相关申请和/或通过引用并入本申请要求提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,267、提交于2014年2月12日的美国临时专利申请61/939,228的优先权。前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。
技术领域：
本发明总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物，该序列靶向例如可使用涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)及其组分的载体系统的、基因组微扰或基因编辑。具体而言，本发明包括优化的模块化CRISPR-Cas酶系统的工程化。关于联邦资助研究的声明本发明是在美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(PioneerAward)DP1MH100706的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
：在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homingmeganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。技术实现要素：发明概述对于具有一系列广泛应用的序列靶向的替代性且稳健的系统和技术存在着迫切需要。本发明着手解决这种需要并且提供了相关优点。CRISPR/Cas或CRISPR-Cas系统(两个术语在本申请通篇可互换地使用)不要求产生靶向特异性序列的定制蛋白，而是通过一个短RNA分子识别一个特异性DNA靶标，可以对单个Cas酶进行程序设计，换句话说可以使用所述短RNA分子将Cas酶募集到一个特异性DNA靶标。将该CRISPR-Cas系统添加到基因组测序技术和分析方法的组库中可以显著使该方法论简化并且提高对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。为了有效而无有害作用地利用CRISPR-Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化和优化方面是至关重要的，这些方面是请求保护的本发明的方面。在一个方面，本发明提供了非天然存在的或工程化的诱导型CRISPR-Cas系统，该系统包含：第一CRISPR酶融合构建体，其附接至诱导型二聚体的第一个一半，和第二CRISPR酶融合构建体，其附接至该诱导型二聚体的第二个一半，其中该第一CRISPR酶融合构建体可操作地连接至一个或多个核定位信号，其中该第二CRISPR酶融合构建体可操作地连接至一个或多个核输出信号，其中与诱导物能量源接触使该诱导型二聚体的该第一个一半和该第二个一半聚到一起，其中使该诱导型二聚体的该第一个一半和该第二个一半聚到一起允许该第一CRISPR酶融合构建体和该第二CRISPR酶融合构建体构成功能性CRISPR-Cas系统，其中该CRISPR-Cas系统包含指导RNA(sgRNA)，该指导RNA包含能够杂交到细胞中的感兴趣的基因组座位中的靶序列上的指导序列，并且其中该功能性CRISPR-Cas系统结合至该靶序列，并且可选地，编辑该基因组座位以改变基因表达。在本发明的一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该诱导型二聚体是或包含诱导型异二聚体或基本上由其组成或由其组成。在一个方面，在诱导型CRISPR-Cas系统中，该诱导型异二聚体的第一个一半或第一部分或第一片段是或包含FKBP(可选地是FKBP12)或由其组成或基本上由其组成。在本发明的一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该诱导型异二聚体的第二个一半或第二部分或第二片段是或包含FRB或由其组成或基本上由其组成。在本发明的一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该第一CRISPR酶融合构建体的安排是或包含N’末端Cas9部分-FRB-NES或由其组成或基本上由其组成。在本发明的一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该第一CRISPR酶融合构建体的安排是或包含NES-N’末端Cas9部分-FRB-NES或由其组成或基本上由其组成。在本发明的一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该第二CRISPR酶融合构建体的安排是或包含C’末端Cas9部分-FKBP-NLS或基本上由其组成或由其组成。在一个方面，本发明提供了在该诱导型CRISPR-Cas系统中该第二CRISPR酶融合构建体的安排是或包含NLS-C’末端Cas9部分-FKBP-NLS或由其组成或基本上由其组成。在一个方面，在诱导型CRISPR-Cas系统中可以存在将该Cas9部分与该诱导型二聚体的一半或部分或片段分开的接头。在一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该诱导物能量源是或包含雷帕霉素或基本上由其组成或由其组成。在一个方面，在诱导型CRISPR-Cas系统中，该诱导型二聚体是诱导型同二聚体。在一个方面，在诱导型CRISPR-Cas系统中，该CRISPR酶是Cas9，例如SpCas9或SaCas9。在一个方面，在诱导型CRISPR-Cas系统中，该Cas9在根据或参考SpCas9的以下分离点的任何一个处被分成两个部分：202A/203S之间的分离位置；255F/256D之间的分离位置；310E/311I之间的分离位置；534R/535K之间的分离位置；572E/573C之间的分离位置；713S/714G之间的分离位置；1003L/104E之间的分离位置；1054G/1055E之间的分离位置；1114N/1115S之间的分离位置；1152K/1153S之间的分离位置；1245K/1246G之间的分离位置；或1098与1099之间的分离。在一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，一个或多个功能结构域与该Cas9酶的一个或两个部分关联，例如，这些功能结构域可选地包含转录激活因子、转录或核酸酶(如Fok1核酸酶)。在一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该功能性CRISPR-Cas系统结合至靶序列并且该酶是deadCas9，该deadCas9当与不具有至少一个突变的CRISPR酶相比时可选地具有降低至少97％或100％的核酸酶活性(或不超过3％并且有利地0％的核酸酶活性)。在一个方面，在该诱导型CRISPR-Cas系统中，该deadCas9(CRISPR酶)包含两个或更多个突变，其中根据SpCas9蛋白或任何相应的直向同源物的D10、E762、H840、N854、N863或D986中的两个或更多个或者根据SaCas9蛋白的N580发生突变，或者该CRISPR酶包含至少一个突变，例如，其中至少H840发生突变。本发明进一步包括并且本发明的一个方面提供了编码如在本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统的多核苷酸。就该CRISPR酶的突变而言，当该酶不是SpCas9时，可以在相应于SpCas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在一个方面，本发明提供了关于在本文讨论的任何或每个或所有实施例，其中该CRISPR酶包含至少一个或多个或至少两个或更多个突变，其中该至少一个或多个突变或该至少两个或更多个突变根据SpCas9蛋白是关于D10、E762、H840、N854、N863或D986，例如就SpCas9而言是D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A，或者根据SaCas9是关于N580，例如就SaCas9而言是N580A，或者Sp或Sa的直向同源物的Cas9中的任何一个或多个对应的突变，或者该CRISPR酶包含至少一个突变，其中对于SpCas9而言至少H840或N863A发生突变或者对于SaCas9而言至少N580A发生突变；例如，其中该CRISPR酶包含根据SpCas9蛋白的H840A、或D10A和H840A、或D10A和N863A，或者Sp蛋白或Sa蛋白的直向同源物的Cas9中的任何一个或多个对应的突变。在一个方面，本发明提供了用于递送如在本文讨论的附接至诱导型二聚体的第一个一半或第一部分或片段并且可操作地连接至一个或多个核定位信号的第一CRISPR酶融合构建体的载体。在一个方面，本发明提供了用于递送附接至诱导型二聚体的第二个一半或第二部分或片段并且可操作地连接至一个或多个核输出信号的该第二CRISPR酶融合构建体的载体。在一个方面，本发明提供了用于递送以下两者的载体：如在本文讨论的附接至诱导型二聚体的第一个一半或第一部分或片段并且可操作地连接至一个或多个核定位信号的第一CRISPR酶融合构建体；以及如在本文讨论的附接至诱导型二聚体的第二个一半或第二部分或片段并且可操作地连接至一个或多个核输出信号的第二CRISPR酶融合构建体。在一个方面，该载体可以是单个质粒或表达盒。在一个方面，本发明提供了用本文讨论的载体中的任一个转化的或表达如在本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统的真核宿主细胞或细胞系。在一个方面，本发明提供了用本文讨论的载体中的任一个转化的或表达本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统的转基因生物或其子代。在一个方面，本发明提供了组成性地表达如在本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统的模式生物。在一个方面，本发明提供了非天然存在的或工程化的诱导型CRISPR-Cas系统，该系统包含：第一CRISPR酶融合构建体，其附接至诱导型异二聚体的第一个一半，和第二CRISPR酶融合构建体，其附接至该诱导型异二聚体的第二个一半，其中该第一CRISPR酶融合构建体可操作地连接至一个或多个核定位信号，其中该第二CRISPR酶融合构建体可操作地连接至核输出信号，其中与诱导物能量源接触使该诱导型异二聚体的该第一个一半和该第二个一半聚到一起，其中使该诱导型异二聚体的该第一个一半和该第二个一半聚到一起允许该第一CRISPR酶融合构建体和该第二CRISPR酶融合构建体构成功能性CRISPR-Cas系统，其中该CRISPR-Cas系统包含指导RNA(sgRNA)，该指导RNA包含能够杂交到细胞中的感兴趣的基因组座位中的靶序列上的指导序列，并且其中该功能性CRISPR-Cas系统编辑该基因组座位以改变基因表达。在一个方面，本发明提供了一种治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括通过用如本文讨论的多核苷酸或本文讨论的载体中的任一个转化该受试者而诱导基因编辑并且向该受试者给予诱导物能量源。本发明包括这种多核苷酸或载体在药剂的制造中的用途，例如，这种药剂用于治疗受试者或用于治疗受试者的这样一种方法。在一个方面，在该方法中还提供了修复模板，例如通过包含所述修复模板的载体递送该修复模板。本发明还提供了一种治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括通过用本文讨论的多核苷酸或本文讨论的载体中的任一个转化该受试者而诱导转录激活或抑制，其中所述多核苷酸或载体编码或包含无催化活性的CRISPR酶和如本文讨论的关联的一个或多个功能结构域；该方法进一步包括向该受试者给予诱导物能量源。因此，本发明尤其包括同二聚体连同异二聚体，deadCas9或基本上没有核酸酶活性的Cas9(例如，通过突变)，其中存在一个或多个NLS和/或一个或多个NES的系统或复合物；连接至分离Cas9的一个或多个功能结构域；方法(包括治疗方法)以及用途。应当理解的是，在本文提及CRISPR酶、Cas或Cas蛋白的情况下；这包括本发明的分离Cas9。在一个方面，本发明提供了用于改变或修饰基因产物表达的方法。所述方法可以包括向含有并表达编码该基因产物的DNA分子的细胞中引入工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统，该系统包含Cas蛋白和靶向该DNA分子的指导RNA，由此该指导RNA靶向编码该基因产物的DNA分子，并且该Cas蛋白切割编码该基因产物的DNA分子，由此改变该基因产物的表达；并且，其中该Cas蛋白和该指导RNA并不天然地一起存在。本发明包括含有融合到tracr序列上的指导序列的指导RNA。本发明进一步包括针对在真核细胞中的表达进行密码子优化的Cas蛋白。在一个优选实施例中，该真核细胞是哺乳动物细胞，并且在一个更优选的实施例中，该哺乳动物细胞是人类细胞。在本发明的一个另外的实施例中，该基因产物的表达被降低。在一个方面，本发明提供了工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统，该系统包含Cas蛋白和靶向在细胞中编码基因产物的DNA分子的指导RNA，由此该指导RNA靶向编码该基因产物的DNA分子，并且该Cas蛋白切割编码该基因产物的DNA分子，由此改变该基因产物的表达；并且，其中该Cas蛋白和该指导RNA并不天然地一起存在；这包括本发明的分离Cas9。本发明包括含有融合到tracr序列上的指导序列的指导RNA。在本发明的一个实施例中，该Cas蛋白是II型CRISPR-Cas蛋白，并且在一个优选实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白。这包括本发明的分离Cas9。本发明进一步包括针对在真核细胞中的表达进行密码子优化的Cas蛋白。在一个优选实施例中，该真核细胞是哺乳动物细胞，并且在一个更优选的实施例中，该哺乳动物细胞是人类细胞。在本发明的一个另外的实施例中，该基因产物的表达被降低。