角质细胞生长因子的治疗应用的制作方法

专利名称：角质细胞生长因子的治疗应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用角质细胞生长因子(KGF)刺激角质细胞以外的其它细胞的增长、生长和分化，以及给患者施用KGF以利用其生物学作用再生被损害或病变的细胞和组织。
背景技术：
近些年，生物技术的进展导致新的重组多肽(包括促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子)的形成和治疗性应用，给许多患者带来了好处。已发现表现出具有体外生物学活性的其他多肽的数目也在增加。然而，这些因子的靶细胞的特征和该因子的体内生物学作用对人类潜在的治疗学应用是必需的。
KGF是一种已知的促细胞分裂剂，最初被鉴定为对上皮细胞，特别是对角质细胞有特异性(Rubin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:802-806(1989)；Finch et al.,Science,245:752-755(1989)；Marchese et al.,J.Cell.Phys.144:326-332(1990))。在来自胚胎，新生儿和成人上皮组织的几种基质成纤维细胞系中和从正常成人肾脏和胃肠道提取的RNA中已检测到KGF信使RNA的表达。在胶质细胞、肺、脑或各种上皮细胞系(包括鳞状细胞癌、乳腺上皮细胞、永生的支气管上皮细胞、永生的角质细胞和原代角质细胞培养物)中未检测到该RNA(Finch et al.,Science，出处同上)。然而，KGF对连续的小鼠细胞系BALB/MK细胞具有促有丝分裂活性。(Weissman and Aaronson,Cell,32:599(1983)；也见PNAS和Scienee，出处同上)。这一观察支持了KGF在皮肤中表现出旁分泌作用的证据KGF在真皮(而不在表皮)中生产并作用于角质细胞。
另外，使用角蛋白和filagrin基因的表达证实KGF影响角质细胞的分化和成熟(参见J.Cell Phys．出处同上)。
用重组KGF完成了大量前述工作以考察KGF的生物学活性，重组KGF使得可以对该因子进行更广泛的研究。公开的PCT专利申请WO90/08771描述了从入胚胎成纤维细胞系条件培养基中纯化KGF、分离的多肽之部分氨基酸测序、该基因的克隆及在细菌细胞(E.coli)中表达以得到重组的具生物学活性的KGF。
KGF作为体外角质细胞的刺激剂的作用已被清楚地鉴定，而将KGF当作生长因子仍有待于了解，包括对可成为靶目标的其他细胞种类以及KGF在体内对该细胞的影响。这些资料对于了解KGF用作治疗剂的全部效力是关键的。
发明概要简单地说，本发明涉及发现KGF对非角质细胞上皮细胞的刺激作用。更具体地说，现已发现KGF用于体内诱导正常附属结构(如皮脂细胞和毛囊细胞)、肝脏细胞(如肝细胞)和呼吸粘膜上皮细胞(如Ⅱ型肺细胞)的增生和分化。对于KGF刺激肠粘膜细胞(如胃腺和小肠腺产生粘蛋白的杯状细胞、结肠的隐窝细胞和肠道内的其他上皮细胞)的增生和生长。
构成本发明基础的这些发现，明显地暗示KGF能应用于组织，尤其是其特征为特定类型的细胞损伤或缺失的组织。下面是对根据本发明能用KGF治疗的疾病和医学症状的描述。
附属结构(如毛囊、汗腺、皮脂腺)的增生和分化的刺激作用在烧伤和其他部分及全部深度损伤的患者表皮和真皮再生是非常重要的。现在，用瘢痕形成和角质细胞表面再生来治愈表面缺损，皮肤的完全再生还是不可能的。毛囊、汗腺和皮脂腺的种群重建目前在完全深度的皮肤缺损(包括烧伤)中还不能发生。KGF的使用使这种种群重建成为可能。
大泡性表皮松解是依附于表皮和真皮之间的一种损伤，导致频繁的破裂的疼痛水泡，可引起严重的发病。加速这种损伤的表皮再生(如用KGF治疗)将导致感染的风险减少，减轻疼痛，并减少伤口处理。
当对患者使用化学疗程治疗恶性肿瘤时，引起化学治疗诱导性脱毛症。目前对于阻止引起头发暂时减少的毛囊细胞死亡尚无有效的治疗方法。而KGF可提供这类方法。
男性型脱发症是一种流行的且基本上不可治疗的疾病。男人和女人头发的逐渐减少是一个严重的美容问题。这一症状可用KGF进行全身性的或局部的治疗，如果这种药物能通过头皮使用和吸收，或使用气枪或相似技术喷射进头皮。
胃溃疡尽管可用H2拮抗剂来治疗，但引起严重的发病率和复发率，并且是通过粘膜内面的瘢痕形成来愈合。而例如，用KGF治疗，腺粘膜更快再生的能力将在胃溃疡的治疗上提供显著的治疗学改进。
十二指肠溃疡与胃溃疡一样也可治疗，但开发更完全和更迅速地再生十二指肠粘膜内表面的治疗剂将是一个重要进展。而且，再生性治愈这些溃疡且减少复发的治疗剂将是有利的。KGF提供了这种功效。
