专利名称：P的制作方法
政府支持本发明的工作的一部分得到美国NIH拨款IR43HL53864-01(AHR-B1)的支持。本发明的现有技术血管内的血凝固是常见的疾病。最常见的一种这类疾病是动脉血管内的血栓，该血栓停留在其发生的地方。血栓对患者造成严重的不良影响。例如，在心脏动脉内形成的血栓会限制血流，造成心肌梗死(心脏肌肉的死亡)，这是最严重形式的心脏病之一。
发生在动脉血管内和医疗修复装置内的血栓的特征是血小板粘附在受损伤的血管壁上或修复的表面上，释放它们的颗粒成分，合成前列腺素内过氧化物和血小板凝集。新生成的血小板凝集体是脆性的团状体，被称为“白血栓”。被凝集的(活化的)血小板表面上的促凝血活性导致在白血栓上形成纤维蛋白网络并固定白血栓。多年来，已经对众多的抗血小板制剂作为抑制血栓生成的潜在目标进行了临床发明的研究。有一些制剂，如阿司匹林和潘生丁等已经被作为预防性抗血栓制剂在使用，而另外一些则正在进行临床实验。迄今为止，强有力的制剂，如disintegins、氯苄噻哌啶和它们的类似物等都具有明显的副作用，而比较温和的制剂如阿司匹林等，虽然有一定作用，但效果有限[Hass,W.K.,et al.,N.Engl.J.Med.,321:501-507,(1989)；Weber,M.A.J.,et al.,Am.J.Cardiol.,66:1461-1468(1990)；Lekstrom,J.A.,Bell,W.R.Medicine,70:161-177(1991)]。虽然近来有一些新消息，比如，新药如ReoPro(7E3)的临床效果另人注目，但是，最近的临床实验的成功性方面有了一定的问题，因为发现的事实是，这些制剂都伴有大出血的危险性的增加，有时甚至需要进行输血(The EPICInvestigators(1994)New.Engl.J.Med.,330:956-961)。因此，显然的是，理想的“效益/危险”比率(在此就是相对阿司匹林而改善了的效率与引起非正常出血的倾向之间的比率)还没有达到。
最近对更为有力和有选择性的抑制血小板凝集的化合物的研究建议出它们的更为有效的抗血栓效果。有一些研究认为，ADP这种常规的促效药在动脉血栓生成中起着关键的引发和推动作用[Bernat,A.,et al.,Thromb.Haemost.,70:812-126(1993)；Maffrand,J.P.,et al.,Thromb.Haemostas,59:225-230(1988)；Herbert,J.M.,et al.,Arteriosclerosis and Thrombosis,13:1171-1179(1993)]。因此，对ADP引发的血小板凝集的有力抑制物将是在寻找抗血栓制剂中特别有意义的。已经知道了一段时间的是，二腺苷5’,5-P1,p4-四磷酸(AP4A)是ADP引发的血小板凝集的竞争抑制剂[Zamecnik,P.C.,et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,89:2370-2373(1992)；Harrison,M.J.,et al.,FEBS Lett.,54(1):57-60(1975)；Luthje,J.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,118:704-709(1984)；Chao,F.C.,et al.,Hoppe Seyler’s Z Physiol.Chem.,365:610(1984)]。
二核苷AP4A是生物细胞的普遍存在的成分[Zamecnik,P.C.and Stephenson,M.L.,Regulatory mechanisms for protein synthesis,In:Mammalian Cells,San Pietro,A.,Lamborg,M.R.and Kenney,P.C.(eds),Academic Press,New York,pp.3-16(1967)]。AP4A在正常人的血小板中的浓度高于在其它的细胞成分[Flodgaard,M.and Klenow,M.,Biochemical Journal 208:737-742(1983)]。被储存的AP4A被认为是对代谢为惰性的，因为用3H-腺苷培养血小板得到的是ATP而不是AP4A。用凝血酶处理血小板引起对AP4A的完全释放并伴随着其它被储藏的核苷群的释放，包括ADP和二核苷，二核苷5’,5-P1,p3-三磷酸(AP3A)[Luthje,J.andOglivie,A.,Biochem.Biophys.Res.Comm.115:252-260(1983)]。AP3A在血浆中被水解为AMP(腺苷一磷酸)和ADP(腺苷二磷酸)；AP4A被降解为AMP和ATP(腺苷三磷酸)[Luthje,J.and Oglivie,A.,European Journal of Biochemistry,149:119-127(1985)]。
AP4A的准确的生理学作用还没有被定义清楚，但是，它是与多种细胞代谢现象相关的[Zamecnik,P.,Annals.ofBiochemistry 134:1-10(1983)]。AP4A在血小板中不寻常的高浓度已经引起了它是在血小板生理学中起作用的推测。经过刺激而发生凝集的血小板在释放储存在密集颗粒中的内源性ADP后表现了凝集的第二阶段。体外实验已经证明AP4A竞争抑制ADP引发的血小板凝集，引起凝集的血小板的迅速分散，甚至在凝集已经达到60％时仍然如此[Chao F.C.and Zamecnik,P.,HoppeSeyler’s Z.Physiol.Chem.365:610(1984)]。相反，AP3A引起血小板的逐渐凝集，很可能是通过它的降解产物ADP来完成的。AP3A的凝集活性在加入AP4A时立即被反转[Luthje,J.andOglivie,A.,Biochem.Biophys.Res.Comm.118:704-709(1984)]。
虽然对形成血栓的过程还没有彻底搞清楚，但是，已经鉴定出来了两个主要阶段在动脉血管壁愈伤位置的血小板凝集，以及将发生的凝块结合在一起的交联蛋白聚合体的生成。