在另一个方面，本发明提供了工程化的、非天然存在的载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，这一种或多种载体包含第一调节元件以及第二调节元件，该第一调节元件可操作地连接至CRISPR-Cas系统的指导RNA，该指导RNA靶向编码基因产物的DNA分子，该第二调节元件可操作地连接至Cas蛋白；这包括本发明的分离Cas9。组分(a)和(b)可以位于该系统的相同或不同载体上。该指导RNA靶向在细胞中编码该基因产物的DNA分子，并且该Cas蛋白切割编码该基因产物的DNA分子，由此改变该基因产物的表达；并且，其中该Cas蛋白和该指导RNA并不天然地一起存在。本发明包括含有融合到tracr序列上的指导序列的指导RNA。在本发明的一个实施例中，该Cas蛋白是II型CRISPR-Cas蛋白，并且在一个优选实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白。这包括本发明的分离Cas9。本发明进一步包括针对在真核细胞中的表达进行密码子优化的Cas蛋白。在一个优选实施例中，该真核细胞是哺乳动物细胞，并且在一个更优选的实施例中，该哺乳动物细胞是人类细胞。在本发明的一个另外的实施例中，该基因产物的表达被降低。在一个方面，本发明提供了包含一种或多种载体的载体系统。在一些实施例中，该系统包含：(a)第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至traer配对序列以及用于在该traer配对序列的上游插入一个或多个指导序列的一个或多个插入位点，其中当表达时，该指导序列引导CRISPR复合物在真核细胞中与靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该traer序列上的traer配对序列复合的CRISPR酶；和(b)第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码所述CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含核定位序列；其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上；这包括本发明的分离Cas9。在一些实施例中，组分(a)进一步包括在该第一调节元件的控制之下在tracr配对序列的下游的tracr序列。在一些实施例中，组分(a)进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个指导序列，其中当表达时，该两个或更多个指导序列中的每个引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个不同靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该系统包含第三调节元件(如聚合酶III启动子)控制之下的tracr序列。在一些实施例中，当最佳比对时，沿着该tracr配对序列的长度，该tracr序列展现至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。在一些实施例中，该CRISPR复合物包括一个或多个核定位序列，该一个或多个核定位序列具有足够强度来在真核细胞的细胞核中驱动所述CRISPR复合物以可检测到的量积聚。不希望受理论限制，认为核定位序列对于真核生物中的CRISPR复合物活性不是必要的，但包括此类序列增强该系统的活性，尤其对于靶向细胞核中的核酸分子而言。在一些实施例中，该CRISPR酶是II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9酶。在一些实施例中，该Cas9酶是肺炎链球菌、化脓链球菌、或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物体的突变的Cas9。该酶可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该CRISPR酶是密码子优化的以便在真核细胞中表达。在一些实施例中，该CRISPR酶引导在该靶序列位置处的一条或两条链的切割。在一些实施例中，该第一调节元件是一种聚合酶III启动子。在一些实施例中，该第二调节元件是一种聚合酶II启动子。在一些实施例中，该指导序列在长度上是至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个核苷酸，或10-30个之间、或15-25个之间、或15-20个之间的核苷酸。通常，并且贯穿本说明书，术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达栽体通常是质粒形式。重组表达载体可包含处于适合于在宿主细胞中的核酸表达的形式的本发明的核酸，这意味着这些重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节元件，所述调节元件可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。这样的调节序列例如描述于戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY)185，学术出版社(AcademicPress)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)中。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施例中，载体包含一个或多个polIII启动子(例如1、2、3、4、5或更多个polI启动子)、一个或多个polII启动子(例如1、2、3、4、5或更多个polII启动子)、一个或多个polI启动子(例如1、2、3、4、5或更多个polI启动子)或其组合。polIII启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。polII启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(可选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(可选地具有CMV增强子)[参见，例如，波沙特(Boshart)等人，《细胞》(Cell)41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子以及EF1α启动子。还被术语“调节元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段(《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)转录物、蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白，等等)。有利的载体包括慢病毒以及腺相关病毒，并且也可选择此类型的载体以靶向具体类型的细胞。在一个方面，本发明提供了真核宿主细胞，该宿主细胞包含：(a)第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至traer配对序列以及用于在该traer配对序列的上游插入一个或多个指导序列的一个或多个插入位点，其中当表达时，该指导序列引导CRISPR复合物在真核细胞中与靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该traer序列上的traer配对序列复合的CRISPR酶；和/或(b)第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码所述CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含核定位序列。在一些实施例中，该宿主细胞包含组分(a)和(b)；这包括本发明的分离Cas9。在一些实施例中，组分(a)、组分(b)、或组分(a)和(b)稳定地整合到该宿主真核细胞的一个基因组中。在一些实施例中，组分(a)进一步包括在该第一调节元件的控制之下在tracr配对序列的下游的tracr序列。在一些实施例中，组分(a)进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个指导序列，其中当表达时，该两个或更多个指导序列中的每个引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个不同靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该真核宿主细胞进一步包括一种第三调节元件，诸如一种聚合酶III启动子，该第三调节元件可操作地连接到所述tracr序列。在一些实施例中，当最佳比对时，沿着该tracr配对序列的长度，该tracr序列展现至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。该酶可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该CRISPR酶是密码子优化的以便在真核细胞中表达。在一些实施例中，该CRISPR酶引导在该靶序列位置处的一条或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶缺少DNA链切割活性。在一些实施例中，该第一调节元件是一种聚合酶III启动子。在一些实施例中，该第二调节元件是一种聚合酶II启动子。在一些实施例中，该指导序列在长度上是至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个核苷酸，或10-30个之间、或15-25个之间、或15-20个之间的核苷酸。在一个方面，本发明提供了非人类真核生物；优选地多细胞真核生物，包含根据所述实施例中任一个的真核宿主细胞。在其他方面，本发明提供了真核生物；优选地多细胞真核生物，包含根据所述实施例中任一个的真核宿主细胞。在这些方面的一些实施例中，该生物体可以是动物；例如哺乳动物。另外，该生物体可以是一种节肢动物，诸如一种昆虫。该生物体也可以是一种植物。进一步，该生物体可以是一种真菌。在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括在此所述的组分中的一种或多种。在一些实施例中，该试剂盒包括一种载体系统以及用于使用该试剂盒的说明书。在一些实施例中，该载体系统包含(a)第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至traer配对序列以及用于在该traer配对序列的上游插入一个或多个指导序列的一个或多个插入位点，其中当表达时，该指导序列指导CRISPR复合物在真核细胞中与靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该traer序列上的traer配对序列复合的CRISPR酶；和/或(b)第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码所述CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含核定位序列，并且有利地这包括本发明的分离Cas9。在一些实施例中，该试剂盒包括位于该系统的相同或不同载体上的组分(a)和(b)。在一些实施例中，组分(a)进一步包括在该第一调节元件的控制之下在tracr配对序列的下游的tracr序列。在一些实施例中，组分(a)进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个指导序列，其中当表达时，该两个或更多个指导序列中的每个引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个不同靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该系统进一步包括一种第三调节元件，诸如一种聚合酶III启动子，该第三调节元件可操作地连接到所述tracr序列。在一些实施例中，当最佳比对时，沿着该tracr配对序列的长度，该tracr序列展现至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。在一些实施例中，该CRISPR酶包括一个或多个核定位序列，该一个或多个核定位序列具有足够强度来在真核细胞的细胞核中驱动所述CRISPR酶以可检测到的量积聚。在一些实施例中，该CRISPR酶是II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9酶。在一些实施例中，该Cas9酶是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物体的突变的Cas9。该酶可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该CRISPR酶是密码子优化的以便在真核细胞中表达。在一些实施例中，该CRISPR酶引导在该靶序列位置处的一条或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶缺少DNA链切割活性。在一些实施例中，该第一调节元件是一种聚合酶III启动子。在一些实施例中，该第二调节元件是一种聚合酶II启动子。在一些实施例中，该指导序列在长度上是至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个核苷酸，或10-30个之间、或15-25个之间、或15-20个之间的核苷酸。在一个方面，本发明提供了修饰在一种真核细胞中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链；这包括本发明的分离Cas9。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体递送到所述真核细胞，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该CRISPR酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、以及该tracr序列。