炎性肠疾病，如节段性肠炎(主要感染小肠)和溃疡性结肠炎(主要感染大肠)，是病因未知的慢性疾病，引起粘膜表面的损伤、发炎、修复期间形成瘢痕和粘连并在感染的个体中有很高的发病率。目前的治疗方法是设法控制炎症。刺激粘膜表面的表面再生的治疗方法(如用KGF)导致快速愈合，可能对控制疾病的恶化有利。
在放射和化学治疗的治疗方式中，肠道毒性是一个主要的限制因素。用KGF进行预治疗可以对小肠粘膜产生细胞保护性影响，允许增大这类治疗的剂量而减小潜在致命的肠道毒副作用。
KGF治疗对整个胃肠道粘液的产生具有显著的影响。这一特性可能在保护肠粘膜兔受消化物的损伤和在限制诸如炎性肠疾病状态中损伤的扩散是有用的。
由肺内Ⅱ型肺细胞产生的表面活性物质总产量的缺乏引起早产婴儿的透明膜疾病，导致肺泡的萎缩。尽管皮质甾类能在28周胎儿中加速成熟和分泌并超出很大程度，但目前对更小的胎儿尚无治疗办法，在这类胎儿中引起大量的发病率和死亡率。诱导Ⅱ型肺细胞增生和分化的治疗剂(如KGF)在这类疾病的治疗中可能有明显的益处。
吸烟是烧伤后一周内发病和死亡的明显原因，起因于支气管上皮和肺泡的坏死。生长因子(如KGF)可能刺激这些结构的增生和分化，诱导其修复和再生，在治疗吸入性损伤中可能有益处。
肺泡的逐渐减少导致肺气肿。生长因子(如KGF)能刺激再生或保护残留肺泡的细胞，这将具有治疗学益处。目前还没有有效的治疗方法。
肝硬化继发于病毒性肝炎和慢性乙醇摄入，是发病和死亡的重要原因。由KGF产生的肝细胞之细胞保护、增生和分化可改善肝功能，这对减缓或阻止肝硬化的发展有益处。
发生在肝硬化晚期的暴发性肝衰竭是一种威胁生命的疾病。诸如KGF之类的因子能诱导剩余肝细胞的增生，这对这一疾病将直接有利，目前仅用肝移植可治疗该疾病。
急性病毒性肝炎是频发的亚临床性和自限性疾病。然而，在少数患者中，几周内可引起严重肝损伤。KGF作为一种细胞保护剂在阻止肝细胞变性中将有用。
由乙酰氨基苯、氟烷、四氯化碳和其它毒紊引起对肝脏的毒性损伤，可用对肝细胞具有细胞保护作用的生长因子(KGF)来改善。
因此，本发明包含KGF的用途，包括在治疗学上(或在合适的情况下，在预防上)用于治疗上面提到的疾病，以及含有合适的、治疗学上有效量的KGF之药品附图简述

图1显示了合成的寡核苷酸DNA的核苷酸序列，它用于KGF的重组表达系统构建体中，所说的KGF被应用于本文所述的体内实验。
图2描述兔耳朵部分深度真皮的伤口模型，经修改产生一通过软骨的伤口，以更好地定量新组织的生长。
图3描述了修改性兔耳部分深度真皮伤口模型中KGF处理后的和对照的伤口上皮再生。KGF治疗后再生上皮的总面积如左所示，伤口再生上皮的百分数如右所示。
图4显示使用兔伤口模型，以KGF治疗达5天后伤口边缘基底部和上基底部角质细胞的增生。
图5描述了经KGF治疗过的和对照的伤口以溴脱氧尿苷(BrdU)处理过的毛囊组织学分析以显示在修改性兔模型中的细胞增生。
图6描绘了相同兔模型中KGF处理过的和对照的伤口皮脂腺的油红O染色。
图7和图8显示了以KGF进行气管内处理过的健康大鼠肺泡隔上皮细胞微乳头状过度生长。
图9和图10显示给相同的健康大鼠气管内施用KGF后肺内大部分肺泡上皮细胞的立方形生长。
图11和图12显示这种处理过的大鼠肺泡隔内表面增生的肺泡上皮细胞含有各种大小和形状的片状包涵体。
图13A显示给健康大鼠气管内投药后支气管上皮的KGF处理之增生效应。
图13B显示了与图13A试验组相应的健康大鼠对照(仅用赋形剂)组的支气管上皮。
图14描绘了在成年大鼠肺中KGF受体(KGFR)的RNase保护试验结果。
图15显示KGF处理4天后对剂量依赖型的胃肠道和肝增重。
图16显示以KGF处理4天后对剂量依赖型的大鼠肝脏蛋白质合成的增加。
图17显示使用BrdU标记(A)或分裂计数(B)测量的以KGF处理1到7天的动物肝脏肝细胞增长的增生作用。
图18和19描绘了部分肝切除的大鼠以KGF处理后肝脏质量的恢复。
图20描绘了四氯化碳中毒大鼠以KGF处理后血清谷氨酸-草酰乙酸转氨酶水平的降低。
图21显示以KGF处理1到7天后大鼠胃腺内胃腺长度和粘液形成量的增加。
图22显示以KGF处理1到7天后大鼠小肠内十二指肠隐窝长度和粘液产量的增加。
图23显示了以KGF处理1到7天后大鼠结肠隐窝的增加。
图24显示了以KGF处理1到7天后大鼠结肠隐窝深度的增加。
具体实施方案的描述为鉴定KGF可对之产生显著生物学效应并表现出有效治疗学价值的上皮细胞的特异性种类，使用活动物体内施用KGF并观察和分析结果来进行广泛的研究。在下面各实施例中使用的重组KGF按如下方法制备。
