利用啤酒废酵母制备风味酵母提取物及多糖的方法
【专利摘要】本发明涉及啤酒废酵母的再利用工艺，具体地说，涉及一种利用啤酒废酵母制备风味酵母提取物及多糖的方法。本发明采用天然物质壳聚糖加速酵母细胞自溶，高压匀质破壁使酵母多糖得率高、活性好，且省去了脱盐和去毒等繁杂的步骤，有效避免了对环境的污染；充分利用啤酒废酵母资源，同时得到3种多糖制品和风味酵母提取物，做到了资源的最大化利用；多糖提取工艺能够生产出活性更高的葡聚糖，而且，避免了有机溶剂的污染，实现了资源利用与环境保护相结合，开创了污染少、效益高的生产模式；对β-葡聚糖的粗提物依次利用阴离子交换和伴刀豆亲和层析进行纯化，制得的葡聚糖纯度高、含量高且具有良好生物学活性。
【专利说明】利用啤酒废酵母制备风味酵母提取物及多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及啤酒废酵母的再利用工艺，具体地说，涉及一种利用啤酒废酵母制备风味酵母提取物及多糖的方法。
【背景技术】
[0002]啤酒废酵母是啤酒工业的副产物，在啤酒生产过程中，经主发酵和后发酵的酿造工艺后大量产生。我国现有啤酒企业500多家，年产啤酒4200多万吨，每年产生啤酒废酵母60-90万吨。啤酒废酵母的产生对于整个生态环境具有重要的影响，因此，如能对啤酒废酵母加以综合利用，则可以较大限度地减轻环境污染，保护生态平衡，以便较快地实现绿色啤酒工业发展的目标。
[0003]首先，啤酒废酵母中含有丰富的蛋白质、核酸、维生素、矿物质、多糖等，其细胞壁从外向内分层，分别为甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖。甘露聚糖和葡聚糖作为难以被人体消化的膳食纤维在机体内起着重要的生理活性功能:1、促进胃肠道蠕动，清除有害物质；2、促进肠道内有益菌的生长和繁殖；3、抑制血清胆固醇的升高并使其代谢正常化；4、提高巨噬细胞的活性，增强细胞免疫力。
[0004]其次，啤酒废酵母中还含约大量的海藻糖，海藻糖在生物体内除了作为结构成分，提供能量以外，还对多种生物活性物质具有优异的保护作用。
[0005]第三，啤酒废酵母经自溶后产生的酵母抽提物是一种优良的天然调味料，添加到各类食品中能很好的改善产品风味，提高产品品质。目前，生产酵母抽提物的方法主要有:自溶法、酶分解法和酸分解法等。利用自溶法生产的酵母抽提物蛋白质分解率高、游离氨基酸含量高、风味好、成本较低，但呈味核苷酸含量低，而且，其裂解产物往往固液分离比较困难，还易引起其它微生物的污染。在传统工艺中，一般会加入无机盐(如氯化钠或一些非极性的有机溶剂)加速裂解，但在自溶后的上清液中进行酵母粉的提取时，会引入脱盐或去毒等复杂的工序。此外，一些工艺中采用酶解法加速自溶，但由于价格昂贵，只能局限于实验室分析。
[0006]第四，(6-葡聚糖是从啤酒废酵母自溶后的沉淀中提取的，传统工艺中的热酸碱法会导致葡聚糖链在一定程度上的降解，这不仅降低了产量而且削弱了葡聚糖的生物学功倉泛。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，提供一种利用啤酒废酵母泥制备风味酵母提取物、海藻糖、甘露聚糖及P -葡聚糖的方法，以解决上述的技术问题。
[0008]本发明是通过以下技术方案来实现的:
[0009]一种利用啤酒废酵母制备风味酵母提取物及多糖的方法，其特征在于:包括如下步骤:
[0010]1、浆状的啤酒废酵母加水稀释，经80目筛粗滤2次，得酵母悬浮液；向酵母悬浮液中加浓度为5%的酒石酸脱苦，30分钟后，按照3500转/分的转速进行离心旋转15分钟，弃掉上清液，得纯化的啤酒废酵母；
[0011]2、向纯化的啤酒废酵母中加纯水悬浮酵母细胞，纯化的啤酒废酵母:纯水=1:2 ；向酵母悬浮液中加入溶有壳聚糖的醋酸溶液和5’-磷酸二酯酶粗酶液，pH值调至2.5-7.5，并在30°C -54°C的温度条件下搅拌10-20小时；自动裂解后的酵母悬浮液按照4000转/分的转速进行离心旋转20分钟；产生的上清液过分子量为5000的超滤膜除去大分子物质；超滤滤过液再过分子量为200-300的纳滤膜，纳滤浓缩液在温度为70°C，浓度为30%的乙醇溶液中抽提20分钟，干燥后，制得海藻糖；超滤浓缩液和纳滤滤过液经喷雾干燥后，制得风味酵母提取物；
[0012]3、收集步骤2产生的沉淀物，即酵母细胞壁，将其悬浮于蒸馏水中，然后，通过高压匀质仪进行匀质处理；采用氢氧化钠溶液将经匀质处理的悬浮液的PH值调至7.0 ;搅拌并加热悬浮液至125°C，5小时后，冷却至45 °C，再用蒸馏水稀释，并按照4000转/分的转速进行离心旋转10分钟；得到的一次沉淀物用蒸馏水洗涤2次，备用；上清液转移至新的容器中，搅拌并加入乙醇，直到含水量达到30%，搅拌混合均匀后，置于5°C的条件下过夜；次日过滤，得到的二次沉淀物用浓度为70%的乙醇洗涤2次，并用旋转蒸发仪回收乙醇；经洗涤并回收乙醇的二次沉淀物在70°C的条件下真空干燥，制得无色无定型粉末，即为粗甘露聚糖；粗甘露聚糖通过Sephsdex G_75层析柱提纯,制得精甘露聚糖；
[0013]4、将步骤3中经洗涤的一次沉淀物悬浮于蒸馏水中，总体积至10L，加热至45°C，并用氢氧化钠溶液调PH值调至10.5 ;持续搅拌，并在时间点为O、1.5小时、3小时分别加入Savinase蛋白酶，每次加入量为7.5ml ;持续作用5小时后，用醋酸中和，并按照4000转/分的转速进行离心旋转10分钟；得到的三次沉淀物用蒸馏水洗涤2次，再用乙醇洗涤3次，并用旋转蒸发仪回收乙醇；经洗涤并回收乙醇的三次沉淀物在70°C的条件下真空干燥，制得浅黄色粉末；取40毫克浅黄色粉末，使其溶解于175微升蒸馏水中，经DEAE-S印hacel柱层析处理除去残留的蛋白质，包含有(6-葡聚糖的没有结合的部分用缓冲液洗脱后收集，得到葡聚糖样品；为除去葡聚糖样品中残留的甘露聚糖，用伴刀豆球蛋白A-琼脂糖凝胶柱对葡聚糖样品进行纯化，包含有3 -葡聚糖的没有结合的部分用缓冲液洗脱后收集，用双蒸水透析后，冷冻干燥制得高纯度的3 -葡聚糖。
[0014]有益效果:与现有技术相比，本发明提供了一种高效的啤酒废酵母综合利用方法，可提高啤酒废酵母的利用率，达到废弃物最大资源化，对于减少资源浪费和环境污染具有重要意义，同时，本发明所述的啤酒废酵母的综合利用也显示出良好的市场前景和经济效益。具体地说，本发明具有以下优点:
[0015]1、采用天然物质壳聚糖加速酵母细胞自溶，高压匀质破壁使酵母多糖得率高、活性好，且省去了脱盐和去毒等繁杂的步骤，有效避免了对环境的污染；
[0016]2、充分利用啤酒废酵母资源，同时得到3种多糖制品和风味酵母提取物，做到了资源的最大化利用；
[0017]3、与传统的热酸碱方法相比，本发明的多糖提取工艺能够生产出活性更高的葡聚糖，而且，避免了有机溶剂的污染，实现了资源利用与环境保护相结合，开创了污染少、效益高的生产模式； [0018]4、对(6-葡聚糖的粗提物依次利用阴离子交换和伴刀豆亲和层析进行纯化，制得的葡聚糖纯度高、含量高且具有良好生物学活性。