在一些实施例中，所述载体被递送到受试者内的真核细胞中。在一些实施例中，所述修饰发生在细胞培养物中的所述真核细胞中。在一些实施例中，该方法进一步包括在所述修饰之前从受试者中分离所述真核细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括使所述真核细胞和/或从中衍生的细胞返回到所述受试者中。在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上；这包括本发明的分离Cas9。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体递送到所述真核细胞，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该CRISPR酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、以及该tracr序列。在一个方面，本发明提供了产生包含突变的疾病基因的模式真核细胞的方法。在一些实施例中，疾病基因是与患有或产生一种疾病的风险的增加相关联的任何基因。在一些实施例中，该方法包括(a)向真核细胞中引入一种或多种载体，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：CRISPR酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列；和(b)允许CRISPR复合物结合到靶多核苷酸上以实施在所述疾病基因内的该靶多核苷酸的切割，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，由此产生包含突变的疾病基因的模式真核细胞；这包括本发明的分离Cas9。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一个方面，本发明提供了一种用于研发生物活性剂的方法，该生物活性剂调制与疾病基因相关的细胞信号传导事件。在一些实施例中，疾病基因是与患有或产生一种疾病的风险的增加相关联的任何基因。在一些实施例中，该方法包括(a)使测试化合物与所述实施例中的任一项的模式细胞接触；并且(b)检测读数变化，该变化指示与所述疾病基因的所述突变关联的细胞信号传导事件的减少或增加，从而开发调制与所述疾病基因关联的所述细胞信号传导事件的所述生物活性剂。在一个方面，本发明提供包括在tracr配对序列上游的指导序列的一种重组多核苷酸，其中当表达时该指导序列引导一种CRISPR复合物与存在于真核细胞中的一个对应的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该靶序列是存在于真核细胞中的病毒序列。在一些实施例中，该靶序列是原癌基因或癌基因。在一个方面，本发明提供了通过在一个或多个细胞中的基因中引入一个或多个突变来选择一种或多种细胞的方法，该方法包括：将一种或多种载体引入一种或多种细胞中，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：CRISPR酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、tracr序列、以及编辑模板；其中该编辑模板包含消除CRISPR酶切的一个或多个突变；允许该编辑模板与靶多核苷酸在有待筛选的一种或多种细胞中进行同源重组；允许CRISPR复合物结合到靶多核苷酸上以实施在所述基因内的该靶多核苷酸的切割，其中该CRISPR复合物包含与(1)可杂交到该靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该CRISPR复合物与该靶多核苷酸的结合诱导细胞死亡，由此允许选择其中已经引入一个或多个突变的一种或多种细胞；这包括本发明的分离Cas9。在一个优选的实施例中，该CRISPR酶是Cas9。在本发明的另一个优选实施例中，该有待选择的细胞可以是真核细胞。本发明的方面允许选择特异细胞，而不需要选择标记或可能包括反选择系统的两步法。在本文，存在短语“这包括本发明的分离Cas9”或类似文本；并且，这是表明在本文的实施例中的一种或该CRISPR酶或Cas9可以是如本文讨论的分离Cas9。“结合位点”或“活性位点”包括结合腔或区域中的位点(如原子、氨基酸残基的官能团或多个这样的原子和/或基团)或基本上由其组成，该结合腔或区域可以结合至化合物(如核酸分子)，所述化合物涉及在结合中。在本文引用的材料中的CRISPR酶晶体的结构信息允许探询CRISPR酶(例如Cas9)与sgRNA(或嵌合RNA)和靶DNA的相互作用，从而允许工程化或改变或产生该CRISPR酶的模块化或多部分组分，以获得整个CRISPR-Cas系统的新的功能性或者以优化整个CRISPR-Cas系统的功能性。模块化或多部分CRISPR酶还允许产生可以被进一步优化的诱导型CRISPR-Cas系统。诱导型CRISPR-Cas系统的方面描述在提交于2013年7月21日并且于2014年1月30日作为PCT公开WO2014018423A2而公开的标题为“诱导型DNA结合蛋白和基因组干扰工具及其应用(INDUCIBLEDNABINDINGPROTEINSANDGENOMEPERTURBATIONTOOLSANDAPPLICATIONSTHEREOF)”的PCT申请PCT/US2013/051418中，将其内容通过引用以其全文结合在此。在一个方面，本发明涉及非天然存在的或工程化的诱导型CRISPR-Cas系统，该系统包含附接至诱导型异二聚体的第一个一半的第一CRISPR酶融合构建体和附接至该诱导型异二聚体的第二个一半的第二CRISPR酶融合构建体，其中该第一CRISPR酶融合构建体可操作地连接至一个或多个核定位信号，其中该第二CRISPR酶融合构建体可操作地连接至核输出信号，其中与诱导物能量源接触使该诱导型异二聚体的第一个一半和第二个一半聚到一起，其中使该诱导型异二聚体的第一个一半和第二个一半聚到一起允许该第一CRISPR酶融合构建体和该第二CRISPR酶融合构建体构成功能性CRISPR-Cas系统，其中该CRISPR-Cas系统包含指导RNA(sgRNA)，该指导RNA包含能够杂交到细胞中的感兴趣的基因组座位中的靶序列上的指导序列，并且其中该功能性CRISPR-Cas系统编辑该基因组座位以改变基因表达。在本发明的一个实施例中，该诱导型异二聚体的第一个一半是FKBP12并且该诱导型异二聚体的第二个一半是FRB。在本发明的另一个实施例中，该诱导物能量源是雷帕霉素。在本发明的一个优选实施例中，该CRISPR酶是Cas9，例如SpCas9。因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此披露放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前描述的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法的权利。应注意，在本披露并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包括(comprises)”、“包括的(comprised)”、“包括了(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包含(includes)”、“包含的(included)”、“包含了(including)”等等；并且这些术语如“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”和“基本上由……组成(consistsessentiallyof)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。可以有利的是遵循Art.53(c)EPC和Rule28(b)和(c)EPC实践本发明。在本文没有内容应解读为承诺。这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。附图说明本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体提出。通过参考对说明性实施例进行叙述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：图1A-D示出了SpCas9-FRBP12和SpCas9-FRB融合蛋白的产生。(A)卡通图描绘出了11个位置(蓝色三角形)，在这些位置处SpCas9将被分离并融合到FKBP12(C-末端片段)或FRB(N-末端片段)。(B)FKBP12和FRP的结构。融合位点以黄色圆圈指示。(C)由位置#12产生的SpCas9融合蛋白的代表性展示。(D)表格汇总了11种FKBP12/FRB融合物的精确定位。融合侧列的第一个数字是指其中FKBP12将被融合到相应的SpCas9片段上的氨基酸。第二个数字是指其中FRB将被融合到相应的SpCas9片段上的氨基酸。图2A-B示出了(A)PX330和pTB005质粒的卡通图。示出了用于产生SpCas9-FKBPfu15和SpCas9-FRBfu15的代表性引物结合位点。(B)最终的SpCas9-FKPBfu15质粒和中间体SpCas9-FRPfu15质粒的卡通图。最终形式的SpCas9-FRB构建体在N-末端上具有NES。图3A-C示出了掺入了NLS、15个氨基酸接头和20bp吉布森(Gibson)同源侧的序列的PCR引物的表格。图4A-C示出了掺入了产生的无NLS的FRB-Cas9融合段的引物的表格。图5A-C显示雷帕霉素处理诱导SpCas9-FRB/FKBP12融合蛋白的组装并且在EMX1基因座处导致indel形成。(A)SpCas9融合段的卡通图。FPB段在N-末端上包含核输出序列(NES)。FKBP段的侧翼是核定位序列(NLS)。(B)代表性SURVEYOR凝胶，示出了由雷帕霉素诱导的分离Cas9(顶部)和未诱导的分离Cas9(底部)介导的indel形成。(C)由诱导的(蓝色)与未诱导的(橙色)分离Cas9介导的indel形成的定量。图6A-G示出了诱导型分离-Cas9的产生和优化。(a)Cas9的带状物表示。三角形指示分离-4(绿色)和分离-5(红色)的分离位点(b)诱导型分离Cas9融合物的简图。人类密码子优化的化脓链球菌Cas9的N-末端段和C-末端段被分别融合到FRB和FKBP二聚化结构域。(c和d)用于优化分离Cas9系统的策略。在不存在雷帕霉素的情况下(c)，由于添加了来自人类PTK2的NES，Cas9(N)-FRB-NES段螯合在细胞质中。Cas9(C)-FKBP段包含两个NLS并且被主动输入细胞核中。在存在雷帕霉素的情况下(d)，Cas9(N)-FRB-NES结合至Cas9(C)-FKBP。所得重组装的Cas9的NLS介导核输入并且随后结合至靶向的座位。(e)有(左边)和没有(右边)雷帕霉素的情况下，分离-4和分离-5在人类EMX1座位处介导的indel的代表性SURVEYOR测定。箭头指示预期的SURVEYOR片段。Nd＝未检测到(f)含有U6启动子驱动的sgRNA、EFS启动子驱动的分离Cas9段和嘌呤霉素抗性基因(puro)的慢病毒分离Cas9质粒的示意图。2A自切割肽(P2A)将两个分离Cas9段与puro分开。(g)通过EMX1座位和四个注释OT处的深度测序测量的indel频率。在转导后4周(wt-Cas9；n＝2个生物复制)或6周(分离Cas9；n＝3个生物复制)测量indel(****p<0.0001)。雷帕霉素处理持续12天。所有图中都是平均值±s.e.m.。图7A-C示出了使用分离dCas9-VP64融合物的诱导型转录激活。(a)用于转录激活的dCas9(N)-FRB-2xNES和dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64融合物的示意图。每个段都具有注释的点突变(D10A或N863A)，在进行雷帕霉素诱导的组装时，其重构deadCas9。VP64转录激活因子结构域融合至dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64段的C-末端。(b)在用分离-4(Split)和四个sgRNA/基因转染的HEK293FT细胞中通过qPCR测量的ASCL1、MYOD1和IL1RN基因表达。与全长deadCas9-VP64(全长)(n＝3个技术重复)相比，在有和没有雷帕霉素情况下在细胞中对表达进行测量(n＝4个生物重复)。将未转染的细胞用作基线。(c)雷帕霉素处理后2、6、12、24和72小时通过qPCR测量的HEK293FT细胞中的ASCL1表达和N2A细胞中的Neurog2表达(对于每个时间点，n＝3个生物重复)。将细胞用雷帕霉素继续处理(深蓝色圆圈)，仅处理2小时(浅蓝色方块)或未经处理(橙色三角形)。将未转染的细胞用作基线。所有图中都是平均值±s.e.m.。图8A-G显示Cas9可以被分离并且Cas9-FRB/FKBP融合蛋白展现出雷帕霉素诱导型重组装。(a)Cas9一级结构的示意图，其中11个分离位置由红色和绿色箭头指示。红色箭头表示环区中的分离；绿色箭头表示非结构化区域中的分离。N-末端中的末端氨基酸(aa)的位置。Cas9分离在分离#下指示。BH＝桥螺旋，PI＝PAM相互作用结构域。(b)诱导型分离Cas9策略的简图。人类密码子优化的化脓链球菌Cas9的N-末端段和C-末端段被分别融合到FRB和FKBP二聚化结构域。Cas9-FRB/FKBP段是分开且无活性的，直到雷帕霉素诱导的FRB和FKBP的二聚化导致功能性全长Cas9核酸酶的重组装。(c)在经(顶部)和不经(底部)雷帕霉素诱导的情况下，针对所有11种Cas9分离，分离Cas9在人类EMX1座位处介导的indel的代表性SURVEYOR测定。箭头指示预期的SURVEYOR片段。(d)(c)的定量。误差条反映了来自两个单独的生物重复的五个技术重复的SEM。(e)用于测试缺乏二聚化结构域的N-末端和C-末端Cas9段的自动组装的策略的简图。(f)分离-4至分离-6和分离-11在人类EMX1座位处介导的indel的代表性SURVEYOR测定。(g)(f)的定量。误差条反映了来自进行的两个生物重复的三个技术重复的SEM。图9A-B示出了包含分离Cas9的单个载体构建体(A)。