期蛋白D/PRAD1/bcl-1。DNA结合和基因表达蛋白质p62fos，p62fosB，p46fra1，p39jun，p39junB，NF-kB，rhoB和p17max.核致癌基因和转录因子p50ets-1，p53ets-2，p75ski，p72sno，p145evi-1，p135cb1，p80rel，p43CREB，p39c-jun，p98lyt，p52erbAalpha，p52erbAbeta，p88糖皮质素受体，p66雌激素-R，p145ab1，和p145arg.其他具有高特异性肿瘤抗原特征的目前还未知的蛋白质或其片段也被本发明包括。一些肿瘤衍生的蛋白质明显地存在于肿瘤细胞中，而不存在于或以非常低的量存在于正常细胞中。因此，这些蛋白质作为抗肿瘤体液和细胞免疫反应的高特异性靶存在，并因此称为高特异性肿瘤抗原(HSTA)。更具体地说，高特异性肿瘤抗原是指能够诱导MHC限制性T细胞反应的基本上纯的组合物。可以用本领域熟知的标准方法分离蛋白质。例如使用三步骤分离方法。首先，培养肿瘤细胞。在一个优选的实施方案中，使用了多个肿瘤细胞系。典型地，至少使用10个肿瘤细胞系以获得肿瘤细胞。特定肿瘤的细胞系是商业上可获得的。例如，实施例1提供了25个SCC细胞系。其他从ATCC可获得的SCC细胞系的例子是CRL-1550CCL-23、CRL-1554HTB-54、CRL-1555HTB-58、HTB-31CRL-1623、HTB-32CRL-1624、HTB-33CRL-1628、HTB-34CRL-1629和HTB-35。将等量的各肿瘤细胞系混合在一起。破碎细胞膜释放出胞质蛋白质，也释放出松散附着在内胞质膜表面上的蛋白质。经超离心从膜和胞质细胞器中分离这些胞质蛋白质。因为肿瘤细胞处于细胞分裂(有丝分裂)的不同阶段和/或因为它们常常缺乏核膜，所以该蛋白质混合物也包含可溶的核蛋白质。使胞质蛋白质的混合物共价结合到纸圆盘上。将该圆盘与癌症病人和对照的血清一起保温以测定IgA、IgE、IgM和/或IgG抗体水平。其次，经离子交换层析(HPLC)将细胞内蛋白质混合物分离成小的组分。将各组分中的蛋白质混合物共价偶联到供抗体检测的纸圆盘上。其中有些部分在肿瘤病人中诱发较高的抗体水平和/或滴度。进一步用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离对肿瘤病人诱发较高血清抗体水平的亚组分达到单个分子水平。将以上步骤中获得的各阳性蛋白质组分经PAGE处理后进行蛋白质印迹分析。切下蛋白质印迹阳性(仅肿瘤病人阳性)带，进行NH2末端测序或中间肽区域氨基酸序列分析。然后，用各蛋白质的氨基末端序列(或内部末端序列)构建核酸探针和/或免疫原性肽，以分离完整蛋白质分子的DNA模板序列。然后用模板序列构建产生大量特异性蛋白质的表达系统。用已知方法在微生物、昆虫细胞或哺乳动物细胞中复制含有模板序列的载体。一旦分离后，即用对照和肿瘤病人血清筛选肿瘤相关蛋白质，以鉴定那些与肿瘤病人血清发生特异性免疫反应的蛋白质。确定抗原和血清(抗体)间免疫反应性的方法是本领域公知的。测定与特定免疫球蛋白(例如，IgA、IgE、IgG和IgM)的免疫反应性的方法也是本领域已知的。例如，用IgA/IgG血清试验检测抗原。这些试验可以用结合到固相支持物上的抗原以夹心方式进行。使固相支持物与含有抗体的血清接触。加入与结合的抗体有免疫反应性的标记的抗体。除去未结合的反应物。标记的量可与针对抗原的IgA或IgG抗体相互关联。这一试验也可以指示出哪一种蛋白质抗原或肽对特定的个体是免疫原性的(即，哪一种蛋白质或肽在不同个体中消除特异性T辅助细胞)。在这一实施方案中，至少一种类型的高特异性肿瘤抗原能结合到固相支持物上和被筛选，以确定对血清中IgA到IgG抗体的免疫反应性。在另一个实施方案中，提供了IgE血清试验。在该试验中，将抗原结合到固相支持物上。使固相支持物与血清接触。将IgE抗体连接到与固相结合的抗原上。加入对IgE抗体有免疫反应性的标记的抗体以结合IgE。除去未结合的反应物。抗原反应性IgE的存在或量与标记的抗体的数相关。这一试验也可以用来指示哪一种肿瘤抗原或肽对特定个体免疫原性的(哪一种蛋白质或肽在不同个体中已经诱导产生了特异性T辅助细胞，并且因此哪一种自身蛋白质或肽是可被病人T细胞免疫系统识别的)。在血清与抗原接触之前，较好(但不是必需的)使用常规技术将抗原固相化。在一个可替代的实施方案中，可以使用下文详细描述的基于脂质体的检测法。就常规固相化来说，例如可将聚苯乙烯板与按本发明制得的抗原悬液一起保温。另外，例如可按已知方法将在电泳凝胶上作为蛋白质带分离的抗原转移到硝化纤维素片上(参见Towbinetal.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，764350-54(1979)；Burnetteetal.，Biochem.，11295-203(1981))。将抗原结合到基本上惰性的底物上的许多其他方法是本领域已知的。使结合的抗原与待检血清样品接触以试验抗该抗原之抗体的存在。抗原和血清较好至少保温5到15分钟。当保温是在或接近人体温(约37℃)下进行时则需要较短时间。在其它温度例如在4℃下保温时也是合适的，不过需要额外的保温时间。在37℃下的保温时间是从约5分钟到过夜。快速检测也可在室温下完成。然后洗涤结合的抗原以除去任可未结合的抗体。即那些对抗原非特异性的抗体。最好用缓冲溶液(例如PBST、PBSTT或Tris/Tween/氯化钠/叠氮化合物)洗涤。较好进行多次洗涤。保温期间，肿瘤特异性抗体结合到固相化抗原上以产生抗原/抗体复合物。在洗涤过程中，所有未结合的抗体基本上被除去。由于本发明的抗原的高特异性，所以对肿瘤非特异性的抗体基本上被洗涤除去。当然，如果试验样品不含有特异性抗体，固相化的抗原便会基本上不与人抗体结合，续而有关抗原/抗体复合物的试验将不会指示出这种复合物实质上地存在。另一方面，如果供试验样品富含抗体，这些抗体应结合在固相化的抗原上以形成大量供续后检测的抗原/抗体复合物。抗原/抗体复合物的检测可用许多已知方法完成。优选的方法包括但不限于酶联免疫吸附法、乳胶凝集法、Western印迹技术或间接免疫荧光法。一般来说，与固相化抗原复合的特异性抗体可通过与标记的或其他可检测的对待试免疫球蛋白特异性的第二抗体接触来检测如果试验样品是人血清，例如，可检测的第二抗体则是对人免疫球蛋白特异性的。第二抗体较好与固相化的抗原一起保温约5分钟到过夜。加入免疫学过量的抗体，即足够量的抗体或其片段以结合已被结合的抗原。然后，用缓冲溶液洗(优选地是多次洗)抗原以除去所有未结合的标记的抗体。洗涤将基本上除去除结合到存在于抗原上的免疫球蛋白上的标记的抗体外的所有标记的抗体。当然，基本上只有存在于这一点上的人免疫球蛋白才是肿瘤特异性抗体。因此，可间接地通过确定标记的第二抗体的存在或不存在来检测肿瘤特异性抗体的存在。有许多用于检测该标记的已知技术，这些技术可依据所使用的标记类型而不同。例如，荧光素标记的抗体可通过扫描荧光素的特征性波长处的发射光来检测。另外，酶标记可通过与合适的底物保温并检测酶活性(优选地是引起颜色变化的活性)来检测。该活性可由肉眼观察确定，或者可在合适波长处用分光光度计自动读取。另外，酶标记可以是辣根过氧化物酶，底物可以是H2O2和2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，所述磺酸在酶的存在下产生可由分光光度计在414nm检测的化合物。在Western印迹分析中，当酶结合到第二抗体上时即可检测到阳性信号。与合适底物保温，酶促产生显色产物，用这一方法分辨的抗原带即与该产物很接近。可通过肉眼观察来确定反应活性带的存在。在间接免疫荧光试验中，荧光素标记的第二抗体可以由荧光激活的检测器或由肉眼观察检测出来。基于脂质体的检测法可涉及包在脂质体内的荧光素、酶或底物，其中肿瘤抗原在所述脂质体表面上表达。将这些脂质体与稀释的待试体液样品一起保温，并充分洗涤之。在表面上有形成抗原抗体复合物之免疫球蛋白的任何脂质体可被结合到含有脂质体之聚苯乙烯管的内壁上的对待检免疫球蛋白特异性的第二抗体识别。带有结合到其表面的抗体的脂质体将固定在管壁上，而非固相化的脂质体则将被洗掉。脂质体例如可被去污剂或补体溶解，酶或原来在内部的底物即成为游离的，以便与管中溶液内的互补底物(或酶)反应。酶活性，优选地是颜色变化反应可经肉眼观察到或经分光光度法检测出来。超过预测定的阳性值外的酶活性指示肿瘤特异性抗体的存在。任何可能含有抗体的样品都可以按本文提出的方法来检测。待试样品较好是体液，例如血液、血清、尿、眼泪及唾液等。除了人的样品外，还可以从哺乳动物例如非人灵长目动物、马、猪等取得样品。由于所描述的试验的灵敏性，在试验前稀释样品是可能的。可加入与各样品相溶的任何体液、待试抗体和抗原组合物来稀释。当以血清作为样品时，例如可以用选自下列一组的一种或多种液体稀释磷酸盐缓冲的盐水，pH7.0-7.4(以下称作“PBS”)加有吐温20的PBS(以下称作“PBST”)含有硫汞撒的PBST(下文称之为“PBSTT”)；含有明胶的PBSTT(此后称作“PBSTTGG”)。当试验IgG抗体时，稀释比率可以高至从约1∶100到约1∶1000。一旦经筛选鉴定了肿瘤特异性抗原，即可用本领域已知的标准技术分离并纯化那些抗原。下文实施例中详细描述从SCC和乳腺癌中鉴定和制备肿瘤特异性抗原。本发明还涉及可用这一方法制备的肿瘤特异性抗原。在一个优选的实施方案中，制备了可用这一方法制备的抗原。在一个优选的实施方案中，肿瘤特异性抗原是SCC抗原，例如SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。在另一个优选的实施方案中，肿瘤特异性抗原是乳腺癌特异性抗原，例如磷酸化的dbl。在一个实施方案中，dbl是p66dbl，该dbl较好包含SEQIDNO2的氨基酸残基序列。在不同的实施方案中，磷酸化的dbl包含一个或多个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。在磷酸化的dbl包含至少一种磷酸化的丝氨酸残基的情况下，该残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442处。在磷酸化的dbl包括至少两个磷酸化的丝氨酸残基的情况下，所述残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442处。在磷酸化的dbl包括至少三个磷酸化的丝氨酸残基的情况下，所述残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3和9或者436、438和442处。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的苏氨酸残基的情况下，该残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号38、263、380、403和406处。在磷酸化的dbl包括至少两个磷酸化的苏氨酸残基的情况下，所述残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406处。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的酪氨酸残基的情况下，该残基较好位于SEQIDNO3的氨基酸残基位置编号201处。磷酸化的dbl也可以包括多于一种类型的磷酸化的氨基酸残基。在一个实施方案中，磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的苏氨酸残基，优选地是，其中(a)两个磷酸化丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号23和25处，并且一个磷酸化的苏氨酸残基位于氨基酸残基位置编号38处；(b)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402处，并且两个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406处或者(c)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402处，并且一个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403或406处。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的酪氨酸残基时，所述残基较好位置为一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号202处，且一个磷酸化的酪氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201处。在另一个实施方案中，磷酸化的dbl包括SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸残基序列。B.肿瘤细胞功能性蛋白质另一方面，本发明提供了一种鉴定肿瘤细胞功能性蛋白质的方法，该方法包括鉴定存在于肿瘤细胞中对肿瘤病人为选择性免疫原性的蛋白质。在一个实施方案中，肿瘤细胞是SCC细胞或乳腺癌细胞。在一个优选的实施方案中，所述功能性蛋白质对肿瘤细胞是选择性功能性的。这里使用的术语肿瘤细胞功能性蛋白质意指在肿瘤细胞中表达的蛋白质，该蛋白质在保持肿瘤细胞存活力中起作用。肿瘤细胞功能性蛋白质也可以在正常的、非肿瘤细胞中表达。肿瘤细胞功能性蛋白质在肿瘤细胞中可以是选择性功能性的。在后一种情况下，该蛋白质不在正常细胞中表达，以不同于在肿瘤细胞中之形式的形式表达，或以低的水平在正常细胞中表达以致于该蛋白质不能以可检测的程度参与正常细胞功能。另一方面，本发明提供了一种制造肿瘤细胞的功能性蛋白质的方法，该方法包括以下步骤(a)鉴定存在于肿瘤细胞中的蛋白质，该蛋白质对肿瘤病人是选择性免疫原性的(b)分离并纯化该蛋白质。本发明还将包括以这种方法制造的蛋白质。在另一个实施方案中，一种制造肿瘤细胞的功能性蛋白质的方法进一步包括以下步骤(c)测定分离和纯化的蛋白质的序列(d)制备编码所述已测序之蛋白质的多核苷酸(e)用包含所述多核苷酸的表达载体转化宿主细胞(f)在足以表达所述蛋白质的条件下培养转化的宿主细胞；(g)收集所述蛋白质。本领域技术人员很容易了解到，肿瘤特异性抗原可以是肿瘤细胞的选择性功能性蛋白质。本发明还公开了选择性功能性肿瘤细胞蛋白质。如下列实施例1中所提出的，SCC抗原3.3很可能是这样一种功能性蛋白质。已测定了SCC3.3的氨基末端序列，并发现具有部分氨基酸残基序列Gln-Phe-Pro-Phe-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr(SEQIDNO1)。该序列与人乳头瘤病毒E6蛋白质相匹配，所述蛋白质是一种在促进肿瘤生长和发育中起作用的致癌基因产物。如上所述，本发明已鉴定了作为乳腺癌特异性抗原的磷酸化的dbl。dbl很可能是一种乳腺癌选择性功能性蛋白质。dbl致癌基因产物是分布在胞质和与细胞骨架基质相关的细胞膜部分之间的66kD胞质磷蛋白(Srivastavaetal.，IdentificationoftheproteinencodedbythehumandiffuseB-celllymphoma(dbl)oncogene.ProcNatlAcadSciUSA1986，86(23)8868-72)，该蛋白Eva和Aaronson使用人B-细胞淋巴瘤DNA转染NIH/3T3细胞而分离的(Evaetal.，IsolationofahumanoncogenefromadiffuseB-celllymphoma，Nature1985，316(6025)273-5)。其正常的同系物是包含925个氨基酸的115kD原致癌基因产物(p115dbl)(Ronetal.，Molecularcloningandcharacterizationofthehumandblproto-oncogeneevidencethatitsoverexpressionissufficienttotransformNIH/3T3cell.EmboJ1988，7(8)2465-73)。p66dbl由478个氨基酸组成(Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductsdefineadistinctclassoftransformingproteins.Proc.NatlAcadSciUSA1988.85(7)2061-5)。它是一种融合蛋白，其末端428个氨基酸相当于p115分子的末端残基。p66dbl具有dbl原致癌基因产物中不存在的额外的50个氨基酸部分(Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductdefinesadistinctclassoftransformingproteins.Proc.NatlAcadSciUSA1988，85(7)2061-5)，但这些残基从一尚未知的基因来源渗入的。p66和p115dbl两者均在丝氨酸残基上被磷酸化，并偶有某些苏氨酸的磷酸化(Grazianietal.，Thehumandbl-proto-oncogeneproductisacytoplasmicphosphoproteinwhichisassociatedwiththecytoskeletalmatrix.Oncogene1989，4(7)823-9)。与原致癌基因产物的1小时相比，p66dbl具有6小时的磷酸化细胞内半寿期(Grazianietal.