专利名称：一种从藻类中提取制备脱镁叶绿素甲酯一酸a的方法
技术领域：
本发明属于从藻类中提取叶绿素技术领域。
脱镁叶绿素甲酯一酸A(Pheophorbide a,PhA)
是一种用新的激光化学方法治疗恶性肿瘤的高效光敏化药剂、将PhA静脉注入患者体内，24小时后主要潴留在肿瘤组织，经激光照射肿瘤部位可以杀死肿瘤细胞，而不损坏正常细胞。
目前国际上PhA的制备是采用层析技术从高等绿色植物和蕨类植物中提取叶绿素A(Chla)，然后用酸或酶脱去Chla的叶绿醇尾制得PhA。这些植物中均含有叶绿素B(Chlb)。Chlb的化学结构与Chla仅差一个基团，要得到高纯度的Chla需要大量的试剂进行层析。费时，浪费资金，效益低。
本发明的目的是用不含Chlb的藻类为原料，先将色素去掉，然后萃取得到Chla再通过液相法制备出PhA，脱酸后得到水溶性的PhA。
本发明从藻类中提取PhA，大体经过三个主要步骤1、提取藻类中的色素、把藻类的磨浆用低浓度的盐、碱、酸、醇溶解，然后在高浓度盐溶液中沉淀出色素。
2、提取酯溶液性的叶绿素A、类胡萝卜素、叶黄素等，采用醇、酮、醚、烷烃、苯等溶剂萃取，再经过吸附、层析、萃取可将Chla分离出来。
3、脱镁叶绿素甲酯一酸A的制备稀酸 浓酸叶绿素A——脱镁叶绿素A——脱镁叶绿素甲酯一酸A(Chlorophlla) (Pheophytinea) (Pheophorbide a)本发明提取方法的详细说明如下原料的选取。以紫菜、石花菜、三叉仙菜、角叉菜等红藻、蓝绿藻、黄绿藻为原料。新采集的材料要摘除藻根，洗去泥沙等污物后用清水冲洗，空除水分。中、大形藻体要剪短磨碎；单细胞藻类选用适当网目的筛子过筛后用清水冲洗。干品要水发好后用清水冲洗。
食用色素的提取。将磨碎的原材料浸泡到提取剂浓度在2-60％的提取液中12-24个小时后过滤。分别收取滤液和滤渣，提取剂使用甲醇、乙醇、盐酸、硫酸、氢氧化钾、氢氧化钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸铵等酸、碱、盐、醇。往滤液中加盐，有沉淀析出，过滤收取沉淀物，得食用色素。将滤渣再浸泡到提取剂浓度为50-99％的提取液中12-24小时后过滤，收取滤液。往滤液中加去离子水把提取剂浓度降至40-60％，再加吸附剂充分搅拌均匀后过滤，分别收取滤液和吸附剂，蒸干滤液可得食用色素。吸附剂采用化石粉、硅藻土、脱脂棉、纤维素、有机树脂。
PhA的制备用60-95％提取液淋洗吸附剂，收取洗脱液(Chla)。往洗脱液中滴入数滴1摩尔浓度的盐酸，溶液变棕色，Chla反应成脱镁叶绿素A后进行蒸馏，降低提取剂浓度至溶液中出现混浊为止。把溶液置于分液漏斗中，加入萃取剂摇匀后静止1小时。萃取剂可用乙醚、石油醚、辛烷、三氯甲烷、苯、二甲苯等烷烃、芳烃及其衍生物。脱镁叶绿素A萃进萃取剂中后，遗弃下层水溶液，再加入少许去离子水摇匀后静置。往脱镁叶绿素A萃取液中滴入硫酸，使Chla脱掉叶绿素醇尾生成PhA。PhA是水溶性化合物，从萃取剂中分离出来进入下层水溶液之中。分离出PhA水溶液加入去离子水使PH值降到3以下，再加入吸附剂充分搅拌均匀后过滤，再用去离子水淋洗，洗脱过剩的酸至PH为中性为至。将吸附剂浸入70-99％的提取液中洗脱出PhA。馏出PhA溶液中的提取剂，得到PhA水溶液，进行浓度和电解质调节后可做为注射针剂进行临床使用。将PhA水溶液蒸干后得黑色固体PhA便于保存。PhA及其溶液均需避光保存。以上各个蒸馏过程中均可回收提取试剂，减少成本、避免环境污染。