在雷帕霉素的存在下，分离Cas9显示出与野生型类似的indel形成，但是在不存在雷帕霉素的情况下indel形成比野生型明显要低(B)。本文的这些图仅仅是出于说明性的目的，并且不一定是按比例绘制的。具体实施方式就关于CRISPR-Cas系统、其组分以及这样的组分的递送(包括方法、材料、递送运载体、载体、粒子、AAV及其制备和使用，包括关于量和配制品，全部在本发明的实践中都是有用的)的一般信息而言，参考：美国专利号8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,889,418和8,895,308；美国专利公开US2014-0310830(美国申请序列号14/105,031)、US2014-0287938A1(美国申请序列号14/213,991)、US2014-0273234A1(美国申请序列号14/293,674)、US2014-0273232A1(美国申请序列号14/290,575)、US2014-0273231(美国申请序列号14/259,420)、US2014-0256046A1(美国申请序列号14/226,274)、US2014-0248702A1(美国申请序列号14/258,458)、US2014-0242700A1(美国申请序列号14/222,930)、US2014-0242699A1(美国申请序列号14/183,512)、US2014-0242664A1(美国申请序列号14/104,990)、US2014-0234972A1(美国申请序列号14/183,471)、US2014-0227787A1(美国申请序列号14/256,912)、US2014-0189896A1(美国申请序列号14/105,035)、US2014-0186958(美国申请序列号14/105,017)、US2014-0186919A1(美国申请序列号14/104,977)、US2014-0186843A1(美国申请序列号14/104,900)、US2014-0179770A1(美国申请序列号14/104,837)和US2014-0179006A1(美国申请序列号14/183,486)、US2014-0170753(美国申请序列号14/183,429)；欧洲专利申请EP2771468(EP13818570.7)、EP2764103(EP13824232.6)和EP2784162(EP14170383.5)；以及PCT专利公开WO2014/093661(PCT/US2013/074743)、WO2014/093694(PCT/US2013/074790)、WO2014/093595(PCT/US2013/074611)、WO2014/093718(PCT/US2013/074825)、WO2014/093709(PCT/US2013/074812)、WO2014/093622(PCT/US2013/074667)、WO2014/093635(PCT/US2013/074691)、WO2014/093655(PCT/US2013/074736)、WO2014/093712(PCT/US2013/074819)、WO2014/093701(PCT/US2013/074800)和WO2014/018423(PCT/US2013/051418)。还参考分别提交于2013年1月30日；2013年3月15日；2013年3月28日；2013年4月20日；2013年5月6日和2013年5月28日的美国临时专利申请61/758,468；61/802,174；61/806,375；61/814,263；61/819,803和61/828,130。还参考提交于2013年6月17日的美国临时专利申请61/836,123。另外参考各自提交于2013年6月17日的美国临时专利申请61/835,931、61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080和61/835,973。进一步参考提交于2013年8月5日的美国临时专利申请61/862,468和61/862,355；提交于2013年8月28日的61/871,301；提交于2013年9月25日的61/960,777和提交于2013年10月28日的61/961,980。又进一步参考：各自提交于2014年6月10日(6/10/14)的PCT专利申请号PCT/US2014/041803、PCT/US2014/041800、PCT/US2014/041809、PCT/US2014/041804和PCT/US2014/041806；提交于2014年6月11日的PCT/US2014/041808；和提交于2014年10月28日的PCT/US2014/62558，以及各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请序列号61/915,150、61/915,301、61/915,267和61/915,260；提交于2013年1月29日和2013年2月25日的61/757,972和61/768,959；提交于2013年6月17日的61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080、61/835,973和61/835,931；均提交于2014年6月11日的62/010,888和62/010,879；各自提交于2014年6月10日的62/010,329和62/010,441；各自提交于2014年2月12日的62/939,256和61/939,242；提交于2014年4月15日的61/980,012；提交于2014年8月17日的62/038,358；各自提交于2014年9月25日的62/054,490、62/055,484、62/055,460和62/055,487；和提交于2014年10月27日的62/069,243。还参考提交于2014年9月25日的美国临时专利申请号62/055,484、62/055,460和62/055,487；提交于2014年4月15日的美国临时专利申请61/980,012；以及提交于2014年2月12日的美国临时专利申请61/939,242。参考提交于2014年6月10日的尤其指定美国的PCT申请，申请号PCT/US14/41806。参考提交于2014年1月22日的美国临时专利申请61/930,214。参考各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,251；61/915,260和61/915,267。参考提交于2014年4月15日的美国临时专利申请USSN61/980,012。参考提交于2014年6月10日的尤其指定美国的PCT申请，申请号PCT/US14/41806。参考提交于2014年1月22日的美国临时专利申请61/930,214。参考各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,251；61/915,260和61/915,267。参考提交于2014年1月22日的美国临时专利申请61/930,214。参考各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,251；61/915,260和61/915,267。参考提交于2014年1月22日的美国临时专利申请61/930,214。参考各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,251；61/915,260和61/915,267。参考分别提交于2012年12月12日、2013年1月2日、2013年3月15日和2013年6月17日的标题均为“用于序列操纵的系统、方法与组合物(SYSTEMSMETHODSANDCOMPOSITIONSFORSEQUENCEMANIPULATION)”的美国临时专利申请61/736,527、61/748,427、61/791,409和61/835,931。还参考分别提交于2013年1月29日和2013年2月25日的标题均为“用于序列操纵的系统、方法与组合物(SYSTEMSMETHODSANDCOMPOSITIONSFORSEQUENCEMANIPULATION)”的美国临时申请61/757,972和61/768,959。还参考了美国临时专利申请61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080以及61/835,973，每个提交于2013年6月17日。这些专利、专利公开和申请的每一者，以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献，连同其中提到的或在其中任何文献中提到并通过引用结合在其中的针对任何产品的任何说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。所有文献(例如，这些专利、专利公开和申请以及申请引用文献)在如同每个单独文献被确切地且单独地指明为通过引用结合的相同程度上通过引用并入本文。就关于CRISPR-Cas系统的一般信息而言，还提及的是以下各项(也通过引用而特此并入本文)：使用CRISPR/Cas系统进行的多元基因组工程化(MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems).丛(Cong)，L.、兰(Ran)，F.A.、科克斯(Cox)D.、林(Lin)，S.、巴雷德(Barretto)，R.、哈比卜(Habib)，N.、徐(Hsu)，P.D.、武(Wu)，X.、江(Jiang)，W.、马拉菲尼(Marraffini)，L.A.、&张(Zhang)，F.《科学》(Science)2月15日；339(6121):819-23(2013)；使用CRISPR-Cas系统对细菌基因组进行RNA-指导的编辑(RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems).江(Jiang)W.、比卡德(Bikard)D.、科克斯(Cox)D.、张(Zhang)F、马拉菲尼(Marraffini)LA.《自然生物技术》(NatBiotechnolMar)；31(3):233-9(2013)；通过CRISPR/Cas-介导的基因组工程化在多基因中携带突变的小鼠的一步产生(One-StepGenerationofMiceCarryingMutationsinMultipleGenesbyCRISPR/Cas-MediatedGenomeEngineering).王(Wang)H.、杨(Yang)H.、奇瓦里拉(Shivalila)CS.、多拉蒂(Dawlaty)MM.、程(Cheng)AW.、张(Zhang)F.、耶尼施(Jaenisch)R.《细胞》(Cell)5月9日；153(4):910-8(2013)；哺乳动物内源转录和外遗传状态的光控制(Opticalcontrolofmammalianendogenoustranscriptionandepigeneticstates).科纳曼(Konermann)S、布里格姆(Brigham)MD、特里维诺(Trevino)AE、徐(Hsu)PD、海登里希(Heidenreich)M、丛(Cong)L、普莱特(Platt)RJ、斯科特(Scott)DA、丘奇(Church)GM、张(Zhang)F.《自然》(Nature).2013年8月22日；500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.电子版2013年8月23日；通过RNA指导的CRISPRCas9进行的双切以用于增强的基因组编辑特异性(DoubleNickingbyRNA-GuidedCRISPRCas9forEnhancedGenomeEditingSpecificity).兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、林(Lin)，CY.、古滕伯格(Gootenberg)，JS.、科纳曼(Konermann)，S.、特里维诺(Trevino)，AE.、斯科特(Scott)，DA.、井上(Inoue)，A.、马托巴(Matoba)，S.、张(Zhang)，Y.、&张(Zhang)，F.《细胞》(Cell)8月28日.pii:S0092-8674(13)01015-5.(2013)；RNA指导的Cas9核酸酶的DNA靶向特异性(DNAtargetingspecificityofRNA-guidedCas9nucleases).徐(Hsu)，P.、斯科特(Scott)，D.、温斯坦(Weinstein)，J.、兰(Ran)，FA.、科纳曼(Konermann)，S.、阿格瓦拉(Agarwala)，V.、李(Li)，Y.、法恩(Fine)，E.、吴(Wu)，X.、沙勒姆(Shalem)，O.、克拉迪克(Cradick)，TJ.、马拉菲尼(Marraffini)，LA.、包(Bao)，G.、&张(Zhang)，F.《自然生物技术》(NatBiotechnol)doi:10.1038/nbt.2647(2013)；使用CRISPR-Cas9系统进行的基因组工程化(GenomeengineeringusingtheCRISPR-Cas9system).兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、赖特(Wright)，J.、阿格瓦拉(Agarwala)，V.、斯科特(Scott)，DA.、张(Zhang)，F.《自然工具》(NatureProtocols)十一月；8(11):2281-308.(2013)；在人类细胞中基因组规模CRISPR-Cas9敲除筛选(Genome-ScaleCRISPR-Cas9KnockoutScreeninginHumanCells).沙勒姆(Shalem)，O.、桑耶纳(Sanjana)，NE.、哈尔特宁(Hartenian)，E.、史(Shi)，X.、斯科特(Scott)，DA.、迈克尔森(Mikkelson)，T.、赫克尔(Heckl)，D.、埃伯特(Ebert)，BL.、罗特(Root)，DE.、登奇(Doench)，JG.、张(Zhang)，F.《科学》(Science)12月12.(2013).[电子版先于印刷版]；在与指导RNA和靶DNA复合物中的cas9的晶体结构(Crystalstructureofcas9incomplexwithguideRNAandtargetDNA).