，Thehumandbl-proto-oncogeneproductisacytoplasmicphosphoproteinwhichisassociatedwiththecytoskeletalmatrix.Oncogene1989，4(7)823-9)。p66dbl也已显示含有比p115dbl更多的磷酸化的残基。与相应的p115原致癌基因产物一样，p66dbl很可能发挥类-ras多肽(例如见于酵母细胞中的cdc24)之GDP-GTP交换因子的功能(Adamsetal.，Thehematopoieticallyexpressedvavproto-oncogeneshareshomologywiththedblGDPPro-GTPexchangefactor，thebcrgeneandayeastgene(CDC24)involvedincytoskeletalorganizationOncogene1992，7(4)611-8)。C.检测抗肿瘤特异性抗原之抗体的试剂盒和方法另一方面，本发明提供了一种用于检测与肿瘤特异性抗原有免疫反应活性的抗体的存在的检测试剂盒，该试剂盒包含足够量的至少用于一次试验的肿瘤特异性抗原。用于试剂盒中的肿瘤特异性抗原与以上提到的相同。肿瘤特异性抗原优选地是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3或者磷酸化的dbl。该试剂盒还包括用于检测与肿瘤特异性抗原发生免疫反应的抗体(例如，抗原-抗体结合物或复合物)的方法。所述抗体是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。检测抗原-抗体复合物的方法是如上文提出的。再一方面，本发明还提供了一种检测存在于生物体液中的对肿瘤特异性抗原有免疫反应活性的抗体的方法。该方法包括以下步骤(a)使体液样品与肿瘤特异性抗原形成混合物(b)将混合物在生物反应条件下保留一段时间，使之足以在存在于样品中的抗体与肿瘤特异性抗原之间形成结合物(c)检测结合物的存在。所述肿瘤特异性抗原较好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述抗体是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。如上文提到的检测抗原抗体结合物形成的优选技术包括但不限于酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法、乳胶凝集法和基于脂质体的检测法。另外，也可使用Western印迹法，在这种情况下，通过肉眼观察来确定电泳带，暗色带的实质性出现可以看作是阳性指征。可看作阳性信号(即包含SCC特异性抗体之试验样品的指征)的抗原/抗体复合物的检测范围依据所选用的检测方法而异，但一般可限定为大于平均数加上用阴性对照组样品所观察之结果1个标准差的值。而所有其它参数(样品的稀释度、保温时间等)保持恒定。在某些实施方案(其中需较高的特异性)中，可以使用平均值加2个或平均值加3个标准差。阴性对照组应包含已知无肿瘤特异性抗原的个体。D.制造/制备对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞群的方法本发明提供了鉴定可用于产生抗肿瘤效应细胞之肿瘤抗原的方法。肿瘤抗原可以是能够诱导T细胞发育的，而所述T细胞在识别和消灭肿瘤细胞上有效的。作为背景，细胞例如B和T淋巴细胞起着免疫系统之效应细胞的作用。这些淋巴细胞分别参与发动抗外来抗原的体液和细胞介导的免疫反应。成熟的B和T细胞带有对不同的抗原特异的受体。成熟T淋巴细胞表达CD3细胞表面分子。T细胞的两种主要类别，即CD8＋T细胞细胞毒性T细胞(CTL)和CD4＋T细胞(T辅助细胞)可在肿瘤治疗中起重要作用。一般说来，CD8+细胞被认为是介导直接杀伤，而CD4+细胞被认为是通过分泌细胞因子介导抗肿瘤作用。所述细胞因子例如包括具有直接和/或间接抗肿瘤活性的白细胞介素2、肿瘤坏死因子、淋巴毒素、干扰素、集落刺激因子和巨噬细胞活化因子。然而，CD8+T细胞和CD4+T细胞可以具有重叠功能(即CD4+细胞能够通过直接胞溶杀伤，CD8+细胞能通过分泌细胞因子起作用)。CD8+和CD4+T细胞间的主要区别在于，CD8+T细胞识别由I类MHC分子呈现的抗原，而CD4+T细胞识别由II类MHC分子呈现的抗原。一般说来，由靶细胞合成的内部抗原进入I类MHC抗原呈现途径以排阻外部细胞环境中的抗原。在外细胞环境中的抗原，包括分泌的自身蛋白质和由肿瘤细胞死亡和破坏所释放的内蛋白质，进入II类MHC抗原加工途径并刺激CD4+细胞。在大多数正常免疫反应中，CD8+和CD4+T细胞两者均参与。但每单独的亚群也能介导肿瘤治疗。因此，本发明提供了一种制备对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞群的方法，该方法包括以下步骤(a)分离对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞(b)诱导致敏的T细胞数量扩增。诱导最好在肿瘤特异性抗原，且必要时在抗原呈现细胞存在下完成。用于这一方法的T细胞较好从循环淋巴细胞、淋巴结或肿瘤组织中分离。该方法还可进一步包括以下步骤(c)继代培养T细胞，以鉴定对特定肿瘤特异性表位敏感的T细胞。已开发出扩增免疫T细胞以扩充其数量的技术，该技术包括在体外用抗原进行特异性激活，接着用抗原、单核饲养细胞和IL-2进行重复周期性再刺激(参见Cheeveretal.，J.Immunol，1261318(1981)；Cheeveretal.，J.Exp.Med.155968(1982)和Cheeveretal.，J.Exp.Med.1631100(1986))。应注意的是，在人中真正同基因的肿瘤细胞仅从完全相同的双生子获得。由于变种和其他各种原因，包括不充足的肿瘤样品和肿瘤细胞培养及扩增的困难。常常不能得到自体肿瘤细胞。虽然饲养细胞的供给从理论上可经照射自身的白趋细胞(leukophoresedcell)而实现，但抗原可获得性问题仍然没有解决。本发明提供了对这一问题的一种解决办法，所说的问题中将涉及足以引起各肿瘤类型所有衍生细胞之免疫原性总体内容的抗原文库。下文给出了对肿瘤特异性抗原肽文库的描述。更具体地说，SCC抗原是由特异性T辅助淋巴细胞识别的，因为这些免疫细胞是B淋巴细胞产生IgA、IgE和IgG所需要的。本发明提供了被肿瘤反应性T辅助(Th)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的抗原。可以使用显示与个别病人的MHCI或II分子结合的抗原肽克隆和扩充这些淋巴细胞，以提供自身Th细胞和/或CTL。可以冷冻克隆的淋巴细胞以提供多个处理组。所述处理将包括大量注入肿瘤靶向Th细胞和/或CTL以起到肿瘤细胞杀伤和消除作用。这一处理方法的另一个益处是在肿瘤消除后保留T辅助记忆细胞以防止肿瘤复发。培养中的细胞可扩增至大约108至1010个细胞继承性能转移多达5×1010个细胞没有出现明显毒性。所述免疫原性肿瘤特异性抗原较好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。在另一个实施方案中，在病人不能以可回收的量产生免疫T细胞时可以在体外激活淋巴细胞。因此，另一方面，本发明提供了一种制造对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞的方法。该方法包括以下步骤(a)分离含有纯净的非抗原致敏的T细胞的自体T细胞群；(b)鉴定免疫原性肿瘤特异性抗原；(c)用免疫原性肿瘤特异性抗原致敏非抗原致敏的T细胞。所述肿瘤特异性抗原较好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述T细胞较好是T辅助淋巴细胞或特异性细胞毒性T细胞。可用对肿瘤表达的抗原特异的T细胞治疗恶性肿瘤。作为一个例子，可以分离对特定类型的肿瘤特异的T细胞并将其用于患有肿瘤的病人。可以在体外产生肿瘤特异性T细胞并用于治疗癌症病人(参见Rosenbergetal.，N.Engl.J.Med.3191767(1988))。已将这种类型的治疗称作继承性免疫治疗。可从受治疗者体内分离对某些肿瘤抗原特异的T细胞，扩增并再以足可消除肿瘤细胞的量重新用于病人。(参见Riddleetal.，J.Immunol.Neth.128189(1990))。更详细的说明参见实施例1，J.iv和v。在另一个实施方案中，可使用肿瘤抗原开发用于预防癌症的疫苗。在该实施方案中，构建了牛痘病毒(Vaccinia)或另一载体病毒，所述病毒含有编码与个别病人MHC构架匹配之肿瘤抗原的核酸(参见Mackett，Proc.Nat′lAcadSci.USA797415-19(1982)；Mackett，J.Virol.49857-65(1984))。该疫苗可以加在一种药学上可接受的载体中使用。E.提高肿瘤相关蛋白质免疫特异性再一方面，本发明提供了包括磷酸化肿瘤相关抗原在内的提高肿瘤相关抗原之免疫原性特异性的方法。优选的肿瘤抗原是乳腺癌抗原例如，包含SEQIDNO2的氨基酸残基序列的dbl。如上文所提出的，磷酸化的dbl是一种乳腺癌特异性抗原。与来源于正常的、非乳腺癌病人的血清相比，磷酸化的p66dbl与来源于肿瘤病人的血清发生特异性免疫反应。实施例2给出了有关增加磷酸化的dbl之免疫特异性的详细描述。导致对肿瘤血清之免疫特异性增加的dbl磷酸化是由于丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的增加或异常的磷酸化。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基时，该残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442处。在磷酸化的dbl包括至少两个磷酸化的丝氨酸残基时，所述残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442处。在磷酸化的dbl包括至少三个磷酸化的丝氨酸残基时，所述残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3和9或者436、438和442处。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的苏氨酸残基时，该残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号38、263、280、403或406处。在磷酸化的dbl包括至少两个磷酸化的苏氨酸残基时，所述残基较好位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406处。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的酪氨酸残基时，该残基较好位于SEQIDNO3的氨基酸残基位置编号201处。磷酸化的dbl也可以包括多于一个类型的磷酸化的氨基酸残基。在一个实施方案中，磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的苏氨酸残基，较好是，其中(a)两个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号23和25处，并且一个磷酸化的苏氨酸残基位于氨基酸残基位置编号38处；(b)一个磷酸化丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402处，并且两个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406处或者(c)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402处，并且一个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403或406处。在磷酸化的dbl包括至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的酪氨酸残基时，所述残基较好的位置为一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号202处，且一个磷酸化的酪氨酸残基位于SRQIDNO2的氨基酸残基位置编号201处。在另一个实施方案中，磷酸化的dbl包括位于SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、3536、37或38的氨基酸残基序列。F.肿瘤特异性抗原的肽文库本发明提供了建立肿瘤特异性体液抗原肽文库的方法。该方法包括以下步骤(a)从肿瘤细胞分离一种或多种选择性免疫原性蛋白质(b)在每一种选择性免疫原性蛋白质中鉴定对肿瘤病人为选择性致免疫原的一个或多个表位。(c)就每一个表位制备含有该表位的肽，其中各单个肽都不含有被非肿瘤受试者识别的表位。(d)形成肽文库。在一个实施方案中，分离包括以下步骤(a)从肿瘤细胞中提取蛋白质；(b)筛选对照和肿瘤病人血清，以确定哪一种蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应(c)分离和纯化选择性免疫原性蛋白质。上文已提出了从肿瘤细胞分离蛋白质和用对照和肿瘤病人血清筛选那些蛋白质以确定与肿瘤病人血清发生特异性免疫反应之所述蛋白质的方法。鉴定方法较好包括以下步骤(a)限定蛋白质中的潜在表位(b)合成含有所述蛋白质之一部分的肽，该部分含有一个表位；(c)筛选对照和肿瘤病人血清，以确定哪一种蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应，并且由此鉴定对肿瘤病人为选择性免疫原性之蛋白质中的表位。可用本领域中已知的各种方法鉴定肿瘤特异性抗原中的潜在表位。举例来说，可以测定抗原的氨基酸残基序列，并将该序列与现有已鉴定的表位比较。在表位涉及到磷酸化的残基时，可用滚动总合分析(rollingsumanalysis)鉴定潜在的磷酸化位点。下文给出如用于磷酸化dbl的这种滚动总合分析的说明。一旦限定了潜在表位，即制得含有至少一个这样的表位的肽。尽管一个单独的肽可以包含多于一个的潜在表位，但单个肽不含有与非肿瘤受试者血清发生免疫反应的表位。合成蛋白质的方法是本领域中已知的。构建长度达20个氨基酸的，其中包含那些氨基酸残基序列以及加到每个个别肽上的额外的非特异性间隔氨基酸残基(甘氨酸或丙氨酸)的肽，以使其从与人血清白蛋白(HSA)结合的位点上伸出(Eminieta1.，Primingforandinductionofanti-poliovirusneutralizingantibodiesbysyntheticpeptides。Nature1983304(5928)699-703McMillanetal.，Syntheticidiotypesthethirdhypervariableregionofmurineanti-dextranantibodies。Cell1983，35(3Pt2)859-63Makelaetal.，InWeirDM，ed.Handbookofexperimentalimmunology.OxfordBlaekwellScientificPublications，19861)。此外，每一肽在其氨基或羧基末端具有非特异性半胱氨酸，以通过N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐连接键共价偶联到其载体HSA上(Carlssonetal.，Proteinthiolationandreversibleprotein-proteinconjugation。N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate，anewheterobifuctionalreagent.BiochemJ1978，173(3)723-37Leeetal.，Amethodforpreparingbeta-hCGCOOHpeptide-carrierconjugatesofpredictablecomposition。MolImmunol1980，17(6)749-56)。在肽已具有半胱氨酸残基的情况下，不加入特异性接头氨基酸。一种可替换的方法是，使用碳化二亚胺方法将每个肽连接到HSA上(VanRegenmorteletal.，Synthetiepolopeptidesasantigens.Amsterdam，NewYork&londonElservier，1988(BurdenRH，VanKnippenbergPH，ed.LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)。各肽最好是共价偶联到HSA上。需要有载体分子以便可预定地提供足量的用于分析的肽，并且也给每一种肽更多的天然突出位点以利于抗体偶联。采用可预见的连接方法(61-66)将个别肽以高摩尔比率(＞10∶1，肽∶HSA)偶联到HSA上。HSA用作优选的载体分子，因为与使用非自身载体蛋白质(例如，牛血清白蛋白(BSA))相比，它能与自体抗体发生最小的反应。最好将肽偶联到HSA分子表面的游离氨基基团上。对肿瘤病人和对照血清进行抗HSA-肽结合物之混合物的试验。用我们标准的Western印迹法分析该HSA-肽混合物。利用所有可能的肽取代物的混合物用于鉴定那些与任何个别肽反应的肿瘤和对照血清。为了尽可能地减少非癌症特异性表位反应，可用肽的非表位等同物抑制每份试验的血清样品。那些肽被结合到HSA上并以混合物形式使用，以抑制识别各肽之非特异性表位的血清抗体。那些与肿瘤特异性表位反应的抗体(很可能仅存在于肿瘤病人血清中)则可能未受到抑制。