一种抗草甘膦融合蛋白及其编码基因、产生方法与应用与流程

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种融合的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)及其编码基因、获得该融合蛋白的方法及其在培育抗草甘膦植物中的应用。

背景技术：
草甘膦是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解、不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中的一个关键酶，其具有由两个保守的亚基组成的哑铃状结构。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是竞争性EPSPS抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱生物体正常的氮代谢而使其死亡。1976年，美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用。随着植物基因工程技术的发展和应用，抗草甘膦除草剂的转基因作物研究已成为热点。目前，转EPSPS基因的抗草甘膦除草剂转基因作物已经在多个国家广泛应用。目前利用EPSPS基因开展植物抗草甘膦研究主要有两种方法：第一种，是在植物中过量表达EPSPS，并以此拮抗草甘膦的竞争性抑制。Amrhein等通过逐渐增加草甘膦的浓度，加大草甘膦的选择压力，分离获得了一个耐草甘膦的矮牵牛细胞系。分析这个细胞系中的EPSPS基因，发现该细胞系的基因组中EPSPS基因的拷贝数扩增了20倍，使该酶的产量大大增加(AmrheinN,JohanningD,etal.Biochemicalbasisforglyphosate-toleranceinabacteriumandplanttissueculture.FEBSLett.,1983,157:191-196)。第二种，是使EPSPS发生突变，使其在保持催化活性的同时降低对草甘膦的亲和性，甚至不亲和。Stalker等从鼠伤寒沙门氏菌中分离到对草甘膦表现抗性的菌株，研究发现EPSPS的第101位的脯氨酸残基变为丝氨酸残基,将突变体编码基因转入烟草后可使转基因烟草对草甘膦的抗性提高(StalkerDM,HiattWR,etal.Aaminoacidsubstitutionintheenzyme5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthaseconfersresistancetotheherbicideglyphosate.JBiolChem,1985,260:4724-4728)；Padgette等将来自大肠杆菌的aroA基因编码的EPSPS的第96位的甘氨酸残基突变为丙氨酸残基，结果发现突变蛋白对草甘膦的结合活性显著降低，将编码该突变蛋白的基因在矮牵牛中表达后可显著提高其对草甘膦的抗性(PadgetteSR,ReDB,GasserCS,etal.Site-directedmutagenesisofaconservedregionofthe5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthaseactivesite.JBiolChem,1991,266:22364-22369)；朱桢等(2005，专利申请号：200510002739.7)通过易错PCR(Error-PronePCR)方法获得水稻的抗草甘膦突变体，其EPSPS的第106位氨基酸残基由脯氨酸残基变为亮氨酸残基；MichaelSpnecer等将玉米EPSPS第102位的苏氨酸残基突变为异亮氨酸残基，第106位脯氨酸残基突变为丝氨酸残基，使含有该突变的EPSPS的编码基因的植株获得抗除草剂特性(美国专利号：6040497)。本申请人曾将来自棉花的EPSPS第101位苏氨酸残基定点突变为异亮氨酸残基，第105位脯氨酸残基改变为丝氨酸残基，获得可提供一定草甘膦抗性的EPSPS突变基因(PCT/CN2010/078327)。某些外源基因(例如EPSPS编码基因)在植物中过量表达会增加植物的草甘膦抗性，但是外源基因的过量表达在一定程度上会影响受体的正常生长发育。因此，获得新的EPSPS编码基因，使其在同样的表达强度下实现更高的草甘膦抗性水平，是开展植物草甘膦抗性基因工程的优选方案。目前为止，所有的研究报道均是在不改变EPSPS长度的情况下，利用对功能域氨基酸残基的定点突变，增加酶对草甘膦的抗性。

技术实现要素：
本发明的思路是以微减棉花EPSPS蛋白突变体BHR2(PCT/CN2010/078327,下文称为MC-EPSPS)的活性中心容积为目的,采用不同EPSPS同源对比差异互补的设计思路获得一批突变体融合蛋白，并进一步进行草甘膦抗性鉴定分析，筛选功能显著改善的突变融合蛋白。其中的一个设计实现了本发明的内容。根据上述发明思路，发明人通过对MC-EPSPS和另外一种EPSPS蛋白G2-aroA(中国专利03826892.2)的氨基酸序列进行同源对比分析，发现MC-EPSPS在不同区域存在小段氨基酸的缺失或冗余(图1)。据此发现，本发明采用蛋白质工程和基因工程相结合的技术，获得了一个EPSPS突变体融合蛋白(下文称为MC2-EPSPS)，该融合蛋白是在MC-EPSPS蛋白的N端融合了G2-aroA蛋白N端的26个氨基酸残基。通过原核表达及转基因植物功能鉴定发现，本发明融合蛋白MC2-EPSPS的抗草甘膦水平较MC-EPSPS和G2-aroA均有显著提高。本发明首次采用EPSPS融合蛋白筛选方案，获得了草甘膦抗性显著提高的EPSPS突变体融合蛋白(MC2-EPSPS)及编码所述MC2-EPSPS融合蛋白的基因，这使得可在外源EPSPS基因表达水平相同的情况下，获得草甘膦抗性更强的转基因植物，从而提供了一种获得抗草甘膦除草剂转基因植物的优选方案。本发明的第一方面提供一种融合蛋白，其序列为SEQIDNO：2。本发明的第二方面提供编码本发明第一方面所述融合蛋白的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序列具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本发明的第三方面提供一种重组表达载体，其包含本发明第二方面所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与表达载体的表达控制序列可操作地连接。在一个优选的实施方案中，所述表达载体为pET28b；在另一个优选的实施方案中，所述表达载体为pCAMBIA2300。