尼氏玛素(Nishimasu)，H.、兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、科纳曼(Konermann)，S.、舍哈塔(Shehata)，SI.、多米耶(Dohmae)，N.、石谷(Ishitani)，R.、张(Zhang)，F.、努尔基(Nureki)，O.《细胞》(Cell)2月27.(2014).156(5):935-49；在哺乳动物细胞中CRISPR内切核酸酶Cas9的基因组宽结合(Genome-widebindingoftheCRISPRendonucleaseCas9inmammaliancells).吴(Wu)X.、斯科特(Scott)DA.、凯里兹(Kriz)AJ.、邱(Chiu)AC.、徐(Hsu)PD.、达东(Dadon)DB.、程(Cheng)AW.、特里维诺(Trevino)AE.、科纳曼(Konermann)S.、陈(Chen)S.、耶尼施(Jaenisch)R.、张(Zhang)F.、夏普(Sharp)PA.《自然生物技术》(NatBiotechnol.)(2014)4月20日.doi:10.1038/nbt.2889，用于基因组编辑和癌症建模的CRISPR-Cas9敲入小鼠(CRISPR-Cas9KnockinMiceforGenomeEditingandCancerModeling)，普拉特(Platt)等人，《细胞》(Cell)159(2):440-455(2014)DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014，用于基因组工程化的CRISPR-Cas9的开发与应用(DevelopmentandApplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering)，徐(Hsu)等人，《细胞》(Cell)157，1262-1278(2014年6月5日)(徐2014)，使用CRISPR/Cas9系统在人类细胞中进行遗传筛选(GeneticscreensinhumancellsusingtheCRISPR/Cas9system)，王(Wang)等人，《科学》(Science).2014年1月3日；343(6166):80-84.doi:10.1126/science.1246981，用于CRISPR-Cas9介导的基因失活的高活性sgRNA的合理设计(RationaldesignofhighlyactivesgRNAsforCRISPR-Cas9-mediatedgeneinactivation)，多恩奇(Doench)等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)，在线公开于2014年9月3日；doi:10.1038/nbt.3026，以及使用CRISPR-Cas9在哺乳动物脑中对基因功能进行体内探询(InvivointerrogationofgenefunctioninthemammalianbrainusingCRISPR-Cas9)，斯维奇(Swiech)等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)；在线公开于2014年10月19日；doi:10.1038/nbt.3055。将这些文献的每一个通过引用并入本文，并且简要讨论如下：丛(Cong)等人基于嗜热链球菌Cas9以及还有化脓链球菌Cas9两者改造了II型CRISPR/Cas系统以用于在真核细胞中使用，并且证实了Cas9分子可以通过短RNA指导以诱导在人类和小鼠细胞中DNA的精确切割。他们的研究进一步显示Cas9在转化成一种切口酶时可以用来以最低诱变活性促进在真核细胞中的同源定向修复。另外，他们的研究证实多个指导序列可以被编码进单一CRISPR阵列中以使得能够在哺乳动物基因组内的内源性基因组座位位点处同时编辑若干，证实了RNA指导的核酸酶技术的容易可编程性和广泛可应用性。这种使用RNA以编程细胞内序列特异性DNA切割的能力定义了新一类的基因组编辑工具。这些研究进一步显示，其他CRISPR座位可能是可移植入哺乳动物细胞中的，并且还可以介导哺乳动物基因组切割。重要地，可以设想的是CRISPR/Cas系统的若干方面可以进一步改进以增加其效率和多功能性。江(Jiang)等人使用规律间隔成簇短回文重复(CRISPR)-关联的Cas9内切核酸酶，与双-RNA复合，以在肺炎链球菌和大肠杆菌的基因组中引入精确的突变。该途径依赖于在靶基因组位点处的双-RNA:Cas9-引导的切割，以杀死未突变的细胞，并且回避对选择性标记或反选择系统的需要。该研究报道通过改变短CRISPRRNA(crRNA)的序列以使单一-和多个多核苷酸变化被携带在编辑模板上而重编程双-RNA:Cas9特异性。该研究显示，同时使用两种crRNA使得多元诱变成为可能。另外，当该途径与重组工程组合使用时，在肺炎链球菌中使用描述的途径回收的接近100％的细胞包含希望的突变，并且在大肠杆菌中回收的65％包含突变。科纳曼(Konermann)等人解决了在本领域中对通用和稳固技术的需要,其使得能够基于CRISPRCas9酶以及还有转录激活因子样效应子对DNA-结合结构域进行光调节和化学调节。来自微生物CRISPR-Cas系统的Cas9核酸酶通过20nt指导序列而靶向特异性基因组座位，其可以耐受与该DNA靶标的某些错配并由此促进不希望的脱靶诱变。为了解决此问题，兰(Ran)等人描述了将Cas9切口酶突变体与配对的指导RNA相组合以引入靶向的双链断裂的途径。因为基因组中的单独切口以高保真性被修复，所以同时经由适当补偿指导RNA而形成切口对于双链断裂是必需的，并且所述切口形成延伸了特异性识别的碱基的数目以用于靶标切割。作者证实了使用配对的切口形成可以降低在细胞系中的脱靶活性50至1,500倍，并且从而促进在小鼠受精卵中的基因敲除而不牺牲中靶切割效率。这个通用策略使得多种多样的要求高特异性的基因组编辑应用成为可能。徐(Hsu)等人表征了在人类细胞中SpCas9靶向特异性以告知靶位点的选择并避免脱靶效应。该研究评价了在293T和293FT细胞中的>100个预测的基因组脱靶座位处>700个指导RNA变体和SpCas9-诱导的indel突变水平。这些作者报道SpCas9以序列依赖性方式耐受指导RNA与靶DNA之间在不同位置处的错配，对错配的数目、位置和分布敏感。这些作者进一步示出SpCas9-介导的切割不受DNA甲基化的影响，并且SpCas9和sgRNA的剂量可被滴定为使得脱靶修饰最小化。另外，为了促进哺乳动物基因组工程应用，这些作者报道提供基于网络的软件工具以指导靶序列的选择和验证连同脱靶分析。兰(Ran)等人描述了用于在哺乳动物细胞中Cas9-介导的经由非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)基因组编辑、连同产生修饰的细胞系(以用于下游功能研究)的一组工具。为了最小化脱靶切割，这些作者进一步描述了一种双-切口策略，使用的是Cas9切口酶突变体与配对的指导RNA。由这些作者提供的方案经实验得出用于选择靶位点、评价切割效率和分析脱靶活性的指南。这些研究显示，以靶设计开始，基因修饰可以在少至1-2周内实现，并且修饰的克隆细胞系可以在2-3周内得以衍生。沙勒姆(Shalem)等人描述了新的在基因组广度范围上探询基因功能的方式。他们的研究显示，递送基因组范围的CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)文库利用64,751个独特的指导序列靶向18,080个基因，这些指导序列使得在人类细胞中阴性和阳性选择筛选两者成为可能。首先，这些作者显示，使用该GeCKO文库来鉴定癌症和多能干细胞中对于细胞活力至关重要的基因。接着，在黑色素瘤模型中，这些作者针对基因进行筛选，这些基因的损失涉及对维罗非尼(一种抑制突变体蛋白激酶BRAF的治疗剂)的抗性。他们的研究显示，最高级候选物包括先前验证的基因NF1和MED12连同新颖的命中物NF2、CUL3、TADA2B、和TADA1。这些作者观察到在靶向相同基因的独立指导RNA之间的高水平的一致性以及高比率的命中确认，并且因此证实了采用Cas9进行基因组范围筛选的前景。尼氏玛素(Nishimasu)等人以2.5A°分辨率报道了与sgRNA复合的化脓链球菌Cas9以及其靶DNA的晶体结构。该结构揭示了一种由靶识别和核酸酶叶片组成的两叶片构造，其将sgRNA:DNA异源双链体容纳在它们的界面处的带正电的凹槽中。然而识别叶片对于结合sgRNA和DNA是至关重要的，核酸酶叶片包含HNH和RuvC核酸酶结构域，这些结构域适合地被定位为分别用于靶DNA的互补和非互补链的切割。核酸酶叶片还包含负责与原型间隔子邻近基序(PAM)相互作用的羧基-末端结构域。这种高分辨率结构和伴随的功能分析已经揭示了RNA-指导的由Cas9进行的DNA靶向的分子机制，由此为合理设计新的通用基因组编辑技术做好准备。吴(Wu)等人标定了在小鼠胚胎干细胞(mESC)中，来自化脓链球菌的无催化活性Cas9(dCas9)(加载有单一指导RNA(sgRNA))的基因组广度的结合位点。这些作者显示，测试的四种sgRNA中的每一种将dCas9靶向至数十和数千个之间的基因组位点，这些基因组位点频繁地通过sgRNA中的5-核苷酸种子区和NGG原型间隔子邻近基序(PAM)表征。染色质不可接近性降低了dCas9与具有匹配种子序列的其他位点的结合；因此70％的脱靶位点是与基因相关联的。这些作者显示，在用催化活性的Cas9转染的mESC中295dCas9结合位点的靶向测序鉴定出超过背景水平的仅一个突变位点。这些作者提出了一种针对Cas9结合和切割的两态模型，其中种子匹配触发了结合但是需要与靶DNA的广泛配对用于切割。徐(Hsu)2014是一篇综述文章，它大体讨论了CRISPR-Cas9的从酸奶到基因组编辑的历史，包括细胞的基因筛选，其在2014年6月5日之前提交的本说明书的谱系中的申请的信息、数据和发现中。徐2014的总体传授不涉及本说明书的特定模型、动物。还提及的是蔡(Tsai)等人，“用于高度特异性基因组编辑的二聚体CRISPRRNA-指导的FokI核酸酶(DimericCRISPRRNA-guidedFokInucleasesforhighlyspecificgenomeediting)”，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)32(6):569-77(2014)，据信其不是本发明或申请的现有技术，但是可以在本发明的实践中考虑。并且提及的是以下美国临时申请：提交于2013年12月12日的61/915,251、提交于2014年1月22日的61/930,214、提交于2014年4月15日的61/980,012；以及尼氏玛素(Nishimasu)等人，“与指导RNA和靶DNA复合的Cas9的晶体结构(CrystalStructureofCas9inComplexwithGuideRNAandTargetDNA)”，《细胞》(Cell)156(5):935-949，DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001(2014)，其各自并且全部通过引用并入本文，尤其是就涉及Cas9晶体的“本文引用的材料”而言。诱导物能量源可以被简单地认为是诱导物或二聚化剂。出于一致性，本文始终使用术语‘诱导物能量源’。该诱导物能量源(或诱导物)用以重构Cas9。在一些实施例中，该诱导物能量源通过诱导型二聚体的两个一半的作用使Cas9的两个部分聚到一起。因此诱导型二聚体的两个一半在诱导物能量源的存在下被聚到一起。二聚体的两个一半在没有诱导物能量源的情况下将不形成到二聚体(二聚化)。因此，诱导型二聚体的两个一半与诱导物能量源协作，以二聚化该二聚体。这进而通过使Cas9的第一部分和第二部分聚到一起而重构Cas9。CRISPR酶融合构建体各自包含分离Cas9的一部分。这些构建体优选地经由接头(如本文描述的GlySer接头)融合至该二聚体的两个一半之一。该二聚体的两个一半可以是基本上相同的一起形成同二聚体的两种单体，或者它们可以是不同的一起形成异二聚体的单体。因此，两种单体可以被认为是整个二聚体的一半。在Cas9酶的两个部分实质上包含功能化Cas9的意义上，该Cas9是分离的。该Cas9可以充当基因组编辑酶(当与靶DNA和指导物形成复合物时)，如切口酶或核酸酶(切割DNA的两条链)，或者它可以是基本上作为具有非常少的或没有催化活性的DNA结合蛋白的deadCas9，这典型地是由于其催化结构域中的两个或更多个突变(D10与H840或N863组合，并且尤其是D10A与H840A或N863A组合在SpCas9中是最优选的并且相应的突变体适于直向同源物)。分离Cas9的两个部分可以被认为是该分离Cas9的N’末端部分和C’末端部分。融合典型地是在Cas9的分离点。换言之，分离Cas9的C’末端或N’末端部分融合至二聚体两个一半之一，同时N’末端的C’末端部分融合至二聚体的另一半。在断裂是新产生的意义上，Cas9不一定是分离的。典型地经由计算机模拟设计分离点并将其克隆到构建体中。总之，分离Cas9的两个部分(N’末端和C’末端部分)形成完整的Cas9，优选地包含至少70％或更多的野生型氨基酸(或编码它们的核苷酸)，优选至少80％或更多、优选至少90％或更多、优选至少95％或更多并且最优选至少99％或更多的野生型氨基酸(或编码它们的核苷酸)。一些修剪是可能的，并且设想了突变体。可以完全去除非功能性结构域(如Rec2结构域)。重要的是，这两个部分可以被聚到一起并且所希望的Cas9功能被恢复或重构。该二聚体可以是同二聚体或异二聚体。本文提供了实例。可以在与第一CRISPR酶构建体的可操作连接中使用一个或多个(优选两个)NLS。可以在与第一CRISPR酶构建体的可操作连接中使用一个或多个(优选两个)NES。NLS和/或NES优选地在分离Cas9-二聚体(即半二聚体)融合物的侧翼，即，一个NLS可以定位在第一CRISPR酶构建体的N’末端并且一个NLS可以定位在第一CRISPR酶构建体的C’末端。类似地，一个NES可以定位在第二CRISPR酶构建体的N’末端并且一个NES可以定位在第二CRISPR酶构建体的C’末端。当提及N’或C’末端时，应当理解的是，这些末端对应于相应核苷酸序列中的5’端和3’端。