专利名称：筛分型吸附树脂的制备及在分离人参皂甙单体Rb1中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及吸附树脂的合成和中药有效成分的分离技术领域，特别是合成平均孔径小而且孔径分布均匀的高选择性聚苯乙烯吸附树脂，使其具有筛分和吸附的协同作用，能够按照分子尺寸的差别进行精确筛分，最后将其用于分离人参总皂甙、三七总皂甙提取物中的单体皂甙Rb1。
背景技术：
含有人参皂甙类有效成分的中药材在民间传统用药和现代药物开发研究中都表现出显著的生物活性，例如人参、西洋参、三七等。多年的实践表明，它们对于心血管系统、血液和造血系统、中枢神经系统、免疫系统均有很好的药理活性，可以延缓人体衰老。人参皂甙中的药理成分主要含有几种结构相近的单体皂甙成分，如人参皂甙Rb1，人参皂甙Rg1，人参皂甙Re，另外三七中还含有一种特殊的单体皂甙三七皂甙R1。它们的结构如下 一般的，单体皂甙几乎可以再现总皂甙的全部生物学活性，但是随着研究的深入，人们发现有些单体皂甙具有独特的药理作用，甚至发现有些单体皂甙具有相反的药理活性，如Rg1有较强的溶血作用，而Rb1则具有抗溶血作用，Rb1促进血小板聚集，而Rg1、Re抑制血小板聚集。在胆固醇代谢的影响研究中，有人认为原人参二醇为甙元的人参皂甙Rb1等刺激胆固醇合成的作用较强，而以原人参三醇为甙元的人参皂甙Rg1、Re则作用较弱，因此单体皂甙的不同配比能够实现不同的药效。
在人参总皂甙中单体皂甙Rb1的药理研究引起人们的极大关注，江沛等人的研究结果证实，Rb1的抗模拟移植肺缺血再灌注损伤作用效果明显，而Rg1对肺缺血再灌注损伤无明显抑制作用[江沛，等.人参皂苷Rb1和Rg1对模拟移植肺的保护作用，中山医科大学学报，1997，18(2)85～88]，所以Rb1是一种很有前途的保护移植肺的药物，值得进一步研究。另外更为重要的是Rb1可以经过化学转化方法对其进行化学结构的修饰改造，得到某些次生甙的纯品。次生甙一般具有明显的药理活性，如Rh2是一种新近发现的抗肿瘤、抗转移的天然植物成分，化疗增效减毒的首选药物[全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编上册[M]，北京人民卫生出版社，1992.20.]；次生甙Rg3具有抑制肿瘤新生血管形成的作用[1，潘子民，叶大风，谢兴，等.人参皂甙Rg3对荷瘤卵巢癌的严重联合免疫缺陷鼠的抗肿瘤血管生成作用的研究[J].中华妇产科杂志，2002，37(4)227-230；2，高勇，王杰军，许青.人参皂甙Rg3抑制肿瘤新生血管形成的研究[J].第二军医大学学报，2001，22(1)40-42]。因此，次生甙具有极高药用价值和应用前景。二十世纪80年代开始，国际上很多学者努力开发次生甙产品。但是这些次生甙一般含量甚微或者植物中不含有，只是一种代谢产物，所以极大的限制了它的应用开发，因此若能从含量较高的人参皂甙单体通过化学结构的修饰或改造得到所需的次生甙，(例如从人参中提取人参二醇类皂甙Rb1，水解法改变二醇类皂甙糖基制备低极性人参皂甙[章春芳，低极性人参皂甙的制备研究，安徽化工，2005，(3)25])，对于人参皂甙的药用研究必将更加深入。目前单体皂甙的主要来源仍然是从天然植物中提取分离，一般是溶剂萃取法，反复过硅胶柱和Sephadex柱，步骤繁琐，耗费大量的溶剂且得到的产品仅限于定量分析用。其对分离差别小的化合物分离差，操作时间长，溶剂耗费量大。有的用正相或者反相的HPLC来对单体皂甙进行分离，虽然得到的产品纯度较高，但是一般得到的量也是比较少，仅限用于分析用，且成本比较高，且HPLC所以的流动相一般有乙腈，毒性也是很大的。因此建立一种过程简单、成本较低、环境友好的分离方法以制备高纯度的单体皂甙是非常有意义的。大孔吸附树脂具有稳定性高，吸附容量大，选择性好和容易再生等优点，在许多中药的有效成分提取和分离中取得了很好的效果，成为推进中药现代化不可缺少的分离技术，用树脂法来分离总皂甙中的单体皂甙Rb1的研究还未见报道。由于总皂甙中几种主要单体皂甙的结构相似，分子量以及极性差别不大，用一般的大孔吸附树脂难于分离。
发明内容本发明目地是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种高选择性的聚苯乙烯型吸附树脂的制备方法，并将其用于人参总皂甙、三七总皂甙提取物中单体皂甙Rb1的分离，以市售的提取物为原料，只经“吸附一脱附”一步简单工艺，即可达到人参皂甙Rb1与其他单体皂甙的完全分离。