本发明的第四方面提供一种重组细胞，其包含本发明第二方面所述的核苷酸序列或者本发明第三方面所述的重组表达载体；在一个优选的实施方案中，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞；在另一个优选的实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本发明的第五方面提供一种改善植物草甘膦抗性的方法，包括：将本发明第二方面所述的核苷酸序列或者本发明第三方面所述的重组表达载体导入植物细胞、组织、器官或植株并使所述核苷酸序列表达；在一个优选的实施方案中，所述植物为烟草；在另一个优选的实施方案中，所述植物为棉花。本发明的第六方面提供一种制备融合蛋白的方法，其包括将本发明第二方面所述的核苷酸序列插入表达载体并使所述核苷酸序列与所述表达载体的表达调控序列可操作地连接，然后将所得重组表达载体导入生物体使所述基因表达；在一个优选的实施方案中，所述生物体是大肠杆菌；在另一个优选的实施方案中，所述生物体为烟草；在另一个优选的实施方案中，所述生物体为棉花。本发明的第七方面提供本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的核苷酸序列、本发明第三方面所述的重组表达载体或本发明第四方面所述的重组细胞用于改善植物草甘膦抗性以及用于植物育种的用途；在一个优选的实施方案中，所述植物为烟草；在另一个优选的实施方案中，所述植物为棉花。附图说明图1：棉花MC-EPSPS蛋白与EPSPS蛋白G2-aroA的氨基酸序列进行同源对比分析的结果。图2：原核表达载体pET28b-MC2的质粒图。图3：分别含pET28b-MC2、pET28b-MC、pET28b-G2或pET28b的BL21(DE3)PlysS转化子在含150mM草甘膦的液体M9基础培养基中的生长曲线图。图4：BL21(pET28b-MC)、BL21(pET28b-MC2)和BL21(pET28b-G2)中蛋白的表达情况。其中第1泳道为蛋白Marker(名称：UnstainedProteinMolecularWeightMarker；购自深圳研顺生物科技有限公司)；第2和3泳道为BL21(pET28b-G2)两个克隆子的蛋白粗提物，第4和5泳道为BL21(pET28b-MC)两个克隆子的蛋白粗提物，第6和7泳道为BL21(pET28b-MC2)两个克隆子蛋白粗提物，第8和9泳道为BL21(pET28b)两个克隆子蛋白粗提物。图5：pBI121-ATP-G2的质粒图。图6：pBI121-PTP-G2的质粒图。图7：pBI121-CTP-G2的质粒图。图8：图8a为pCAMBIA2300-2的构建流程；图8b和8c为pCAMBIA-35S-PTP-MC2的构建流程。图9：将6～7叶期的非转基因烟草再生幼苗和T0代转基因烟草幼苗随机排列，喷施2000ppm草甘膦15天后，再次喷施3000ppm草甘膦7天后观察到的结果。图9a为两个转PTP-MC2-EPSPS基因的烟草植物，其余抗性植物与其类似，在此未示出；图9b为两个转PTP-MC-EPSPS基因的烟草植株，其余植株与其类似，在此未示出；图9c为两个转PTP-G2基因烟草植株，其余植株与其类似，在此未示出；图9d为非转基因对照植株。图10：对转基因烟草和非转基因烟草进行RT-PCR检测的电泳结果。1-3为转PTP-MC2-EPSPS基因的抗3000ppm草甘膦T0代转基因烟草植株，4-6为转PTP-MC-EPSPS基因的不抗3000ppm草甘膦T0代转基因烟草植株，7-9为转PTP-G2-EPSPS基因的不抗3000ppm草甘膦草甘膦T0代转基因烟草植株，10-12为转PTP-MC2-EPSPS基因不抗3000ppm草甘膦的T0代转基因烟草植株，13为非转基因对照烟草。内参为烟草内源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB158612.1)。图11：将4～5叶期的非转基因棉花幼苗和T0代转基因棉花幼苗随机排列，喷施3000ppm草甘膦至饱和(每平米喷施50ml)10天后所观察到的结果。图11a为两个转PTP-MC2-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株与其类似，在此未示出；图11b为两个转PTP-MC-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株与其类似，在此未示出；图11c为两个转PTP-G2基因抗性棉花植株，其余抗性植株与其类似，在此未示出；图11d为非转基因对照植株。图12：对转基因棉花机非转基因对照棉花进行RT-PCR检测的电泳结果。1-2为转PTP-MC2-EPSPS基因的抗草甘膦T0代转基因棉花植株，3-5为PTP-MC-EPSPS基因的不抗草甘膦T0代转基因棉花植株，6-8为转PTP-G2基因的不抗草甘膦的T0代棉花，9-11为不抗草甘膦的转PTP-MC2-EPSPS基因的T0代棉花，12为非转基因对照棉花。陆地棉内源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/32186889)为内参。图13为pCAMBIA-35S-PTP-MC2的质粒图。具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。实施例1MC2-EPSPS编码基因的获得1.棉花5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因C-EPSPS的克隆取鄂杂棉11F1(创世纪转基因技术有限公司销售)叶片0.5g，按植物RNA提取试剂盒(购自Invitrogen)说明书操作提取棉花叶片的总RNA。棉花叶片总RNA逆转录：在0.2mlEP管中，加入2.0μl总RNA(0.1μg/μl)和2.0μlOligo(dT12-18)(2μM)，混匀，65℃水浴10分钟，立即冰浴5分钟，然后加入2.0μl10×RTbuffer，2.0μl250μMdNTPmix，2.0μl100mMDTT，9.8μlDEPCH2O，0.2μl200U/μlSuperScriptIII(Invitrogen)，混匀后50℃反应60分钟；然后在70℃失活15分钟；-20℃保存。棉花EPSPS编码基因的获得：以上述所得棉花cDNA为模板，扩增得到包括棉花EPSPS编码基因的5’端非翻译区(5’UTR)、叶绿体导肽(CTP)、EPSPS编码基因和3’端非翻译区(3’UTR)在内的基因组序列。