经PCR从人包皮成纤维细胞(AG1523)RNA中分离出重组KGF基因，所得DNA连接到pCFM1156表达载体NdeⅠ和BamHⅠ限制性位点之间。质粒pCFM1156衍生于美国专利4,710,473所述的pCFM836质粒(本文引入该美国专利供参考)，经破坏2个内源性NdeⅠ限制性位点，用T4聚合酶补齐末端，接着连接平末端，用下面含有SEQ.ID.NO:1和SEQ.ID.NO:2的寡聚核苷酸双链取代单一ClaⅠ和KpnⅠ限制性位点之间的小段DNA序列ClaⅠ KpnⅠ5′ CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3′3′ TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5′使用标准电穿孔(BioRad Gene Pulser)转化程序将pCFM1156KGF质粒克隆到FM5宿主细胞(ATCC#53911)。为降低观察到的内部翻译启动，用设计为减少内部核糖体结合位点(图1)的使用之合成寡聚核苷酸DNA取代KGF基因KpnⅠ和EcoRⅠ之间的DNA序列。连接和电穿孔到FM5细胞(ATCC#53911)后，挑选含pCFM1156KGF-dsd的克隆。编码KGF基因的DNA经测序来证实。然后在10升发酵罐中用标准饲养培养基30℃下培养细胞，在葡萄糖有限的条件下允许细胞以指数速率生长以阻止毒性副产物的积累。在指数中期的细胞密度下，温度突然升高到42℃以诱导KGF基因的转录，然后在大约37℃维持以利于发酵的KGF诱导期的剩余物。收集细胞膏并冷冻贮存。利用蛋白质非常高的等电点(S-Sepharose Fast Flow Pharmacia)和大小(Superdex 75,Pharmacia)经标准色谱程序从机械破碎的细胞膏中纯化具生物学活性的KGF。在Rubin等(PNAS，出处见上)所描述的促有丝分裂试验中测量纯化的重组KGF蛋白质之内毒素和生物学活性。
实施例1体内伤口愈口模型中附属结构之KGF刺激的增生和分化在本实施例中，使用修改的兔耳部分深度真皮伤口模型。由Mustoe等人(J.Clin.Invest.,87:694-703(1991))描述的兔耳真皮溃疡模型，使用6mm环钻经修改在耳背侧真皮产生一个通过软骨的伤口。因此经软骨下表面表皮部分的生长来愈合伤口，在愈合期间不可能收缩，允许精确定量新组织(图2)。按上面所述制备的重组KGF用作治疗伤口愈合的制剂。材料和方法在手术当天使用一次KGF或仅用磷酸缓冲盐载体，并用Tegaderm封闭套(3M Company,St.Paul,MN)覆盖伤口(0.25cm2)。处死前，每只动物按每kg体重50mg的量静脉注射BrdU(AldrichChemical Company,Milwaukee.WI)。BrdU的施用是为了更好地定量基部角质细胞增生的程度和基部细胞迁移到表皮生发层和角质层的动态。处死后，剖开每个伤口，一部分在最适冷冻温度培养基(OCT,Miles Inc.,Elkhart,IN)中冷冻，第二部分在Omnifix(Al-Con,Genetics,Inc.,Melville,NY)中固定并按常规组织学方法进行处理。在各伤口的3μm厚切片上进行Masson Trichrome、油红O和免疫组织化学(IHC)染色。再生上皮的测量使用校准态的测微尺对每个伤口的伤口全长和上皮缺口长进行测量。经取全长和上皮缺口长之差除以各伤口的全长计算出各伤口再生上皮的百分数。来自每个伤口两部分的资料进行平均。使用单尾未配对Student t-检验分析上皮长测量值和再生上皮百分数的差异。
计算各剂量组处理过的和未处理过的伤口产生的上皮面积。各剂量对对照组进行单边ANOVA和Dunnett t-检验。上皮细胞增生和分化的测量用抗-BrdU(Dako Corp,Carpinteria,CA)、抗生物素蛋白-生物素复合物(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)和二氨基联苯胺底物(DAB,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)染色石蜡包埋的3μm组织切片。切片用0.1％蛋白酶溶液消化，接着用2N HCl处理，经与3％过氧化氢溶液接触抑制内源性过氧化物酶。切片用10％的正常马血精的磷酸缓冲盐(PBS)溶液封闭，然后与在1％牛血清白蛋白中按1∶400稀释的抗-BrdU一起温育。洗涤后，切片与在1％TBSA中按1∶100稀释的过氧化物酶连接的抗生物素蛋白-生物素复合物一起温育20分钟。然后，切片浸入DAB底物(10mg DAB,20m1 PBS,20μl 30％过氧化氢)中10分钟。切片用苏木精复染。BrdU处理过的毛囊组织学分析BrdU掺入和IHC染色后，用Kruskall-Wallis多重比较试验计数和分析每个伤口创面的毛囊总数。进一步的分析包括对每处理组中具有10个或更多增生细胞的毛囊之伤口百分数的卡一方检验。另外，在所有含多于5个增生细胞的毛囊中计数了BrdU正染细胞数。