本发明为解决上述问题所采用的方案是，改变传统的大孔吸附树脂由非良溶剂经相分离致孔的方法，采用傅氏烷基化后交联方法合成一种平均孔径较小且孔径分布均匀的新型孔结构的吸附树脂，此类树脂兼具筛分和吸附双重功能，可实现总皂甙中分子尺寸较大的单体皂甙Rb1的分离。
本发明提供的筛分型聚苯乙烯吸附树脂的具体制备方法，通过以下步骤实现
(1)低交联聚苯乙烯吸附树脂的制备在常温下，将明胶或聚乙烯醇溶解于水中，配成0.5％-5％的水相，加热至30-50℃，以苯乙烯和二乙烯苯的混合单体为反应油相(二乙烯苯占混合单体总质量的0.5-1.5％)，其中水相与油相体积比为3∶1，以过氧化苯甲酰为引发剂，用量为混合单体总质量的1-3％，经悬浮聚合，缓慢升温至70-80℃反应3小时以上，再缓慢升温至85℃反应3小时，再缓慢升温至95℃以上反应3小时，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联凝胶型聚苯乙烯树脂，简称白球。
(2)低交联氯甲基化的苯乙烯树脂的制备常温下在三口瓶中加入白球，以氯甲醚和二氯乙烷的混合溶液充分溶胀，混合溶液用量为白球质量的6-8倍，氯甲醚和二氯乙烷的体积比为1∶2。加入ZnCl2作催化剂，用量为低交联聚苯乙烯质量的40-80％，充分混匀，然后升温到30-40℃，反应8-12小时，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联氯甲基化的苯乙烯树脂，简称氯球。
(3)筛分型聚苯乙烯吸附树脂的制备常温下在三口瓶中加入氯球，用二氯乙烷充分溶胀，用量为氯球质量的8-10倍，在搅拌下滴加四氯化锡和二氯乙烷混合溶液，用量为低交联氯甲基化苯乙烯树脂质量的50-70％，且四氯化锡和二氯乙烷的体积比为1∶1-2∶1，以0.5-2.0℃/min的速度将温度升至80-100℃，反应8-10小时，停止反应，过滤，洗涤，得到的树脂于索氏提取器中用无水乙醇提取6-8小时，将树脂取出晾干，真空干燥，得到本发明所需的筛分型聚苯乙烯吸附树脂。
其外观特征和结构参数为树脂为红棕色半透明的球形颗粒，粒径0.3-1.0mm，比表面积为1200-1600m2/g干树脂，含水量为50-70％，平均孔径为2-3nm，孔隙率50-80％。
上述筛分型聚苯乙烯吸附树脂在分离三七总皂甙、人参总皂甙提取物中单体皂甙Rb1的应用(1)将市售人参皂甙、三七皂甙提取物用水溶解，制得吸附溶液。
(2)将以上制备的吸附树脂装入吸附柱中，吸附柱的规格为柱直径/柱长为1/8-1/20。
(3)室温下，将吸附溶液以0.3-1.0BV/小时的流速通过树脂柱，其中Rb1无法扩散进入树脂孔中被有效吸附而随吸附溶液从树脂柱中流出，其它皂甙被完全吸附在树脂柱上。
(4)每次吸附时，树脂的处理量为8-19mg总皂甙粗提物/ml湿树脂，粗提物中总皂甙含量为60％-75％，其中Rb1含量为20％-35％。
(5)吸附完成后，收集吸附流出液，树脂柱以70％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，流出液和洗脱液分别经减压蒸馏回收溶剂，浓缩、真空干燥，得到两种固体产品，分别经Waters484高效液相色谱仪检测，流出液蒸干后的固体产品中只含有人参皂甙Rb1，基本不含其余单体皂甙，而洗脱液蒸干后的固体产品中不含人参皂甙Rb1而只含其余单体皂甙。
本发明的优点和积极效果本发明根据单体皂甙的结构特征和尺寸大小差别，合成了一种孔径小而均匀、且孔径在一定范围内可调的新型孔结构的聚苯乙烯型吸附树脂，利用该树脂所具有的筛分和吸附双重功能，可实现分子极性差别不大，结构相似，但是在分子尺寸上有差别的分子的分离。由于Rb1的尺寸较大而无法进入树脂孔道被吸附，从而在吸附过程中随吸附溶液从树脂柱中流出，其余单体皂甙由于尺寸较小，可以进入树脂孔道被吸附，吸附完成后，树脂柱用一定浓度的乙醇解吸，这几种单体皂甙随洗脱液流出，因此我们只通过“吸附-洗脱”一步简单工艺，既可实现Rb1和其它单体皂甙的完全分离，避免了现有分离工艺中使用大量强毒性、易挥发、易燃的有机溶剂且分离工艺烦琐的缺陷，本发明工艺简单，不使用毒性有机溶剂，环境友好，树脂可再生使用，生产成本低，人参皂甙Rb1的纯度高于50％，且不含有其它单体皂甙，可为进一步的药用开发提供大量试验样品。