反应体系如下：50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlcDNA，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(购自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4各2.0μl(便于后续构建，在引物两端分别引入EcoRI、SacI识别位点)，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min、5个循环(94℃变性45s、56℃退火45s、72℃延伸2min)，25个循环(94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸2min)，72℃延伸7min。所得的扩增产物经EcoRI和SacI酶切后插入到克隆载体pBluescriptIISK(-)(下文称为pBluescript载体，购自深圳研顺生物技术有限公司)的EcoRI和SacI多克隆酶切位点之间，连接反应体系及反应条件如下：酶切后的PCR产物3μl，2×T4DNA连接酶缓冲液5μl，酶切后的pBluescript载体1μl，T4DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。所得载体命名为pBluescript-C-EPSPS。取10μL连接反应产物，加入到100μL大肠杆菌JM109感受态细胞(购自TAKARA)中并混匀，冰浴30min、42℃热休克60s、冰浴2min，另加250μLLB培养液(含1％胰蛋白胨，购自OXOID；0.5％酵母提取物，购自OXOID；1％NaCl，购自国药)后置于37℃摇床中，以225r/min振荡培养30min。取200μL培养后的菌液涂布于含50μg/mL氨苄青霉素(购自北京拜尔迪)的LB固体培养平板(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％琼脂)上，37℃培育18h。挑取克隆子并分别进行PCR(反应体系及条件同上)验证，将PCR阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序所用引物为BcaBESTTMSequencingPrimerRV-M(SEQIDNO:5),BcaBESTTMSequencingPrimerM13-47(SEQIDNO:6),特异性引物(SEQIDNO:7)，测序所得序列为SEQIDNO:8。8SEQIDNO:8中第7bp－184bp为5’UTR区；第185bp－418bp为叶绿体导肽核苷酸序列；第419bp－1750bp为编码EPSPS蛋白的核苷酸序列(命名为C-EPSPS)，所述C-EPSPS对应的氨基酸序列为SEQIDNO:9(其为去除导肽并在N端增加甲硫氨酸后的EPSPS蛋白的氨基酸序列)；第1751－2028bp为3’UTR。2.棉花EPSPS编码基因C-EPSPS的定点突变以上述经过测序验证的pBluescript-C-EPSPS质粒为模板，对C-EPSPS基因进行定点突变，将其所编码蛋白N端第三个α螺旋中的苏氨酸(SEQIDNO:9中第102位氨基酸)改变为异亮氨酸，脯氨酸(SEQIDNO:9中第106位氨基酸)改变为丝氨酸。为表达载体构建需要，将SEQIDNO:9中第208位的脯氨酸及第406位的丙氨酸进行同义突变，消除了原基因中存在的NdeI(SEQIDNO:8中第1038bp处的“CATATG”突变为“CTTATG”)和NcoI(SEQIDNO:8中第1632bp处的“CCATGG”突变为“CTATGG”)两个酶切位点对后续构建的影响。所述定点突变过程如下：1)使用突变引物SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12，并将其5’端磷酸化以利于后续PCR产物的连接、环化。引物磷酸化反应过程如下：引物SEQIDNO:10(50μM)：5μl引物SEQIDNO:11(50μM)：5μl引物SEQIDNO:12(50μM)：5μl10×T4DNAPolynucleotideKinaseBuffer(购自TAKARA)：3μlT4DNAPolynucleotideKinase(购自TAKARA)：1μlATP(10mM)：3μl补水至30μl37℃反应45min后置于4℃终止反应并保存。定点突变过程：以所述含C-EPSPS基因的克隆载体pBluescript-C-EPSPS为模板，反应过程使用STRATAGENE的QuikChangeMulti突变试剂盒并参照其说明书操作(在25μl反应体系中，加入约70ng模板质粒，2.5μl10×QuickchangeMultiBuffer，3.0μl磷酸化的引物混合物，1.0μldNTPMix，1.0μlMultienzymeblend，加水至25μl。反应条件：95.0℃预变性1min；30个循环(95.0℃变性1min；55℃退火1min；65℃延伸10min)，反应完成后通过冰浴将温度降至37.0℃以下，加1μlDpnI，37.0℃消化2h，取2μl消化产物直接转化大肠杆菌)。将所得的突变后的载体命名为pBluescript-MC-EPSPS。取3μL突变后的质粒,转化大肠杆菌JM109感受态细胞进行克隆测序验证(反应体系及方法同上)。经PCR及测序验证得到发生目标突变的克隆子后保存备用。设计引物SEQIDNO:13和SEQIDNO:14，以上述经验证发生目标突变的pBluescript-MC-EPSPS质粒为模板，扩增除导肽序列以外的棉花EPSPS编码区序列，其5’端增加起始密码子ATG以便于后续构建。反应体系及反应条件如下：50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlpBluescript-MC-EPSPS质粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(购自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:13和SEQIDNO:14各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min、33个循环(94℃变性45s、56℃退火45s、72℃延伸2min)，72℃延伸7min。两引物末端分别设计NcoI和XhoI位点，将扩增产物用NcoI和XhoI酶切后插入至pET28b的NcoI和XhoI多克隆位点之间，获得重组表达载体pET28b-MC。取10μL连接反应产物，转化到100μL大肠杆菌JM109感受态细胞中(方法同上)。