本发明附图的图面说明如下
图1是本方法得到的PhA的分子结构和电子光谱图，也是摘要附图。
图中实线为激发光谱，虚线为荧光光谱。
从图中可见，用本发明的方法得到的PhA，在418nm和669nm有两个特征峰值，这与标准样品是一致的，说明本方法得到的PhA是可信的。
本发明中由于原料中不含叶绿素B和C，因而可以得到高纯度的PhA。且本方法简便，节省试剂，效益是常规法的十倍以上。
下面通过实例对本发明给予进一步的说明。
实施例1称取摘洗干净的紫菜1公斤磨碎后加入2升浓度为10％的乙醇溶液。浸泡24小时后用100目筛子过筛，收取滤液和滤渣。量取1升滤液并加入300克NaCl，充分搅拌均匀静置1小时后有红色物质析出，其主要成份为藻红蛋白。过滤收取藻红蛋白，干燥后保存。藻红蛋白可做为红色食用色素使用。
往滤渣中加1升浓度为95％的乙醇溶液，浸泡12小时后过滤，收取滤液。往滤液中加入1升去离子水和200克硅藻土，充分搅拌均匀静置1小时后过滤，收取吸附剂和滤液。蒸干滤液得黄色固体，可做为黄色食用色素。
往硅藻土吸附剂加入1升95％的乙醇溶液，搅拌均匀后过滤，收取滤液。向滤液中加入数滴1摩尔HCl，溶液由蓝绿色变为棕色。蒸馏溶液，馏出乙醇到溶液刚出现混浊为止。再将溶液置于分液漏斗中，按1∶1(V/V)加入正辛烷，摇匀静置1小时后遗弃下层溶液。按1∶0.1(V/V)加入去离子水摇匀静置30分钟后分层，向上层正辛烷中滴入浓硫酸，有深棕色溶液进入下层水溶液中至不再有棕色溶液下降为止。收取下层棕色溶液，往里加去离子水至PH为6止。称取脱脂棉50克浸湿，用其做为吸附剂进行过滤。用95％的乙醇淋洗吸附了PhA的脱脂棉，洗脱出PhA。蒸馏PhA洗脱液，馏去乙醇，得PhA水溶液，进行浓度和电解质调整后便制成了PhA注射剂针剂。蒸干洗脱液可得黑色固体PhA粉末便于保存。
实施例2称取摘洗干净的角叉菜1公斤磨碎后加入2升浓度为5％的食盐水溶液，浸泡12小时后用100目筛子过筛，收取滤液和滤渣。量取1升滤液并加入300克NaCl，充分搅拌静置1小时后有红色物质析出。过滤收取红色物质并干燥之。
往滤渣中加入1升浓度为90％的丙酮溶液，浸泡12小时后过滤，收取滤液。往滤液中加入1升去离子水和400克化石粉，搅拌均匀静止1小时后过滤，收取滤液和化石粉。蒸干滤液得黄色固体粉末。
往化石粉吸附剂中加1升浓变为90％的丙酮溶液。充分搅拌均匀静置1小时后过滤，收取滤液。向滤液中加数滴1摩尔HCl，溶液变棕色，蒸馏出丙酮待溶液刚出现混浊的为止。将溶液置于分液漏斗中按1∶1(V/V)加入苯摇匀静置1小时后，弃去下层溶液。按1∶0.1(V/V)加入去离子水摇匀静置1小时后分层。向上层苯中滴入浓硫酸，有棕黑色物质下沉进入下层水溶液中至不再产生为止。收取下层液体并加入去离子水至PH值为6止，再加入200克硅藻土搅拌均匀后静置1小时后过滤。用90％的丙酮淋洗硅藻土吸附剂，洗脱出PhA，并蒸馏出丙酮得PhA水溶液，进行浓度和电解质调整后就制成了PhA注射针剂。蒸干洗脱液得黑色固体PhA便于保存。
实施例3藻类磨浆用20％浓度的KOH浸泡，采用二甲苯为有机提取剂，浓硫酸浓度采用80％，其它步骤同实施例1。
实施例4藻类磨浆用2％浓度的NaOH浸泡，有机提取剂用60％浓度的丙酮，萃取PhA用石油醚，浓硫酸为70％浓度，其它同实施例1。