所试验的抗体同种型是IgA、Igd、IgM和IgE。在对任何给定的免疫原性蛋白质反应中，个别病人很可能产生不同的反应性抗体同种型。患有早期阶段疾病的病人与患有晚期阶段病人相比，前者中产生占优势的IgM有力地说明，即使在癌症原位(CIS)阶段，也有可能通过测定IgM活性进行早期检测。分析IgE反应活性以试验这样一种前题，即IgG生成性致敏需要更长时间的抗原暴露，因此其在早期肿瘤检测中不可能是有用的同型。因此须在肿瘤发育阶段的整个过程中分析被试血清的任何这种反应性。试验来源于肿瘤发育所有阶段之病人的血清样品，同时试验来源于具有良性损害病人的和健康受试者的对照样品。针对个别HSA-肽结合物试验所有初始反应性病人和对照者的血清。用与HSA-肽结合物的混合物起阳性反应的血清试验各单个结合物的体液反应性。试验方法学上是相同的。然而，在每一种情况下，添加抗原是相应的非表位HSA结合物且不是添加结合物混合物。进一步分析那些只与肿瘤病人血清反应的肽。画出最长的，在各表位两边的可能的肿瘤特异性氨基酸序列的序列图谱。这一工作的一个成功结论提供了作为肿瘤特异性免疫原发挥作用并且也用作在不需制备性抗原添加的情况下进行肿瘤特异性血清抗体检测的理想的来源抗原的肽。即使在其表位区域的结构识别方面发生微小变化，对最大可能的肿瘤特异性免疫原性区域的描绘也会给出足够的与大多数可获得的血清抗体反应的结合位点。这将增加试验的敏感性。因此在这一过程中，我们可以在特定表位以外达5-6个氨基酸处发现有表位特异性。由于由在表位和远端氨基酸间的盐桥导致了远端肽构象的变化，所以这种情况是可能发生的(Otovosetal.，Phosphorytationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sizedsubunit.J.ProteinChem1988，7(4)365-76)。合成鉴定为肿瘤特异性的肽的各种较短变体，并进行抗阳性肿瘤血清和对照血清试验。待检对照血清包含统计学上有意义数目的从良性损伤病人和健康受试者获得的样品。本发明还将涉及用这一方法制得的文库。在一个优选的实施方案中，所述表位包含一个异常磷酸化的氨基酸残基序列。能够经受细胞内磷酸化的蛋白质是一大类靶分子。这一类分子的代表性例子示于附图11中。其成员包括编码癌基因的蛋白质，磷酸化的受体蛋白质、细胞激酶、细胞周期蛋白质、转录因子及其他蛋白质。候选分子很可能包括(1)对肿瘤细胞而不是正常细胞在性质上和/或数量上特异的蛋白质(2)在正常细胞中有很短磷酸化期限，而在肿瘤细胞中则保持较长磷酸化期限的蛋白质(3)与细胞增殖密切相关的蛋白质和(4)在胚胎组织中产生的并在正常胎后组织中缺少的，但在乳腺癌细胞中表达的蛋白质。基于科技文献中的详述选择候选的蛋白质。为描述定性和定量特异性而分析涉及癌基因转录的蛋白质、磷酸化的受体、细胞激酶、细胞周期蛋白质、转录因子和其他磷酸化的蛋白质的引述文献。基于免疫组织化学分析、RNA和/或DNA杂交以及特异性蛋白质分离工作描述相对特异性。还基于我们进行的对乳腺癌组织的免疫化学分析选择候选的蛋白质。起始的候选蛋白质是在其他肿瘤系统中试验阳性的癌基因编码的蛋白质、其他癌基因编码的蛋白质、磷酸化的受体、细胞激酶、细胞周期蛋白质、转录因子及与细胞增殖和/或分化相关的其他蛋白质。也可以基于来源于尝试从乳腺癌细胞分离用作选择性特异性体液免疫原的胞质蛋白的信息选择候选蛋白质。将建立的细胞系，例如BThr-20、BThr-474、BThr-483、MCF-7、MDAla-MB-134、MDAla-MB-157、MDAla-MB-231、MDAla-MB-453、MDAla-MB-468和SKBArg-3(AmericanTissueTypeCollection，Rockyille，MD)培养至50ml细胞堆积体积。以含水缓冲液从每细胞沉淀物中提取可溶性蛋白质，并使用几种不同的层析步骤进行再分离。用DEAE阴离子交换层析法分离，接着用SP阳离子交换层析法分离可溶性蛋白质。将得自DEAE和SP层析的单个含蛋白质组分在7.5％和15.0％的聚丙烯酰胺胶(PAGE)上电泳，并转移到硝化纤维素纸上进行单个乳腺癌细胞蛋白质的Western印迹分析。一旦被这样鉴定后，便将这些蛋白质电泳转移到聚亚乙烯氟膜上，并用于部分氨基酸序列测定。推导的氨基酸序列得以鉴定全部氨基酸序列已知的蛋白质。如果推导的氨基酸序列不是以前描述的蛋白质，则它们即被用作在描述那些分子的基因组序列中使用的模板。如上所述，磷酸化的dbl已被鉴定为一种乳腺癌特异性抗原。因此，在另一方面，本发明提供了一种建立乳腺癌特异性体液抗原肽文库的方法，该方法包括以下步骤(a)鉴定存在于乳腺癌细胞中的蛋白质，所述蛋白质对乳腺癌病人是选择性免疫原性的；(b)确定该蛋白质的潜在的磷酸化位点(c)合成包含该蛋白质部分的肽，每一种蛋白质均含有至少一个磷酸化位点并且其中至少一个磷酸化位点是磷酸化的(d)筛选所述肽，以鉴定对乳腺癌病人为选择性免疫原性的磷酸化的肽(e)形成磷酸化的选择性免疫原性肽的文库。在一个实施方案中，所述蛋白质是癌基因转录的蛋白质、细胞周期蛋白质、受体、转录因子或其他调节蛋白质或底物蛋白质。在本方法的一个实施方案中，所述蛋白质是dbl，并且潜在的磷酸化位点包括(a)一个在SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上的磷酸化的丝氨酸残基(b)至少两个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和433、436和442或者438和442上的磷酸化的丝氨酸残基(c)至少三个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3和9或者436、438和442上的磷酸化的丝氨酸残基(d)一个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号38、263、380、403和406上的磷酸化的苏氨酸残基(e)至少两个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上的磷酸化的苏氨酸残基；(f)至少一个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上的磷酸化的酪氨酸残基(g)至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的苏氨酸残基，其中(i)磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号23和25上，且一个磷酸化的苏氨酸残基位于氨基酸残基位置编号38上；(ii)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，且两个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上或者(iii)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，且一个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403或406上；或(h)至少一个磷酸化的丝氨酸残基或至少一个磷酸化的酪氨酸残基，其中磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号202上，且磷酸化的酪氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上。上述方法的蛋白质部分较好包括SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸残基序列。筛选大量合成的对乳腺癌特异性血清抗体有反应活性的候选肽，制得肿瘤特异性肽文库。然后，用该文库作为来源抗原，用该抗原进行高敏感性和特异性的血清学试验，以在大多数病人中检测早期乳腺癌。p66dbl的完全氨基酸序列已由Eva描述过(Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductdefinesadistinctclassoftransformingproteins.ProcNatlAcadSciUSA1988，85(7)2061-5)。使用概略性的用于描述表面肽的四种单独的方法，我们已绘制出那些很可能认定为磷酸化候选位点的氨基酸残基的图谱。利用7个连续残基的滚动总合分析法(rollingSumanalysis)时，用于构成一致性分析的个别方法包括确定亲水性指标(Hoppetal.，Predictionofproteinantigenicdeterminantsfromaminoacid-sequences.ProcNatlAcadSciUSA1981；78(6)3824-3828)，HPLC肽保留指标(Parkeretal.，Newhydrophilicityscalederivedfromhigh-performanceliquidchromatographypeptideretentiondatacorrelationofpredictedsurfaceresidueswithantigenicityandx-ray-derivedaccessibilitysites.Biochemistry1986；255425-5432)，疏水性指标(FauchereJL，PliskaV.Hydrophobicparameterspiofamino-acidsidechainsfromthepartitioningofAsn-acetyl-amino-acidamides.EurJMedChem1983；18(4)369-375)，和可及性指标(Fragaetal.，Predictionofthesecondarystructureandfunctionalsitesofmajorhistocompatibilitycomplexmolecules.JMolRecognit1990；3(2)65-7347).潜在的磷酸化位点包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基。与乳腺癌相关的dbl的异常磷酸化可以发生在许多位点并涉及到多于一种类型的残基。p66的联合滚动总合分析图解显示于图10中。适合外部暴露要求的肽区域图解显示于图10中。基于以上分析，具有最大丝氨酸磷酸化潜在性的p66dbl肽序列包括SEQIDNOs3-10所指定的那些序列，其中磷酸化残基下面画线标示Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO3)Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO4)Ala-Pro-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala(SEQIDNO5)Cys-Gln-Asn-Lys-Pro-Arg-Ser(SEQIDNO6)Glu-Leu-Leu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Asp-Cys-Glu-Gly(SEQIDNO7)Cys-Lys-Arg-Arg-Val-Glu-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Asp-Arg(SEQIDNO8)Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO9)andAla-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Gln(SEOIDNO10).具有最大苏氨酸磷酸化可能性的p66dbl肽序列包括SEQIDNOs3-10所指定的那些序列，其中磷酸化残基下面画线标示Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO11)Lys-Lys-Gly-Ala-Thr-Lys-Met-Lys-Asp-Leu-Ala-Arg(SEQIDNO12)Val-Lys-Lys-Arg-Lys-Gln-Gln-Asp-Gln-Leu-Thr-Glu-Arg-Asp-Lys-Phe(SEQIDNO13)和Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO14).具有最大酪氨酸磷酸化可能性的p66dbl肽序列是Glu-Leu-Leu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Asp-Cys-Glu-Gly(SEQIDNO15).某些p66dbl序列具有包含丝氨酸和苏氨酸潜在磷酸化位点之残基的组合。那些残基是Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO16)Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO17).一个p66dbl序列具有包含丝氨酸和酪氨酸潜在磷酸化位点之残基的组合Glu-Leu-Leu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Asp-Cys-Glu-Gly(SEQIDNOl8).试验了所有包括那些含磷酸化苏氨酸和/或酪氨酸残基在内的可能的磷酸化肽置换，因为异常磷酸化不可能仅限于丝氨酸残基。以上列出的16个肽加上在额外的带有磷酸化残基位点的其它肽。假如附加肽具有两种或多种能够经受磷酸化的氨基酸残基，则它们包括那些肽的不同磷酸化/去磷酸化的组合。Szendrei的工作预示了对分析在5个氨基酸跨度(理想的表位大小)内含有一个磷酸化的氨基酸的变化之各表位的需要(Szendreietal.，RecognitionoftheminimalepitopeofmonoclonalantibodyTau-1dependsuponthepresenceofaphosphategroupbutnotitslocation.J.NeurosciRes1993，34(2)249-9)，Szendrei已证明单个氨基酸残基的去磷酸化阻止特异性单克隆抗体结合到由那些残基限定的表位上。所除外的是其中可磷酸化的残基被多于六个不可磷酸化的残基(即，肽SEQIDNO6中的第二个S和T)相互分开的置换，因为这些置换会限定两个分离的和不同的表位区域。所述附加肽和其衍生构建体包括Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO19)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO20)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO21)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO22)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO23)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO24)；Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO25)Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO26)；Cys-Lys-Arg-Arg-Val-Glu-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Asp-Arg(SEQIDNO27)Cys-Lys-Arg-Arg-Val-Glu-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Asp-Arg(SEQIDNO28)；Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO29)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO30)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO31)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO32)Ala-Ser-Gln-Ser-Vsl-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO33)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO34)；Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO35)Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO36)；Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO37)；和Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO38).有关合成含有磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基之肽的基本技术是本领域已知的(Carpenteretal，Phosphoinositide3-kinaseisactivatedbyphosphopeptidesthatbindtotheSH2domainsofthe85-kDasubunit.JBiolChem1993；268(13)9478-83；Ottingeretal.