取200μL培养后的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)的LB固体培养平板上，37℃培育18h。挑选正常生长的菌落进行测序验证，所得突变后的基因序列为SEQIDNO:15，并将其命名为MC-EPSPS。3.融合基因MC2-EPSPS克隆根据G2-aroA蛋白(专利申请号：03826892.2)的氨基酸序列，在保持其氨基酸不变的前提下，根据棉花密码子偏好性设计G2基因，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(序列为SEQIDNO:16)。将合成的G2基因T克隆至pUC57-T载体中，所得的重组质粒命名为pUC57-G2。设计引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:18，以扩增G2基因5’端的78个核苷酸序列，并使其5’端带NcoI位点，3’端带NdeI位点。采用TAKARA的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以上述pUC57-G2质粒为模板进行PCR反应。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlpUC57-G2质粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:18各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s)，72℃延伸10min。PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5μl10×ExBuffer，0.5μl5mM的dATP，2.5μlExTaq。ExTaq及10×ExBuffer均购自TAKARA。反应条件：70℃反应30分钟。将得到的约100bp的DNA片段回收(使用购自Omega的回收试剂盒)，并将其连接至pGEMT-easy载体(购自Promega),然后转化JM109感受态细胞((购自TAKARA)(连接体系及转化方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。经NcoI和NdeI双酶切鉴定后将得到2个阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，保留测序正确克隆子，命名为pGEM-G2(78)。利用引物SEQIDNO:19和SEQIDNO:14，以上述经测序验证的pET28b-MC质粒为模板扩增MC-EPSPS基因，使其5’端带NdeI位点，3’端带XhoI位点，PCR反应条件为：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。将所得PCR产物连接到pGEMT-easy载体(购自Promega),然后转化JM109感受态细胞进行克隆测序验证(反应体系及方法同上)。经NdeI和XhoI双酶切鉴定正确后，将得到2个阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，保留测序正确克隆子,命名为pGEM-MC。用NcoI和XhoI酶切pET28b，并回收载体片段；用NcoI和NdeI双酶切pGEM-G2(78),并回收约78bp大小的片段；用NdeI和XhoI双酶切pGEM-MC，回收1300bp大小的片段，将上述三个片段进行三片段连接，获得重组质粒pET28b-MC2(见图2)，G25’端的78bp加MC-EPSPS基因组成的融合基因命名为MC2-EPSPS。经转化JM109感受态细胞后进行克隆测序验证(方法同上)，该融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1，其所对应蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO:2。实施例2MC2-EPSPS基因原核表达产物抗草甘膦特性分析原核表达载体构建：参照上述pET28b-MC2载体的构建策略和步骤，使用引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:20在G2基因两端分别引入NcoI和XhoI位点，并通过NcoI和XhoI酶切将G2基因插入到pET28b载体，获得原核表达载体pET28b-G2。抗草甘膦功能分析：将上述pET28b-MC、pET28b-MC2和pET28b-G2表达载体及质粒对照pET28b分别转化原核表达菌株BL21(DE3)PlysS(购自上海博麦德生物技术有限公司)，转化方法参照《分子克隆》(第三版)中的描述。将所得阳性转化子分别命名为BL21(pET28b-MC)、BL21(pET28b-MC2)、BL21(pET28b-G2)及BL21(pET28b)，并将其分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的液体M9基础培养基(含48mMNa2PO4·7H2O，22mMKH2PO4，8.5mMNacl，19mMNH4Cl，2mMMgSO4，0.1mMCaCl2和0.4％葡萄糖)，37℃下活化过夜后，按1:100(V/V)稀释。分别取300μL稀释后的菌液接种到30mL液体M9基础培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，以200rpm,37℃空气浴的条件培养。培养到OD600＝0.100左右，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，购自TAKARA)至终浓度为1mmol/L，加入草甘膦(购自山东滨州九安化工有限公司)至终浓度150mM，以200rpm，37℃空气浴的条件培养14小时，然后继续培养并每隔2小时测定一次培养物OD600，并记录其生长情况。每组设两个重复，测定结果见表1。将每组的值求平均值后，绘制生长曲线图(图3)。表1150mM草甘膦浓度下携带不同基因的BL21(DE3)PlysS生长情况表从表1和图3可看出，在含有150mM草甘膦的M9基本培养基中，携带MC2-EPSPS基因的转化子BL21(pET28b-MC2)的生长速度显著快于携带MC-EPSPS基因的转化子BL21(pET28b-MC)或携带G2基因的转化子BL21(pET28b-G2)；而只携带pET28b质粒的转化子在含有150mM的草甘膦的M9基本培养基中的生长已受到严重的抑制。每组的两重复间的结果基本一致。