一种优选的安排是第一CRISPR酶构建体被安排成5’-NLS-(N’末端Cas9部分)-接头-(二聚体的第一个一半)-NLS-3’。一种优选的安排是第二CRISPR酶构建体被安排成5’-NES--(二聚体的第二个一半)-接头-(C’末端Cas9部分)-NES-3’。适合的启动子优选在这些构建体各自的上游。这两种构建体可以分开或一起递送。在一些实施例中，与第二CRISPR酶构建体的可操作连接中的一个或全部NES可以被换为NLS。然而，这典型地不是优选的，并且在其他实施例中，与第二CRISPR酶构建体的可操作连接的定位信号是一个或多个NES。还应当理解的是，NES可以可操作地连接至分离Cas9的N’末端片段，并且NLS可以可操作地连接至分离Cas9的C’末端片段。然而，优选的是这样的安排，其中NLS可操作地连接至分离Cas9的N’末端片段并且NES可操作地连接至分离Cas9的C’末端片段。NES用以将第二CRISPR酶融合构建体定位在细胞核外，至少直到提供诱导物能量源(例如，至少直到向诱导物提供能量源以执行其功能)。诱导物的存在刺激两种CRISPR酶融合物在细胞质中二聚化并且使得对于二聚化的第一和第二CRISPR酶融合物定位至细胞核而言在热力学上有价值。不被理论所束缚，申请人认为NES将第二CRISPR酶螯合到细胞质上(即细胞核外)。第一CRISPR酶上的NLS将它定位至细胞核。在两种情况下，申请人使用NES或NLS将平衡(核运输的平衡)转向希望的方向。二聚化典型地发生细胞核外(非常小的部分可能发生在细胞核中)并且二聚化的复合物上的NLS将核运输平衡转向核定位，因此二聚化并且因此重构的Cas9进入细胞核。显示出这的示意图提供在图6C和6D中。有益地，申请人已经能够在分离Cas9中重构功能。使用瞬时转染来证明这个概念并且二聚化在存在诱导物能量源的背景下发生。没有看到CRISPR酶的分开片段具有活性。然后使用通过慢病毒递送的稳定表达使其显现出并且显示可以使用分离Cas9方法。本发明的这种分离Cas9方法是有益的，因为它允许诱导Cas9活性，因此允许时间控制。此外，可以使用不同的定位序列(即，NES和NLS是优选的)，以减少来自自动组装复合物的背景活性。还可以使用组织特异性启动子(例如第一和第二CRISPR酶融合构建体各自的启动子)用于组织特异性靶向，由此提供空间控制。可以使用两种不同的组织特异性启动子来发挥更好程度的控制，如果需要的话。就阶段特异性启动子而言可以使用相同的方法或者可以存在阶段和组织特异性启动子的混合物，其中第一和第二CRISPR酶融合构建体之一处于组织特异性启动子的控制下(即可操作地连接至或包含)，同时第一和第二CRISPR酶融合构建体中的另一者处于阶段特异性启动子的控制下(即可操作地连接至或包含该启动子)。诱导型CRISPR-Cas系统包含一个或多个核定位序列(NLS)，如在此所描述的，例如像可操作地连接至第一CRISPR酶融合构建体。这些核定位序列理想地具有足够的强度，以便驱动所述第一CRISPR酶融合构建体在真核细胞的细胞核中以可检测到的量积聚。不希望被理论所束缚，认为核定位序列对于真核生物中的CRISPR复合物活性不是必要的，但包括此类序列增强该系统的活性，尤其对于靶向细胞核中的核酸分子而言，并且帮助操作本发明的2-部分系统。同样地，第二CRISPR酶融合构建体可操作地连接至核输出序列(NES)。的确，它可以连接至一个或多个核输出序列。换言之，与第二CRISPR酶融合构建体一起使用的输出序列的数目优选是1或2或3。典型地2是优选的，但是在一些实施例中1是足够的并且因此是优选的。NLS和NES的适合实例在本领域是已知的。优选的实例是在本文的实例中使用的那些。例如，优选的核输出信号(NES)是人类蛋白酪氨酸激酶2；以及(NLS)。优选的信号将是物种特异性的。在使用FRB和FKBP系统的情况下，FKBP的侧翼优选是核定位序列(NLS)。在使用FRB和FKBP系统的情况下，优选的安排是N’末端Cas9-FRB-NES:C’末端Cas9-FKBP-NLS。因此，第一CRISPR酶融合构建体将包含C’末端Cas9部分并且第二CRISPR酶融合构建体将包含N’末端Cas9部分。本发明的另一个有益方面是它可以被快速开启，即具有快速响应。不被理论所束缚，认为Cas9活性可以通过二聚化现有(已经存在)的融合构建体(通过与诱导物能量源接触)进行诱导，这比通过表达(尤其是翻译)新的融合构建体更迅速。因此，第一和第二CRISPR酶融合构建体可以提前在靶细胞中进行表达，即需要Cas9活性之前。然后可以在时间上控制Cas9活性并且然后通过添加诱导物能量源来快速构建，这理想地比通过表达(包括转录的诱导)由例如载体递送的Cas9更快速地起作用(以二聚化异二聚体并且由此提供Cas9活性)。除非另外显而易见的，术语Cas9和CRISPR酶在本文可互换地使用。然而，CRISPR酶优选是Cas9并且最优选Sp(化脓链球菌)Cas9或其变体或衍生物。在实例2中，申请人证明Cas9可以被分成两种组分，当被聚回到一起时其重构功能性核酸酶。采用雷帕霉素敏感型二聚化结构域，申请人产生了用于对Cas9介导的基因组编辑和转录调节进行时间控制的化学诱导型Cas9。换句话说，我们已经证明通过被分成两个片段可以使Cas9成为化学诱导型的，并且雷帕霉素敏感型二聚化结构域可以被用于Cas9的受控重组装。申请人表明重组装的Cas9可以用来介导基因组编辑(通过核酸酶/切口酶活性)以及转录调节(作为DNA结合结构域，所谓的“deadCas9”)。因此，使用雷帕霉素敏感型二聚化结构域是优选的。Cas9的重组装是优选的。可以通过恢复结合活性来确定重组装。在Cas9是切口酶或诱导双链断裂的情况下，本文描述了相比于野生型的适合的比较百分比。雷帕霉素处理持续12天。将它以200nM给予。这种时间和/或摩尔剂量是针对人类胚肾293FT(HEK293FT)细胞系的适当剂量的实例并且这可以用在其他的细胞系中。这个数字可以被外推用于体内治疗应用，例如以mg/kg计。然而，还可以设想的是，这里还使用了用于向受试者给予雷帕霉素的标准剂量。所谓“标准剂量”意指在雷帕霉素的正常治疗应用或主要适应症下的剂量(即当给予雷帕霉素用于预防器官排斥时使用的剂量)。图8提供了Cas9一级结构的示意图，其中11个分离位置的优选实例由红色和绿色箭头指示。红色箭头(数字1-4和10)表示环区中的分离，而绿色箭头(数字5-9和11)表示非结构化区域中的分离。下文讨论考虑的分离。值得注意的是，Cas9-FRB/FKBP段的优选安排是分开且无活性的，直到雷帕霉素诱导的FRB和FKBP的二聚化导致功能性全长Cas9核酸酶的重组装。因此，优选的是附接至诱导型异二聚体的第一个一半的第一CRISPR酶融合构建体与附接至诱导型异二聚体的第二个一半的第二CRISPR酶融合构建体分开递送和/或分开定位。为了将Cas9(N)-FRB片段螯合在细胞质中，在细胞质中它不太可能与核定位的Cas9(C)-FKBP片段二聚化，优选的是在Cas9(N)-FRB上使用来自人类蛋白酪氨酸激酶2的单个核输出序列(NES)(Cas9(N)-FRB-NES)。在雷帕霉素的存在下，Cas9(N)-FRB-NES与Cas9(C)-FKBP-2xNLS二聚化，以重构完整的Cas9蛋白，其将核运输平衡转向核输入并且允许DNA靶向(图6C-D)。高剂量的Cas9可以加重脱靶(OT)序列处的indel频率，这些序列展现出与指导链的几个错配。此类序列是尤其敏感的，如果错配是非连续的和/或在指导物的种子区外的话。因此，Cas9活性的时间控制可以用于降低长期表达实验中的剂量并且因此与组成型活性的Cas9相比，产生减少的脱靶indel。病毒递送是优选的。具体而言，设想了慢病毒或AAV递送载体。申请人产生了分离-Cas9慢病毒构建体，类似于lentiCRISPR质粒。分离段应足够小以配合AAV的约4.7kb的尺寸限制。申请人的数据证明，分离Cas9的稳定的、低拷贝表达可以用于在靶向的座位处诱导实质性indel而不在脱靶位点处引起显著的突变。申请人克隆了Cas9片段(基于本文描述的分离5的2个部分)。也可以使用deadCas9。这种deadCas9在FRB融合物(dCas9(N)-FRB-2xNES)中具有D10A点突变并且在FKBP融合物中具有N863A点突变并且已经添加了VP64反式激活结构域至Cas9(C)-FKBP-2xNLS中(dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64)(图7A)。这些片段重构了无催化活性的Cas9-VP64融合物(dCas9-VP6)。在雷帕霉素的存在下通过VP64诱导转录激活，以诱导Cas9(C)-FKBP融合物和Cas9(N)-FRB融合物的二聚化。换言之，申请人测试了分离dCas9-VP64的可诱导性并且显示在雷帕霉素的存在下通过分离dCas9-VP64诱导转录激活。因此，本发明的诱导型Cas9可以与一个或多个功能结构域(如转录激活因子或阻遏物或核酸酶(如Fok1))关联。功能结构域可以结合至或与分离Cas9的一部分融合。优选的安排是第一CRISPR酶构建体被安排成5’-第一定位信号-(N’末端Cas9部分)-接头-(二聚体的第一个一半)-第一定位信号-3’并且第二CRISPR酶构建体被安排成5’-第二定位信号--(二聚体的第二个一半)-接头-(C’末端Cas9部分)-第二定位信号-功能结构域-3’。这里，功能结构域被放置在第二CRISPR酶构建体的3’端。可替代地，功能结构域可以被放置在第一CRISPR酶构建体的5’端。可以在3’端或5’端或在两端使用一个或多个功能结构域。适合的启动子优选在这些构建体各自的上游。这两种构建体可以分开或一起递送。定位信号可以是NLS或NES，只要它们在每种构建体中不相互混杂即可。在一个方面，本发明提供了诱导型CRISPR-Cas系统，其中该Cas9(CRISPR酶)当与不具有至少一个突变的CRISPR酶相比时具有降低至少97％或100％的核酸酶活性。在一个方面，本发明提供了任何上述系统，其中该CRISPR酶包含两个或更多个突变，其中根据SpCas9蛋白或任何相应的直向同源物的D10、E762、H840、N854、N863或D986中的两个或更多个或者根据SaCas9蛋白的N580发生突变，或者该CRISPR酶包含至少一个突变，其中至少H840发生突变。在一个方面，本发明提供了本文提到的系统，其中该CRISPR酶包含两个或更多个突变，包含根据SpCas9蛋白或任何相应的直向同源物的D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A或者根据SaCas9蛋白的N580A或者包含H840A的至少一个突变。在一个方面，本发明提供了任何本文提到的系统，其中该CRISPR酶包含根据SpCas9蛋白或任何相应的直向同源物的H840A、或D10A和H840A、或D10A和N863A。在一个方面，本发明提供了任何本文提到的系统，其中该CRISPR酶包含：根据SaCas9蛋白或任何相应的直向同源物的N580A；或根据SpCas9蛋白或任何相应的直向同源物的D10A，；以及根据SaCas9蛋白的N580A。因此，还优选的是该Cas9是deadCas9。理想地，分离应当始终是这样的，使得催化结构域不受影响。对于deadCas9，意图是发生DNA结合，但是不显示切割或切口酶活性。在一个方面，本发明提供了如本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统，其中一个或多个功能结构域与该Cas9关联。这个功能结构域可以与分离Cas9的一部分或两部分关联(即，结合至其上或与其融合)。可以存在与分离Cas9的两个部分各自关联的功能结构域。因此，这些功能结构域可以典型地被提供为第一和/或第二CRISPR酶融合构建体的部分，作为该构建体内的融合物。功能结构域典型地经由接头(如GlySer接头)融合，如本文讨论的。这一个或多个功能结构域可以是转录激活结构域或阻遏物结构域。尽管它们可以是不同的结构域，但是优选的是所有功能结构域是激活因子或阻遏物并且不使用两者的混合物。转录激活结构域可以包含VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA或SET7/9。在一个方面，本发明提供了如本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统，其中与该Cas9关联的一个或多个功能结构域是转录阻遏物结构域。在一个方面，本发明提供了如本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统，其中转录阻遏物结构域是KRAB结构域。在一个方面，本发明提供了如本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统，其中转录阻遏物结构域是NuE结构域、NcoR结构域、SID结构域或SID4X结构域。在一个方面，本发明提供了如本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统，其中与衔接蛋白关联的一个或多个功能结构域具有一种或多种活性，包括甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性、DNA切割活性、DNA整合活性或核酸结合活性。在一些实施例中，组蛋白修饰结构域也是优选的。下文讨论了示例性组蛋白修饰结构域。转座酶结构域、HR(同源重组)机构结构域、重组酶结构域和/或整合酶结构域作为本发明的功能结构域也是优选的。在一些实施例中，DNA整合活性包括HR机构结构域、整合酶结构域、重组酶结构域和/或转座酶结构域。在一个方面，本发明提供了如本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统，其中DNA切割活性是由于核酸酶。在一个方面，本发明提供了如本文讨论的诱导型CRISPR-Cas系统，其中核酸酶包括Fok1核酸酶。此类功能结构域(其与本发明的分离Cas9系统是优选的)的用途还详细讨论在康纳尔曼(Konermann)等人(“用工程化的CRISPR-Cas9复合物进行的基因组范围内的转录激活(Genome-scaletranscriptionalactivationwithanengineeredCRISPR-Cas9complex)”《自然》(Nature)公开于2014年12月11日)中。本发明的系统可以与任何指导物一起使用，但是在一些实施例中，优化的指导物是优选的。