，Synthesisofphosphotyrosine-containingpeptidesandtheiruseassubstratesforproteintyrosinephosphatases.Biochemistry1993；32(16)4354-61；Otovosetal.，Phosphorylationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sizedsubunit.JProteinChem1988；7(4)365-76；Andrewsetal.，Solid-phasesynthesisofarangeofO-phosphorylatedpeptidesbypost-assemblyphosphitylationandoxidation.IntJPeptProteinRes1991；38(5)469-75；Garbay-Jaureguiberryetal.，Solidphasesynthesisofpeptidescontainingthenon-hydrolyzableanalogof(O)phosphotyrosine，p(CH2PO3H2)Phe.Applicationtothesynthesisof344-357sequencesofthebeta2adirenergicreceptor.IntJPeptProteinRes1992；39(6)523-7；Escobedoetal.，Aphosphatidylinositol-3kinasebindstoplatelet-derivedgrowthfactorreceptorsthroughaspecificreceptorsequencecontainingphosphotyrosine.MolCellBiol1991；11(2)1125-32；Kwonetal.，StereochemistryspecifiestheregiochemistryofphosphorylationintwocAMP-dependentproteinkinasesubstrates.JBiolChem1993；268(22)16725-9).很容易构建含有单个或多个磷酸化残基的肽。可用本领域已知的标准HPLC技术将单个肽纯化达到＞95％的纯度。使用已知的标准HPLC法以及质谱分析法完成氨基酸组合物和单个肽序列的认定(Garbay-Jaureguiberryetal.，Solidphasesynthesisofpeptidescontainingthenon-hydrolyzableanalogof(O)phosphotyrosine，p(CH2PO3H2)Phe.Applicationtothesynthesisof344-357sequencesofthebeta2adrenergicreceptor.IntJPeptProteinRes1992；39(6)523-7；Kwonetal.，StereochemistryspecifiestheregiochemistryofphosphorylationintwocAMP-dependentproteinkinasesubstrates.JBiolChem1993；268(22)16725-9；Stachowiaketal.，PeptidemappingusingthermosprayLC/MSdetectionrapididentificationofnemoglobinvariants.PeptRes1989；2(4)267；Khandkeetal.，InfluenceofionsoncyclizationoftheaminoterminalglutamineresiduesoftrypticpeptidesofstreptocccalPepM49protein.ResolutionofcyclizedpeptidesbyHPLCandcharacterizationbymassspectrometry.IntJPeptProteinRes1989；34(2)118-23).Szendrei已指出，检测被单个单克隆抗体识别的表位上的磷酸盐取代是可能的(Szendreietal.，RecognitionoftheminimalepitopeofmonoclonalantibodyTau-1dependsuponthepresenceofaphosphategroupbutnotitslocation.J.NeurosciRes1993；34(2)243-9)。而且，其他研究已经阐明，由于磷酸盐分子的盐桥接，相互的最接近的残基的磷酸化可以提供表位改变构象变化(OtovosLJr.，HollosiM，PerczelA，DietzscholdB，FasmanGD.Phosphorylationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sizedsubunit.JProteinChem1988；7(4)365-76).单个人血清抗体的表位结合敏感性用于确定由异常磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基的新抗原表位是否存在于p66dbl中。合成SEQIDNOs3-38所指定的肽，结合到HSA并按如上文提出的方法分析之。简单地说，进行乳腺癌和对照血清抗HSA-磷酸化肽结合物之混合物的试验。用Western印迹法分析HSA-肽混合物。利用所有可能的肽置换的混合物鉴定那些与任何单个肽反应的肿瘤和对照血清。为了尽可能减少非肿瘤特异性表位反应，向各待试血清样品中添加具有SEQIDNOs3-10、12和13所示肽的未磷酸化的等同物。将这些肽结合到HSA上并用于混合物中，以抑制识别各磷酸化肽之非特异性表位的血清抗体。那些与肿瘤特异性表位反应的抗体(很可能仅在肿瘤病人血清中)很可能仍是未被抑制的。所检测的抗体同型是IgA、IgG、IgM和IgE。在对任何给定的免疫原性蛋白质反应中，个别病人很可能产生不同的反应性抗体同型。与患有II、III和IV期疾病的病人相比，患有I期疾病的病人中产生占优势的IgM强有说明，即使在原位肿瘤(CIS)阶段也可能通过测定IgM反应活性进行早期诊断。分析IgE反应性，以试验这样一种前题IgG产生致敏需要延长的抗原暴露时间并且因此在早期乳腺癌检测中不可能是有用的同型。因此，应在待检血清的乳腺癌相应发展阶段的全过程中分析任何这种反应活性。试验来源于导管和小叶癌症所有阶段的病人的血清样品以及来源于包括良好损伤病人和健康受试者的对照样品。对所有发生反应的病人和对照血清再进行抗个别HSA-磷酸化肽结合物的试验。用与HSA-肽结合物反应阳性的血清试验每一单个结合物的体液反应性。试验方法学是相同的。然而，在每一种情况下，添加抗原是相应的非磷酸化HSA结合物而不是添加结合物的混合物。进一步分析那些只与乳腺癌血清反应的磷酸化的肽。绘出最长的，在各变异磷酸化氨基酸残基两边的可能的乳腺癌特异性氨基酸序列序列图谱。这一工作的成功结论提供了作为肿瘤特异性免疫原发挥作用并且也用作在不需制备性抗原添加的情况下进行肿瘤特异性血清抗体检测之理想来源抗原的肽。即使在其磷酸化残基识别区域的结构识别方面发生微小变化，对最大可能性的肿瘤特异性免疫原性区域的描绘也会给出足够的与大多数可获得的血清抗体反应的结合位点。如此将增加试验的敏感性。异常残基磷酸化可以赋予表位特异性延至磷酸化残基外5-6个氨基酸处。由于磷酸化残基和远端氨基酸间的盐桥导致了远端肽构象的改变，所以这种情况是可能发生的(Octovosetal.，Phosphorylationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sjzedsubunjt.J.ProteinChem1988，7(4)365-76)。合成鉴定为乳腺癌特异性的肽的各种较短的变体，并进行抗dbl-阳性乳腺癌血清试验。待检对照血清包含统计学上有意义数目的从良性损伤病人和健康受试者获得的样品。在没有制备性血清添加的情况下检验全长度肽。如发现所产生的阳性反应性是对肿瘤血清特异性的，便将证实总的肽特异性。如果肿瘤和对照血清分享所测得的反应性，所研究的肽则在超出最近之磷酸化残基5个氨基酸的一端和另一端缩短2个氨基酸。重新试验各新的肽，如果必要时，可进一步缩短直至出现所需的特异性抗体反应性。最终的结果是获得异常磷酸化肽的文库，以其作为乳腺癌特异性体液抗原的来源。然后，可用这些抗原建立检测早期乳腺癌的基于抗体的筛选试验。G.检测肿瘤存在的试剂盒期望的检测水平是检测原位癌(C-I-S)。假如所提供的分子(例如p66dbl)能鉴定其他76％的乳腺癌病人，则可能是在目前没有可靠的等同物的I期癌症检测。提供了一种基于ELISA的原型筛选试验。其来源抗原是本发明的肿瘤特异性抗原。将特异性肽共价偶联到HSA上以可靠地包被微滴定孔。用中性的、非反应性接头氨基酸序列合成各肽，以利于其连接到HSA上，以为其提供远离HSA分子的足够的凸出部分，从而可随意得到血清抗体结合。经特异性优化实验分别确定每一结合物的包被量。用得自定量的个别抗原铺涂的信息构成成比例抗原混合物配方。使用HSAla-肽结合物混合物以提供高灵敏性和特异性。将源于足够大和不同肿瘤特异性抗原组的抗原混合在一起。也考虑肽-HSA混合物的组合看哪一种抗原最适合早期肿瘤识别。因此，针对早期肿瘤病人血清和C-I-S病人血清筛选免疫原性肽。也试验个别抗体同型以确定哪一个异型是最适于早期检测的。实施例1HSTA的鉴定缺少特异性的，可作为靶的鳞状细胞癌(SCC)抗原已大大限制了免疫治疗。例如疫苗和继承性能转移肿瘤反应性T细胞的开发。这一实施例表明，大多数SCC病人和受试者具有抗SCC胞质蛋白质的血清IgA、IgE和IgG抗体。这些蛋白质中的某些似乎可用作高特异性肿瘤抗原，因为当用Western印迹技术分析时它们可与病人IgA和IgG抗体高排他性地结合。在该实施例中，鉴定了30份HSTA肿瘤抗原。个别HSTA与不同病人的血清和不同阳性/阴性组合受试者血清的IgA或IgG发生反应。所有病人血清都表现出具有一定量与某些HSTA反应的免疫球蛋白，而病人血清则不含与所有HSTA反应的抗体。因此可从病人体内分离和扩增分化SCC抗原的文库。更具体地说，本实施例显示(1)25个单个SCC系的扩增；(2)从这些细胞系的混合物中分离可溶性胞质蛋白和其他分子；(3)SCC胞质蛋白结合到CNBr活化纸盘上；(4)试验各种SCC病人和对照血清中结合到胞质抗原上的IgA、IgE和IgG；和(5)抗原抑制研究，以证实各检测法的特异性。使用不同肿瘤来源的单克隆SCC细胞系的混合物，以通过稀释减少抗原的作用。所述抗原以不足以形成足够免疫原性的量存在于各细胞类型中，或者仅存在于很少几种细胞系中并因此被认为是小的或少的抗原。使用偶联到试验抗原上的CNBr活化的纸盘，因为它们通过游离的氨基基团提供蛋白质的偶联，从而避免将碳水化合物和核酸作为抗原。与IgG一起测定IgA和IgE同型，因为它们由B细胞表达也需要有T细胞的共同参与。A.血清样品来源分析了65份患有头和颈SCC的病人的血清和65份年龄和性别相配的对照对象的血清。25份病人血清来源于患有第I或II期疾病的受试者，43份血清样品来源于患有III和IV期疾病的病人。对照样品从年龄和性别相配的健康受试者收集。B.肿瘤细胞培养以约相等的量扩增25份已建立的SCC细胞系，以给出等于35ml的合并的细胞沉淀物。所有细胞系都来源于头部和颈部各不同位置的肿瘤。细胞系包括UM1、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17和18(从Dr.T.Carey，UniversityofMichigan，AnnArbor获得)，SCC-21、23、24、25、26、28、29、30、31(NorthwesternUniversity)以及HTB-43、CCL-23和138(ATCC，Rockville，MD)。所有细胞系均用MEM＋NNEAA＋7％FBS＋SerXtend培养基(CultureFacility，U.C.S.F)培养和扩增。在大约70％汇合时，用加在Puck′s盐水中的0.1％胰蛋白酶和0.4％EDTA的溶液在37℃处理5-10分钟，从组织培养瓶分离出用于扩增目的或胞质蛋白分离的细胞单层。然后加入新鲜培养基并轻轻搅动单层以释放单个细胞。以1500RPM离心所形成的细胞悬液，抽取并弃去上清液，将细胞沉淀物重新悬浮在组织培养介质中以进一步扩增，或者用PBS(50mM磷酸钠，pH7.5，＋150mMNaCl)洗涤两次以进行胞质蛋白质分离。C.细胞内蛋白质的分离将洗涤过的并离心沉淀的肿瘤细胞悬浮在含有PBS和1mM苄脒、1mMEDTA、1mMPMSF及1mM冷却到4℃的亮抑蛋白酶肽(leupeptin)的溶液中。当混合物足够达到起泡的条件下用超声波将细胞悬液处理15秒钟，同时在冰水浴中冷却混合物。然后将超声处理的悬液以100,000g在4℃下离心60分钟。将上清液放置在一边，并重新悬浮细胞沉淀。将超声处理-离心步骤重复七次。合并所有上清液并弃去含有细胞膜、完整核和大的细胞器的最终的细胞沉淀物。使用3,500MW孔隙透析管将合并的上清液溶液对含有3种蛋白酶抑制剂的PBS透析。使用Bio-Rad蛋白质检测试剂盒(BioRad，Richmond，Ca)测定经加工之溶液的蛋白质含量。然后等分样品，并将不立即使用的样品置于-20℃下冷冻。D.对病人和对照血清的RAST分析对血清样品进行特异性IgE分析(Ceska，etal.，Allerg.Clain.Immun.491-19(1972))。CNBr活化的纸盘按每盘用10微克的量与SCC蛋白质偶联。抗血清是125I标记的亲和纯化羊抗-人IgE。血清和抗血清保温步骤延长至20小时，并将洗涤缓冲液改变成含有0.1％吐温20的PBS。用25IUIgE/ml标准品校准检测系统(Nalebuff，etal.，CarlsbadCASymposiaFoundation35-48(1989))。相对SCC蛋白质偶联的圆盘和空白圆盘检测各血清样品(每圆盘100μl)。空白圆盘是已用50mM乙醇胺猝灭的CNBr活化的圆盘。大于或等于相应空白圆盘获得的平均本底值之上2.5个标准差的试验值被看作阳性。在用过量非特异性IgE(1,000IU/ml人骨髓瘤IgE(ScrippsLaboratory，SanDiego，Ca)试验，确定本底图型在它们与SCC蛋白质偶联的圆盘间存在的净本底无差异后，即将空白纸盘用作本底展示物。E.IgE-阳性血清的RAST抑制作用从肿瘤病人和对照受试者随机选择10份SCCIgE阳性样品进行SCC细胞内蛋白质抑制分析。抑制溶液含有2.5mg/mlSCC蛋白质加上在PBS中的8％人血清。每份血清样品单独用SCC抗原溶液和8％HSA/PBS溶液作1∶2系列稀释。每份样品在与SCC蛋白质偶联的纸盘保温前均在4℃保温18小时。其它步骤按用于测定IgE抗体的步骤完成。F.测定对SCC胞质蛋白特异性的血清IgA和IgG抗体将血清样品用纯净的羊血清稀释至1∶2000。稀释样品加盖并于室温轻轻搅动下保温4小时。用100微升稀释的病人和对照血清用于复制SCC胞质蛋白质偶联的纸盘并复制空白纸盘。加血清的盘在25-27℃保温20小时。然后用275微升50mMPBS，pH7.3，0.1％吐温20(洗涤缓冲液)将纸盘洗3次。最后一次洗涤是将纸盘浸渍10分钟。将整个洗涤周期重复3次以上。以每盘50微升将125I标记(BoltonHunter方法)的，亲和纯化的羊抗人IgA或抗人IgG(KirkegaardandPerry，Gaithersburg，Md)加样于每个纸盘上。将每种放射标记的抗血清用纯净的羊血清稀释以达到40,000-45,000计数/分钟/50微升样品。圆盘再在25-27℃下保温20小时，如前以4次10分钟周期洗涤，然后在8计数器中计数2分钟。按以下公式确定各被分析样品的特异活性抗原盘的平均值减(平均值＋空白盘的2.5SD)/50微升放射性核素溶液的平均计数。G.IgA、IgG-阳性血清的RAST抑制对从肿瘤病人和对照组中随机挑选的10份SCCIgA阳性血清样品和10份IgG阳性样品用SCC胞质蛋白质抑制法分析。抑制溶液含有加在纯净羊血清中的2.5mg/mlSCC蛋白质。已经用纯净羊血清稀释至1∶100的每份血清样品再用SCC抗原溶液和单用纯净羊血清按1∶2稀释。将这样处理的每份样品在4℃下保温18小时，然后与SCC蛋白质偶联的纸盘一起保温。其余步骤与用于测定IgA和IgG的步骤相同。H.SCC胞质蛋白质的离子交换分级分离将按实施例1，C部分的所述方法制得的胞质蛋白质混合物对20mM磷酸钠缓冲液，pH8.2透析(3,500孔透析管)。将所形成的物质加于用20mM磷酸钠缓冲液pH8.2(缓冲液A)预平衡过的Bio-RadDEAE半制备性HPLC柱(Bio-Rad，Richmond，CA)上，以2ml/分钟的流速进行12小时的线性递度洗脱，最终达到100％缓冲液B(缓冲液A＋1MNaCl)。收集75管含蛋白质的部分。然后将流出的材料加于Bio-RadSP离子交换柱上并在相似条件下洗脱，收集25管。然后使用Bio-Rad蛋白质定量试剂盒确定各管的蛋白质含量，等分各管内容物并在-20℃下冷冻。I.筛选抗分级分离之抗原的病人和对照血清将CNBr活化的纸盘与按实施例1，H部分所述的方法分离的各SCC胞质蛋白质部分的材料以每纸盘相等于5微克蛋白质的量一起保温并按实施例1，H部分所述的方法处理之。10份病人和10份对照血清与代表每一洗脱部分的一起保温，并检测其IgA结合。检测另一组10份病人和10份对照血清的IgG结合。选择当针对与整个胞质蛋白质混合物偶联的纸盘试验时已登记为对一份或其他蛋白质呈阳性反应的血清。