由此可见，MC2-EPSPS蛋白的抗草甘膦能力比MC-EPSPS蛋白或G2蛋白的抗草甘膦能力有显著提高。原核表达情况分析：挑取BL21(pET28b-MC)、BL21(pET28b-MC2)和BL21(pET28b-G2)单菌落分别接种到液体LB(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃下活化过夜后，按1:100(V/V)稀释。各取50μL所述稀释液分别接种到5mL液体LB(含卡那霉素50μg/mL)中，在37℃、200rpm下培养到OD600＝0.6左右，分别加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃振荡培养诱导表达3h。分别离心并收集沉淀的菌体，用2×SDS上样缓冲液重悬菌体，沸水中煮5min得到蛋白粗提物，12000rpm离心1min，分别取15μL上清进行SDS-PAGE电泳分析。参考Sambrook等(1989)的方法，用10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，0.25％考马斯亮蓝R-250染色。结果如图4所示，第1泳道为蛋白Marker(名称：UnstainedProteinMolecularWeightMarker；购自深圳研顺生物科技有限公司)；第2和3泳道为BL21(pET28b-G2)两个克隆子的蛋白粗提物，第4和5泳道为BL21(pET28b-MC)两个克隆子的蛋白粗提物，第6和7泳道为BL21(pET28b-MC2)两个克隆子蛋白粗提物，第8和9泳道为BL21(pET28b)两个克隆子蛋白粗提物。由电泳图可以看出，经IPTG诱导的携带MC-EPSPS、MC2-EPSPS和G2基因的克隆子均可表达出大小约为47kDa的目的蛋白，并且MC2-EPSPS蛋白略大于MC-EPSPS和G2蛋白。这表明，在相同的表达条件下，三者均可获得有效表达，并且电泳结果显示三者的蛋白表达水平没有显著差异。综上可知，MC2-EPSPS抗草甘膦能力的提高不是由于蛋白的过量表达引起的，而是由于蛋白结构的改变引起的。实施例3叶绿体导肽筛选、鉴定1.载体构建对NCBI已报道的拟南芥、矮牵牛和棉花的叶绿体导肽基因ATP、PTP和CTP的DNA序列进行密码子分析，经同义替换消除ATP和PTP中的稀有密码子，并在所述3种导肽的5’端加BamHI酶切位点，3’端加NcoI酶切位点，所得序列分别为SEQIDNO:21(ATP)、SEQIDNO:22(PTP)和SEQIDNO:23(CTP)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将所述三个序列分别T克隆至pUC57-T载体中，所得重组质粒分别命名为pUC57-ATP、pUC57-PTP和pUC57-CTP。利用引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:24，采用TAKARA的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以pUC57-G2质粒为模板进行PCR反应来扩增G2基因，使其5’端带NcoI位点，3’端带SacI位点。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlpUC57-G2质粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:24各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s)，72℃延伸10min。PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5μl10×ExBuffer，0.5μl5mM的dATP，2.5μlExTaq。ExTaq及10×ExBuffer均购自TAKARA。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约1300bp的DNA片段回收(使用购自Omega的回收试剂盒)，并将其连接至pGEMT-easy载体(购自Promega),然后转化JM109感受态细胞(连接体系及转化方法同上)，随机挑取10个白色菌落分别接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。经NcoI和SacI双酶切鉴定后将得到2个阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，保留测序正确克隆子，命名为pGEM-G2。用BamHI和NcoI双酶切质粒pUC57-ATP，回收ATP片段；用NcoI和SacI双酶切pGEM-G2，回收G2片段，用BamHI和SacI双酶切质粒pBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)，回收载体片段，以三片段连接方式将上述回收的ATP和G2片段同时插入pBI121中，获得植物表达载体pBI121-ATP-G2。同理构建pBI121-PTP-G2和pBI121-CTP-G2,图谱分别如图5，6，7所示。将上述质粒分别通过电击转化农杆菌LBA4404(购自Invitrogen，转化方法参照匡小婴等.影响根癌农杆菌的电击转化条件.食品与生物技术学报.2005年04期)，并通过抗生素及PCR筛选获得阳性转化克隆。将含有所述质粒的农杆菌单菌落接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平(购自深圳市凯联生物技术有限公司)的YEB液体培养基(含0.1％酵母提取物，0.5％牛肉膏，0.5％蛋白胨，0.5％蔗糖，0.05％MgSO4.7H2O)中。28℃、200rpm振荡暗培养过夜至对数期(OD600值0.8～1.2)用于植物转化。2.转化烟草用75％酒精浸泡烟草种子(NicotianatabacumL.，国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号I5A00660)30s，用灭菌双蒸水洗两次。