皮脂腺的油红O染色油红O是一种中性脂肪特异性染料，用于鉴定皮脂细胞和皮脂腺，使用F.L.Carson(Histotechnology:A Self-InstructionalText ASCP Press，Chicago(1990))所述的程序在冰冻切片上进行。简单地说，7μm冰冻切片经空气干燥在锌-福尔马林中固定10分钟。切片浸入0.3％ w/v油红O(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中，然后在60％异丙醇中室温下处理30分钟，在60％异丙醇中脱色后用Learner苏木精复染。测定皮脂腺的大小和每个腺体的细胞数。结果和分析在以4-40μg/cm2的KGF处理过的伤口上观察到上皮再生加速和上皮厚度增加。处理后第5天的伤口与对照相比表现出明显的上皮再生增强(76.7％对52.5％,1μg的KGF)，新上皮的厚度以剂量依赖性方式增加，在每伤口10μg KGF剂量下处理后第5天和第7天几乎是对照伤口表皮面积的2倍(图3)。组织学分析表明，上皮再生以发芽的方式大量出现于真皮的附属结构中，即皮脂腺、汗腺和毛囊。
基部角质细胞增生和基部细胞迁移分析揭示出KGF处理1天后伤口边缘增生的基部角质细胞数目增加(图4)。KGF处理的第2天，在表皮上基底层的增生角质细胞数目增加表明增生细胞向表皮生发层的转变时间加快。处理后的第5天，在基底层伤口显示出较少的增生，表明上皮修复和分化加速的自我限制(图4)。角质细胞随着其向上迁移表现出进行正常的成熟以形成角质层。
未料到还观察到了皮脂细胞增生和分化的增加以及毛囊增生的增加。KGF处理过的伤口与对照伤口相比毛囊和皮脂腺均表现出形态更大和数量更多(分别见图5和6)。经油红O染色以选择性地鉴别皮脂腺的组织切片显示出该腺体数目明显增加且形态也显著增大，表明皮脂细胞的增生和分化加快形成产皮脂的细胞。在KGF处理过的伤口中也观察到每个毛囊中增生细胞数目的剂量依赖性增加。
以前在兔耳模型中检查了表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)(J.Clin.Invest.,同上，和Pierce et al.,Amer,J.Pathol.140:1375-1388(1992))。尽管已知两种生长因子都刺激上皮再生，但EGF和碱性FGF都不影响附属结构(如皮脂腺和毛囊)的增生或分化。KGF刺激皮肤中的多种细胞类型增生继而分化的能力及其最初从成纤维细胞中分离出来的事实表明KGF是一种皮肤再生过程的有效旁分泌刺激物。
实施例2KGF体内刺激Ⅱ型肺细胞的增生和分化完成本实施例以评价施用KGF对健康大鼠呼吸道上皮细胞的影响。材料和方法雄性Lewis大鼠，每只体重200-250克，使用Ulich等人的方案(in Amer.J.Pathol.,138:1485-1496(1991))，单次气管内注射以盐水或磷酸缓冲盐水稀释的各种剂量的KGF。注射的KGF剂量为0.1、1.0、5.0和10.0mg/kg。对照大鼠接受一次气管内注射赋形剂。在注射KGF后6小时和1、2、3、4、5和6天各时间点处死大鼠，肺用布安氏固定剂经气管内导管膨胀，石蜡包埋肺的矢状切面，用苏木精和曙红染色组织学切片。结果和讨论0.1mg/kg的KGF不能引起组织学上可见的肺泡上皮细胞增生。1.0mg/kg的KGF引起轻微但有限的肺泡上皮细胞增长。在5.0和10.0mg/kg剂量下分别观察到肺泡上皮细胞增生的增加。在气管内注射后6小时或1天时KGF不能引起肺泡上皮细胞组织学上可见的增长。在第2天，在KGF处理后的大鼠肺内观察到肺泡隔上皮细胞疣状微乳头的增生(图7、8)。在第3天，在大部分肺的肺泡全部由表面上观察到肿泡上皮细胞的分散的低立方形到立方形的生长(图9、10)。然而，肺的一些区域保持正常的组织学状态。第三天大鼠增生的肺泡上皮组织学形态与入肺反应性Ⅱ型肺细胞增生的形态基本相同。气管内注射后第4天和第5天可观察到KGF处理过的大鼠肺内增生的肺泡上皮量减少。第6天，KGF处理过的和对照的大鼠肺不可区别开。
气管内注射3天后对KGF处理过的大鼠肺进行超微结构检查。肺泡隔内表面增生的肺泡上皮细胞几乎一律含有一个或多个不同大小和形状的层状包涵体(图11、12)。在第3天，KGF处理过的大鼠支气管上皮增生，但其增生并不像肺泡细胞增生一样显著。正常情况下由表面为单层上皮细胞的较小的远端支气管以内表面上皮假复层化的形式增加增生，这种增生以支气管上皮的簇生或微乳头状生长，和以支气管上皮内有丝分裂数增加来进行(图13A、13B)。