就用于测定IgA的对照血清来说，一个例外是仅一份呈现阳性。在试验序号1中一起检测所有样品的IgA结合，并在试验编号2中检测所有样品的IgG结合。使用空白纸盘确定各血清样品的中值本底。利用空白纸盘计算每个受试组分值的分数。使用下列公式计算每一受试组分值的分数部分值(序号计数)/中值病人本底(序号计数)。将SCC病人血清作为一组与年龄和性别匹配对照组比较以计算每一部分的中值分数。为了确定哪一种部分最可能是具有肿瘤特性蛋白质，从相应的SCC病人分数中减去相当于特定部分的各病人中值分数。鉴定那些产生净的阳性分数的部分以按J部分所述进行PAGE分级分离和Western印迹分析。J.使用病人和对照血清分级分离的SCC胞质蛋白质的放射自显影Western印迹分析按照Laemmli所述方法，用10％分离胶和最大电泳格式(HoeferScientificInstrument，SanFrancisco，CA)进行SDS-PAGE。分离胶的体积是142mm宽×140mm长×1mm厚。样品孔宽度是6mm。将从DEAE离子交换层析柱上回收的可溶性SCC抗原对1mM磷酸钠缓冲液，pH7.2透析(3500MW孔透析管)，并且以1ml等份分离在聚丙烯管中。向每支管中加入三种酶抑制剂(各1mM)以尽可能减少SCC蛋白质的降解。所有各部分均用Speed-Vac(SarantInstruments，Farmingdale，NY)完全干燥，然后在-20℃下保存。重新溶解10微克形式的各所需蛋白质部分，与样品缓冲液混合并煮沸4分钟，得到各孔上样的10微升样品。各凝胶在20mA(恒定电流)下开始电泳25分钟，直到所有蛋白质进入分离的胶为止。然后将电流提高到25MA约3小时或者直到溴苯酚盐染料达到凝胶的底部为止。i.凝胶转移电泳后移出凝胶并在轻轻搅动下在转移缓冲液(100mMTris-甘氨酸，pH8.8，10％甲醇)中平衡10分钟。将一张14×16cm的硝化纤维素纸片和六张Whatman3号滤纸(15×16cm)浸入装有两块相近尺寸海绵的11转移缓冲液中。将凝胶置入有纸和两块海绵的转移缓冲液中。将凝胶放在硝化纤维素纸的顶上，接着是3张Whatman滤纸和一层海绵。然后将3张Whatman滤纸和另一块海绵置入胶的顶上。在转移装配时，注意不要在硝化纤维素和胶之间留下气泡。组装好后置入转移小室中，供给40伏(恒定电压)过夜，第二天增加到400伏持续电泳45分钟。在整个电泳过程中使用冷却处理。使用非接触(no-touch)技术剪下相应于电泳通道的6mm凝胶条并在5％脱脂牛奶粉、50mMPBS和0.05％NaN3溶液中封闭2小时。ii.第一抗体步骤病人或对照血清用含有5％脱脂牛奶粉和0.05％NaN3的纯净羊血清稀释至1∶200，并在室温下轻轻搅动2小时，在轻轻搅动下将各条与稀释的病人血清，对照受试者血清和单独的稀释剂室温保温20小时。每一凝胶条用3ml含有0.1％吐温20的PBS洗涤5次，使每次洗涤间有10分钟的浸渍间隙。iii.第二抗体步骤125I标记的亲和纯化的羊抗-人IgA或IgG(KirkegaardandPerry，Gaithersburg，MD)用5％脱脂奶粉、50mMPBS、0.05％NaN3充分稀释以给出50,000CPM/50微升。每个条与2ml标记的抗-IgA或抗-IgG溶液在室温下保温20小时。然后将各个条洗涤5次，干燥，并在X-光胶片上曝光48小时。iv.从自体外周血、淋巴结和肿瘤组织制备HSTA致敏的淋巴细胞群从单个SCC病人获得新抽取的、肝素化的外周血。该血液用Hank′s平衡盐溶液(HBSS)稀释至1∶2并加在FicollHypaque密度梯度管(Hystopaque，SigmaChemicals，St.Louis)上。这样制得的样品在2,500rpm下离心20分钟，从Ficoll和HBSS界面回收淋巴细胞，然后用HBSS洗涤三次。将这些新制备的淋巴细胞悬浮在含有30％人AB血清和10％DMSO的RPMI1640中，并在液氮中冷冻保存备用。研碎淋巴结(LN)组织，并通过相近尺寸的不锈钢筛以获得单细胞悬液。按上述方法分离LN淋巴细胞并在液氮中冷冻保存备用。解冻后，将淋巴细胞重新悬浮在20％AB血清中，然后用含有10％人AB血清的RPMI-1640(此后称作完全界质或CM)洗涤3次以除去DSMO。L，抗原特异性T细胞的产生将新鲜的或新解冻的2×106淋巴细胞悬浮在2mlCM中，在体外用可溶性HSTA肽或蛋白质致敏。其中每份加在24孔平板之单个孔的样品均在37℃于5％CO2环境下保温24天后，从每一孔中取出1ml培养基，并换成1mL含1微克/mlrIL-2的培养基。第11天，在照射过的抗原呈现细胞(APC)存在下用抗原并用相似量的IL-2进行第2次体外致敏。APC是同种PBL(大于105个)或树突细胞。在经所需数量的抗原/rIL-2重复刺激步骤导致T细胞增殖后，进行特异性靶细胞杀伤和/或抗原特异性T细胞增殖试验。M.使用增殖试验和铬释放试验确定抗原特异性T细胞反应i.增殖试验在96孔平底平板中，在有自体或MHC匹配抗原呈现细胞的5微克/ml特异性肽或肽混合物存在下.将一式三份悬浮在CM中的105个细胞培养三天，向阳性对照孔中加入植物血凝素(PHA)代替特异性抗原，阴性对照孔则使用单独的培养基。在收获前用3H胸苷(0.5μCl/孔)脉冲处理细胞18小时。用自动收获器和含有分别转移之NYLON(DuPont)圆盘的试管收获细胞并在闪烁计数器中计数放射活性。ii.细胞毒性试验在37℃下用250μCiCr51将1×106个SCC靶细胞标记60分钟。SCC细胞是自体的或与MHC密切匹配的细胞。保温后用HBSS洗三次以除去未结合的Cr51。以不同的效应细胞对靶细胞(E∶T)比例(即50∶1、25∶1、5∶1、1∶1)混合标记的靶细胞和效应细胞。将所得到的效应细胞/靶细胞混合物悬浮在200μlCM中，并以500rpm离心3分钟使细胞与细胞接触。保温4小时后，将微量滴定板以1000rpm离心5分钟，除去100μl上清液并在γ计数器中计数。V.从自体外周血和/或淋巴结制备未致敏的淋巴细胞群从未经受治疗的SCC病人体内获得新抽取的、肝素化的含有未致敏淋巴细胞的外周血。用Hank′s平衡盐溶液(HBSS)将血液按1∶2稀释，并加到Ficoll-Hypaque密度梯度管(Hystopaque，SigmaChemicals，St，Louis)上。将这样制得的样品以2,500rpm离心20分钟，从Ficoll和HBSS间的界面上回收淋巴细胞，然后用HBSS洗3次。将这些新制备的淋巴细胞悬浮在含有30％人AB血清和10％DMS0的RPMI1640中。如果不立即使用，则将其冷冻保留在液氮中。研碎淋巴结(LN)组织，并通过相近孔隙的不锈钢筛，以获得单细胞悬液。按上述方法分离LN淋巴细胞并在液氮中冷冻保存备用。解冻后，将淋巴细胞重新悬浮在20％AB血清中，然后用含有10％人AB血清的RPMI-1640(此后称作完全介质或CM)洗涤3次以除去DMSO。抗原特异性T细胞的产生将新鲜的或新解冻的2×106个淋巴细胞悬浮在2mlCM中，并在体外用可溶性HSTA肽或蛋白质致敏，其中每份样品均在5％CO2环境下于37℃在24孔平板的单个孔中保温处理。4天后，从各孔中除去1ml培养基并换成1ml含1μg/mlrIL-2的培养基。第11天，在照射过的抗原呈现细胞(APC)存在下用抗原和用相似量的IL-2进行第2次体外致敏。APC是同种PBL(大于105个)或树突细胞。在经所需数量的抗原/rIL-2重复刺激步骤导致T细胞增殖后，进行特异性靶细胞杀伤和/或抗原特异性T细胞增殖试验。使用增殖试验和铬释放试验确定抗原特异性T细胞反应增殖试验在96孔平底平板中，将一式三份悬浮在CM中的105个细胞与自体或MHC匹配抗原呈现细胞一起，在5微克/ml特异性肽或肽混合物存在下培养3天，向阳性对照孔中加入植物血凝素(PHA)代替特异性抗原，并在阴性对照孔中单独使用培养基。用3H胸苷(0.5μCi/孔)对细胞施加脉冲18小时，然后收获细胞。使用自动收获器和含有分别转移之NYLON(Dupont)圆盘的试管收获细胞，以在闪烁计数器中计数放射活性。细胞毒性试验在37℃下将1×106个SCC靶细胞用250μCiCr51标记60分钟。SCC靶细胞是自体的或与MHC匹配的细胞。培养后，用HBSS洗涤三次以除去未结合的Cr51。以不同的效应细胞对靶细胞(E∶T)比例(即50∶1、25∶1、5∶1、1∶1)混合标记的靶细胞和效应细胞。将所得到的效应细胞/靶细胞混合物悬浮在200μ1CM中，并以500rpm离心3分钟使细胞与细胞接触。保温4小时后，将微滴定板以1000rpm下离心5分钟，除去100μ1上清液并在γ计数器中计数。结果大多数病人和对照受试者(分别为40/65和46/65)血清中部具有IgA、IgE或IgG细胞内SCC蛋白质特异性抗体。65个肿瘤病人中的30个和65个对照个体中的40个是IgE阳性的(参见附图1)。65个病人中的18个，和65个对照个体中的仅1个受试者的血清是IgA-阳性的(参见附图2)。65个病人中的17个个体和14个对照个体的血清是IgG-阳性的。在SCC病人和对照组间，男性和女性受试者间未发现IgE和/或IgG抗体阳性优势的统计差异性。此外，在各种所研究的类别之间未记录到平均IgE和/或IgG值的统计学差异。IgA-阳性优势出现在SCC组(27.7％)超过对照组(1.5％)。一个有趣的观察结果是病人与对照个体在产生IgE和产生抗SCC细胞内抗原之JgA和/或IgG的能力之间存在明显的反比关系(图3a、b)。所有抗体同型抑制研究均为阳性，表明特异性抗原/抗体偶联的高度可能性，并因此导致高程度的个体试验的特异性。图4以这样一个病人举例说明了这一点。该研究证明，存在明显的针对鳞状上皮细胞癌之细胞内蛋白质的体液免疫反应。还了解到，在大多数病人和对照受试者血清中存在抗自身蛋白质的抗体。虽然尚不知道这些抗体的功能，但就其性质来说某些基本的结论还是可能做出的。首先，很可能是大多数IgE和IgG抗体识别对SCC和正常细胞二者共同的细胞内蛋白质，条件是给出相等的抗体阳体优势和两组受试者共有组平均血清抗体值。其次，SCC组的更高IgA阳性优势表明某些SCC胞内蛋白质在正常细胞中没有足够呈现。抗自身抗体可以是正常的，自身稳定机制的一部分，例如对正常细胞更新期间释放的细胞内分子的结合。抗体与自身抗原的连接可以维持细胞碎片的清除，途径是将其掺入到免疫复合物中并使这些免疫复合物结合到Fc或巨噬细胞及其他清除细胞的补体受体上。如果有过度高数量的免疫复合物形成并且以广泛和非特异的方式沉积到正常组织上，则增加了细胞死亡时这一过程可能是有害的。另外，如果免疫复合物沉淀增加和/或补体固定优先发生在肿瘤部位，从而导致高度的定点炎症和继后的抗肿瘤免疫反应，则自身抗原结合过程可能有利于SCC病人存活。后者可能由细胞内SCC抗原驱动的T细胞介导的。此外，这一研究得到的结论是(1)抗自身IgE存在于大多数受试者的血清中(2)在IgE的产生和IgA或IgG抗体产生间存在反比关系。IgE特异性或自身蛋白质的鉴定与我们目前对IgE功能的了解相反。在经典的I型免疫反应中，在对外源蛋白质和半抗原化小分子如青霉素引起的免疫反应时产生的IgE只达到较小的程度。大多数IgE自由循环。少量(少于总体IgE的0.01％)被特异性Fc受体结合到嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面膜上。暴露于特异性抗原(变应原)导致IgE对抗原和抗原-IgE抗体复合物对肥大细胞的多聚结合。这种复合物的结合导致肥大细胞脱颗粒和血管活性及趋化分子的释放。随着显著量的IgE积聚和胞内SCC抗原的伴随存在(作为恒定细胞更新的结果)，在IgE-阳性肿瘤病人中可能发生显著的自我定向的超敏感性反应，例如过敏反应，但显然没有发生。比较而言，在外源抗原例如蜂毒存在下，具有相似水平的特异性IgE可导致严重的和潜在的致命性过敏反应。有可能存在另一种且总体上不同的IgE介导的免疫反应，因为它是内在靶向的，该免疫反应促进正常的体内平衡功能。一种可能的功能可以是自家免疫现象的下调，其中IgE的产生可以是免疫途径的一种活性组分，该途径将绕过或减慢抗自身IgA和/或IgG的产生。这一功能可能是对阻止受良好调节的IgA、IgG抗自身抗体反应转变为提高的和失控制的反应所必需的控制和平衡系统的一部分。这可以解释Berczi的早期观察结果(Bzrezi，I.，Holford，S.V.Warsi，Z.H.，McMorris，L.S.，Thorlakson，R.H.，Thorlakson，T.K.，Sehon，A.H.，Tumor-reactiveIgEantibodiesinplasmaofpatientswithgastrointestinalcarcinomas.CancerImmunol.Immunother1983.14(3)180-4)，其中他注意到一种对那些具有高血清水平抗自身IgE的肿瘤病人存活的有害作用。然而，这一研究的最主要的结论是，存在被宿主T淋巴细胞识别的SCC相关胞内抗原，(这是真实的，因为血清IgA、IgE或IgG抗体的存在需要抗原特异性辅助细胞在产生那些抗体同型中发挥相关功能)，其以显著的量释放到肿瘤外周，如果正确处理的话，可以用于产生自体抗肿瘤效应细胞。(b)这一研究表明，显著量的SCC胞内蛋白质以高的独占性结合到SCC病人的IgA和IgG抗体上，并因此被称为高特异性肿瘤抗原(HSTA)。所述HSTA经一系列的分离步骤被鉴定，这些步骤包括(1)用离子交换层析法根据组成分子的等电点不同，将SCC细胞内蛋白质混合物细分成100个次级混合物(2)将代表量的每一次级混合物偶联到CNBr一活化纸盘上(3)利用单个盘试验病人和对照血清以确定IgA和IgG抗体结合(4)选择SCC胞内蛋白质次级混合物，其相应的纸盘在肿瘤病人血清间引起较高的IgA和/或IgG结合(5)利用聚丙烯酰胺胶电泳法分离各优选次级混合物内的个体分子；(6)进行放射自显影western印迹分析以鉴别哪一种个体蛋白质优先与病人血清中的IgA或IgG反应(7)选择与SCC病人血清的IgA或IgG反应，但不与对照血清的IgA或IgG反应的分子作为HSTA。这项研究基于明显的病人IgA或IgG结合提供了30种HSTA。那些结合IgA的HSTA(图5A和5B)似乎是更有希望的抗原候选者，因为在单个肿瘤病人血清间它们可比结合病人IgG的分子以更高的频率被识别。基于它们的CNBr和考马斯兰结合特征，HSTA似乎主要是由蛋白质构成的。与来源于病人和对照受试者的抗体反应的分子多达HSTA的两倍。所有IgA和IgG反应性分子的组合仍比经考马斯兰染色以PAGE法鉴定的蛋白分子数目少(少25％)，这意味着并不是所有存在于细胞膜内部的分子都是对病人或对照受试者有免疫原性的。大多数SCCHSTA的大小在50,000和80,000(道尔顿)MW之间。一种HSTA(35.1)是令人感兴趣的，因为它结合所有10份SCC病人被检血清中的IgA，而不结合相应10份对照血清中的抗体。其它HSTA(3.3、27.3、37.2、39.1、39.2、39.4、40.3、47.3、47.4、49.2、50.1和50.2)各自地与不同病人组合血清中的IgA反应。这些结果也是令人感兴趣的，因为将其Western印迹试验结果累积起来时(图5A和5B)，它们也以绝对特异性100％地鉴定出SCC病人。已用标准技术测定了一种HSTA3.3的序列并发现其具有SEQIDN01中所示的部分序列。该肽与人乳头瘤病毒的E6蛋白质匹配。E6蛋白质是一种癌基因产物，其在促进肿瘤生成中起作用。背景绝大多数自体抗原是细胞内的、广泛分布的并似乎都是蛋白质。如基于免疫组织化学的研究中所描述的，这些抗原在肿瘤细胞和正常细胞两者中表达。(Pfaffetal.，Humanmonoclonalantibodyagainstatissuepolypeptideantigen-relatedproteinfromapatientwithasignet-ringcellcarcinomaofthestomach.CancerRes1990；50(16)5192-8；Abeetal.，Humanmonoclonalantibodiesagainstcytokeratin18generatedfrompatientswithgastriccancer.JpnJCancerRes1989；80(3)271-6；Furukawaetal.，Twohumanmonoclonalantibodiesreactingwiththemajorgangliosidesofhumanmelanomasandcomparisonwithcorrespondingmousemonoclonalantibodies.CancerRes1989；49(1)191-6；Skaletskyetal.，Ahumanmonoclonalantibodytocytokeratinintermediatefilamentantigensderivedfromatumordraininglymphnode.Hybridona1988；7(4)367-76；ImamA，MitchellMS，ModlinRL，TaylorCR，KempfRA，KanMJ.Humanmonoclonalantibodiesthatdistinguishcutaneousmalignantmelanomasfrombenignneviinfixedtissuesections.JInvestDermatol1986；86(2)145-8；PickeringJW，MisraRP.Humanmonoclonalantibodiestocytokeratinsassociatedwithsquamouscellcarcinoma.ClinImmunolImmunopath1984；32253-60).大多数针对表面膜抗原的人单克隆抗体是IgM同型的(Pigattoetal.