具体实施方式
实施例1筛分型吸附树脂的制备方法，通过以下步骤实现在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成浓度1.0％的水溶液450ml，于1000ml三口瓶中水浴加热至45℃；将148.5g苯乙烯、1.5g二乙烯苯、1.5g过氧化苯甲酰混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠大小适宜，经悬浮聚合，78℃反应3小时以上，再缓慢升温至85℃反应3小时，再缓慢升温至95℃以上反应3小时，停止反应，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联凝胶型聚苯乙烯树脂，简称白球。
在1000ml三口瓶中加入40g的白球，以240g氯甲醚和480g二氯乙烷的混合溶剂作溶胀剂，将白球充分溶胀后，25g无水ZnCl2，混合均匀后，升温至35℃，反应10小时，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联氯甲基化苯乙烯树脂，简称氯球。
在1000ml三口瓶中加入50g的氯球，以500g二氯乙烷使其充分溶胀后，在搅拌下滴加15g四氯化锡和15g二氯乙烷的混合溶液，以1.0℃/min的速度将温度升至80℃，反应10小时，经过滤，洗涤，于索氏提取器中用无水乙醇提取8小时，取出树脂，晾干后真空干燥，得到所需的筛分型吸附树脂，其外观特征和结构参数为树树脂为红棕色半透明的球形颗粒，粒径0.4-0.8mm，比表面积为1255m2/g干树脂，含水量为59％，平均孔径为2.17nm，孔隙率56.5％。
实施例2
筛分型吸附树脂的制备方法，通过以下步骤实现在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成浓度1.0％的水溶液4.5升，于10升三口瓶中水浴加热至45℃；将1.5Kg苯乙烯、0.15Kg二乙烯苯、30g过氧化苯甲酰混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠大小适宜，经悬浮聚合，78℃反应3小时以上，再缓慢升温至85℃反应3小时，再缓慢升温至95℃以上反应3小时，停止反应，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联凝胶型聚苯乙烯树脂，简称白球。
在10升三口瓶中加入400g的白球，以2.8Kg氯甲醚和5.6Kg二氯乙烷的混合溶剂作溶胀剂，将白球充分溶胀后，300g无水ZnCl2，混合均匀后，升温至30℃，反应12小时，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联氯甲基化苯乙烯树脂，简称氯球。
在三口瓶中加入50g的低交联氯甲基化苯乙烯树脂，以10倍低交联氯甲基化苯乙烯树脂量的二氯乙烷使其充分溶胀后，在搅拌下滴加四氯化锡和二氯乙烷混合溶液，用量均为低交联氯甲基化苯乙烯树脂量的55％，并以一定速度将温度升至90℃，反应8.5小时，经过滤，洗涤，于索氏提取器中提取7小时，取出树脂，晾干后真空干燥，得到所需的筛分型吸附树脂，其外观特征和结构参数为树树脂为红棕色半透明的球形颗粒，粒径0.3-1.0mm，比表面积为1128m2/g干树脂，含水量为65％，平均孔径为2.21nm，孔隙率58.2％。
实施例3上述筛分型吸附树脂在分离三七总皂甙中单体皂甙Rb1的应用将纯度为66.3％的市售三七总皂甙提取物165.0mg(其中人参皂甙Rb1含量为20.6％，人参皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的总含量为45.7％)，溶解于40ml水中，配成吸附溶液，通过装有上述筛分型吸附树脂的树脂柱(柱长20cm，内径1.5cm，装有20ml湿树脂)，吸附速度为1BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脱，流速为1BV/h，流出液和洗脱液分别经减压蒸馏、真空干燥得固体物，经Waters484高效液相色谱仪检测，吸附流出液中人参皂甙Rb1含量为53.6％，其它三种单体皂甙未检出，洗脱液中三种单体皂甙的含量为87.4％，Rb1未检出。