气管内用药的KGF引起肺泡上皮细胞的显著增生。细胞内在超微结构水平上存在层状细胞质包涵体与增生的细胞是Ⅱ型肺细胞的假设一致。层状包涵体不表现出在有些情况下大鼠实验性Ⅱ型肺细胞增生表现出的数量或嗜锇性，但与正常大鼠肺表现出的层状包涵体非常相似。除了引起肺泡细胞增生外，KGF还引起支气管上皮细胞的增生。可能增生的肺泡上皮代表支气管上皮从末端支气管到肺泡实质的向下生长。然而，似乎更可能KGF直接作用于Ⅱ型肺细胞，因为注射KGF两天后肺泡隔肺细胞的多点微乳头状发芽生长方式在第3天以立方形细胞伸出肺泡汇合的内表面。另外，Ⅱ型肺细胞被认为是有丝分裂应答性肺泡上皮细胞类群，并期望是对有效的内源性肺泡细胞生长介质(如KGF)产生应答的肺泡细胞类型。最后，对增生细胞内层状包涵体的鉴定表明它们不仅分化成Ⅱ型肺细胞，而且起源于Ⅱ型肺细胞。
KGF对Ⅱ型肺细胞的刺激效应与观察到的每等份总RNA样品中肺内KGF受体信使RNA总量是在成熟的年轻大鼠其它各种器官中所发现的水平的2到3倍这一结果一致。在本实验中，使用修改的Ambion RNase保护试验(RPAⅡ,No.1410)检测KGF受体信使RNA水平。
用于本试验的“反意”RNA探针具有下面序列(SEQ.ID.NO:3):5′GAAUACGAAUUCCUUGCUGUUUGGGCAGGACAGUGA-GCCAGGCAGACUGGUUGGCCUGCCCUAUAUAAUUGG-AGACCUUACAUAUAUAUUCCCCAGCAUCCAUCUCCG-UCACAUUGAACAGAGCCAGCACUUCUGCAUUGGAGC-UAUUUAUCCCCGAGUGGAUC 3′使用Promega Riboprobe Gemini Ⅱ试剂盒(#P2020)从编码上述相应DNA序列的线型化模板DNA制备反意探针。经切下准确大小的带并在Ambion溶液F中洗脱RNA探针从尿素-聚丙烯酰胺凝胶中纯化RNA探针。
编码与“反意”探针互补的RNA序列的“有意义”RNA标准品序列如下(SEQ.ID.NO:4):5′GGGAGACAAGCUUGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAG-AGGAUCCACUCGGGGAUAAAUAGCUCCAAUGCAGAA-GUGCUGGCUCUGUUCAAUGUGACGGAGAUGGAUGCU-GGGGAAUAUAUAUGUAAGGUCUCCAAUUAUAUAGGG-CAGGCCAACCAGUCUGCCUGGCUCACUGUCCUGCCCA-AACAGCAAGG 3′使用Promega Riboprobe Gemini Ⅱ试剂盒(#P2020)制备冷(无放射活性标记)有意义链标准品并在G50 Sephadex Quick旋转柱上纯化。
按照标准Ambion(RPA Ⅱ #1410)方案，50μg总RNA与105cpm的探针先95℃温育4分钟，再45℃温育12到18小时。RNase(1∶500 Ambion溶液R)与杂交溶液37℃下温育40分钟，接着加入灭活/沉淀试剂(溶液Dx)。然后使用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳按大小分离RNAase保护的片段，全部凝胶浸没于Phosphorimagerscreen中。然后条带在Molecular Dynamics Phosphorimager中定量。结果如图14所示。
KGF作为Ⅱ型肺细胞生长因子的鉴定提高了KGF用作胎儿肺成熟刺激物显示出与糖皮质激素相似的治疗学效力的可能性。KGF在临床上刺激成人肺损伤后支气管肺泡的修复中也可能是有用的。KGF对Ⅱ型肺细胞的增生效应表明KGF可能在调节表面活性剂的合成和分泌中起重要作用。
实施例3KGF刺激的肝细胞增生和分化本实施例评价了经全身性施用KGF对成年大鼠肝脏上皮组织的影响材料和方法，雄性大鼠随意接受水和食物。所有动物每天接受腹膜内注射KGF或PBS，注射1天、4天或7天。在所有实验中，每组至少分析5只动物。
所有大鼠以CO2室息而死，死后立即以心脏穿刺取血用于血清化学，血液冷冻贮存直至分析。分析血清的标准血清化学和电解质。在黑暗中称肝脏的重量，重量以每100克体重(百分体重)的克数来表达。组织样品放入10％缓冲的福尔马林中以备常规组织学处理。
肝脏切片用苏木精和曙红(H和E)染色。处死前1小时，大鼠经腹膜内注射接受5Dmg/kg的BrdU。进行抗BrdU免疫组织化学，使BrdU掺入DNA的复制细胞可见。
使用校准的目镜物镜方格网测定肝脏的标记指数(LI)。每只动物计数10个视野并平均。计数每单位面积的总核数和被标记的核数。校准计数的视野所代表的肝实质的相同面积，计数的所有视野与肝门三岔脉相邻。
使用未配对双尾Student t-检验或单边ANOVA多组比较分析全部资料。结果和讨论进行剂量应答试验以鉴定KGF的有效剂量。每天注射KGF，四天后摘取器官。当以ANOVA比较时，仅仅每天以5mg/kg的最高剂量注射的肝脏(以百分体重表示)与对照有显著性差异(图15)。其中注意到对于肝脏合成的血清蛋白质，胆固醇和甘油三酯化合物，1和5mg/kg KGF剂量处理的大鼠与对照大鼠相比明显较高(图16)。