，Occupationaldermatitisinbakersaclueforatopiccontactdermatitis.ContactDermatitis1988；16(5)263-71；Janssonetal.，ThehumanrepertoireofantibodyspecificitiesagainstThomsen-FriedenreichandTn-carcinoma-associatedantigensasdefinedbyhumanmonoclonalantibodies.CancerImmunolImmunother1992；34(5)294-8；Imametal.，Generationandimmunohistologicalcharacterizationofhumanmonoclonalantibodiestomammarycarcinomacells.CancerRes1985；45(1)263-7l；和Houghtonetal.，Detectionofcellsurfaceandintracellularantigensbyhumanmonoclonalantibodies.Hybridcelllinesderivedfromlymphocytesofpatientswithmalignantmelanoma.JExpMed1983；158(1)53-65)。发现大多数定向细胞表面抗原都是碳水化合物(Furukawaetal.，Twohumanmonoclonalantibodiesreactingwiththemajorgangliosidesofhumanmelanomasandcomparisonwithcorrespondingmousemonoclonalantibodies.CancerRes1989；49(1)191-6；Miyakeetal.，FirstestablishmentofahumanmonoclonalantibodydirectedtosulfatedglycosphingolipidsSM4s-GalandSM4g，fromapatientwithlungcancer.CancerRes1992；52(8)2292-7；Danetal，Humanamtigliomamonoclonalantibodiesfrompatientswithastrocytictumors.JNeurosurg1992；76(4)660-9).尽管已确定了很少数几种被人单克隆IgG结合的相应的细胞内抗原的特征，可能是蛋白质但因为IgG的表达需要邻近T辅助细胞的共同作用，故有理由推测其一定是蛋白质(Senetal.，TcellsurfacemoleculesregulatingnoneognateBlymphocyteactivation.RoleofCD2andLFAla-1.J.Immunol1992，148(4)1037-42)。T辅助细胞致使IgM生成B细胞转换成同型IgA、IgE和/或IgG生成细胞。T辅助细胞本身则只识别蛋白质(肽)抗原。在可用免疫组织化学法检测肿瘤细胞中而不是在正常细胞中的某些自体抗原(Imametal.，Generationandimmunohistologicalcharacterizationofhumanmonoclonalantibodiestomammarycarcinomacells.CancerRes1985；45(1)263-71；McKnightetal.，Humanmonoclonalantibodiestonuclearantigens.HumAntibodiesHybridomas1990；1(2)77-82；Werneretal.，Humanmonoclonalantibodiesdirectedagainstovariancarcinoma.GynecolOncol1989；34(2)148-54；Kanetal.，Humanmonoclonalantibodiesdiectedagainstmelanomatumor-associatedantigens.CancerRes1986；46(5)2490-6).这些研究表明，某些细胞内肿瘤细胞分子在正常细胞中不存在或者以降低的量存在于正常细胞内。因此，这些分子可以用作肿瘤选择性免疫原。这些分子可以包括恶性转化抗原。(Kanetal.，Tumor-reactivehumanimmunoglobuiinGmonoclonalantibodyfromamelanomapatient.CancerRes1989；49(16)4536-41；Vollmersetal，SC-1，afunctionalhumanmonoclonalantibodyagainstautologousstomachcarcinomacells.CancerRes1989；49(9)2471-6)与细胞增殖和增殖调节作用相关的蛋白质分子例如p53(Labrecqueetal.，Analysisoftheanti-p53antibodyresponseincancerpatients.CancerRes1993；533468-3471)融合蛋白例如bcr-abl(Vollmersetal.，SC-l，afunctionalhumanmonoclonalantibodyagainstautologousstomachcarcinomacells.CancerRes1989；49(9)2471-6；Chenetal.，T-cellimmunitytothejoiningregionofp210BCArg-ABLprotein.ProcNatlAcadSciUSA1992；89(4)1468-72)癌基因表达产物例如mybandmyc(Ben-Mahrezetal.，Circulatingantibodiesagainstc-myconcogeneproductinseraofcolorectalcancerpatients.IntJCancer1990；46(1)35-8；Sorokineetal.，Presenceofcirculatinganti-c-myboncogeneproductantibodiesinhumansera.IntJCancer1991；47(5)665-9)以及不完全合成的分子例如乳腺粘蛋白核心蛋白(Barndetal.，Specific，majorhistocompatibilitycomplex-unrestrictedrecognitionoftumor-associatedmucinsbyhumancytotoxicTcells.ProcNatlAcadSciUSA1989；86(18)7159-63).肿瘤特异性分子的定性的或定量的存在很可能是由于高度癌细胞增殖、去分化、遗传不稳定性及代谢过程不协调的结果。如用组织化学法检测到的表现出高肿瘸特异性的自体抗原可以被病人和正常人B淋巴细胞表达的单克隆抗体所识别(Posneretal.，AnIgGhumanmonoclonalantibodlyreactivewithasurfacemembraneantigenexpressedonmalignantbreastcancercells.HumAntibodiesHybridomas1991；2(2)74-83)。在这一引证文献中，作者描述了人单克隆抗体的产生，所述抗体独占性地与白血病细胞的细胞内抗原反应，但其衍生于正常受试者，EBV转化的B淋巴细胞。实施例2乳腺癌特异性体液抗原基于其各自的功能差异和可获得性选择潜在的肿瘤特异性蛋白质。被检分子是dbl、erbB1、erb-B2(HER-2/neu)、erbB-3、fos、HSP70、jun、lck、lyn、p13、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes。已知这些蛋白质中有些是与乳腺癌密切相关的(erbB-2、fos、jun和ras)。其中有些很可能与乳腺癌细胞无关(dbl、erbB-3、lck、lyn和yes)，并可在第一亚组都是抗体反应性的情况下被选来作为对照。某些则以相同的频率见于肿瘤和正常上皮中(erbB-1、HSP70、p13、p190、rapGAP和rasGAP)。选择这些蛋白质是为了确定与正常存在的胞内蛋白有特异反应活性的血清抗体是否常规存在于患有或不患有乳腺癌的受试者中。有些蛋白质见于不同的细胞成分或结构中细胞膜(dbl、erbB1、erbB-2和erbB-3)、胞质溶胶(dbl、HSP70、lck、lyn、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes)或细胞核(fos、jun和p13)。有些具有可影响其免疫原性潜能的不同功能细胞膜受体(erbB-1、erbB-2和erbB-3)、激酶或激酶效应物(dbl、lck、lyn、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes)、反应调节剂(fos、jun和p13)或其他蛋白质(HSP70)。有些具有细胞内及细胞外成分(erbB-1、erbB-2和erbB-3)。如果是抗体反应性的，则这些蛋白质是令人感兴趣的，因为它们能为试验我们的愿望提供方便的工具，即预期细胞内的蛋白质或其部分具有启动免疫识别的能力，而细胞外的蛋白质或其部分则没有。或者，如果膜蛋白的胞外区域是抗体反应性的，其反应性程度要比其内在部分低得多。为此目的，我们已获得erbB-3的细胞外区域，用它试验那些与完整的erbB-2分子呈阳性反应的血清。初步结果表明，erbB-2(Disisetal.，ExistentTcellandantibodyimmunitytoher-2/neuproteininpatientswithbreastcancer，CancerRes.，1993)和p21ras(Husebyetal.，Detectionofantibodyresponsedtorasproteinsinpatientswithcoloncancer，CancerRes.，1993)可以用作体液免疫原。用放射自显影Western印迹分析法检测乳腺癌病人和良性乳腺损伤病人的特异性体液免疫反应性。用这一方法检测了对16种被检蛋白质的血清IgA反应性。检测IgA是由于在我们以前的SCC研究中其表现有较高的优势。由15个患有小叶乳腺癌的女性病人和15个年龄相当的患良性乳腺损伤(纤维腺瘤或纤维囊性疾病)的女性患者中获得筛选血清。使用如此选择出的对照血清，试图描述是否所检测的乳腺癌血清中的蛋白质特异性抗体反应性都是肿瘤特异性的。以各种方式提供被检蛋白质。有些是在微生物或昆虫细胞表达系统中产生的重组体蛋白质fos、HSP70、jun、lck、lyn、p13、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes(附录IV)。其他的则是在NIH/3T3转染的细胞系中表达的蛋白质即dbl、erbB-1、erbB-2和erbB-3(Di-Fioreetal.，erbB-2isapotentoncogeneWheneverexpressedinNIH/3T3cell，Science，1987，237(4811)178-82Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductdefinesadistinctclassoftransformingproteins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85(7)2061-5)。后者是从单独培养并匀浆化的NIH/3T3转染体中半纯化的。简单地说，培养单个转染的细胞系，用20mMTris-HCl，pH8.5洗涤3次，在冰水浴中冷却，经超声处理制成匀浆并离心。对erbB受体来说，然后均用0.1％SDS从超声处理后的沉淀中提取各蛋白质样品，接着以三个连续步骤用丙酮(25％、50％和85％丙酮)沉淀。在50％丙酮沉淀物发现每一种erbB蛋白质。就dbl来说，于相同的条件下沉淀水溶性部分，但在85％丙酮沉淀物中回收该蛋白质。癌基因编码的蛋白质dbl表现有对乳腺癌选择性免疫原性之分子的功能。如图6所描绘的，13种蛋白质与血清IgA抗体反应。未反应的蛋白质是erbB-1、erbB-3和lck。在阳性反应者中，dbl看来是最特异的(6/15阳性肿瘤病人血清对1/15阳性良好损伤血清)。其余的IgA反应性蛋白质当乳腺癌病人血清试验时不比用良性病人血清试验时有更明显的阳性结果。这一结果对于已有文献说明其在乳腺癌中起癌基因作用的蛋白质erbB-2、fos、jun和ras来说是特别真实的。通过在乳腺癌细胞和正常上皮中表达的所有蛋白质同样是血清抗体反应性的。这一点证实了我们的关于普遍存在胞质蛋白质特异性自体血清抗体的鳞状上皮细胞癌研究的早期观察结果。某些原来认为不被乳腺癌细胞表达的蛋白质是抗体反应性的(dbl、fyn、lyn和yes)而其他一些则不是(erbB-3、lck)。就dbl卷入乳腺癌的理由来说，是其表现出有利于检测乳腺癌病人血清的较高抗体阳性优势。造血蛋白质fyn、lyn和yes同样与肿瘤病人血清和对照血清发生反应，说明这些蛋白质在其他恶性肿瘤损伤中不大可能是肿瘤特异性免疫原。在erbB-2的内部和外部区域之间存在明显不同的反应性。在所试验的三种表皮生长因子受体中，仅erbB-2是抗体反应性的(4/15阳性癌症病人血清对2/15阳性良性损伤血清)。这可能是由于其与乳腺癌损伤的高定量关联。然后，6份erbB-2阳性血清对erbB-2的细胞外区呈阴性试验结果。这一数据强化或进一步说明，细胞外自身蛋白质在细胞膜边界之后避开免疫监视是其免疫原性的一个关键要素。然而，除外膜受体组，在位于不同胞内间隔中的蛋白质之间没有免疫原性潜能的明显不同。在基于其细胞内功能，各蛋白质间也无差异。也试验了dbl的IgG-特异性反应性，以确定其对乳腺癌的选择性是否可得以保持。与1/15良性损伤血清相比，3/15乳腺癌血清是IgG反应性的。与dbl的结合IgA＋IgG反应性是6/15阳性乳腺癌血清对2/15良性损伤血清。使用FujiBAS2000激光扫描系统(FujiFilmCo.，Tokyo，Japan)我们可以定量每一种抗体/dbl相互作用的阳性反应性的程度。如图7所示，与良性乳腺损伤组仅2个弱阳性值相比，4/15乳腺癌病人血清对IgA＋IgG呈强阳性反应，并且2个为弱阳性的。实施例3用作乳腺癌特异性体液抗原的磷酸化形式的dbl纯化了dbl的磷酸化和非磷酸化变体。Grazianietal.，的工作(GrazianiG，RonD，EvaA，SrivastavaSK.Thehumandbl-Proto-oncogeneproductisacytoplasmicphosphoproteinwhichisassociatedwiththecytoskeletalmatrix.Oncogene1989，4(7)823-9)表明，p66dbl癌基因产物较通常预料的p115dbl原癌基因产物更显著地被磷酸化。不仅p66形式在乳腺癌中比在正常细胞中很可能被更多量地表达，而且与其正常的p115同系物有性质上的不同。利用从如前所述的dbl转染的NIH/3T3细胞的含水匀浆，以DEAE和SP离子交换HPLC分别纯化p66dbl的两种变体。在DEAE和SP离子交换层析后，分离流过部分中的最小磷酸化或未磷酸化的p66dbl。磷酸化程度高的dbl存在于DEAE离子交换以约13到21％NaCl洗脱的部分中。未磷酸化的dbl同样地与乳腺癌血清和对照血清发生反应。利用原来的30份血清板试验IgA抗体反应性。其结果揭示出良性损伤病人血清和肿瘤病人血清间相同的反应性(图8)，15份乳腺癌血清中的10份和15份良性乳腺损伤血清中的8份是阳性的。磷酸化的dbl与乳腺癌血清反应比与良性损伤血清反应更显著。15份乳腺癌血清中的8份是IgA反应阳性的，而15份对照血清中只4份是阳性的(图9)。最近的研究虽然所有6份原来的阳性乳腺癌血清仍为阳性，但又加入了最新研究得到的另外2个阳性结果。试验良性损伤血清时也增加了2个额外的阳性结果。这些后来的研究结果增加了我们正在使用的p66dbl抗原是异质的，由7种变体组成的这种可能性某些变体可能是异常磷酸化的，而有的是正常磷酸化的；某些变体可能是有较高肿瘤特异性的，而另一些是有较低肿瘤特异性的；有些p66dbl变体可能是在与见于p115原致癌基因上相匹配的肽位点上磷酸化的有些具有p115磷酸化的位点加上重新异常磷酸化位点；或者有些仅具有重新磷酸化的位点。如果相应于不涉及磷酸化的p66dbl肽表位的非特异性反应可以被中和，那么与p115磷酸化位点(磷酸化的或未磷酸化的)匹配的和/或相当于重新磷酸化的位点的，但其本身未被磷酸化的也许能获得更多的肿瘤特异性结果。这种情况是可能发生的，因为剩下的抗原表位可以是异常磷酸化的位点。相应于p115磷酸化的位点的反应很可能不是磷酸化的。然而，相应于不涉及磷酸化之dbl肽表位的那些反应和与非磷酸化的p115和/或未重新磷酸化的p66磷酸化位点匹配的那些反应可能被中和。向试验血清中加入未磷酸化的p66dbl很可能对那种目的有益。因此使用渐增量的非磷酸化的dbl重新试验这8份阳性癌症病人血清和4份阳性良性损伤病人血清。当每200μl稀释的血清样品中加入4μg非磷酸化的dbl时出现了最大信号抑制。这时，所有终止了对照血清IgA反应性而4份乳腺癌血清仍然保持阳性。阻断抗原渐增到10μg不能消除其余的阳性乳腺癌血清的IgA反应性。在4份余留的IgA-阳性血清中，两份是在初步dbl研究中呈现IgA阳性的血清。利用最佳化dblWestern印迹分析法试验大量乳腺癌病人血清和对照血清。将这种更特异的dbl检测法用于检验59份乳腺癌血清，27份患有良性乳腺损伤病人的血清和36份年龄相当的健康女性对照者的血清。发现59份乳腺癌病人血清中的14份(24％)、27份良性乳腺损伤病人血清中的1份(4％)和36份健康女性对照血清中的1份(3％)是对磷酸化的dbl有阳性IgA或IgG抗体反应性的。