实施例4将纯度为66.3％的市售三七总皂甙提取物357.6mg(其中人参皂甙Rb1含量为20.6％，人参皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的总含量为45.7％)，溶解于40ml水中，配成吸附溶液，通过装有上述筛分型吸附树脂的树脂柱(柱长20cm，内径1.5cm，装有20ml湿树脂)，吸附速度为1BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脱，流速为1BV/h，吸附流出液和洗脱液分别经减压蒸馏、真空干燥得固体物，经Waters484高效液相色谱仪检测，吸附流出液中人参皂甙Rb1含量为50.1％，其它三种单体皂甙未检出，洗脱液中三种单体皂甙的含量为81.2％，Rb1的含量为0.8％。
实施例5将纯度为66.3％的市售三七总皂甙提取物362.0mg(其中人参皂甙Rb1含量为20.6％，人参皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的总含量为45.7％)，溶解于40ml水中，制成三七总皂甙溶液以待吸附，通过装有上述筛分型吸附树脂的树脂柱(柱长20cm，内径1.5cm，装有20ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h，吸附流出液和洗脱液分别经减压蒸馏、真空干燥得固体物，经Waters484高效液相色谱仪检测，吸附流出液中人参皂甙Rb1含量为55.8％，其它三种单体皂甙未检出，洗脱液中三种单体皂甙的含量为88.6％，Rb1未检出。
实施例6将纯度为68.5％的市售人参总皂甙提取物357.3mg(其中人参皂甙Rb1含量为31.2％，人参皂甙Rg1和Re的总含量为37.3％)，溶解于40ml水中，配成吸附溶液，通过装有上述筛分型吸附树脂的树脂柱(柱长20cm，内径1.5cm，装有20ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h，吸附流出液和洗脱液分别经减压蒸馏、真空干燥得固体物，经Waters484高效液相色谱仪检测，吸附流出液中人参皂甙Rb1含量为62.5％，Rg1和Re未检出，洗脱液中Rg1和Re的总含量为89.3％，Rb1未检出。
实施例7将纯度为66.3％的市售三七总皂甙提取物801.2mg(其中人参皂甙Rb1含量为20.6％，人参皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的总含量为45.7％)，溶解于100ml水中，配成吸附溶液，通过装有上述筛分型吸附树脂的树脂柱(柱长50cm，内径2.5cm，装有100ml湿树脂)，吸附速度为0.45BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脱，流速为0.45BV/h，吸附流出液和洗脱液分别经减压蒸馏、真空干燥得固体物，经Waters484高效液相色谱仪检测，吸附流出液中人参皂甙Rb1含量为58.9％，其它三种单体皂甙未检出，洗脱液中三种单体皂甙的含量为90.1％，Rb1未检出。
实施例8将纯度为66.3％的市售三七总皂甙提取物1588.4mg(其中人参皂甙Rb1含量为20.6％，人参皂甙Rg1、Re和三七皂甙R1的总含量为45.7％)，溶解于100ml水中，配成吸附溶液，通过装有上述筛分型吸附树脂的树脂柱(柱长50cm，内径2.5cm，装有100ml湿树脂)，吸附速度为0.3BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脱，流速为0.3BV/h，吸附流出液和洗脱液分别经减压蒸馏、真空干燥得固体物，经Waters484高效液相色谱仪检测，吸附流出液中人参皂甙Rb1含量为54.3％，其它三种单体皂甙未检出，洗脱液中三种单体皂甙的含量为87.2％，Rb1未检出。
实施例9将纯度为68.5％的市售人参总皂甙提取物40.0g(其中人参皂甙Rb1含量为31.2％，人参皂甙Rg1和Re的总含量为37.3％)，溶解于4升水中，配成吸附溶液，通过装有上述筛分型吸附树脂的树脂柱(柱长150cm，内径25cm，装有2Kg湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用70％乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h，吸附流出液和洗脱液分别经减压蒸馏、真空干燥得固体物，经Waters484高效液相色谱仪检测，吸附流出液中人参皂甙Rb1含量为59.3％，Rg1和Re未检出，洗脱液中Rg1和Re的总含量为91.3％，Rb1未检出。