特别优选的是根据以上提及的康纳尔曼(Konermann)(《自然》(Nature)，2014年12月11日)论文的指导物。修饰这些指导物，这样使得蛋白质结合RNA部分(如适体)被添加至或替换四环(tetraloop)和/或茎环2。然后相应的RNA结合蛋白结构域可以用于识别RNA并且将功能结构域(如本文描述的那些)募集到指导物。这主要用于与deadCas9一起使用，通过核酸酶(如Fok1)导致转录激活或抑制或DNA切割。此类指导物与deadCas9结合使用是强大的，并且是尤其强大的，如果该Cas9本身还与其自身的功能结构域(如本文讨论的)关联的话。当deadCas9(具有或不具有其自身的关联功能结构域)被诱导以根据本发明重构，即作为分离Cas9，则该工具是尤其有用的。指导RNA(sgRNA)(还优选用于在本发明中)可以包含指导序列，该指导序列能够杂交到细胞中的感兴趣的基因组座位中的靶序列上，其中该sgRNA的至少一个环通过插入一个或多个不同的RNA序列而被修饰，这一个或多个RNA序列结合至一种或多种衔接蛋白，并且其中该衔接蛋白与一个或多个功能结构域关联。该CRISPR酶优选是deadCas9。它可以包含至少一个突变，这样使得该CRISPR酶具有不超过5％的不具有该至少一个突变的CRISPR酶的核酸酶活性；和/或至少一个或多个核定位序列。还提供了非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：一种或多种指导RNA(sgRNA)，其包含能够杂交到细胞中的感兴趣的基因组座位中的靶序列上；CRISPR酶，其包含至少一个或多个核定位序列，其中该CRISPR酶包含至少一个突变，这样使得该CRISPR酶具有不超过5％的不具有该至少一个突变的CRISPR酶的核酸酶活性，其中至少一种sgRNA的至少一个环通过插入结合至一种或多种衔接蛋白的一个或多个不同RNA序列而被修饰，并且其中该衔接蛋白与一个或多个功能结构域关联。通过插入结合至一种或多种衔接蛋白的一个或多个不同RNA序列而被优选修饰的sgRNA的至少一个环是四环或茎环2中的一者或两者。插入的结合至一种或多种衔接蛋白的一个或多个不同RNA序列优选是对相同的或不同的衔接蛋白具有特异性的一个适体序列或者两个或更多个适体序列。衔接蛋白优选地包括MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、7s、PRR1。尤其稳定表达分离dCas9的细胞系可以是有用的。申请人已经证明，Cas9可以被分成两个不同的片段，当使用化学诱导被聚回到一起时其重构功能性全长Cas9核酸酶。分离的Cas9构造将有用于多种应用。例如，分离Cas9可以允许通过将每个片段放在不同的组织特异性启动子之下而将Cas9活性限制在交叉的细胞群的遗传策略。另外，还可以采用不同的化学诱导型二聚化结构域(如APA)和赤霉素。该诱导物能量源优选是化学诱导。分离位置或地点是Cas9酶的第一部分与第二部分分开的点。在一些实施例中，第一部分将包含或编码氨基酸1至X，同时第二部分将包含或编码氨基酸X+1至端点。在这个实例中，编号是连续的，但是这可能不总是必要的，因为氨基酸(或编码它们的核苷酸)可以从分离端的任一端修剪下来，其条件是保留足够的DNA结合活性和(如果需要的话)DNA切口酶或切割活性，例如相比于野生型Cas9至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的活性。本文提供的示例性编号可以参考野生型蛋白，优选野生型SpCas9蛋白。然而，设想的是可以使用野生型SpCas9蛋白的突变体。例如，在晶体数据论文本身中，使用deadCas9并且这些在一些实施例中是优选的，参见在本文其他地方的讨论。编号还可以不完全遵循SpCas9编号，因为例如可以使用一些N’或C’末端截短或缺失，但是这可以使用标准序列比对工具解决。作为序列比对工具，直向同源物也是优选的。因此，可以使用本领域的普通技术选择分离位置，例如基于在本文引用的材料中提供的晶体数据。在实例1和2中，申请人研究了SpCas9中的许多分离位置，其全部都起作用，因为申请人能够重构具有诱导型二聚化结构域的Cas9。在实例1中，对以下进行了尝试，如图1中所示，尤其是图1D，复制如下：融合侧结构结构域202A/203S外侧环Rec2255F/256D外侧环Rec2310E/311I外侧环Rec1534R/535K外侧环Rec1572E/573C非结构化的Rec1713S/714G非结构化的Rec11003L/104E非结构化的RuvC31054G/1055E非结构化的RuvC31114N/1115S非结构化的PI1152K/1153S外侧环PI1245K/1246G非结构化的PI示出了SpCas9(总计1368个氨基酸)中的氨基酸分离位置的表格最简单地在晶体结构的帮助下完成潜在的分离侧的鉴定。对于Sp突变体，应该容易地显而易见的是例如序列比对的相应位置是什么。对于非Sp，人们可以使用直向同源物的晶体结构，如果该直向同源物与预期Cas9之间存在相对较高程度的同源性的话。理想地，分离位置应当位于区域或环内。优选地，在氨基酸序列的中断不会引起结构特征(例如α-螺旋或-β片层)的部分或完全破坏的地方出现分离位置。非结构化区域(在晶体结构中不显现的区域，因为这些区域不足够结构化以在晶体中“冻住(frozen)”)通常是优选选择。在本发明的实例中，申请人在所有暴露于SpCas9表面的非结构化区域中进行了分离。非结构化区域或外侧环内的位置可能不需要精确地是以上提供的数字，而是可以与以上给出的位置的任一侧相差例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个氨基酸，取决于环的大小，只要分离位置仍落入非结构化区域或外侧环内即可。在一些实施例中，Rec2结构域的外侧环中的分离是优选的。在其他实施例中，Rec1的外侧环中的分离是优选的。在其他实施例中，PI的外侧环中的分离是优选的。在其他实施例中，Rec1的非结构化区域中的分离是优选的。在其他实施例中，RuvC3的非结构化区域中的分离是优选的。在其他实施例中，PI的非结构化区域中的分离是优选的。申请人遵循作为优选实例并且作为指南提供的以下程序。由于非结构化区域并不显现在晶体结构中，申请人交叉参考了具有SpCas9的一级氨基酸序列的晶体周围的氨基酸序列。每个非结构化区域由3至10个氨基酸构成，这并没有显现在晶体中。申请人因此在这些氨基酸之间进行分离。在SpCas9中仅有非结构化区域中的6个分离是可能的。在这个假设下，通过测试更多的分离，申请人有更高的机会找到起作用的分离(初步怀疑具有较大蛋白质的分离肯定起作用)。为了包括更多的潜在分离侧，申请人使用与非结构化区域相同的标准包括了位于Cas9外的环中的分离。出人意料的是所有以上分离都起作用。在一些实施例中，分离位置在Cas9的外侧环中。在其他优选实施例中，分离位置在Cas9的非结构化区域中。非结构化区典型地是高度挠性的外侧环，其结构不能从晶体图案中容易地确定。分离优选地出现在以上提到的两个氨基酸之间，例如第一行中的202A的C’末端。任何上述分离在SpCas9中都是优选的或者相应位置在突变SpCas9或直向同源物中是优选的。在一些实施例中，分离位置可以在202A/203S之间。在一些实施例中，分离位置可以在255F/256D之间。在一些实施例中，分离位置可以在310E/311I之间。在一些实施例中，分离位置可以在534R/535K之间。在一些实施例中，分离位置可以在572E/573C之间。在一些实施例中，分离位置可以在713S/714G之间。在一些实施例中，分离位置可以在1003L/104E之间。在一些实施例中，分离位置可以在1054G/1055E之间。在一些实施例中，分离位置可以在1114N/1115S之间。在一些实施例中，分离位置可以在1152K/1153S之间。在一些实施例中，分离位置可以在1245K/1246G之间。另一个优选位置是1098与1099之间的分离，如在实例1中提到的。一旦已经鉴定出分离位置，便可以设计适合的构建体。例如，一种这样的构建体示于图1C中，相对于202A/203S之间的分离。典型地，NES被定位在分离氨基酸的第一部分的N’末端(或编码它的核苷酸的5’端)。那样的话，NLS被定位在分离氨基酸的第二部分的C’末端(或编码它的核苷酸的3’端)。以此方式，第一CRISPR酶融合构建体可以可操作地连接至一个或多个核输出信号，并且第二CRISPR酶融合构建体可以可操作地连接至核定位信号。当然，可以提供相反的安排，其中NLS被定位在分离氨基酸的第一部分的N’末端(或编码它的核苷酸的5’端)。那样的话，NES被定位在分离氨基酸的第二部分的C’末端(或编码它的核苷酸的3’端)。因此，第一CRISPR酶融合构建体可以可操作地连接至一个或多个核定位信号，并且第二CRISPR酶融合构建体可以可操作地连接至核输出信号。实例2建立在上文之上并且使用类似的位置。这些位置在下文列出并且接近上文使用的那些。还参见图2(尤其是图2A)和实例2。在一个方面，上文的分离4、5和6是有益的，因为用于包装目的使这两个部分(分离的任一侧)保持大致相同的长度有一些优势。例如，认为当转录物的尺寸大约相同时更易于维持两个段之间的化学计量。在实例2中，人类密码子优化的化脓链球菌Cas9的N-末端和C-末端段被分别融合到FRB和FKBP二聚化结构域。这种安排是优选的。它们可以被切换(即N’末端融合到FKBP并且C’末端融合到FRB)，这种安排同样起作用，但是建议是这种经切换的安排使Cas9的两个部分离得更远。优选在本文中使用接头(如(GGGGS)3)，以将Cas9片段与二聚化结构域分开。(GGGGS)3是优选的，因为是相对较长的接头(15个氨基酸)。甘氨酸残基最具挠性并且丝氨酸残基提高了接头在蛋白质外的机会。(GGGGS)6、(GGGGS)9或(GGGGS)12可以优选用作替代物。其他优选的替代物是(GGGGS)1、(GGGGS)2、(GGGGS)4、(GGGGS)5、(GGGGS)7、(GGGGS)8、(GGGGS)10或(GGGGS)11。例如，图8显示了N’末端Cas9片段与FRB之间的(GGGGS)3。它还显示了FKB与C’末端Cas9片段之间的(GGGGS)3。替代接头是可获得的，但是高度挠性接头被认为最佳地起作用，以允许有最大机会将Cas9的2部分聚在一起并且因此重构Cas9活性。一种替代方案是核质蛋白的NLS可以用作接头。接头还可以用在Cas9与任何功能结构域之间。再一次，这里可以使用(GGGGS)3接头(或其6、9或12个重复形式)，或者核质蛋白的NLS可以用作Cas9与功能结构域之间的接头。设想了FRB/FKBP系统的替代物。例如，ABA和赤霉素系统。因此，FKBP家族的优选实例是以下任何一种诱导型系统。在FK506的存在下与钙调磷酸酶A(CNA)二聚化的FKBP；在FKCsA的存在下与CyP-Fas二聚化的FKBP；在雷帕霉素的存在下与FRB二聚化的FKBP；在库马霉素的存在下与GryB二聚化的GyrB；在赤霉素的存在下与GID1二聚化的GAI；或在HaXS的存在下与HaloTag二聚化的Snap-tag。FKBP家族本身的替代物也是优选的。例如，在FK1012的存在下进行同二聚化的FKBP(即，一个FKBP与另一个FKBP二聚化)。因此，还提供了非天然存在的或工程化的诱导型CRISPR-Cas系统，该系统包含：第一CRISPR酶融合构建体，该构建体附接至诱导型同二聚体的第一个一半，和第二CRISPR酶融合构建体，该构建体附接至该诱导型同二聚体的第二个一半，其中该第一CRISPR酶融合构建体可操作地连接至一个或多个核定位信号，其中该第二CRISPR酶融合构建体可操作地连接至(可选地一个或多个)核输出信号，其中与诱导物能量源接触使该诱导型同二聚体的第一个一半和第二个一半聚到一起，其中使该诱导型同二聚体的第一个一半和第二个一半聚到一起允许该第一和第二CRISPR酶融合构建体构成功能性CRISPR-Cas系统，其中该CRISPR-Cas系统包含指导RNA(sgRNA)，该指导RNA包含能够杂交到细胞中的感兴趣的基因组座位中的靶序列上的指导序列，并且其中该功能性CRISPR-Cas系统结合至该靶序列，并且可选地，编辑该基因组座位以改变基因表达。在一个实施例中，同二聚体优选是FKBP并且诱导物能量源优选是FK1012。在另一个实施例中，同二聚体优选是GryB并且诱导物能量源优选是库马霉素。在另一个实施例中，同二聚体优选是ABA并且诱导物能量源优选是赤霉素。在其他实施例中，该二聚体是异二聚体。异二聚体的优选实例是以下任何一种诱导型系统：在FK506的存在下与钙调磷酸酶A(CNA)二聚化的FKBP；在FKCsA的存在下与CyP-Fas二聚化的FKBP；在雷帕霉素的存在下，在库马霉素的存在下与FRB二聚化的FKBP；在赤霉素的存在下与GID1二聚化的GAI；或在HaXS的存在下与HaloTag二聚化的Snap-tag。申请人使用FKBP/FRB，因为它被良好地表征并且两个结构域都足够小(<100个氨基酸)，以帮助包装。此外，雷帕霉素已经被使用了好久并且副作用被很好地理解。大的二聚化结构域(>300aa)也应起作用，但是可能需要更长的接头以允许Cas9重构。保罗姆鲁甘(Paulmurugan)和甘比尔(Gambhir)(《癌症研究》(CancerRes)，2005年8月15日65；7413)讨论了FRB/FKBP/雷帕霉素系统的背景。另一篇有用的论文是克拉布特里(Crabtree)等人(《化学与生物学》(Chemistry&Biology)13，99-107，2006年6月)的文章。本发明的图6B还显示了构建体的有用简图以及如通过本发明所设想的在雷帕霉素的存在下的所得表达和二聚化。在实例3中，构建了单个载体(表达盒(质粒))，如示于图9A中的。sgRNA处于U6启动子的控制下。使用了两种不同的Cas9分离：来自实例2的分离4和5。分离Cas9构建体是基于以下项的：第一CRISPR酶融合构建体，其侧翼为NLS，其中FKBP经由GlySer接头融合至分离Cas9的C末端部分；以及第二CRISPR酶融合构建体，其侧翼为NES，其中FRB经由GlySer接头与分离Cas9的N末端部分融合。为了分开第一和第二CRISPR酶融合构建体，在转录分离中使用P2A。在雷帕霉素的存在下，分离Cas9显示出与野生型类似的indel形成，但是在不存在雷帕霉素的情况下indel形成比野生型明显要低。因此，提供了单个载体。