大多数dbl反应性血清是IgA-阳性的(10/16)或者是IgG阳性的(4/16)。2份病人血清是IgA和IgG反应性的。异常磷酸化的dbl等同地与来源于I期或II期小叶癌症病人的血清发生反应(图9)。20份I期病人血清中的4份(20％)是dbl反应性的29份II期病人血清中的7份(24％)是dbl反应性的；3份III期血清中的1份是反应性的2份IV期血清中的1份是反应性的。而且，5份来源于患有小叶癌症病人的血清中有1份也是反应性的。从患有I期疾病的病人获得阳性血清提示与乳腺癌密切相关的抗原刺激早期体液免疫反应。如果能检测对dbl的异常磷酸化的肽区域和/或其它致癌基因编码的蛋白质的IgG反应，则也有可能检测很早期的免疫反应(也许在癌症原位阶段)。如在I期病人血清中观察到强的IgA和/或IgG反应，则很可能更早地检测到前体同型IgM。所包含的实施例举例说明本发明的何选方式。所附实施例的某些方面是从技术和方法角度描述的而这些技术和方法是由本发明人在实践本发明中发现或认为是行之有效的。这些实施例是通过使用发明人的标准的实验室实践举出的。就发明的公开和本领域技术人员的一般水平而言，技术人员会意识到所附实施例仅意欲举例说明本发明，并且可以进行许多改动，修饰和替换而不背离本发明的精神和范围。说明书中所引述的文献在此一并作为参考，其作用是补充、解释、提供背景，或教导方法学、技术和/或利用其组合。序列表(1)一般信息(i)申请人Calenoff，Emanuel(ii)发明名称免疫原性肿瘤蛋白质和肽及其使用方法(iii)序列数38(iv)通信地址(A)联系人Arnold，White&Durkee(B)街道321NorthClarkStreet，Suite800(C)城市Chicago(D)州IL(E)国家美国(F)邮编60610(v)计算机可读形式(A)装置类型Floppydisk(B)计算机IBNPCcompatible(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(vi)目前的申请资料(A)申请号US未知(B)申请日1994.1.12(C)分类(viii)代理人/代理机构信息(A)姓名Northrup，ThomasE.(B)登记号33，268(C)参考/案卷号nwun002(ix)通讯信息(A)电话312-744-0090(B)传真312-755-4489(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO1GlnPheProPheGlyAlaGlyGluThr15(2)SEQIDNO2信息(i)序列特征(A)长度477氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO2MetSerSerGlyArgArgArgGlySerAlaProTrpHisSerPheSer151015ArgPhePheAlaProArgSerProSerArgAspLysGluGluGluGlu202530GluGluArgProGlyThrSerProProProAlaProGlyArgSerAla354045AlaSerHisValLeuAsnGluLeuIleGlnThrGluArgValTyrVal505560ArgGluLeuTyrThrValLeuLeuGlyTyrArgAlaGluMetAspAsn65707580ProGluMetPheAspLeuMetProProLeuLeuArgAsnLysLysAsp859095IleLeuPheGlyAsnMetAlaGluIleTyrGluPheHisAsnAspIle100105110PheLeuSerSerLeuGluAsnCysAlaHisAlaProGluArgValGly115120125ProCysPheLeuGluArgLysAspAspPheGlnMetTyrAlaLysTyr130135140CysGlnAsnLysProArgSerGluThrIleTrpArgLysTyrSerGlu145150155160CysAlaPhePheGlnGluCysGlnArgLysLeuLysHisArgLeuArg165170175LeuAspSerTyrLeuLeuLysProValGlnArgIleThrLysTyrGln180185190LeuLeuLeuLysGluLeuLeuLysTyrSerLysAspCysGluGlySer195200205AlaLeuLeuLysLysAlaLeuAspAlaMetLeuAspLeuLeuLysSer210215220ValAsnAspSerMetHisGlnIleAlaIleAsnGlyTyrIleGlyAsn225230235240LeuAsnGluLeuGlyLysMetIleMetGlnGlyGlyPheSerValTrp245250255IleHisLytLysGlyAlaThrLytMetLysAspLeuAlaArgPheLys260265270ProMetGlnArgHisLeuPheLeuTyrGluLysAlaIleValPheCys275280285LysArgArgValGluSerGlyGluGlySerAspArgTyrProSerTyr290295300SerPheLysHisCysTrpLysMetAspGluValGlyIleThrGluTyr305310315320ValLysGlyAapAsnArgLysPheGluIleTrpTyrGlyGluLysGlu325330335GluValTyrIleValGlnAlaSerAsnValAspValLysMetThrTrp340345350LeuLysGluIleArgAsnIleLeuLeuLysGlnGlnGluLeuLeuThr355360365ValLysLysArgLysGlnGlnAspGlnLeuThrGluArgAspLysPhe370375380GlnIleSerLeuGlnGlnAsnAspGluLysGlnGlnGlyAlaPheIle385390395400SerThrGluGluThrGluLeuGluHisThrSerThrValValGluVal405410415CysGluAlaIleAlaSerValGlnAlaGluAlaAanThrValTrpThr420425430GluAlaSerGlnSerValGluIleSerGluGluProAlaGluTrpSer435440445SerAsnTyrPheTyrProThrTyrAspGluAsnGluGluGluAsnArg450455460ProLeuMetArgProValSerGluMetAlaLeuLeuTyr465470475(2)SEQIDNO3信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2..3(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO3MetXaaXaaGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO4信息(i)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置1(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置3(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO4XaaProXaaArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyThr151015(2)SEQIDNO5信息(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO5AlaProGlyArgXaaAlaAla15(2)SEQIDNO6信息(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键Xaa(B)位置7(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO6CysGlnAsnLysProArgXaa15(2)SEQIDNO7信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置6(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO7GluLeuLeuLysTyrXaaLysAspCysGluGly1510(2)SEQIDNO8信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置7(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置11(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO8CysLysArgArgValGluXaaGlyGluGlyXaaAspArg1510(2)SEQIDNO9信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置1(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO9XaaThrGluGluThrGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO1O信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置4(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO1OAlaXaaGlnXaaValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO11信息(i)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)胶数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置16(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO11SerProSerArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyXaa151015(2)SEQIDNO12信息(i)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO12LysLyaGlyAlaXaaLysMetLysAspLeuAlaArgl510(2)SEQIDNO13信息；(i)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置11(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO13ValLysLysArgLysGlnGlnAspGlnLeuXaaGluArgAspLysPhe151015(2)SEQIDNO14信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO14SerXaaGluGluXaaGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO15信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的酪氨酸(xi)序列描述SEQIDNO15GluLeuLeuLysXaaSerLysAspCysGluGly1510(2)SEQIDNO16信息(i)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置1(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置3(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置16(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO16XaaProXaaArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyXaa151015(2)SEQIDNO17信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置1(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO17XaaXaaGluGluXaaGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO18信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的酪氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置6(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO18GluLeuLeuLysXaaXaaLysAspCysGluGly1510(2)SEQIDNO19信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO19MetXaaSerGlyArgArgGlySerl5(2)SEQIDNO2O信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2..3(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO2OMetXaaXaaGlyArgArgGlySer15(2)SEQIDNO21信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置3(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO21MetSerXaaGlyArgArgGlySer15(2)SEQIDNO22信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置3(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO22MetSerXaaGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO23信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO23MetSerSerGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO24信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO24MetXaaSerGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO25信息(i)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置1(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO25XaaProSerArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyThr151015(2)SEQIDNO26信息(i)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置3(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO26SerProXaaArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyThr151015(2)SEQIDNO27信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置7(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO27CysLysArgArgValGluXaaGlyGluGlySerAspArg1510(2)SEQIDNO28信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键Xaa(B)位置7(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO28CysLysArgArgValGluSerGlyGluGlyXaaAspArg1510(2)SEQIDNO29信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO29AlaXaaGlnSerValGluIleSerGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO30信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置4(