1991年9月17日授予P.C.Zamecnik的美国专利第5,049,550号(此后称为Zamecnik’550)描述了使用AP4A和其类似物作为抗血栓制剂在例如防止冠状动脉和脑血管的血栓栓塞的发生中的应用，以及防止血栓形成于血液透析动静脉旁路。该Zamecnik’550专利还描述了依赖于抑制血小板凝集的防止血栓生成的方法，以及仅含有AP4A类似物的相关组合物，或者该组合物中还含有溶解血栓制剂。特别是，该Zamecnik’550专利报道了多种AP4A类似物对ADP引发的血小板凝集的抑制性效果(ID50)，作为对这些制剂的抗血栓效果的测量。对在p2,p3位置之间具有P-C-P桥的AP4A二磷酸类似物用氟替换氯，没有看到该类似物在ADP引发的血小板凝集检测中的抑制活性有明显的改善。本发明的概述本发明的基础是发现了P1,p4-二硫-p2,p3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,p4-四磷酸(另外可以称为“硫代-CHCl-AP4A”或“ApspCHClppsA”)具有比在该篇专利中揭示的其它的AP4A类似物更为有力的抑制ADP引发的血小板凝集的效果。相应地，本发明涉及含有ApspCHClppsA的组合物，以及将该组合物应用在冠状动脉和脑血管血栓的生成、血液透析动静脉旁路和防止血栓发生中。本发明进一步涉及含有ApspCHClppsA组合物的医药使用，除了仅含有该成分外，还可以含有抗血栓制剂。
根据本发明，还揭示了含有ApspCHClppsA的组合物。在具体优选的实施方案中，存在有效抗血栓剂量的ApspCHClppsA、医药上可以接受的载体。一般，有效抗血栓剂量是可以抑制血小板凝集的剂量。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药用组合物。该组合物含有ApspCHClppsA和医药上可接受的载体。在具体的优选的实施方案中，药用组合物中含有可以调节哺乳动物抗血栓效应剂量的ApspCHClppsA。因此，在优选的实施方案中，药用组合物的配制是让其含有用于哺乳动物的预先选定数量(例如，一次给药量)的ApspCHClppsA。
根据本发明的另一个方面，揭示了一种含有ApspCHClppsA和溶解血栓数量的至少一种溶解血栓制剂的药用组合物。优选的是，在该组合物中含有的ApspCHClppsA是有效抗血栓形成剂量。更优选的是，溶解血栓的制剂选自组织血纤维蛋白溶酶原激活子、链激酶和尿激酶。
本发明还揭示了对那些需要进行溶解血栓调控的哺乳动物进行这种调控的方法。该方法包括想哺乳动物提供含有对调控溶解血栓为有效剂量的ApspCHClppsA的药用组合物。在一个实施方案中，该调控溶解血栓的方法包括在哺乳动物中将血栓溶解掉。调控溶解血栓的有效剂量的ApspCHClppsA是其有效的抗血栓形成的剂量。优选地，ApspCHClppsA是与有效溶解血栓剂量的溶解血栓制剂一起提供给哺乳动物。优选的溶解血栓制剂选自组织血纤维蛋白溶酶原激活子、链激酶和尿激酶。就象本领域技术人员可以立即明白的那样，ApspCHClppsA可以与有效溶解血栓剂量的溶解血栓制剂同时或分带提供给哺乳动物。
根据本发明的另一个方面，调控哺乳动物溶解血栓效果的方法包括抑制血栓在哺乳动物中的生长。有效抑制血栓生长剂量的ApspCHClppsA是有效抑制血小板凝集的剂量或有效的抗血栓形成的剂量。
根据本发明的另一个方面，调控哺乳动物溶解血栓效应的方法包括降低(如防止)血栓在哺乳动物中的形成。通过向哺乳动物提供有效抗血栓形成的ApspCHClppsA或提供有效抑制血小板凝集剂量的ApspCHClppsA，可以降低血栓在哺乳动物中的形成。ApspCHClppsA。
根据本发明的另一个调控哺乳动物中溶解血栓效应方法的实施方案，是将有效抑制血小板凝集的剂量的ApspCHClppsA提供给哺乳动物，从而在活体中抑制血小板凝集。
本发明的这些和其它的目的、优点和应用等，都将在参照发明详述和优选的实施方案后更为明了。
在本文中引用的专利或专利公开文本都通过引述而全部合并于本文。本发明的详细叙述本发明的主题涉及使用ApspCHClppsA作为抗血栓形成制剂。本发明的基础是发现了向哺乳动物提供Ap2pCHClpp3A可以抑制血小板凝集，而且认为其可以降低血栓的发生。令人惊奇的是，ApspCHClppsA在体外对血小板凝集的抑制活性比天然的AP4A的活性高若干个数量级，而且比已知的AP4A类似物(例如，在Zamecnik’550中揭示的化合物E13，它与ApspCHClppsA的不同之处是在亚甲基桥上发生了氟对氯的替代)明显强大。ApspCHClppsA具有比它自身的非硫代形式(例如，在Zamecnik’550中揭示的化合物E10，以及本说明书后面的实施例中的描述的)更为显著有效的抑制血小板凝集的活性。这种血小板凝集的抑制活性无法从与AP4A或已知的AP4A类似物(其结构在下面给出)的结构相似性中预测到的。例如，Zamecnik’550的表3揭示了AppCHClppA(化合物E10)的抑制活性(ID50值)是3μM,AppCHFppA(化合物E5)的ID50值是4μM。因此，对于这些AP4A类似物，氟对氯的替代并没有明显地影响其对ADP引发的血小板凝集的抑制活性。根据这些结果，本领域的技术人员将不会期望得到本发明的与现有技术AP4A类似物相比的显著改善的抑制活性。
天然的AP4A具有如下的通式(通式Ⅰ)
Zamecnik’550的E5(简写为AppCHFppA)具有如下的通式
Zamecnik’550的E10(简写为AppCHClppA)具有如下的通式
Zamecnik’550的E13(简写为ApspCHClppsA)具有如下的通式
最新揭示的AP4A类似物，ApspCHClppsA具有如下的通式
当把AP4A提供给哺乳动物时，它显示出对ADP引发的血小板凝集的显著抑制。在凝集发生之前或之中加入外源性AP4A，减弱了第二波的反应，并且引起凝集的血小板的迅速分散。抑制程度表现为与加入的外源性AP4A的剂量有直接相关性。因为血小板的凝块形成动脉血栓，所以，优选的防止血栓发生的治疗策略是使用干扰血小板彼此间的粘合以及在血管壁上的粘合的治疗制剂(例如，AP4A)。因此，在本发明的一个实施方案中，ApspCHClppsA被提供给哺乳动物来调控溶解血栓的效果，例如，防止或抑制栓塞。
在本文中，术语“调控溶解血栓效应”指的是防止或降低在哺乳动物中血栓形成的现象，例如，在没有提供硫代-CHCl-AP4A的情况下的形成血栓的可能性和与血栓形成有关的生长等的统计学上的降低。例如，在哺乳动物中调控溶解血栓效应包括1)促进血栓在哺乳动物中的溶解；2)抑制血栓在哺乳动物中的生长；3)降低(如防止)血栓在哺乳动物中的生成；以及4)抑制在哺乳动物中发生的血小板凝集(例如，在需要降低血栓形成的可能性的时候进行预防性处理)。