再用0.1％升汞浸泡8min，用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于MS固体培养基(含18.78mMKNO3，1.25mMKH2PO4，20.6mMNH4NO3，1.5mMMgSO4，3.0mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4，7.4g/L琼脂，蔗糖30g/L)上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，将处于对数生长期的分别含表达载体pBI121-ATP-G2、pBI121-PTP-G2或pBI121-CTP-G2质粒的农杆菌LBA4404浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS固体培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+1mg/L细胞分裂素(BA，购自上海稼丰园艺用品有限公司)+0.1mg/L萘乙酸(NAA，购自上海稼丰园艺用品有限公司)+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素(购自深圳市凯联生物技术有限公司))上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入含有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。在转化过程中部分叶盘不作浸染，让其再生为正常小苗，在后续实验中作为阴性对照。取获得的转基因烟草叶片，提取DNA(方法参照《分子克隆》(第三版))，用SEQIDNO:17和SEQIDNO:24作为检测引物。50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:17和SEQIDNO:24各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，并将PCR鉴定为阳性的植株保存备用。上述三种质粒分别获得约30个转化事件。3.抗草甘膦功能鉴定将6～7叶期的非转基因烟草再生幼苗和T0代转基因烟草幼苗随机排列，喷施2000ppm草甘膦(商品名：农达，购自深圳诗佳贸易公司)至饱和(每平米喷施50ml)。7天后观察试验结果发现，非转基因对照植株严重萎蔫，转基因烟草结果如下：其中28株转ATP-G2基因的烟草均表现不同程度萎蔫，未发现抗性植株；29株转CTP-G2基因的烟草中只有1株抗性植株；30株转PTP-G2基因的烟草中有5株抗性植株。后续研究中，均以PTP作为EPSPS基因的导肽序列。实施例4MC2-EPSPS基因植物表达载体构建选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择含双增强子的35S启动子及Tnos终止子分别作为MC2-EPSPS基因的启动子和终止子。用引物SEQIDNO:25和SEQIDNO:26以植物表达载体pBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos启动子，使其两端分别带EcoRI、BglII酶切位点。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlpBI121质粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(购自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:25和SEQIDNO:26各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过EcoRI、BglII酶切将所得PCR产物插入到pCAMBIA2300(购自Promega，T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-1。使用引物SEQIDNO:27和SEQIDNO:28，以pBI121质粒为模板扩增Tnos终止子，使其两端分别带SacI、EcoRI酶切位点。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlpBI121质粒，1.0μlPrimeSTARHSDNA聚合酶(购自TAKARA)、10μM的引物SEQIDNO:27和SEQIDNO:28各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过SacI、EcoRI酶切将所得PCR产物插入到pCAMBIA2300-1获得pCAMBIA2300-2，具体构建流程如图8a所示。使用引物SEQIDNO:29和SEQIDNO:30，以载体pCAMBIA2300为模板扩增含双增强子的35S启动子。所述两条引物的5’端分别带HindIII和BamHI，PCR产物经酶切后插入到pUC18载体(购自TAKARA)中，得到重组质粒pUC18-35S。根据公布的OK(Omega&Kozak)序列及PS序列(Processing&Splicingsequence)(两者已在ZL95119563.8中充分公开)合成BamHI-OK-PstI-XhoI-PS-SacI片段，其序列为SEQIDNO:31。其中，该片段的5’端和3’端分别带BamHI和SacI酶切位点，在OK与PS之间以PstI、XhoI两酶切位点相连，两个酶切位点间插入保护碱基便于后续的酶切构建。利用BamHI和SacI酶切，将OK-PstI-XhoI-PS插入到所述重组质粒pUC18-35S中，获得重组质粒pUC18-35S-OK-PS。设计引物SEQIDNO:32和SEQIDNO:33，以质粒pUC57-PTP为模板扩增PTP序列，使其5’端添加PstI酶切位点，其3’端添加NcoI酶切位点，通过酶切以三片段连接的方式将PstI-PTP-NcoI(经PstI和NcoI双酶切)及NcoI-MC2-EPSPS-XhoI(将上述pET28b-MC2用NcoI和XhoI双酶切)两个片段同时插入到pUC18-35S-OK-PS(PstI和XhoI双酶切)中，获得重组质粒pUC18-35S-OK-PTP-MC2-PS利用HindIII和SacI酶切将所述重组质粒pUC18-35S-OK-PTP-MC2-PS35S至PS的片段(SEQIDNO:34)插入到pCAMBIA2300-2中，并进行克隆测序检测(感受态细胞转化、筛选及测序方法同上)，获得植物表达载体pCAMBIA-35S-PTP-MC2(见图13)，具体构建流程如图8(图8b-8c)所示。参照与pCAMBIA-35S-PTP-MC2载体构建相同的步骤，获得重组质粒pUC18-35S-OK-PTP-MC-PS和pUC18-35S-OK-PTP-G2-PS。分别将两质粒中35S至PS的片段(分别为SEQIDNO:35，SEQIDNO:36)插入到pCAMBIA2300-2的HindIII和SacI多克隆酶切位点之间并克隆测序检测(感受态细胞转化、筛选及测序方法同上)，获得植物表达载体pCAMBIA-35S-PTP-MC和pCAMBIA-35S-PTP-G2。