实施例5藻类磨浆用30％浓度的(NH3)2SO4浸泡，有机提取剂用80％浓度的甲醇，萃取剂用乙醚，改浓硫酸为99％浓度的盐酸，其它同实施例1。
实施例6藻类磨浆用20％浓度的丙酮浸泡，有机提取剂用石油醚、硫酸浓度为90％，其它同实施例1。
权利要求
1.一种从藻类中提取制备脱镁叶绿素甲酯一酸A(PhA)的方法，采用红藻、蓝绿藻、黄绿藻为原料，其特征是(1)、用低浓度的酸、碱、盐、醇或酮溶液进行藻类磨浆的食用色素的提取；(2)、然后采用醇、酮、醚或烷烃、芳烃及衍生物萃取方法提取精制叶绿素A；(3)、再采用稀酸液相法脱镁、再用浓酸酯化制备出PhA；(4)、采用硅藻土、化石粉、脱脂棉、有机树脂吸附剂进行PhA的脱酸和精制。
2.根据权利要求1的方法，其特征是采用下述步骤进行(1)、选取紫菜、石花菜、三叉仙菜、角叉菜为原料，摘除藻根，洗去泥沙等污物，清水洗净，空除水分，剪磨碎或过筛成磨浆；(2)、食用色素的提取将(1)备好的原料浸泡在浓度为2-60％的提取液中12-24小时后过滤，分别收取滤液和滤渣，提取剂可使用甲醇、乙醇、盐酸、硫酸、氢氧化钾、氢氧化钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸铵等；(3)、往(2)中得到的滤液中加氯化钠，有沉淀析出，过滤收取沉淀物，得到食用色素；(4)、将(2)得到的滤渣再浸泡到浓度为50-99％的有机提取液中12-24小时，然后过滤，收取滤液，往滤液中加去离子水将提取剂浓度降至40-60％，再加吸附剂充分搅拌均匀后过滤，分别收取滤液和吸附剂，蒸干滤液可得食用色素，提取剂可以是醇类丙酮、醚类最好是乙醇、丙酮、石油醚，吸附剂可采用化石粉、硅藻土、脱脂棉、纤维素、有机树脂等；(5)、PhA的制备用60-95％浓度的乙醇提取液浸泡(4)中得到的吸附剂搅拌均匀后过滤，收取滤液(Chla)，往滤液中滴入数滴1摩尔浓度的盐酸，溶液变棕色，Chla反应成脱镁叶绿素A，然后进行蒸馏，至提取液浓度降低至溶液中出现混浊为止；把该溶液置于分液漏斗中，加入萃取剂摇匀后，静止1小时，遗弃下层水溶液，再加入去离子水摇匀后静置，向萃取液中滴入硫酸有深棕色溶液进入下层水溶液中至不再有棕色溶液下降为止，使Chla脱掉叶绿醇尾生成PhA,PhA从萃取剂中分离出进入下层水溶液中；萃取剂可用乙醚、石油醚、辛烷、三氯甲烷、苯、二甲苯等；(6)、收取(5)得到的下层棕色PhA水溶液，加去离子水使PH降至3以下，再加入吸附剂充分搅拌后过滤，再用去离子水淋洗，至PH为中性为止；(7)、将吸附剂浸入70-99％浓度的提取液中洗脱出PhA；然后蒸馏出PhA溶液中的提取剂，得到PhA水溶液；(8)、将(7)得到的PhA水溶液蒸干，得到黑色固体的PhA；(9)、在以上各个蒸馏过程中可回收提取剂。
全文摘要
一种从藻类中提取制备脱镁叶绿素甲酯一酸A的方法,属于叶绿素提取技术领域。以红藻、蓝绿藻、黄绿藻等为原料,用低浓度的酸、碱、盐、醇溶液进行食用色素的提取,然后采用萃取方法提取精制Chla,再采用液相法制备出PhA,采用吸附剂进行PhA脱酸,得到高纯度的PhA。本发明中由于原料中不含叶绿素B和C,因而可得到高纯度的PaA,方法简便,节省试剂,效益是常规法的十倍以上。
文档编号C07D487/00GK1230546SQ9810724
公开日1999年10月6日 申请日期1998年4月1日 优先权日1998年4月1日
发明者孟继武 申请人:中国科学院长春物理研究所