AP4A在兔血中的半存留期比较短，在体内和体外都是如此(血小板得自于接受了AP4A的对象的血液)。对照体内的消除，体外的AP4A的消失就相对长很多。对此的解释可以是因为使用了含柠檬酸盐的血液，其已经显示了对负责AP4A降解代谢的依赖于金属离子的水解酶的抑制[Luthje,J.and Ogilvie,A.,European J.Bio.Chem.149:119-127(1995)]，并且与观察到的向正常血浆中加入的90％32p-标记的AP4A在37℃培养10分钟后完全消失的现象吻合[Kim et al.,Blood 66:735-737(1995)]。在刺激血小板发生释放现象中从浓密颗粒中释放的相对高浓度的内源性血小板AP4A对于调控血小板凝集的分散可能是重要的。因此，如同在美国专利第5,049,550(Zamecnik’550)中所揭示的那样，通过提供外源性AP4A来维持高循环水平的AP4A可以获得抗血栓生成效应。这就建议AP4A或其类似物，如ApspCHClppsA，可以作为临床的抗血小板或抗血栓形成制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了对需要进行溶解血栓效应进行调控的哺乳动物的调控溶解血栓效应的方法。该调控溶解血栓效应的方法包括给哺乳动物提供包含有效调控溶解血栓效应剂量的ApspCHClppsA的药用组合物。在本文中，调控溶解血栓效应包括促进血栓在哺乳动物中的溶解，抑制血栓在哺乳动物中的生长，降低(如防止)血栓的生成，以及抑制发生的血小板凝集(在已经有血栓或还没有血栓的情况下都是如此)。
一般而言，ApspCHClppsA可以通过腹膜内、肌肉内、口服、肠胃道、皮下、或缓释胶囊等形式给药。然而，优选的给药方式是静脉内注射。ApspCHClppsA可以在任何适当的位置给到哺乳动物的血液中，虽然加入在被怀疑或已知血栓位置附近或其上游方更好。调控溶解血栓效应的有效剂量的ApspCHClppsA是可以在被处理的哺乳动物中调控具体溶解血栓效应的剂量。例如，当调控溶解血栓效应的方法是促进哺乳动物中血栓溶解时，则调控这种溶解血栓效应的有效剂量ApspCHClppsA就是有效的抗血栓形成的剂量，即与抗血栓生成制剂一起使用时可以促进已经存在的血栓发生溶解的剂量。优选地，有效的抗血栓生成剂量是每公斤体重为约5-25毫克。更优选地，抗血栓生成剂量为每公斤体重约10-15毫克。
当调控溶解血栓效应的方法是要抑制哺乳动物中血栓的生长的时候，有效剂量的ApspCHClppsA是在体内可以有效抑制血小板凝集的ApspCHClppsA剂量(每公斤体重每天5-25毫克，更优选每公斤体重每天10-15毫克)。一般而言，在体内可以有效地抑制血小板凝集的剂量是每公斤体重约5-25毫克，更优选每公斤体重约10-15毫克。
当调控溶解血栓效应的方法是要降低哺乳动物中血栓的生成的时候(例如，通过降低体内血小板凝集)，则要达到这个目的所需要的有效剂量ApspCHClppsA是抑制体内血小板凝集并进而降低(如防止)哺乳动物中发生血栓的剂量。当调控溶解血栓效应的方法是要抑制哺乳动物中血小板凝集的时候(不论是否已经有血栓存在)，则ApspCHClppsA的有效剂量是与在体内抑制血小板凝集所需要的ApspCHClppsA剂量相似的剂量。
在为了获得上述效果的具体情况下，所给药的实际ApspCHClppsA数量将依赖于所使用的组合物的配方、给药方式、患者的临床特征等而变化。但是，一般而言，ApspCHClppsA的剂量是每天每公斤体重约10微克-10毫克。
如上所述，在体内有效抑制血小板凝集的有效剂量是与抑制血栓形成的剂量近似的剂量(有效抗血栓生成剂量)。但是，在体内发生的血管内阻塞(血栓形成)是复杂过程的结果，该过程涉及病理-生理学现象，包括例如，1)在血小板粘合到受伤的血管壁上之后，血小板的活化、凝集、凝固系统的活化(血栓的产生)；2)由受伤的血管释放组织凝固因子(通过外部的凝固通道产生血栓)；3)由受伤的血管释放组织血纤维蛋白溶酶原活化子(产生纤维蛋白溶酶)；4)抗血栓活性(与正常的生理学活性相关)；以及5)提高血小板与内皮下组织的相互作用并由血流冲走疏松的凝块。
血栓生成中会发生上述现象，虽然它们有些是促进血栓的形成，而另一些又是防止凝块的生成的。因此，在优选的实施方案中，ApspCHClppsA是与抗血栓制剂一起给药的，例如，同最常见的抗血栓制剂肝素一起给药。
注射ApspCHClppsA时可以加入药理学可接受的载体，还可以同其它的药物一起给药(例如，抗血栓制剂)。药理学可接受的载体是那些溶解ApspCHClppsA或将其保持在悬浮液中并且与生理条件相容的载体。药理学可接受的载体的实例包括，盐或非离子化合物的水溶液，例如，氯化钠或葡萄糖，一般为等渗浓度。虽然可以有其它的药物与ApspCHClppsA一起存在于溶液中，但重要的是这些另外的药物不能够干扰ApspCHClppsA在体内抑制血小板凝集的活性。本领域的技术人员都知道，或者通过常规实验就可以知道是否某中与ApspCHClppsA共存于溶液中的药物会干扰ApspCHClppsA在体内抑制血小板凝集的活性。用于调控溶解血栓效应的组合物可用于处理哺乳动物，例如但不限于，人、家畜、牲畜等。
根据本发明的优选的实施方案，一种调控哺乳动物溶解血栓效应的方法包括，促进在哺乳动物中溶解血栓或防止其延伸。优选地，溶解血栓的方法包括给哺乳动物提供有效抗血栓形成剂量的ApspCHClppsA并伴随有效溶解血栓剂量的溶解血栓制剂。在本文中，术语“溶解血栓制剂”指的是把血栓溶解或使其分离的制剂。血栓指的是在心血管系统中由血液成分形成的凝块，它们可以是闭塞性的，或是粘合在血管壁或心脏壁上但又没有完全堵塞通道的。因此，有效的溶解血栓剂量的溶解血栓制剂是可以在体内溶解凝块剂量。本领域的技术人员都知道，或通过常规实验就可以知道ApspCHClppsA的抗血栓生成有效剂量以及溶解血栓制剂的有效剂量。在具体的优选实施方案中，溶解血栓制剂选自组织血纤维蛋白溶酶原活化子、链激酶和尿激酶。