分别用上述获得的阳性植物表达载体pCAMBIA-35S-PTP-MC2、pCAMBIA-35S-PTP-MC或pCMABIA-35S-PTP-G2质粒通过电击转化农杆菌LBA4404，将筛选得到的阳性转化克隆暗培养过夜至对数期(OD600值0.8～1.2)用于植物转化(方法同实施例3)。实施例5利用农杆菌介导法转化烟草用实施例4中所得的处于对数生长期的分别含表达载体pCAMBIA-35S-PTP-MC2、pCAMBIA-35S-PTP-MC或pCAMBIA-35S-PTP-G2质粒的农杆菌LBA4404浸染烟草叶盘，转化方法及阴性对照烟草获得方法如实施例3。取获得的转基因烟草叶片，提取DNA(方法参照《分子克隆》(第三版))，使用引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38(50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min)，并将鉴定结果为阳性的植株保存备用。所述每种质粒的转基因分别获得约80个转化事件。实施例6过表达EPSPS转基因烟草T0代植株抗草甘膦功能鉴定将6～7叶期的非转基因烟草再生幼苗和T0代转基因烟草幼苗随机排列，喷施2000ppm草甘膦(商品名：农达，购自深圳诗佳贸易公司)至饱和(每平米喷施50ml)。7天后观察试验结果发现，非转基因对照(CK1)植株严重萎蔫，而分别转PTP-MC2-EPSPS、PTP-MC-EPSPS或PTP-G2基因的烟草均有部分植株表现出草甘膦抗性，其中转PTP-MC2-EPSPS基因烟草的抗性植株比率为33.7％，显著高于转PTP-MC-EPSPS基因烟草的抗性植株比率(17.3％)和转PTP-G2基因烟草抗性植株比率(13.9％)(统计结果见表2)。CK1为用草甘膦处理的非转基因对照，CK2为未处理的非转基因对照。表2转基因烟草的草甘膦抗性鉴定结果喷施2000ppm草甘膦15天后，对上述抗性转基因烟草再次喷施3000ppm草甘膦，喷施方法同上。7天后观察结果(见图9a-9d)发现，转PTP-MC2-EPSPS基因的28株烟草中除5株叶片轻度发黄、萎蔫外，其余23株均生长正常(图9a为两个转PTP-MC2-EPSPS基因烟草植株，其余抗性植株与其类似，在此未示出)；而14株转PTP-MC-EPSPS基因烟草(图9b为两个转PTP-MC-EPSPS基因烟草植株，其余植株与其类似，在此未示出)和11株转PTP-G2基因烟草(图9c为两个转PTP-G2基因烟草植株，其余植株与其类似，在此未示出)均表现不同程度叶片发黄、萎蔫，甚至死亡，在所述草甘膦浓度处理下未筛选到抗性植株；非转基因对照植株(图9d)死亡。所述结果表明，转PTP-MC2-EPSPS基因烟草植株的草甘膦抗性显著高于转PTP-MC-EPSPS基因或PTP-G2基因烟草植株的草甘膦抗性。根据喷施3000ppm草甘膦的鉴定结果，随机选取其中转PTP-MC2-EPSPS基因植株中的抗草甘膦和不抗草甘膦转基因烟草植株各3棵、转PTP-MC-EPSPS和转PTP-G2不抗草甘膦转基因烟草植株各3棵、及1棵非转基因烟草植株，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)分别提取叶片总RNA。紫外分光光度测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各RNA浓度。依照invitrogen反转录试剂盒(SuperScriptIIIReverseTranscriptase)所提供的方法进行反转录(1μg总RNA作为模板，反转录引物分别为SEQIDNO:38)。使用引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38扩增PTP，检测该融合蛋白的相对表达情况(PTP与EPSPS基因融合表达，检测PTP的转录水平即代表EPSPS基因的转录水平)。50μlPCR反应体系：50μlPCR反应体系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlcDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO:37和SEQIDNO:38各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。以烟草内源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB158612.1)作为内参，对上述转基因样品进行RT-PCR检测。反转录引物为SEQIDNO:40；PCR引物为SEQIDNO:39和SEQIDNO:40。反转录及PCR体系和条件同上。PCR产物电泳结果如图10所示：1-3为转PTP-MC2-EPSPS基因的抗3000ppm草甘膦T0代转基因烟草植株，4-6为转PTP-MC-EPSPS基因的不抗3000ppm草甘膦T0代转基因烟草植株，7-9为转PTP-G2基因的不抗3000ppm草甘膦草甘膦T0代转基因烟草植株，10-12为转PTP-MC2-EPSPS基因不抗3000ppm草甘膦的T0代转基因烟草植株，13为非转基因对照烟草。上述检测结果表明,对照烟草植株中没有PTP基因的转录；不抗草甘膦的转PTP-MC2-EPSPS基因烟草植株中目的基因转录较弱或没有转录；抗3000ppm草甘膦T0代转PTP-MC2-EPSPS基因的烟草植株与不抗草甘膦的转PTP-MC-EPSPS基因和转PTP-G2基因的烟草中目的基因转录程度基本一致(第9泳道转PTP-G2基因植株转录较弱除外)。以上结果表明，在所转基因的转录基本水平一致的情况下，转PTP-MC2-EPSPS基因烟草植株的草甘膦抗性显著高于转PTP-MC-EPSPS基因或PTP-G2基因烟草植株的草甘膦抗性。实施例7利用农杆菌介导法转化棉花使用农杆菌介导法进行棉花的遗传转化。具体操作步骤如下：1.无菌苗制备(1)棉花种子用浓硫酸(H2SO4)脱去短绒，自来水洗掉种子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇浸泡对种子进行表面消毒1min，再用10％～15％过氧化氢(H2O2)处理2～4h，用无菌水冲洗2～3次；(2)在无菌水中浸泡18～24h,待种子露白，再在无菌条件下剥去种皮，种入种苗培养基(1/2MS(含9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNaEDTA，100μMFeSO4)+琼脂6g/L，pH6.8)中；(3)25℃～28℃光培养3～5天备用。