权利要求
1.一种筛分型聚苯乙烯吸附树脂的制备方法，其特征是通过以下步骤实现(1)低交联聚苯乙烯吸附树脂的制备在常温下，将明胶或聚乙烯醇溶解于水中，配成0.5％-5％的反应水相，加热至30-50℃，以苯乙烯和二乙烯苯的混合单体为反应油相，二乙烯苯占混合单体总质量的0.5-1.5％，其中水相与油相体积比为3∶1，以过氧化苯甲酰为引发剂，用量为混合单体总质量的1-3％，经悬浮聚合，缓慢升温至70-80℃反应3小时以上，再缓慢升温至85℃反应3小时，再缓慢升温至95℃以上反应3小时，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联凝胶型聚苯乙烯树脂，简称白球；(2)低交联氯甲基化的苯乙烯树脂的制备常温下在三口瓶中加入白球，以氯甲醚和二氯乙烷的混合溶液充分溶胀，混合溶液用量为白球质量的6-8倍，氯甲醚和二氯乙烷的体积比为1∶2，加入ZnCl2作催化剂，用量为低交联聚苯乙烯质量的40-80％，充分混匀，然后升温到30-40℃，反应8-12小时，经过滤、洗涤处理后，制备出低交联氯甲基化的苯乙烯树脂，简称氯球；(3)筛分型聚苯乙烯吸附树脂的制备常温下在三口瓶中加入氯球，用二氯乙烷充分溶胀，用量为氯球质量的8-10倍，在搅拌下滴加四氯化锡和二氯乙烷混合溶液，用量为低交联氯甲基化苯乙烯树脂质量的50-70％，且四氯化锡和二氯乙烷的体积比为1∶1-2∶1，以0.5-2.0℃/min的速度将温度升至80-100℃，反应8-10小时，停止反应，过滤，洗涤，得到的树脂于索氏提取器中用无水乙醇提取6-8小时，将树脂取出晾干，真空干燥，得到本发明所需的筛分型聚苯乙烯吸附树脂。
2.根据权利要求1所述的筛分型聚苯乙烯吸附树脂的制备方法，其特征是所述的吸附树脂的外观特征和结构参数为树脂为红棕色半透明的球形颗粒，粒径0.3-1.0mm，比表面积为1200-1600m2/g干树脂，含水量为50-70％，平均孔径为2-3nm，孔隙率50-80％。
3.一种权利要求1所述的筛分型聚苯乙烯吸附树脂在分离三七总皂甙、人参总皂甙提取物中单体皂甙Rb1的应用，其特征是(1)将市售人参皂甙、三七皂甙提取物用水溶解，制得吸附溶液；(2)将以上制备的筛分型聚苯乙烯吸附树脂装入吸附柱中，吸附柱的规格为柱内径/柱长为1/5-1/20；(3)室温下，将吸附溶液以0.3-1.0BV/小时的流速通过树脂柱，其中Rb1无法扩散进入树脂孔中被有效吸附而随吸附溶液从树脂柱中流出，其它皂甙被完全吸附在树脂柱上；(4)每次吸附时，树脂的处理量为8-19mg总皂甙粗提物/ml湿树脂，粗提物中总皂甙含量为60％-75％，其中Rb1含量为20％-35％；(5)吸附完成后，收集吸附流出液；树脂柱以70％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；流出液和洗脱液分别经减压蒸馏回收溶剂，浓缩、真空干燥，得到两种固体产品，分别经Waters484高效液相色谱仪检测，流出液蒸干后的固体产品中只含有人参皂甙Rb1，基本不含其余单体皂甙，而洗脱液蒸干后的固体产品中不含人参皂甙Rb1而只含其余单体皂甙。
全文摘要
一种筛分型吸附树脂的制备及在分离人参皂甙单体Rb1中的应用。本发明采用傅氏烷基化后交联方法合成一种平均孔径较小且孔径分布均匀的新型孔结构的吸附树脂，此类树脂兼具筛分和吸附双重功能，可实现分子极性差别不大，结构相似、但在分子尺寸上有差别的物质的分离。由于Rb1的尺寸较大而无法进入树脂孔道被吸附，其余单体皂甙由于尺寸较小，可以进入树脂孔道被吸附，因此本发明只通过“吸附—洗脱”一步简单工艺，既可实现Rb1和其它单体皂甙的完全分离，避免了现有分离工艺中使用大量强毒性、易挥发、易燃的有机溶剂且分离工艺烦琐的缺陷。本发明分离的人参皂甙Rb1的纯度高于50％，且不含有其它单体皂甙，可为进一步的药用开发提供大量试验样品。
文档编号C08F212/36GK101016357SQ20071005675
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者王春红, 施荣富, 武春密, 任萍 申请人:南开大学