ApspCHClppsA可以同抗血栓制剂对哺乳动物共同给药。在本文中，术语“共同给药”包括1)将ApspCHClppsA与抗血栓制剂一同给药；2)在给药抗血栓制剂之前或之后的短时间内给药ApspCHClppsA。这种方式的ApspCHClppsA给药就可以将经过抗血栓制剂的作用后从凝血块上释放下来的血小板被分散和/或防止它们的再次凝集。由于ApspCHClppsA在血栓形成的早期发生作用，因此，它按照如上所述的方式同一种或一种以上的凝块溶解制剂一起使用时效果会更好。
根据本发明的另一个实施方案，调控溶解血栓效应的方法包括抑制在哺乳动物中已经存在的血栓的生长。在这个实施方案中，给药的有效剂量的ApspCHClppsA是在体内有效抑制血小板凝集的剂量(“有效”抗血栓形成剂量)。虽然本申请人并不将本发明限制于某一种具体的机制，但据信的是，对血栓生长的抑制是通过防止在已经存在的血栓的外周进一步凝集血小板而实现的。
根据本发明的另一个实施方案，调控溶解血栓效应的方法包括降低在哺乳动物中血栓的形成。据信，提供ApspCHClppsA抑制哺乳动物的血栓形成是通过防止体内血小板凝集而达到的。相应地，在哺乳动物中降低(如防止)血栓形成的ApspCHClppsA有效剂量是在体内抑制血小板凝集的有效剂量。因此，ApspCHClppsA在冠状动脉和脑血管中防止血栓形成方面是很有用的。由于血栓主要发生在动脉系统中，所以，优选的ApspCHClppsA的用途是对那些具有发生心脏或大脑血栓高度危险的患者的治疗。此外，ApspCHClppsA还可以用于血液透析中，此时患者被与人造肾脏机连接在一起，用ApspCHClppsA可以防止动脉旁路的血栓。进一步，据信的是，当以抑制血小板凝集的剂量给药ApspCHClppsA时，它还可以作为辅助预防制剂来防止心肌梗塞和/或中风后的复发。因而，一般而言，预防性应用ApspCHClppsA的有效剂量是与上述的在已经发生了血栓的位点体内防止血小板凝集的用量相等。
使用ApspCHClppsA调控上述溶解血栓的应用还得到了已经建立了的体内天然AP4A分子应用的支持。例如，AP4A已经表现出在哺乳动物中显著地抑制ADP引发的血小板凝集。在凝集之前或之中加入外源性AP4A引起凝集的血小板的迅速的分散，其程度足以表明与使用的AP4A剂量有直接的相关性。因为血小板凝块形成动脉血栓，优选的防止血栓发生的治疗策略是与上述的给哺乳动物提供ApspCHClppsA来干扰体内血小板相互之间的粘合的策略相同。因此，使用ApspCHClppsA在体内调控溶解血栓的基础是天然的父代分子AP4A和类似物AppCHClppA在临床给药于哺乳动物时抑制血栓形成的科学肯定性。
令人惊奇的是，与天然的AP4A或已经揭示过的类似物相比较，ApspCHClppsA提供的了更好的对血小板凝集的抑制特性。这些效果是无法预见的，而且是无法根据与天然AP4A分子类似物的结构相似性来预测的。ApspCHClppsA与已知的AP4A分子类似物在抑制活性上面的显著差别在下面的实施例中说明，这些实施例不在任何方面对本发明进行限制。实施例除非另有所述，实验程序都是按照美国专利第5,049,550号(Zamecnik’550)提供的程序进行的。该篇专利通过在此引述而全部合并于本文。同时还提供了一些替换程序(例如，释放反应，PF3检测)和其它的一些研究(例如，细胞质钙的运送，纤维蛋白原的结合位点，ADP以外的促效药，血小板cAMP和CHCl-AP4A在血液成分中的分布等)。血液收集在0.1体积的3.8％柠檬酸钠中，血液来自于健康的志愿者，并且他们都经过至少10天的抗血小板制剂的隔离。富含血小板的血浆(PRP)通过梯度离心分离得到，并且被调整到每毫升血浆中含有3.3×108个血小板。除非另外说明，各实施例中都使用富含血小板的血浆。
在本文中，P1,p4-二硫-p2,p3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,P4-四磷酸也称为“硫代-CHCl-AP4A或APsPCHClppsA”。
实施例1---合成ApspCHClppsA在英国谢菲尔得大学的M.Blackburn教授的实验室中进行了ApspCHClppsA的合成，合成分两步。第一，(pα)-二硫代-类似物的制备是，对腺苷5’-硫代一磷酸用二苯基磷酸氯活化，然后用一氯亚甲基二磷酸[Blackburn,G.M.et al.Nucl.Acids Res.15:6991-7004,(1987)]对腺苷5’-硫代一磷酸进行浓缩。还可以参见G.M.Blackburn等人所著“Synthetic Structural Analogues ofDinucleoside Polyphosphates”一书的第11章，以及AP4A and OtherDinucleoside Polyphosphates,ed.A.McLennan,CRC Press Inc.(1992)。经过DEAE琼脂糖色谱后确定其产物用31PNMR鉴定的纯度为99％。使用反相HPLC进行分析纯化后得到纯度为99％的材料和四种立体异构体，即ApspCHClppsA,ApspCHClppA,AppCHClppsA和AppCHClppA。没有进行对这些异构体的进一步提纯。
实施例2---ApsCHClppsA的特征结果Ⅰ、硫代-CHCl-AP4A对ADP引发的血小板凝集的抑制强度开始的筛选是针对几种制剂(包括硫代-CHCl-AP4A并以CHCl-AP4A作为参考)对ADP引发的血小板凝集的抑制效应进行的。根据Born(J.Physiol.162:67,1962)的方法，使用集合度计(Chrono-log,Model 530 VS)用富含血小板的血浆测定血小板凝集。对存在或不存在5μM制剂的条件用5μM的ADP引发血小板凝集。按照已经存在的程序[P.Zamecnik et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA89:2370-2373(1992)]进行剂量依赖性检测，来研究每一种制剂的IC50值。结果列于表1。CHCl-AP4A(对照制剂)的IC50值与以前报道过的数值相一致[P.Zamecnik et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89:2370-2373(1992)]。硫代-CHCl-AP4A在所有的受试制剂中显示出最低的数值(0.81μM)，表示最高的抑制强度。当硫代-CHCl-AP4A的两个腺苷都被脱氧腺苷取代后(硫代-CHCl-dAP4dA)，则其抑制强度就明显降低(9.22μM)。相似地，用脱氧腺苷取代非硫代磷酸化合物(CHCl-dAP4dA)，结果是彻底地丧失了抑制效果(＞100μM)。按照以前对CHCl-AP4A的方式进行对硫代-CHCl-AP4A的动力学研究[P.Zamecnik et al.,PNAS(USA)89:2370-2373(1992)]。硫代-CHCl-AP4A的抑制常数(Ki)是0.33μM，表现出的竞争抑制指示其与参照制剂CHCl-AP4A(1.1μM)的性质相同，但是，具有更强的抑制力。