每天以5mg/kg KGF处理1、4或7天后分析动物。经过大体尸体剖检，在7天时间点的肝脏显著增大。KGF处理过的大鼠在所有试验时间点肝脏重量明显增加(第17天,KGF:4.08±0.08％而对照3.49±0.06％,p=0.0003)。
BrdU阳性核定量分析证实在第一天KGF处理过的大鼠与对照相比增长了3到4倍(图17)。在处理后的第一天，以每个高倍视野内的有丝分裂数表示的有丝分裂指数比对照明显上升，这与BrdU计数结果一致。
这些结果证实KGF对肝脏具有促有丝分裂作用和分化作用。KGF处理1天后肝重的迅速增加与上升的有丝分裂指数和BrdU阳性分数证实KGF对这种上皮占优势的组织具有迅速和有效的影响。尽管KGF的有丝分裂作用迅速下降，但在整个实验过程中以百分体重表示的肝重持续增加。增加的重量最初是由于最早在第1天并持续到处理的4和7天组织学上可观察的细胞增加引起的。由于在肝再生期间在不到两周的时间内肝质量能以大于2倍的速度增加，所以在处理1天后开始发现显著的差别并不奇怪。
白蛋白水平的上升不与脱水以外的其它任何已知疾病状态相联系。由于存在的肺细胞数目增加，KGF很可能诱导血清白蛋白(和其它蛋白质)水平增高。由KGF诱导的蛋白质合成的增加可能对处于晚期肝疾病或肝硬化的病人具有极大的挽救生命的益处。
实施例4部分肝切除术后KGF体内刺激的肝细胞增生和恢复在本实验中，雄性Spraque-Dawley大鼠每只重300到340克，用作实验对象。材料和方法使用Higgins和Anderson(Archives of Pathology,Volume12,Page 196(1931))的程序对每只大鼠施行2/3的部分肝切除。从手术后8小时开始，此后每天继续一次以1mg/kg剂量的PBS(对照组)或KGF皮下注射大鼠。手术后4、7、10或14天称重和处死对照的和KGF处理过的大鼠。然后摘取残余的肝脏并称重。结果和讨论发现以KGF处理部分肝切除的大鼠在绝对和相对基础上都导致肝质量恢复的明显加速，分别如图18和19所示。KGF处理组的肝质量在7天内恢复到手术前的质量值。作为对照，对照组(未经KGF处理)绝对和相对肝质量即使在14天后仍不能完全恢复。
实施例5KGF对化学诱导性肝毒性的改善作用雄性Spraque-Dawley大鼠每只重300到340克，用于试验以评价导入化学毒素后KGF对肝脏的治疗作用。用药在第0天每组12只雄性Spraque-Dawley大鼠的各组以玉米油载体供给1ml/kg或2ml/kg的四氯化碳(CCl4)。每个剂量组往下分成各6只大鼠的两个亚组。施用CCl4后3小时开始，此后每天继续给各亚组皮下注射PBS或1mg/kg/天的KGF。在施用CCl4后22、72、144小时从每只大鼠取血液样品并检测血清谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(SGOT)水平。结果和分析如图2D所示，口服CCl4后皮下注射KGF明显降低血清酶(SGOT)水平，该酶是一种已知的肝损伤指示剂。在以2ml/kg口服后的第1天效果尤其显著。
实施例6KGF刺激的肠粘膜上皮细胞的增生和分化本实施例评价了KGF对健康大鼠肠粘膜上皮细胞的生物学影响。材料和方法雄性大鼠随意接受水和食物。所有动物每天接受腹膜内注射KGF或PBS1、4或7天。在所有实验中，每组至少分析5只动物。
所有大鼠以CO2室息处死。主要器官在黑暗中称重，重量以每100克体重的克数(百分体重)来表示。肠道分成无腺体前肠。胃腺、小肠和大肠。组织样品放入10％缓冲的福尔马林中以备常规组织学处理。
来自摘取的所有器官的切片以苏木精和曙红(H和E)染色。处死前1小时，大鼠经腹膜内注射接受50mg/kg BrdU，使用标准方法进行免疫组织化学使BrdU掺入DNA的复制细胞肉眼可见。选择的组织用过碘酸-希夫(PAS)、Alcian blue pH2.5和Masson-Trichrome染色。
使用校准的目镜测量胃粘膜的高度和胃粘膜PAS染色的深度。同样测量了绒毛长度和十二指肠隐窝深度以及结肠隐窝的深度。为了定量杯状细胞产物的变化，沿十二指肠绒毛基部开始100μm的长度上计数PBS阳性杯状细胞数。在消化道的所有区域，仅对与下层粘膜肌层垂直的腺体或绒毛进行测量。结果以微米或以每单位面积小肠杯状细胞平均数来记载。另外，测定了在结肠限定长度内的结肠隐窝数和增生(两叉或三叉的)隐窝数。每动物重复测量5至10次进行平均。使用未配对双尾Student t-检验或单边ANOVA多组比较分析所有数据(Statview Ⅱ,Abacus Concepts,Berkeley,CA)。结果和讨论首先进行剂量应答试验以鉴定KGF的有效剂量。每天注射KGF，四天后摘取器官。在胃腺、小肠和结肠中观察到显著的剂量应答(图15)。