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO30AlaXaaGlnXaaValGluIleSerGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO31信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置4(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO31AlaSerGlnXaaValGluIleSerGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO32信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置4(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO32AlaSerGlnXaaValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO33信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO33AlaSerGlnSerValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO34信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置8(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(xi)序列描述SEQIDNO34AlaXaaGlnSerValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO35信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO35SerXaaGluGluThrGluLauGluHis15(2)SEQIDNO36信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO36SerThrGluGluXaaGluLeuGluHisl5(2)SEQIDNO37信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置1(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置2(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO37XaaXaaGluGluThrGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO38信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置1(C)鉴定方法磷酸化的丝氨酸(ix)特征(A)名称/关键词Xaa(B)位置5(C)鉴定方法磷酸化的苏氨酸(xi)序列描述SEQIDNO38XaaThrGluGluXaaGluLeuGluHis1权利要求1.一种鉴定肿瘤细胞的功能性蛋白质的方法，该方法包括鉴定存在于所说肿瘤细胞中的蛋白质，该蛋白质对肿瘤病人是选择性免疫原性的。2.按照权利要求1的方法，其中鉴定包括以下步骤(a)筛选对照和肿瘤病人血清以确定那一种蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应。3.按照权利要求3的方法，其中所说的抗体是IgA、IgE、IgG、或IgM免疫球蛋白。4.按照权利要求1的方法，其中所说的肿瘤细胞是SCC细胞或乳腺癌细胞。5.按照权利要求1的方法，其中所说的功能性蛋白质对所说肿瘤细胞是选择性功能性的。6.一种制造肿瘤细胞功能性蛋白质的方法，该方法包括以下步骤(a)鉴定存在于所说肿瘤细胞中的蛋白质，该蛋白质对肿瘤病人是选择性免疫原性的，和(b)分离和纯化所说的蛋白质。7.一种按权利要求6的方法制得的蛋白质。8.按照权利要求6的方法，进一步包括以下步骤(c)测定分离和纯化的蛋白质的序列；(d)制备编码已测序之蛋白质的多核苷酸；(e)用包含所述多核苷酸的表达载体转染宿主细胞(f)在足以表达所述蛋白质的条件下维持被转染的宿主；和(g)收集所述蛋白质。9.一种按包含以下步骤的方法制备的肿瘤特异性抗原(a)鉴定存在于肿瘤细胞中的选择性免疫原性蛋白质；和(b)分离和纯化所述蛋白质。10.一种按权利要求9的方法制备的肿瘤特异性抗原。11.按照权利要求10的抗原，该抗原是SCC抗原。12.按照权利要求11的抗原，该抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。13.按照权利要求10的抗原，该抗原是乳腺癌特异性抗原。14.按照权利要求13的抗原，该抗原是磷酸化的dbl。15.按照权利要求14的抗原，其中dbl包含SEQIDNO2的氨基酸残基序列。16.按照权利要求14的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一个磷酸化的丝氨酸残基。17.按照权利要求16的抗原，其中磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上。18.按照权利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少两个磷酸化的丝氨酸残基。19.按照权利要求18的抗原，其中磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上。20.按照权利要求16的抗原.其中磷酸化的dbl包含至少三个磷酸化的丝氨酸残基。21.按照权利要求20的抗原，其中磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3和9、或者436、438和442上。22.按照权利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一个磷酸化的苏氨酸残基。23.按照权利要求22的抗原，其中磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号38、263、380、403或406上。24.按照权利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少两个磷酸化的苏氨酸残基。25.按照权利要求24的抗原，其中磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上。26.按照权利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一个磷酸化的酪氨酸残基。27.按照权利要求26的抗原,其中磷酸化的酪氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上。28.按照权利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的苏氨酸残基。29.按照权利要求28的抗原,其中a)两个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号23和25上，且一个磷酸化的苏氨酸残基位于氨基酸残基位置编号38上b)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，且两个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上或者c)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，且一个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403或406上。30.按照权利要求16的抗原，其中的磷酸化的dbl包含至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的酪氨酸残基。31.按照权利要求30的抗原,其中一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号202上，且一个磷酸化的酪氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上。32.按照权利要求16的抗原,其中磷酸化的dbl包含SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸残基序列。33.一种增加肿瘤相关抗原的免疫原性特异性的方法，该方法包括使肿瘤相关抗原磷酸化。34.按照权利要求33的方法，其中肿瘤抗原是乳腺癌抗原。35.按照权利要求34的方法，其中乳腺癌抗原是dbl。36.按照权利要求35的方法，其中dbl包含SEQIDNO2的氨基酸残基序列。37.一种检测与肿瘤特异性抗原发生免疫反应的抗体存在的试剂盒，该试剂盒包含足够量的至少用于一次试验的肿瘤特异性抗原。38.按照权利要求37的试剂盒，其中肿瘤特异性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。39.按照权利要求37的试剂盒，其中肿瘤特异性抗原是磷酸化的dbl。40.按照权利要求37的试剂盒，该试剂盒进一步包含检测与所说肿瘤特异性抗原发生免疫反应的所说抗体的工具。41.按照权利要求37的试剂盒，其中所说的抗体是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。42.一种检测在生物体液中是否存在与肿瘤特异性抗原发生免疫反应的抗体的方法，该方法包括以下步骤(a)使体液样品与肿瘤特异性抗原形成预混物；(b)在生物反应条件下保持该预混物一段时间，足以使存在于样品中的抗体与肿瘤特异性抗原形成结合物；和(c)检测结合物的存在。43.按照权利要求42的方法，其中肿瘤特异性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。44.按照权利要求42的方法，其中肿瘤特异性抗原是磷酸化的dbl。45.按照权利要求42的方法，其中抗体是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。46.一种制备对肿瘤特异性抗原敏化的T细胞的方法，该方法包括以下步骤(a)分离含有纯净的非抗原敏化的T细胞的自体T细胞群体；(b)鉴定免疫原性肿瘤特异性抗原和(c)用免疫原性肿瘤特异性抗原敏化非抗原敏化的T细胞。47.按照权利要求46的方法，其中免疫原性肿瘤特异性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。48.按照权利要求46的方法，其中免疫原性肿瘤特异性抗原是磷酸化的dbl。49.按照权利要求46的方法，其中T细胞是T辅助淋巴细胞或特异性细胞毒性T细胞。50.一种制备对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞群体的方法，该方法包括以下步骤(a)分离对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞；和(b)诱导致敏T细胞大量扩增。51.按照权利要求50的方法，其中T细胞是从循环淋巴细胞、淋巴结或肿瘤中分离的。52.按照权利要求50的方法，其中诱导是在肿瘤特异性抗原存在下完成的。53.按照权利要求52的方法，其中诱导是在抗原呈现细胞存在下完成的。54.按照权利要求50的方法，该方法进一步包括以下步骤(c)继代培养T细胞，以鉴定对特定肿瘤特异性表位敏感的T细胞。55.按照权利要求50的方法，其中免疫原性肿瘤特异性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。56.按照权利要求50的方法，其中免疫原性肿瘤特异性抗原是磷酸化的dbl。57.一种制备肿瘤特异性体液抗原的肽文库的方法，该方法包括以下步骤a)从肿瘤细胞中分离一种或多种选择性免疫原性肽；b)在每种所说选择性免疫原性蛋白质中鉴定一个或多个对肿瘤病人为选择性免疫原性的表位；c)制备每一表位的含有所说表位的肽，其中单个肽不含有被非肿瘤受试者识别的表位和d)形成所说肽的文库。58.权利要求57的方法，其中的分离包括以下步骤a)从肿瘤细胞中提取蛋白质；b)筛选对照和肿瘤病人血清以确定哪一种所说蛋白质与肿瘤病人血清的抗体发生特异性免疫反应；以及c)分离和纯化所说的选择性免疫原性蛋白质。59.按照权利要求57的方法，其中的鉴定包括以下步骤a)限定所说蛋白质中的潜在的表位；b)合成含有所说蛋白质之部分的肽，该部分含有一个所说表位；c)筛选对照和肿瘤病人血清，以确定哪一种所说蛋白质与肿瘤病人血清中的抗体发生特异性免疫反应，并从而鉴定所说蛋白质中对肿瘤病人为选择性免疫原性的表位。60.一种由权利要求57的方法制得的肽文库。61.按照权利要求57的方法，其中所说的选择性免疫原性蛋白质是磷酸化的蛋白质。62.一种制备乳腺癌特异性体液抗原的肽文库的方法，该方法包括以下步骤a)鉴定存在于乳腺癌细胞中的对乳腺癌病人为选择性免疫原性的蛋白质；b)限定所说蛋白质的潜在磷酸化位点；c)合成含有所说蛋白质之部分的肽，这部分含有至少一个所说的磷酸化位点，且其中至少一个所说的磷酸化位点是被磷酸化的；d)筛选所说肽，以鉴定对乳腺癌病人为选择性免疫原性的磷酸化的肽；以及e)形成所说的磷酸化的选择性免疫原性肽的文库。63.按照权利要求62的方法，其中所说的蛋白质是dbl。64.按照权利要求62的方法，其中所说的潜在的磷酸化位点包括a)一个在SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上的磷酸化的丝氨酸残基b)至少两个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上的磷酸化的丝氨酸残基c)至少三个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号2、3和9、或者436、438和442上的磷酸化的丝氨酸残基d)一个在SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号38、263、380、403或406上的磷酸化的苏氨酸残基e)至少两个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上的磷酸化的苏氨酸残基f)至少一个位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上的磷酸化的酪氨酸残基g)至少一个磷酸化的丝氨酸残基和至少一个磷酸化的苏氨酸残基，其中i)磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号23和25上，且一个磷酸化的苏氨酸残基位于氨基酸残基位置编号38上；ii)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，目两个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403和406上；或者iii)一个磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号402上，且一个磷酸化的苏氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号403或406上；或者h)至少一个磷酸化丝氨酸残基和至少一个磷酸化的酪氨酸残基，其中所说的磷酸化的丝氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号202上，且所说的磷酸化的酪氨酸残基位于SEQIDNO2的氨基酸残基位置编号201上。65.按照权利要求62的方法，其中所说的部分包含SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸残基序列。66.按照权利要求62的方法，其中所说的蛋白质是一个致癌基因转录的蛋白质、细胞周期蛋白、受体、转录因子或其他调节蛋白质或底物蛋白质。67.按照权利要求62的方法制备的文库。68.一种用于诊断受试者体内是否存在肿瘤的检测试剂盒，所说的试剂盒包含至少足够用于一次试验量的肿瘤特异性体液抗原的肽文库。69.按照权利要求68的试剂盒，其中所说肿瘤是SCC，且所说文库包含两种或多种SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。70.按照权利要求68的试剂盒，其中所说肿瘤是乳腺癌，且所说的文库包含两种以上的由SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38指定的肽。全文摘要本发明涉及肿瘤特异性抗原和肿瘤细胞功能性蛋白质，所述抗原和蛋白质可以经鉴定存在于肿瘤细胞中的对肿瘤病人为选择性免疫原性的蛋白质而制得。本发明还进一步提供了制备肿瘤特异性体液抗原之肽文库的方法，增加肿瘤相关抗原之免疫原性特异性的方法，检测对肿瘤特异性抗原有免疫反应性之抗体存在的检测试剂盒，以及制备对肿瘤特异性抗原敏感的T细胞的方法。文档编号C07K7/06GK1125399SQ94192460公开日1996年6月26日申请日期1994年4月12日优先权日1993年4月16日发明者E·卡伦诺夫申请人:西北大学