表1
Ⅱ、硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A对凝集以外的其它的血小板反应血小板对促效剂的反应除了凝集以外还包括a)释放反应，b)纤维蛋白原受体位点(GPⅡb/Ⅲa)，以及c)血小板因子3的活化。硫代-CHCl-AP4A和参照制剂(CHCl-AP4A,Zamecnik’550的化合物E10)分别对这些反应进行检验。
a)血小板释放反应硫代-CHCl-AP4A和参照制剂对ADP引发和胶原引发的血小板凝集的抑制效应，以及释放反应都在光集合度计上测定。正常的人PRP从柠檬酸钠(0.38％)抗凝集的血液中分离出来。用5μM的ADP或1μg胶原/ml引发血小板凝集和释放反应。光集合度计的配置按照检测血小板凝集和ATP的萤虫素酶反应来安装，同时检测a)没有制剂(对照)；和b)有各种浓度的硫代-CHCl-AP4A或CHCl-AP4A存在的情况。被促效剂活化的血小板释放的ATP数量代表了释放反应。萤虫素酶反应中萤虫素产生的光与释放的ATP数量是线性的关系。
结果列于表2中。一般而言，对释放反应的抑制效果的IC50都低于凝集，这表明制剂(硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A)对释放反应的抑制效果超过这些制剂对凝集的效果。胶原引发的凝集没有被CHCl-AP4A抑制，但是，释放反应被CHCl-AP4A抑制。
表2促效剂 检测CHCl-AP4A硫代-CHCl-AP4A(μM)(μM)ADP凝集 14 1.6ADP释放 4.5 0.7胶原凝集 ＞100 9.0胶原释放 35.0 1.7b)血小板上的纤维蛋白原结合位点(GPⅡb/Ⅲa)已经知道血小板表面上纤维蛋白原受体可以被活化提高。硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A对活化的血小板的纤维蛋白原受体位点的效应通过荧光素异硫代氰酸盐共轭抗纤维蛋白原抗体(FITC-抗-fgn)技术在流动细胞计(FACS,Becton-Dickinson)来检测。PRP的最终应用浓度是1∶20。在有或没有制剂的条件下以22℃温度和5分钟时间和ADP来活化血小板。对活化的血小板用FITC-抗-Fgn在22℃培养10分钟，加入0.5ml的0.2％的甲酰盐水(0.2％甲醛在0.9％NaCl中)来抑制进一步的活化。样品包括的血小板是a)未被刺激的；b)用5μM的ADP刺激的；c)在用ADP刺激之前暴露于制剂(CHCl-AP4A或硫代-CHCl-AP4A)5分钟的。结合在ADP活化的血小板上的纤维蛋白原，与参照制剂(CHCl-AP4A)相比由硫代-CHCl-AP4A优先抑制。
表3
c)血小板因子3(PF3)的活化血小板的PF3的活性被ADP刺激并且用蛇毒凝集时间测定[P.Zamecnik et al.,PNAS(USA)89:2370-2373(1992)]。表4总结了这些制剂对ADP刺激的PF3的效应的结果。每一个数据代表两次实验的平均值。在37℃对新鲜的人的富含血小板的血浆(3×108血小板/ml)在有或没有制剂(10μM)存在的条件下预培养5分钟，然后检测被10μM的ADP刺激的血小板的PF3的活性。硫代-CHCl-AP4A比非硫代的参照制剂(CHCl-AP4A)的抑制效应显著地强大。
表4
Ⅲ、硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A对ADP引发的血小板活化中的调节因子的影响已知在血小板活化的过程中有三种调节因子a)细胞质钙离子运送；b)细胞cAMP水平的改变；以及c)花生四烯酸代谢活性。制剂(硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A)对前两种因子的实验结果描述于下面。
a)细胞质钙离子(Ca++)的运送血小板中Ca++的每一层次的分别代表一种活化水平。吲哚-1乙酰甲基酯(吲哚-1)一般都被用做检测细胞内游离Ca++离子的试剂。吲哚-1与Ca++反应并产生荧光，可以通过双波长(408/485)流式细胞光度计(CoulterEPIC Systems)监视到。用吲哚-1在37℃对血小板培养45分钟。用凝胶过滤法将多余的吲哚-1从培养基中去除。然后，对带有吲哚-1的血小板用6.7μM的ADP在有或没有硫代-CHCl-AP4A(3.3μM)或CHCl-AP4A(6.7μM)存在的条件下活化。监视血小板的荧光强度并对血小板数目作图。对由该图得到的直方图进行分析。没有被刺激的血小板的荧光强度(FI)在42-250之间，峰值在133(基线对照)。用2μM的A23187(钙电离层)处理的血小板明显地向右漂移(FI在150-1000之间，且峰值在530)代表了正对照。ADP活化的血小板具有中等程度的向右的漂移(FI在67-300之间，峰值在158)。ADP对Ca++运送的活化效应相比钙电离层来说是温和的，并且在有硫代-CHCl-AP4A或CHCl-AP4A存在时被完全封闭，例如，ADP活化的血小板在有抑制剂时的表现与没有活化的血小板一样。
