一种棉花异戊烯基转移酶IPT2及其编码基因与应用的制造方法与工艺

本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的异戊烯基转移酶(IPT2)蛋白及其编码基因，以及其在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

背景技术：
非生物胁迫，如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干旱、半干旱地区占陆地面积的34％；我国干旱、半干旱地区约占国土面积的52％，年受旱面积达200-270万公顷，全国灌溉区每年缺水约30亿立方米，因缺水而少收粮食350-400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大，培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来，随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类：(1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来，通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解(LiuQ.1998.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomain，separatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlowtemperature-responsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestress-responsiveabscisicacidsignaling.PlantCell，14：343-357；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell，15：63-78.)。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相关的信号传递途径及信号传递网络系统的研究提供重要的基础。

技术实现要素：
本发明人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆出了棉花的一个异戊烯基转移酶(本文命名为IPT2)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现通过转基因将其导入植株后，可明显改善转基因植株的抗旱性，而且这些性状可稳定遗传。本发明第一方面提供棉花的一个异戊烯基转移酶IPT2的编码基因(本文命名为GhIPT2)，其序列为SEQIDNO：2。本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图2所示的rd29A-GhIPT2-2300载体。本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本发明第四方面提供一种改善植物抗旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物抗旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附图说明图1是GhIPT2的植物表达载体(rd29A-GhIPT2-2300)的构建流程。图2是GhIPT2的植物表达载体(rd29A-GhIPT2-2300)的质粒图。图3是对照烟草和转基因烟草的抗旱性生长情况(图3a为干旱前，图3b为干旱后)；CK(左)：对照烟草；T1Q4(右)：转基因烟草株系。图4是耐干旱T1代转基因烟草植株和不耐干旱对照烟草植株在转录水平上的验证结果。M为Marker(DL2000)，1-8为耐干旱T1代转基因烟草植株，9为质粒PCR阳性对照，10-13为不耐干旱对照烟草植株。具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。实施例1.干旱胁迫下棉花SSH文库构建：具体方法为：利用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片中提取的mRNA作为样本(tester)，以未处理的棉花幼苗的叶片中提取的mRNA作为对照(driver)。具体步骤简述如下：(1)供试材料：非洲棉(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-06838)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光强2000-3000Lx)条件下培养，每周浇1/2MS培养基(含有9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。当苗株高达25-30cm时用于实验。(2)材料处理：将供试幼苗分为2组，每组4盆，每盆1株。第一组为对照组，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光强2000-3000Lx)培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组，25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光强2000-3000Lx)条件下培养，停止浇灌，处理10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。(3)总RNA提取：分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片0.5g，用植物RNA提取试剂盒(购自invitrogen)提取棉花叶片的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA纯化试剂盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分离mRNA。(4)抑制差减杂交：按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。先将DrivermRNA和TestermRNA分别反转录，得到双链cDNA，再以2μgTestercDNA和2μgDrivercDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将TestercDNA和DrivercDNA用RsaI酶切1.5h，然后将酶切后的TestercDNA分成两等份，连接上不同的接头，而DrivercDNA不连接头。两种连有不同接头的TestercDNA分别与过量的Driver混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的DrivercDNA进行第二次正向差减杂交，通过两次抑制性PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。(5)cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定依照pGEM-TEasy试剂盒的程序，将所述第二次正向差减杂交cDNA片段的第二次抑制性PCR产物(使用QIAquickPCRPurificationKit纯化，购自Qiagen)与pGEM-TEasy(购自Promega试剂盒)载体连接，其具体步骤如下：用200μlPCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物3μl，2×T4连接酶缓冲液5μl，pGEM-TEasy载体1μl，T4DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。取10μl连接反应产物，加入到100μl感受态大肠杆菌JM109(购自TAKARA)中，冰浴30min、热休克60秒、冰浴2min，另加250μlLB培养液(含有1％Tryptone(购自OXOID)，0.5％YeastExtract(购自OXOID)，1％NaCl(购自国药))置37℃水浴中，以225rpm振荡培养30min，取200μl菌液接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB(同上)/X-gal/IPTG(X-gal/IPTG购自TAKARA)培养板上，37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的...