【具体实施方式】
[0019]以下参考【具体实施方式】，对本发明做进一步的说明。
[0020]本发明所述利用啤酒废酵母制备风味酵母提取物及多糖的方法，包括如下步骤:
[0021]1、纯化啤酒废酵母
[0022]浆状的啤酒废酵母加水稀释，经80目筛粗滤2次，得酵母悬浮液；向酵母悬浮液中加浓度为5%的酒石酸脱苦，30分钟后，按照3500转/分的转速进行离心旋转15分钟，弃掉上清液，得纯化的啤酒废酵母。
[0023]2、制备海藻糖和风味酵母提取物
[0024]向纯化的啤酒废酵母中加纯水悬浮酵母细胞，纯化的啤酒废酵母:纯水=1:2 ;向酵母悬浮液中加入溶有壳聚糖的醋酸溶液和5’ -磷酸二酯酶粗酶液，pH值调至2.5-7.5，并在30°C -54°C的温度条件下搅拌10-20小时；自动裂解后的酵母悬浮液按照4000转/分的转速进行离心旋转20分钟；产生的上清液过分子量为5000的超滤膜除去大分子物质；超滤滤过液再过分子量为200-300的纳滤膜，纳滤浓缩液在温度为70°C，浓度为30%的乙醇溶液中抽提20分钟， 干燥后，制得海藻糖；超滤浓缩液和纳滤滤过液经喷雾干燥后，制得风味酵母提取物；
[0025]在步骤2中，所述壳聚糖的用量为啤酒废酵母的0.05%-2% ;所述5’ -磷酸二酯酶粗酶液制备方法是:称取一定量的新鲜麦芽根，加少许石英砂、少量水研磨数分钟，按原料与水按1:9加水，在5°C下浸提24小时，过滤得5’ -磷酸二酯酶粗酶液。
[0026]3、制备精甘露聚糖
[0027]收集步骤2产生的沉淀物，即酵母细胞壁，将其悬浮于蒸馏水中，然后，通过高压匀质仪进行匀质处理；采用氢氧化钠溶液将经匀质处理的悬浮液的PH值调至7.0 ;搅拌并加热悬浮液至125°C，5小时后，冷却至45 °C，再用蒸馏水稀释，并按照4000转/分的转速进行离心旋转10分钟；得到的一次沉淀物用蒸馏水洗涤2次，备用；上清液转移至新的容器中，搅拌并加入乙醇，直到含水量达到30%，搅拌混合均匀后，置于5°C的条件下过夜；次日过滤，得到的二次沉淀物用浓度为70%的乙醇洗涤2次，并用旋转蒸发仪回收乙醇；经洗涤并回收乙醇的二次沉淀物在70°C的条件下真空干燥，制得无色无定型粉末，即为粗甘露聚糖；粗甘露聚糖通过Sephsdex G_75层析柱提纯,制得精甘露聚糖。
[0028]4、制备高纯度的P -葡聚糖
[0029]将步骤3中经洗涤的一次沉淀物悬浮于蒸馏水中，总体积至10L，加热至45°C，并用氢氧化钠溶液调PH值调至10.5 ;持续搅拌，并在时间点为O、1.5小时、3小时分别加入Savinase蛋白酶，每次加入量为7.5ml ;持续作用5小时后，用醋酸中和，并按照4000转/分的转速进行离心旋转10分钟；得到的三次沉淀物用蒸馏水洗涤2次，再用乙醇洗涤3次，并用旋转蒸发仪回收乙醇；经洗涤并回收乙醇的三次沉淀物在70°C的条件下真空干燥，制得浅黄色粉末；取40毫克浅黄色粉末，使其溶解于175微升蒸馏水中，经DEAE-S印hacel柱层析处理除去残留的蛋白质，包含有(6-葡聚糖的没有结合的部分用缓冲液洗脱后收集，得到葡聚糖样品；为除去葡聚糖样品中残留的甘露聚糖，用伴刀豆球蛋白A-琼脂糖凝胶柱对葡聚糖样品进行纯化(伴刀豆亲和层析，除去能够和伴刀豆A结合的甘露聚糖和甘露蛋白，进一步提高葡聚糖样品纯度)，包含有3 -葡聚糖的没有结合的部分用缓冲液洗脱后收集，用双蒸水透析后，冷冻干燥制得高纯度的3 -葡聚糖。