b)细胞内cAMP水平的改变cAMP对血小板凝集的抑制效应已知是钙离子运送的相对反应。因此，测试制剂对cAMP调控机制的抑制效应。PRP与盐水(对照)、制剂(20μM和100μM)、或forskolin(10μM)在37℃培养5分钟。培养后，用Ba(OH)2和ZnSO4提取。在提取物中的环AMP被转换为亚乙烯基-cAMP衍生物，并用荧光检测计以HPLC测定其水平[W.Wojcik et a1.,J.Cyclic Nucleotide Res.7:27-35(1981)]。在未知的提取物中的cAMP根据标准图推算出来。观察到了在提取的样品中cAMP水平与荧光检测的线性关系。表5给出了这些制剂对血小板cAMP水平的影响结果。硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A都没有表现出在20μM时对cAMP水平的影响，但在更高浓度(100μM)时表现了中等程度的对血小板cAMP水平的提高。但是，这个提高也许不是特异性效果。虽然没有检测到在实验AP4A制剂中腺苷的污染，但是，可能的是细胞内腺苷核苷酸代谢产物或测试制剂中污染的腺苷对cAMP水平的提高负有责任。10μM的forskolin这种强有力的腺苷酸环化酶刺激子显著地提高了cAMP的水平，被显示为正对照。这些结果建议制剂抑制ADP对血小板的活化效应也许不遵循cAPM调控的机制。
表5
Ⅳ、硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A对除ADP以外的其它的促效剂引发的血小板凝集的效应释放反应表现为血小板活化后的独特的反应。ADP同其它的血小板成分一样，表现为在提高活化中的重要作用。我们研究了其它的促效剂引发的血小板凝集中ADP的作用，这些促效剂包括花生四烯酸、胶原、肾上腺素、凝血酶、和瑞斯托菌素等。由给定浓度的促效剂引发的血小板凝集力在没有制剂的时候为大约60-80％。以不同浓度的硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A进行剂量依赖的抑制研究来估算IC50值。硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A都不影响凝血酶或瑞斯托菌素引发的血小板凝集。对其它的三种促效剂的抑制强度(IC50)值总结于表6中。虽然胶原引发的凝集好象不受CHCl-AP4A的影响，但硫代-CHCl-AP4A却产生了可以检测到的抑制效应。这些结果建议由花生四烯酸、胶原、和肾上腺素引发的血小板凝集的至少50％是依赖于开始血小板活化释放出来的ADP的。这个发现支持上述的制剂对释放反应的抑制效应的观察结果。
表6
Ⅴ、先对硫代CHCl-AP4A和CHCl-AP4A暴露后的血小板的凝集能力血小板具有嘌呤受体(purinoceptor)(P2T)，这是在血小板表面上的一种ADP特异性结合位点。我们相信，AP4A类似物的抑制机制涉及与ADP竞争血小板嘌呤受体。为了检测结合的制剂的稳定性和抑制效应，在22℃将用ACD溶液抗凝固的富含血小板的血浆与25μM硫代-CHCl-AP4A或50μM的CHCl-AP4A预培养30分钟。用凝胶柱过滤(2×108细胞/ml)或离心(3×108细胞/ml)分离出来的血小板重悬浮于不含抑制剂的血浆中，并检测ADP引发的凝集力。对凝胶过滤的实验数据是三次实验的平均值，对离心分离的数据是两次实验数据的平均值。表7给出了这些实验的结果。暴露于硫代-CHCl-AP4A的血小板显示了对接触ADP(22-33％)后凝集力的中度抑制，而接触CHCl-AP4A的血小板则仅仅有轻微的抑制效应(8％)。这些结果建议与血小板结合的AP4A类似物的抑制效应是可逆的。
表7
Ⅵ、硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A对ADP引发的凝集的时间依赖性效应为了进行功能性检测来观察制剂的稳定性，将PRP用2.5μM硫代-CHCl-AP4A或5μM的CHCl-AP4A在37℃培养3小时。在这些实验中使用的抑制剂浓度比较低，特别对硫代的化合物更是如此。按照给定时间采取的样品进行ADP(10μM)引发的凝集测试。结果列于表8中。硫代-CHCl-AP4A的抑制效应可以持续3小时，而CHCl-AP4A的效应则随着培养时间逐渐降低。这些结果建议，当在37℃下将CHCl-AP4A与PRP一起保持的时间超过60分钟后，CHCl-AP4A就变得不稳定，而硫代-CHCl-AP4A则在至少3小时的期间内很稳定。在与全血一起培养的类似实验中，硫代-CHCl-AP4A也显示了类似的稳定性。
表8
硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A的热稳定性将这两种制剂加热至沸腾温度。在第5、15、和30分钟采取样品。用HPLC检测这些制剂对血小板凝集的抑制效应和它们自身的整体性，没有发现变化，表明这两种制剂可以耐受加热处理达30分钟。Ⅷ、硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A在全血中的稳定性为了检测制剂的分子稳定性，将血与每种制剂在37℃培养4小时。在规定的培养时间采样，提取后，对硫代-CHCl-AP4A或CHCl-AP4A用HPLC检测(Waters 600E泵和控制器)，使用了季铵盐阴离子交换柱(Whatman Partisil10)和分析(Beckman SystemGold)。保留时间对硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A分别为5.95分钟和3.39分钟。合并峰值区域，建立浓度范围的标准曲线(1、2、4、6、8、和10μM)。硫代-CHCl-AP4A和CHCl-AP4A都是纯净的，在HPLC上显示的是单峰，试剂浓度与HPLC峰值区域之间是线性关系。用0.38％柠檬酸钠抗凝固的正常人血在有250μM硫代-CHCl-AP4A或CHCl-AP4A存在的情况下于37℃培养4小时。用3％高氯酸提取血样，然后用K2CO3中和。将提取物保存在-80℃直至用于HPLC检测。血样提取物的结果列于表9。表9中的数值是两个实验结果的平均值，表达为nmol/ml血。我们从含有硫代-CHCl-AP4A或CHCl-AP4A的血提取物中发现了两个峰值(主峰和次峰)。总提取效率对CHCl-AP4A在60分钟时为110％，对硫代-CHCl-AP4A在120分钟时为85％。对CHCl-AP4A的高提取效率建议血中的腺苷化合物(可能是腺苷和AMP)可能对主峰有贡献。对CHCl-AP4A主峰的估计值表明有缓慢的降解发生，在4小时后为30％降解。至少80％的降解产物，很可能是氯亚甲基一腺苷三磷酸(AppCp)与次峰(X1)有关。在硫代-CHCl-AP4A情况下的0时间的提取效率相对比较差(69％)，随后有所改善(81-85％)，而且在60分钟后，样品之间的情况更为接近。数据表明，一般情况下，硫代衍生物在37℃下于血液中非常稳定至少4小时。在硫代-CHCl-AP4A情况中的血提取物所出现的次峰可能是异构体(X2)，例如，单硫化合物(ApspCppA或AppCppsA)。用HPLC没有检测到纯净的这些化合物，但是，在0时间的血提取物中记录到一小部分(＜10％)，随后在主峰处为约20％。