每天以5mg/kg KGF处理1、4和7天后分析动物。经过大体尸体剖检，经过4天和7天处理的前肠折叠的粘膜总体上增厚。在4和7天时前肠、胃腺、十二指肠和结肠表现出明显的重量增加，但在处理一天的大鼠并不如此。在7天时，KGF处理过的动物胃腺为0.65±O.01g，而对照为0.48±0.02g(p=0.0001)。
在处理4和7天的动物中不具腺体的前肠重量明显增加。KGF处理过的动物在组织学上不具腺体的前肠鳞状上皮出现轻微的(4天)到显著的(7天)增生。增生的上皮的贲门处突然改变，食管为正常的鳞状上皮，而处理过的前肠为增生上皮。经过一天处理后，胃腺粘膜在组织学上表现正常。在4和7天，在组织学上杯状细胞数明显增加，因为这些细胞具有清楚的开放细胞质。以KGF处理4和7天的动物粘膜厚度表现出轻微增加(图21)。在7天，粘液颈细胞层变宽并移向浆膜表面。PAS染色处理4天和7天的大鼠证实PAS阳性(产粘蛋白的)杯状细胞的数目和大小显著增加。BrdU染色切片进一步鉴定这一层为胃腺的分裂细胞层且表明处理过的大鼠增生细胞增加。KGF处理4天和7天时，胃粘膜腔表面PAS阳性层的厚度也显著增加(图21)。
小肠在所有试验点总体上正常。PAS染色证实产粘液的杯状细胞数增加。这种差别在4和7天时显著(图22)。在任一时间点的绒毛高度没有差别，但在1和7天时隐窝深度明显变大(图22)。
在7天处理组结肠粘膜伸出形成皱褶状折叠，使总表面大量增加。在所有组(包括对照)观察到增生指示物(两叉和三叉状结肠隐窝)，但在短期处理组(例如1天和4天)量最大且最显著，长期处理增生隐窝数减少(图23)。相应地，处理组结肠隐窝的深度增加(图24)。
PAS和Alcian blue染色表明KGF处理后整个结肠的产粘液杯状细胞增加。另外，在全部处理7天的动物中腔表面Alcian blue阳性杯状细胞数增加。处理4天的动物在结肠隐窝上部1/2和1/3的PAS阳性细胞表现出显著的增加。
这些结果证实KGF对胃肠道的上皮组织具有有效的促有丝分裂和分化作用。BrdU标记显示出KGF启动胃粘膜粘液颈层细胞的增生。这些细胞组成胃腺的祖细胞。分裂后，细胞从该层向上迁移(向肠腔)形成表面细胞或向下(向浆膜表面)变成占据胃腺的细胞Toner etal.,1989,in Gastrointestinal and Esophageal Pathology,Churchill Livingstone,New York,NY at Pages 13-28)。而且，KGF启动粘液颈细胞的选择性分化，细胞向上移动变成杯状细胞。处理4天和7天时胃粘膜的总厚度增加。在小肠和大肠看到相似的效果。KGF经过刺激祖细胞启动细胞分裂的增加，导致隐窝延长。KGF也诱导分裂的隐窝细胞分化，其证据为粘液产量增加和绒毛或隐窝杯状细胞数增加。
虽然本发明描述了有关具体实施方案和实施例，但应理解这并不是为了限制本说明书。因此，例如，任何实质上重复天然存在的KGF生物学特性之KGF形式都能用于实现所述的用途。这些形式包括纯化的天然存在的KGF本身，以化学方法合成的KGF，使用上述例子外的其他表达系统重组得到的KGF，以及以天然存在的氨基酸顺序为基础的类似物、变异体、嵌合体等。所有这些形式都可用于本发明的实施中。
本领域的技术人员也将意识到，各种宿主-载体系统可用于表达KGF蛋白质编码序列。它们包括但不局限于病毒感染的哺乳动物细胞系统(例如牛痘病毒、腺病毒等)；以病毒感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒)；微生物如含有酵母载体的酵母，或除用噬菌体DNA、质粒DNA或粘性质粒DNA转化的E.coli外的其他细菌。这些载体表达元件的强度和特异性不同。依赖于所使用的宿主-载体系统不同，可使用一些合适的转录和翻译元件中的任何一种。
一旦使用如本说明书所述的方法或本领域的技术人员已知的其他方法分离、纯化了KGF cDNA表达的蛋白质产物并试验了KGF活性，可将它配制成各种药用组合物。典型地，该组合物包括合适的(通常是化学上定义的)用作治疗剂(KGF)的载体或赋形剂，和依赖于所需投药形式而选用的其它成份。该组合物可包括水性载体或由固相配制品组成，其中KGF掺入到非水相的载体如胶原蛋白、透明质酸和各种多聚物中。该组合物可适于配制成按各种途径用药的形式，包括注射、口服、局部施用、鼻内途径和以肺释放途径。
技术人员将了解到，依赖于所治疗的疾病和用药途径，制剂中的KGF量将随之变化，但可能在某一范围内有效，例如，从每kg体重0.01mg到每kg体重500mg。依赖于疾病和患者的状态可一次或重复用药。它可以与其他治疗结合使用，包括但不局限于其他细胞分裂素和生长因子和用于治疗皮肤、肺、肝脏和胃肠道疾病的其他药用制品。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Amgen Inc.