2.棉花外植体与农杆菌的共培养取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，浸入含表达载体pCAMBIA-35S-PTP-MC2质粒的农杆菌菌液(OD600为0.8～1.2)中5～10min，然后取出下胚轴段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在共培养培养基上(MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+琼脂6g/L，pH5.0，培养基表面铺一层灭菌滤纸)，用封口膜封口。于22℃～25℃在暗处共培养2天。3.愈伤组织诱导及抗性愈伤组织的筛选(1)愈伤组织的诱导将所述共培养后的下胚轴段放入愈伤组织诱导培养基中(MS+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+MgCl20.91g/L+脱乙酰吉兰糖胶2.0g/L+卡那霉素50～100mg/L+头孢霉素500mg/L+葡萄糖30g/L，pH5.8)，在25℃培养2个月(一个月换一次相同的培养基)。4.愈伤组织的增殖继代将诱导出的抗性愈伤组织接入增殖培养基(MS培养基+MgCl20.91g/L+脱乙酰吉兰糖胶2.0g/L+葡萄糖30g/L,pH5.8)中，25℃培养，每隔一个月继代一次，直到愈伤组织分化。在第一次和第二次转入增殖培养基后有部分愈伤组织褐化死亡，正常愈伤组织增殖也不快，第二次继代后，愈伤组织增殖速度才加快。5.愈伤组织的分化及转基因苗移栽愈伤组织经几次继代后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基中(无NH4+、且KNO3加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天门冬酰胺0.5g/L+MgCl20.91～1.35g/L+脱乙酰吉兰糖胶2.0～3.0g/L+葡萄糖20～30g/L,pH5.8)，进一步分化成胚状体，胚状体长成为幼苗后再转入大的三角瓶中，待根长好后练苗移栽。洗去再生棉株根部的培养基，栽到灭菌蛭石中，浇足1/2MS(含9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4，蔗糖30g/L)。栽好的再生棉苗放入控温22℃、控湿80～85％的人工培养箱中5～7d，再在温室中培养10～20d后移栽到土盆或大田中。取获得的转基因棉花叶片，提取DNA(方法参照《分子克隆》(第三版))，如实施例4，利用PCR方法鉴定转基因苗，保留经鉴定为阳性的植株。使用与上述相同的农杆菌介导的方法，分别使用含植物表达载体pCAMBIA-35S-PTP-MC或pCAMBIA-35S-PTP-G2的农杆菌LBA4404转化棉花，并通过PCR进行转基因幼苗检测。所述每种质粒分别获得约30个转化事件。实施例8过表达PTP-MC2-EPSPS转基因棉花T0代植株抗草甘膦功能鉴定将4～5叶期的非转基因棉花幼苗和T0代转基因棉花幼苗随机排列，喷施3000ppm草甘膦(商品名：农达，购自深圳诗佳贸易公司)至饱和(每平米喷施50ml)喷施10天后观察试验结果(见图11a-11d)发现，非转基因对照植株都严重萎蔫甚至死亡(图11d)，转PTP-MC2-EPSPS基因的31株棉花中除8株叶片轻度发黄、萎蔫外其余23株均生长正常(图11a为两个转PTP-MC2-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株与其类似，在此未示出)；而27株转PTP-MC-EPSPS基因棉花(图11b为两个转PTP-MC-EPSPS基因抗性棉花植株，其余抗性植株与其类似，在此未示出)和29株转PTP-G2基因的棉花(图11c为两个转PTP-G2基因抗性棉花植株，其余抗性植株与其类似，在此未示出)均表现不同程度叶片发黄、萎蔫，在所述草甘膦浓度处理下未筛选到抗性植株。所述结果表明，转PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株的草甘膦抗性显著高于转PTP-MC-EPSPS基因或PTP-G2基因棉花植株的草甘膦抗性。根据抗性鉴定结果，随机选取所述转PTP-MC2-EPSPS基因植株中的抗草甘膦棉花植株2棵和不抗草甘膦转基因棉花植株3棵、转PTP-MC-EPSPS基因和转PTP-G2基因不抗草甘膦转基因棉花植株各3棵、及1棵非转基因棉花植株提取RNA，进行RT-PCR检测，所用引物及操作步骤如实施例6所述。以陆地棉内源Actin基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/32186889)作为内参，对上述转基因样品进行RT-PCR检测。反转录引物为SEQIDNO:42；PCR引物为SEQIDNO:41：和SEQIDNO:39。反转录及PCR体系和条件同实施例6中烟草Actin基因的检测。扩增产物电泳结果如图12所示：1-2为转PTP-MC2-EPSPS基因的抗草甘膦T0代转基因棉花植株，3-5为转PTP-MC-EPSPS基因的不抗草甘膦T0代转基因棉花植株，6-8为转PTP-G2基因的不抗草甘膦的T0代棉花，9-11为不抗草甘膦的转PTP-MC2-EPSPS基因的T0代棉花，12为非转基因对照棉花。上述检测结果表明,对照棉花植株中没有PTP的转录；不抗草甘膦的转PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株中目的基因转录较弱或没有转录；抗草甘膦T0代转PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株与不抗草甘膦的转PTP-MC-EPSPS基因和转PTP-G2基因棉花中目的基因转录程度基本一致(第8泳道转PTP-G2基因棉花转录较弱除外)。上述结果表明，在所转基因的转录水平基本一致的情况下，转PTP-MC2-EPSPS基因棉花植株的草甘膦抗性显著高于转PTP-MC-EPSPS基因或转PTP-G2基因棉花植株的草甘膦抗性。从实施例2、6和8的结果可知，MC2-EPSPS融合蛋白的抗草甘膦能力比单独的MC-EPSPS蛋白或G2蛋白的抗草甘膦能力有显著提高，并且所述草甘膦抗性的提高是由于蛋白结构的改变引起的，而不是由于基因转录或蛋白表达量的增加引起的。因此，可在外源EPSPS基因表达水平相同的情况下，获得草甘膦抗性更强的转基因植物，从而可规避通过增强外源基因表达水平来提高抗性这一技术方案可能影响受体植物正常生长发育的负面风险。