表9
Ⅸ、125I标记的CHCl-AP4A在血液成分中的分布血小板具有P2T嘌呤受体，这是对ADP和ATP的特异性的位点[R.G.Humphries et al.,J.Cyclic Nucleotide Res.7:27-35(1981)]。然而，在其它类型的细胞上还有各种不同的嘌呤受体。AP4A类似物也许不仅结合血小板，而且在对全血处理时还与红血球和白血球结合。我们发现这三种血液成分都与CHCl-AP4A相关。在我们的研究中，在37℃对人血用含有痕量125T-CHCl-AP4A的(特异性活性为～35μCi/μMol，由Dr.David Elmaleh,Radiology Department,Massachusetts General Hospital,Boston,MA赠送的)23μM的CHCl-AP4A培养30分钟。用梯度离心分离血小板，将密集的红血球和松散的外层(白血球)进行混合，采用histopaque梯度分离方法[A.Boyum,Scand.J.Clin.Lab.Invest.21(suppl97):77(1968)]分开各成分。对细胞部分清洗两次，并对最终悬浮液计数细胞和放射活性。根据全血的CBC数据计算各个组分的分布。结果(两次测定的平均值)总结于表10。结合位点以每个细胞的数目表达。
表10
所有三种成分都与放射性有关，表明CHCl-AP4A与多种类型的血细胞结合。对细胞类型和分布数据的比较使我们可以计算每个细胞的结合位点的估计值。看起来每个血小板的结合位点数目比红血球多(对数1)，尽管血小板的大小不到红血球的大约十分之一。另一方面，与血小板相比，白血球的每个细胞的结合位点更高(对数2)。这些结果建议细胞单位表面积上的CHCl-AP4A结合位点的数目在白血球、血小板、和红血球中分别为103、102、和101。
实施例3---对硫代-CHCl-AP4A的进一步特征鉴定1、药物代谢学和药物动力学总则在本实施例中使用曾经报道过的兔模型[S.Louie et al.,Thromb.Res.49:557-565(1988)；B.K.Kim et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89:11056-11058(1992)]。本领域的技术人员认为这个兔模型可以预测被检测的试剂在人身上的反应，可以用于选择对人给药的剂量范围。为了防止在手术技术中带来的偏差，由同一个人员对所有的动物进行处理，兔子被随机地分配到实验组和对照组中。
对体重为2-2.5公斤的新西兰白兔注射硫代-CHCl-AP4A，用量为冲击剂量，一次给药或在耳缘静脉连续2小时点滴完成。注射后，按照给定的时间，从耳动脉取血样，并用1/10体积的3.8％柠檬酸钠抗凝固。血样采集之后，立即确定微血管的出血时间[Mielke,C.H.,Thromb.Haemostasis 52:210-211(1984)]。血液的等份试样用高氯酸提取，用于在HPLC上检测试剂。在所有的血样中测定ADP对全血血小板的凝集。这些结果给出了关于有效剂量和有效时间的初步信息。
在进行了一次给药和了连续给药的初步实验后，可以建立硫代-CHCl-AP4A的标准给药程序。在具体方案的给定时间，对颈内动脉导管血栓形成的兔模型中，测试0.5x、1x和2x这三种不同剂量的抗血栓形成效应[S.Louie et al.,Thromb.Res.49:557-565(1988)；B.K.Kim et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89:11056-11058(1992)]。将一定剂量的硫代-CHCl-AP4A配制在10毫升常规生理盐水中，然后用泵以均匀速率给药，或一次给药。对照组的兔子只接受10毫升的生理盐水。对兔子麻醉后，用血管钳分离出一段颈内动脉。插入导管，并在15分钟的时候恢复血流。点滴完成后，或一次注射完成后1小时，移去颈内导管，将其内的物质冲入培养皿中。观察其中的血块和液体血液成分。不同组的颈内导管中发生凝块的现象用卡方检验进行比较。血液硫代-CHCl-AP4A的检测在注射硫代-CHCl-AP4A之前和之后(0、10、20、40、60、和120分钟)，从兔子的另一侧的颈内动脉或耳动脉采集血样。用1/10体积的酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液与血样混合来抗凝固。对血样用高氯酸提取，离心，对酸可溶解的成分用5M的K2CO3中和[S.Louie et al.,Thromb.Res.49:557-565(1988)]。样品储存在-80℃直至用HPLC对核苷酸进行检测。血小板凝集的研究按照实施例1的方法用时间对数全血血小板集合度计(型号530VS)配备记录装置进行对血小板凝集的检测。微血管出血时间的研究采用模拟出血时间装置(Organon Teknika)，对耳朵的背面去除毛发后，在照明条件下仔细选择避开粗血管的位点。在不施加压力的情况下，测定自由流动的出血时间。采用不成对的T检验来比较各组的出血时间。颈内动脉导管血栓形成模型用盐酸开他敏(100mg/kg i.m.)对兔子进行麻醉。用血管钳分离出左侧颈内动脉的一部分。插入1厘米长的聚乙烯管子(1-mm i.d.；intramedic polyethylene tubing PE-90,Clay Adams,Parsippany,NY)，用丝线固定，松开血管钳后，使血流恢复。具体的方案a)对血小板凝集的剂量和时间依赖性效应研究了ADP引发的血小板凝集的一系列四种不同剂量和时间间隔的抑制效应。大约重量为2.5公斤的兔子静脉内注射制剂，一次的剂量为5、10、20、40、和100mg/kg。在注射前采血样，在注射后的30分钟、2小时、6小时、24小时、和48小时(如果需要的话)也采血样。采血样完成后，立即确定微血管的失血时间。对所有血样都进行ADP的全血血小板凝集检测[B.K.Kim et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89:11056-11058(1992)].