[0030]步骤4中，采用相对温和的酶解法，而且，不使用极端pH，可以避免对葡聚糖生物学功能产生影响，不但简单快速、容易大规模生产而且提取后废液不含酸碱，对环境污染小，相对于传统的酸碱法更加环保。此外，为了提高(6-葡聚糖的纯度，对(6-葡聚糖的粗提物依次利用阴离子 交换和亲和层析进行了进一步纯化，从而能够得到高纯度、高含量且具有良好生物学活性的葡聚糖。
【权利要求】
1.一种利用啤酒废酵母制备风味酵母提取物及多糖的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)浆状的啤酒废酵母加水稀释，经80目筛粗滤2次，得酵母悬浮液；向酵母悬浮液中加浓度为5%的酒石酸脱苦，30分钟后，按照3500转/分的转速进行离心旋转15分钟，弃掉上清液，得纯化的啤酒废酵母； (2)向纯化的啤酒废酵母中加纯水悬浮酵母细胞,纯化的啤酒废酵母:纯水=1:2 ;向酵母悬浮液中加入溶有壳聚糖的醋酸溶液和5’ -磷酸二酯酶粗酶液，pH值调至2.5-7.5，并在30°C -54°C的温度条件下搅拌10-20小时；自动裂解后的酵母悬浮液按照4000转/分的转速进行离心旋转20分钟；产生的上清液过分子量为5000的超滤膜除去大分子物质；超滤滤过液再过分子量为200-300的纳滤膜，纳滤浓缩液在温度为70V，浓度为30%的乙醇溶液中抽提20分钟，干燥后，制得海藻糖；超滤浓缩液和纳滤滤过液经喷雾干燥后，制得风味酵母提取物； (3)收集步骤(2)产生的沉淀物，即酵母细胞壁，将其悬浮于蒸馏水中，然后，通过高压匀质仪进行匀质处理；采用氢氧化钠溶液将经匀质处理的悬浮液的PH值调至7.0 ;搅拌并加热悬浮液至125°C，5小时后，冷却至45 °C，再用蒸馏水稀释，并按照4000转/分的转速进行离心旋转10分钟；得到的一次沉淀物用蒸馏水洗涤2次，备用；上清液转移至新的容器中，搅拌并加入乙醇，直到含水量达到30%，搅拌混合均匀后，置于5°C的条件下过夜；次日过滤，得到的二次沉淀物用浓度为70%的乙醇洗涤2次，并用旋转蒸发仪回收乙醇；经洗涤并回收乙醇的二次沉淀物在70°C的条件下真空干燥，制得无色无定型粉末，即为粗甘露聚糖；粗甘露聚糖通过Sephsdex G_75层析柱提纯,制得精甘露聚糖； (4)将步骤(3)中经洗涤的一次沉淀物悬浮于蒸馏水中，总体积至10L，加热至45°C，并用氢氧化钠溶液调PH值调至10.5 ;持续搅拌，并在时间点为O、1.5小时、3小时分别加入Savinase蛋白酶，每次加入量为7.5ml ;持续作用5小时后，用醋酸中和，并按照4000转/分的转速进行离心旋转10分钟；得到的三次沉淀物用蒸馏水洗涤2次，再用乙醇洗涤3次，并用旋转蒸发仪回收乙醇；经洗涤并回收乙醇的三次沉淀物在70°C的条件下真空干燥，制得浅黄色粉末；取40毫克浅黄色粉末，使其溶解于175微升蒸馏水中，经DEAE-S印hacel柱层析处理除去残留的蛋白质，包含有(6-葡聚糖的没有结合的部分用缓冲液洗脱后收集，得到葡聚糖样品；为除去葡聚糖样品中残留的甘露聚糖，用伴刀豆球蛋白A-琼脂糖凝胶柱对葡聚糖样品进行纯化，包含有3 -葡聚糖的没有结合的部分用缓冲液洗脱后收集，用双蒸水透析后，冷冻干燥制得高纯度的3 -葡聚糖。
【文档编号】C08B37/02GK103750258SQ201410028092
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】王宜磊, 张海丽, 张明 申请人:王宜磊