在同一多糖链的4位或6位生物技术硫酸化的硫酸软骨素及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了自未硫酸化的软骨素骨架开始，经化学硫酸化，生产具有10-30kDa平均分子量(Mw)的硫酸软骨素的方法，所述未硫酸化的软骨素骨架经大肠杆菌(E.coli)菌株O5:K4:H4直接产生的荚膜多糖K4的酸水解得到或者由基因改造的大肠杆菌(E.coli)菌株直接生产。N-乙酰基-D-半乳糖胺残基4或6位的硫酸化同时发生于同一的多糖链中，模拟天然硫酸软骨素中观察到的硫酸化模式，其不同于用迄今描述的合成方法得到的硫酸化。
【专利说明】在同一多糖链的4位或6位生物技术硫酸化的硫酸软骨素及其制备方法
[0001]发明【技术领域】
[0002]本发明涉及由未硫酸化的软骨素骨架开始，经化学硫酸化生产硫酸软骨素的方法。根据本发明的方法使得能够在同一多糖链内的N-乙酰基-D-半乳糖胺残基的4位或6位同时硫酸化。因此，得到的硫酸软骨素具有天然硫酸软骨素观察到的相同硫酸化模式，其不同于用目前描述的合成方法得到的硫酸软骨素。
[0003]本发明还涉及具有经SEC测定的平均分子量(Mw)4_9kDa，以及90%4_硫酸盐和10%6-硫酸盐至10%4_硫酸盐和90%6_硫酸盐的单硫酸化基团分布的硫酸软骨素。
技术背景
[0004]硫酸软骨素(CS)是属于糖胺聚糖(GAG)类的复杂天然多糖，其由不同位置硫酸化并通过β 1-3键连接的葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)残基形成的二糖序列组成。
[0005]CS存在于动物组织中，具有结构功能和生理学功能。根据其来源，CS主要由不同百分比的GalNAc的4位或6位单硫酸化的两种类型的二糖单元(分别为二糖A和C)构成。然而，其中硫酸盐基团以不同数量和不同位置存在的二糖可以以不同百分比存在于多糖链中。CS骨架通常还含有少量未硫酸化的二糖。根据具体的动物来源，含有通过氧原子连接在不同位置例如GlcA的2位和GalNAc的6位(二糖D)、GlcA的2位和GalNAc的4位或者GalNAc的4位和6位(二糖Ε)的两个硫酸盐基团的二硫酸化二糖可以以不同百分比存在于 CS 骨架中(Volpi N.J Pharm Pharmacol61，1271，2009。Volpi N.J Pharm Sci96,3168,2007。Volpi N.Curr Pharm Desl2，639，2006)。
[0006]CS中发现的重复二糖单元`具有下述化学式:
[0007]
【权利要求】
1.用于制备其中在同一多糖链中的所有N-乙酰基-D-半乳糖胺单元被随机地或者在4-位或6-位单硫酸化的硫酸软骨素钠盐的方法，所述方法包含下述步骤: a.将软骨素钠盐转化成其游离酸或其与选自四甲基铵、四乙基铵或四丁基铵的季铵阳离子的盐或者转化成吡啶镇盐或甲酯； b.在酸催化存在下，使步骤a)中得到的化合物与其中R选自氢、甲基、乙基或苯基并且R1选自甲基或乙基的式RC(OR1)3的原酸酯反应，得到其中软骨素中存在的重复二糖单元具有式I结构的化合物，
2.权利要求1的方法，其中步骤a)的软骨素钠盐是由大肠杆菌(E.coli)菌株05:K4:H4培养液产生的荚膜多糖K4或者大肠杆菌(E.coli)菌株DSM23644培养液产生的多糖开始而得到的。
3.权利要求1的方法，其中步骤b)用原酸酯进行，所述原酸酯选自原乙酸三甲酯、原乙酸三乙酯、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原丙酸三甲酯、原丙酸三乙酯或原苯甲酸三甲酯，优选原乙酸三甲酯或原乙酸三乙酯，更优选原乙酸三甲酯。
4.权利要求1的方法，其中步骤b)的酸催化用选自樟脑磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸的酸或者用砜树脂完成，优选用樟脑磺酸或者磺酸树脂，更优选用樟脑磺酸完成。
5.权利要求1的方法，其中步骤c)用乙酸酐进行。
6.权利要求1的方法，其中步骤d)在20-40°C、优选在室温进行。
7.权利要求1的方法，其中步骤d)在40-70°C、优选在60°C进行。
8.权利要求1的方法，其中步骤d)在水/水溶性有机酸混合物或者单独的水中进行。
9.权利要求8的方法，其中有机酸选自乙酸、甲酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸或者丙酸树月旨，优选乙酸或丙酸，更优选乙酸。
10.权利要求1的方法，其中得到的硫酸软骨素钠盐具有10-30kDa的平均分子量(Mw)。
11.权利要求10的方法，其中硫酸软骨素钠盐具有90/104S/6S至10/904S/6S比率的单硫酸盐基团分布。
12.权利要求1的方法,其中得到的硫酸软骨素钠盐中4-位和6-位硫酸化的N-乙酰基-D-半乳糖胺单元间的比率低于I。
13.权利要求1的方法,其中得到的硫酸软骨素钠盐中4-位和6-位硫酸化的N-乙酰基-D-半乳糖胺单元间的比率高于I。
14.硫酸软骨素钠盐，其根据权利要求1的方法得到。
15.生物技术来源的具有4000-9000道尔顿平均分子量的硫酸软骨素，其中在同一多糖链中的所有N-乙酰基-D-半乳糖胺单元被随机地或者在4-或6-位单硫酸化。
16.根据权利要求15所述的硫酸软骨素，其具有90/104S/6S至10/904S/6S比率的单硫酸盐基团分布。
17.权利要求14-16的硫酸软骨素用于预防和治疗骨关节炎和/或用于维持肌肉骨骼系统的健康的用途。
18.组合物，其包含权利要求14-16中所要求保护的硫酸软骨素和一种或多种药学或营养学可接受的赋形剂。
19.权利要求18中所述的组合物，其用于预防和治疗骨关节炎和/或用于维持肌肉骨骼系统的健康。
【文档编号】C08B37/08GK103582653SQ201280022676
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年5月10日 优先权日:2011年5月12日
【发明者】D·比安基, M·瓦莱蒂, P·巴扎, N·米拉利亚, E·瓦洛蒂 申请人:诺西斯有限公司