(ⅱ)发明题目角质细胞生长因子的治疗用途(ⅲ)序列数4(ⅳ)联系地址(A)联系人Amgen Inc.
(B)街道Amgen Center 1840 Dehavilland Drive(C)城市Thousand Oaks(D)州加利福利亚州(E)国家美国(F)邮编(ZIP):91320-1789(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型Diskette,3.5in.,DS,2.0Mb(B)计算机IBM兼容性(C)操作系统MS-DOS(D)软件Microsoft Word Version 5.1a(ⅵ)最近申请资料(A)申请号(B)申请日26-03-1993(C)分类(2)SEQ ID NO:1资料(ⅰ)序列特征(A)长度55碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55(3)SEQ ID NO:2资料(ⅰ)序列特征(A)长度49碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49(4)SEQ ID NO:3资料(ⅰ)序列特征(A)长度164碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:#GAAUACGAAU UCCUUGCUGU UUGGGCAGGA CAGUGAGCCA GGCAGACUGGUUGGCCUGCC CUAUAUAAUU GGAGACCUUA CAUAUAUAUU CCCCAGCAUCCAUCUCCGUC ACAUUGAACA GAGCCAGCAC UUCUGCAUUG GAGCUAUUUAUCCCCGAGUG GAUC 164(5)SEQ ID NO:4资料(ⅰ)序列特征(A)长度191碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GGGAGACAAG CUUGCAUGCC UGCAGGUCGA CUCUAGAGGA UCCACUCGGGGAUAAAUAGC UCCAAUGCAG AAGUGCUGGC UCUGUUCAAU GUGACGGAGAUGGAUGCUGG GGAAUAUAUA UGUAAGGUCU CCAAUUAUAU AGGGCAGGCCAACCAGUCUG CCUGGCUCAC UGUCCUGCCC AAACAGCAAG G 19权利要求
1．一种刺激非角质细胞的上皮细胞产生的方法，包括将该细胞与有效量的KGF接触。
2．权利要求1的方法，其中的非角质细胞的上皮细胞选自皮脂细胞、毛囊细胞、肝细胞、Ⅱ型肺细胞、产粘液杯状细胞和其它上皮细胞及其祖细胞，这些细胞包含在皮肤、肺、肝脏和胃肠道中。
3．权利要求1的方法，其中以体内用药实施。
4．权利要求1的方法，其中KGF是重组KGF。
5．权利要求4的方法，其中重组KGF在细菌细胞中产生。
6．权利要求5的方法，其中细菌细胞是E.coli。
7．一种刺激皮脂腺和毛囊细胞产生来治疗真皮损伤的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
8．权利要求7的方法，其中真皮损伤是烧伤。
9．一种治疗大泡性表皮松解的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
10．一种治疗化疗诱导的脱发病之方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
11．一种治疗男性型秃头的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
12．一种治疗胃溃疡的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
13．一种治疗十二指肠溃疡的万法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
14．一种治疗胃和食道糜烂的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
15．权利要求14的方法，其中所治疗的疾病是糜烂性胃炎、食道炎或食道逆流(esophageal reflux)。
16．一种治疗炎性肠疾病的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
17．一种治疗或预防放射或化疗诱导的肠道毒性的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
18．一种治疗透明膜疾病的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
19．一种治疗由口吸入剂引起的呼吸道上皮坏死的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
20．一种治疗肺气肿的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
21．一种治疗肺炎和纤维化的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
22．一种治疗肝硬化的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
23．一种治疗暴发性肝衰竭的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
24．一种治疗急性病毒性肝炎的方法，包括给需要医治的患者施用治疗有效量的KGF。
全文摘要
根据对动物的广泛体内研究,现已发现:除了角质细胞外,角质细胞生长因子(KGF)还刺激上皮组织的各种细胞的增生、生长和分化。这种对KGF体内生物学作用的较好认识使得这一多肽用作治疗剂成为可能,它适于配制成药用组合物,以特异性地治疗损害组织和器官如皮肤附属物、肝脏、肺和胃肠道的疾病和病变。
文档编号C07KGK1217022SQ9419203
公开日1999年5月19日 申请日期1994年3月24日 优先权日1993年3月26日
发明者G·F·皮尔斯, R·M·豪斯利, C·F·莫里斯 申请人:安姆根有限公司