结果给出了有效剂量和有效时间间隔。优选地，每个剂量的实验用六只兔子进行，兔子的总数目是24只。
b)抗血栓形成效应根据前面的研究，用0.5x、1x、和2x的三种有效剂量(ED)测验它们在兔子颈内动脉导管血栓形成模型中抗血栓形成的效应[S.Louie et al.,Thromb.Res.49:557-565(1988)；B.K.Kim et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89:11056-11058(1992)]，时间是注射制剂后的各有效时间(ET)x1、x2、x4。优选地，每一个剂量的研究中使用15只兔子，总共需要150只兔子。
c)双盲效率研究根据前面的研究选择有效剂量，并根据前述的方案进行双盲研究。给兔子随机编号，然后注射不含或含有制剂的生理盐水，具体情况不对实验者公开，直到结束实验为止。
每一组(含有或不含有制剂)优选有15只兔子，总数为30只兔子。用卡方检验来比较两组中出现在颈内动脉导管中的血栓现象。
d)制剂的生物分布和清除时间的研究用Dr.David Elmaleh(Radiology Department.Massachussetts General Hospital,Boston,MA)提供的125I标记硫代-CHCl-AP4A，或采用其它的市售标记物。在每组三只兔子的两组中研究125I标记硫代-CHCl-AP4A的生物分布。在兔子耳静脉静脉内注射含在0.2ml生理盐水中的2-5μCi的制剂。注射后的第5、10、20、40、和90分钟从另一只耳朵的动脉采取血样，然后用戊巴比妥(150mg/kg)处死兔子。收集主要器官，如血液、肾脏、肝脏、肺、脾、脑、胸腺、肌肉、和骨骼，以及膀胱内的尿液，并称重。将组织和器官切成小块，称重，然后放入闪烁计数管内检测125I。计算注射的剂量在各个器官的分布。
e)给药方法、途径和频率磷酸二酯形式的AP4A类似物不通过外细胞膜[P.C.Zamecnik and M.L.Stephenson in H.M.Kalckar etal.,eds.,AlfredBenzon Symposium,I,276-291,Munksgaard,Copenhagen(1968)]。但是，最近的研究表明，寡聚脱氧核苷酸的硫化显著地提高了其抗病毒效率[Leiter,J.M.E.,et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA87:3430-3434(1990)；Agrawal,S.,et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:7079-7083(1988)；Zamecnik,P.C.,et al.,In AIDS Res.Reviews Vol I,Koff,W.C.et al.,(Eds)Marcel Dekker,Inc.NY,301-313(1991)；Matsukura,M.In Antisense Res.and Applications；Crooke,S.T.,et al.,(Eds)CRC Press.,NY 505-520(1993)]。这些都向我们建议硫代-CHCl-AP4A可能最适合以消化道给药。
对麻醉的兔子以胃管给药后的血液中制剂的水平被确定。麻醉后，将胃管通过嘴插入并给药选定的剂量。给药后的第10、30、60、120、240、和360分钟分别采集血样。对血样检测全血的血小板凝集[Cardinal,D.C.and Flower,R.J.,J.Pharmacal.Method 3:135-158(1980)]。提取制剂，并用HPLC确定其在血液中的水平。按照需要的频率重复地向哺乳动物给药，维持血液中抗血小板凝集有效水平的制剂量。
优选地，本研究中使用了六只兔子。本实验的结果有助于定义口服途径给药的各种参数。2、制剂的毒性和安全性在按照标准程序成功地进行了上述药理学的研究之后，又进行了动物毒性研究。优选地，选用两种动物如兔子和猪进行毒性研究。这些动物都是已经被证实的毒性实验种类，而且相应的研究可以被有关机构认可。按照标准程序在GLP设施(TSI MasonLaboratories/Genzyme Corp.,Worcester,MA)进行动物毒性实验。一般，急性毒性实验包括两步1)寻找范围的实验，来建立可以耐受的剂量范围；以及2)急性毒性实验，来建立最大的可耐受剂量。急性毒性实验后，进行慢性毒性实验，以几个不同水平的剂量重复地向动物给药来引发功能性和/或形态学的改变(包括进行预期为毒性水平的实验)。进行慢性毒性实验是要发现在那些器官会发生副作用。在这个实验中，对动物监视其身体上的变化，临床行为，体重的增加，对食物和水的消耗等。在可能的情况下，进行眼科学、心血管和其它的生理参数的测定和监视。对所有的主要器官和组织都进行组织病理学检验。
对一种药品的急性毒性实验一般都第一步的对其毒性潜力的评价。急性毒性实验的目标是确定其副作用，如果可能的话，确定一次高剂量给药时对器官的致死性。观察并记录明显的各个剂量水平中出现的中毒现象，如果在一个以上的剂量水平中发生死亡，则计算其平均致死量。
本文中涉及的每一篇专利或专利文献都通过在此引述而全文合并于本文。
应该理解的时，前面的描述和实施例都仅仅是对优选方案的说明性的介绍。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可以有众多的变型和等同物。
权利要求
1．一种组合物，包括P1,P4-二硫-P2,P3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,P4-四磷酸。
2．根据权利要求1的组合物，其中P1,P4-二硫-P2,P3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,P4-四磷酸以有效的抗血栓形成剂量存在，该组合物还进一步包括药学上可接受的载体。
3．根据权利要求1的组合物，其中所述的有效的抗血栓形成剂量是每天每公斤体重1-25毫克。
4．根据权利要求2的组合物，进一步包括溶解血栓剂量的至少一种溶解血栓制剂。
5．根据权利要求4的组合物，其中所述的溶解血栓制剂选自组织纤维蛋白原活化子、链激酶和脲激酶。
6．根据权利要求3的组合物，进一步包括溶解血栓剂量的至少一种溶解血栓制剂。
7．根据权利要求6的组合物，其中所述的溶解血栓制剂选自组织纤维蛋白原活化子、链激酶和脲激酶。
8．一种调控哺乳动物溶解血栓效应的方法，该方法包括向哺乳动物提供含有抗血栓形成有效剂量的P1,P4-二硫-P2,P3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,P4-四磷酸的组合物来调控溶解血栓效应。
9．根据权利要求8的方法，其中所述的抗血栓形成有效剂量是每天每公斤体重1-25毫克。
10．根据权利要求8的方法，其中所述的调控溶解血栓效应包括促进血栓在哺乳动物中的溶解，有效的P1,P4-二硫-P2,P3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,P4-四磷酸调控溶解血栓效应的剂量是有效的抗血栓形成剂量，该方法进一步包括向哺乳动物提供有效溶解血栓剂量的溶解血栓制剂。
11．根据权利要求10的方法，其中所述的溶解血栓制剂选自组织纤维蛋白原活化子、链激酶和脲激酶。
12．根据权利要求8的方法，其中调控溶解血栓效应包括抑制哺乳动物中血小板凝集，有效的P1,P4-二硫-P2,P3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,P4-四磷酸剂量是在活体中有效抑制血小板凝集的剂量。
13．一种药用组合物，包括P1,P4-二硫-P2,P3-一氯亚甲基5’,5-二腺苷P1,P4-四磷酸，以及药学上可接受的载体。
14．根据权利要求13的组合物，其中所述的组合物被制成适合向哺乳动物一次给药的形式。
全文摘要
本发明揭示了P
文档编号C07H21/02GK1220606SQ97195060
公开日1999年6月23日 申请日期1997年5月1日 优先权日1996年5月2日
发明者布洋恩·K·凯姆, 保尔·C·萨梅克尼克, 萨姆·W·陈 申请人:保尔·C·萨梅克尼克, 布洋恩·K·凯姆, 萨姆·W·陈