该载体包含：第一CRISPR酶融合构建体，其附接至诱导型二聚体的第一个一半，和第二CRISPR酶融合构建体，其附接至该诱导型二聚体的第二个一半，其中该第一CRISPR酶融合构建体可操作地连接至一个或多个核定位信号，其中该第二CRISPR酶融合构建体可操作地连接至一个或多个核输出信号，其中与诱导物能量源接触使该诱导型异二聚体的该第一个一半和该第二个一半聚到一起，其中使该诱导型异二聚体的该第一个一半和该第二个一半聚到一起允许该第一CRISPR酶融合构建体和该第二CRISPR酶融合构建体构成功能性CRISPR-Cas系统，其中该CRISPR-Cas系统包含指导RNA(sgRNA)，该指导RNA包含能够杂交到细胞中的感兴趣的基因组座位中的靶序列上的指导序列，并且其中该功能性CRISPR-Cas系统结合至该靶序列，并且可选地，编辑该基因组座位以改变基因表达。这些元件优选被提供在单个构建体(如表达盒)上。第一CRISPR酶融合构建体在每端优选地侧接至少一个核定位信号。第二CRISPR酶融合构建体在每端优选地侧接至少一个核输出信号。还提供了一种治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括通过用编码系统的多核苷酸或本发明的任何载体转化该受试者而诱导基因编辑并且向该受试者给予诱导物能量源。还可以提供适合的修复模板，例如通过包含所述修复模板的载体递送该修复模板。还提供了治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括通过用编码本发明的系统的多核苷酸或本发明的任何载体转化该受试者而诱导转录激活或抑制，其中所述多核苷酸或载体编码或包含无催化活性的CRISPR酶和一个或多个关联功能结构域；该方法进一步包括向该受试者给予诱导物能量源。还提供了用于在所述治疗方法中使用的包含本发明的系统的组合物。还提供了本发明的系统在用于这样的治疗方法的药剂的制造中的用途。在本文或在本文引用的文献中描述了可通过本发明的系统治疗的病症的实例。单个载体可以包含转录物分离剂，如P2A。P2A将转录物分为两个，以将第一和第二CRISPR酶融合构建体分开。分离是由于“核糖体跳过”。实质上，在翻译过程中核糖体跳过氨基酸，这破坏了蛋白链并且产生两个单独的多肽/蛋白。单个载体还有用于低背景活性不是问题但是高诱导型活性是所希望的应用。一个实例是克隆胚胎干细胞系的产生。正常程序是用编码wtCas9或Cas9切口酶的质粒进行瞬时转染。这些质粒产生Cas9分子，这些分子保留活性持续若干天并且具有更高的脱靶活性机会。使用分离Cas9的单个表达载体允许将“高”Cas9活性限制在较短的时间窗(例如，一个剂量的诱导物，如雷帕霉素)。在没有连续(每日)诱导物(例如雷帕霉素)处理的情况下，单个表达分离Cas9载体的活性较低并且呈现出减少的引起不想要的脱靶效应的机会。经诱导的Cas9活性的峰值在一些实施例中是有益的并且可以使用单个递送载体最容易地引起，但是通过双载体系统(每个载体递送分离Cas9的一半)也是可能的。峰值可以是较高活性并且持续较短时段，典型地是诱导物的寿命。因此，提供了用于产生克隆胚胎干细胞系的方法，该方法包括用编码本发明的系统的多核苷酸或本发明的一种载体转染一种或多种胚胎干细胞以表达本发明的分离Cas9并且向这一种或多种干细胞给予本发明的诱导物能量源或使这一种或多种干细胞与本发明的诱导物能量源接触以诱导Cas9的重构。可以提供修复模板。正如在本文描述的所有方法，应当理解的是将需要适合的sgRNA或指导物。在功能性结构域等与酶的一部分或其他部分“关联”的情况下，这些是典型的融合物。这里相对于一个分子如何与另一个分子‘关联’，例如在CRISPR酶的部分与功能结构域之间，使用术语“与...关联”。在这样的蛋白质-蛋白质相互作用的情况下，可以按抗体识别表位的方式就识别而论看待这种关联。可替代地，一种蛋白可以经由这两种蛋白的融合物与另一蛋白关联，例如一个亚基融合至另一亚基。融合典型地通过将一种蛋白的氨基酸序列添加至另一蛋白的氨基酸序列上而发生，例如经由一起剪接编码每种蛋白或亚基的核苷酸序列。可替代地，这基本上可以被视为两个分子之间的结合或直接连接，如融合蛋白。在任何情况下，融合蛋白可以在感兴趣的两个亚基之间(即酶与功能结构域之间或衔接蛋白与功能结构域之间)包括接头。因此，在一些实施例中，CRISPR酶的部分通过结合至其上而与功能结构域关联。在其他实施例中，CRISPR酶可选地经由接头而与功能结构域关联，因为这两者被融合到一起。接头的实例包括本文讨论的GlySer接头。诱导物的其他实例包括光和激素。对于光，诱导型二聚体可以是异二聚体并且包括第一个一半光诱导型二聚体和第二个(并且互补的)一半光诱导型二聚体。第一个一半和第二个一半光诱导型二聚体的优选实例是CIB1和CRY2系统。CIB1结构域是光敏感型隐花色素2(CRY2)的异源二聚体结合配偶体。本发明包括，该诱导物能量源可以是热、超声波、电磁能或化学品。在本发明的一个优选实施例中，该诱导物能量源可以是抗生素、小分子、激素、激素衍生物、类固醇或类固醇衍生物。在一个更优选的实施例中，该诱导物能量源可以是脱落酸(ABA)、多西环素(DOX)、cumate、雷帕霉素、4-羟基他莫西芬(4OHT)、雌激素或蜕皮激素。本发明提供了至少一种开关可以选自下组，该组由以下各项组成：基于抗生素的诱导型系统、基于电磁能的诱导型系统、基于小分子的诱导型系统、基于核受体的诱导系统以及基于激素的诱导型系统。在一个更优选的实施例中，该至少一种开关可以选自下组，该组由以下各项组成：四环素(Tet)/DOX诱导型系统、光诱导型系统、ABA诱导型系统、cumate阻遏物/操纵子系统、4OHT/雌激素诱导型系统、基于蜕皮激素的诱导型系统以及FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导型系统。还在本文和在PCT/US2013/051418(通过引用并入本文)中讨论了此类诱导物。一般而言，可以使用本发明的分离Cas9方法寻求可以由Cas9(无论是wt、切口酶还是deadCas9(具有或不具有关联功能结构域))造成的任何用途。E益处仍是Cas9活性的诱导型性质作为一个另外的实例，可以用荧光蛋白(像GFP)制备分离Cas9融合物。这允许使基因组座位成像(参见“通过优化的CRISPR/Cas系统使人类活细胞中的基因组座位动态成像(DynamicImagingofGenomicLociinLivingHumanCellsbyanOptimizedCRISPR/CasSystem)”，陈(Chen)B等人《细胞》(Cell)2013)，但是以诱导型方式。因此，在一些实施例中，一个或多个Cas9部分可以与荧光蛋白(例如GFP)关联(并且特别是与其融合)。另外的实验解决了当中靶切割处于相同水平时，野生型(wt)与分离Cas9之间是否存在脱靶切割差异。为了做到这一点，申请人使用wt和分离Cas9质粒的瞬时转染并且在不同时间点进行收获。申请人在发现中靶切割在+/-5％内的一组样品之后寻找脱靶激活。申请人使得细胞系稳定表达wt或分离Cas9而不表达引导物(使用慢病毒)。抗生素选择之后，将指导物用单独的慢病毒进行递送并且在不同时间点进行收获，以测量中靶/脱靶切割。关于用于诱导型转录的系统，申请人使用分离-11克隆了不同构造的分离dCas9。分离-11在两个Cas9片段之间具有最小的结合表面，因此预期该复合物更不稳定并且因此更可能在雷帕霉素撤去之后出现解离。这种方法具有诱导性(尽管诱导性较小)、更多的背景并且它还是不可逆的。申请人将去稳定序列(PEST，参见“mRN-A和蛋白质-去稳定元件用以开发高度响应性报告系统的用途(UseofmRNA-andprotein-destabilizingelementstodevelopahighlyresponsivereportersystem)”，文(Voon)DC等人《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)2005)引入FRB(N)Cas9-NES片段中，以促进更快的降解并且因此降低分离dCas9-VP64复合物的稳定性。此类去稳定序列(包括PEST)在本发明的系统中可以是有利的。产生了稳定表达分离dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1+指导物的细胞系。PLX抗性筛选可以证明，不可逆的定时转录激活在药物筛选中可以是有用的。当分离dCas9-VP64不可逆时，这种方法可以是有利的。一般而言，该CRISPR-Cas或CRISPR系统是如在上述文献(如WO2014/093622(PCT/US2013/074667))中使用的，并且共同地是指转录物和涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔子(spacer)”)或如该术语在本文中使用的“一个或多个RNA”(例如，指导Cas9的一个或多个RNA，例如CRISPRRNA和反式激活(tracr)RNA或单一指导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。一般而言，CRISPR系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为原型间隔子)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施例中，可以通过计算机搜索重复基序来鉴定同向重复，其满足下列标准的任一项或全部：1.发现在II型CRISPR座位侧翼的基因组序列的2Kb窗口；2.跨从20到50bp；并且3.以20到50bp间隔开。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。在一些实施例中，在CRISPR复合物中可以优选的是该tracr序列具有一个或多个发夹并且长度是30个或更多个核苷酸、长度是40个或更多个核苷酸或长度是50个或更多个核苷酸；该指导序列的长度在10至30个核苷酸之间，该CRISPR/Cas酶是II型Cas9酶。在本发明的实施例中，术语指导序列和指导RNA可互换地使用，如在前述引用文献(如WO2014/093622(PCT/US2013/074667))中。一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施例中，当使用适合的比对算法进行最佳比对是，在指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、或更多。可以使用用于比对序列的任何适合的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法、尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法、基于伯罗斯-惠勒变换(Burrows-WheelerTransform)的算法(例如伯罗斯-惠勒比对工具(BurrowsWheelerAligner))、ClustalW、ClustalX、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司；在www.novocraft.com可获得)、ELAND(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获得)、以及Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。在一些实施例中，指导序列在长度上为约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，指导序列在长度上为少于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个、或更少的核苷酸。优选地，该指导序列长10-30个核苷酸。可以通过任何适合的测定法来评估指导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括有待测试的指导序列在内，可以例如通过用编码该CRISPR序列的组分的载体进行转染而被提供到具有相应靶序列的宿主细胞中，随后通过如本文所述的Surveyor测定来评估在该靶序列之内的优先切割。类似地，通过提供该靶序列、包括有待测试的指导序列在内的CRISPR复合物的组分、和不同于该测试指导序列的对照指导序列，并且比较在该测试指导序列与该对照指导序列反应之间的靶序列处的结合或切割率，可以在一个试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其他测定法是可能的，并且将由本领域技术人员想到。指导序列可以被选择为靶向任何靶序列。在一些实施例中，该靶序列是在细胞的基因组内的序列。示例性靶序列包括在靶基因组中为独特的那些。例如，对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。对于嗜热链球菌CRISPR1Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXXAGAAW(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW的嗜热链球菌CRISPR1Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXXAGAAW(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在这些序列的每一个中，“M”可以是A、G、T、或C，并且在序列鉴定中不必考虑为是独特的。在一些实施例中，指导序列被选择为降低在该指导序列内的二级结构程度。在一些实施例中，在最佳地折叠时，该指导序列的约或少于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、或更少的核苷酸参与自我互补碱基配对。可以通过任何适合的多核苷酸折叠算法来确定最佳折叠。一些算法是基于计算最小吉布斯(Gibbs)自由能。一种这样的算法的实例是mFold，正如祖克(Zuker)和施蒂格勒(Stiegler)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)9(1981)，133-148)所描述。折叠算法的另一个实例是使用由维也纳大学(UniversityofVienna)的理论化学研究所(InstituteforTheoreticalChemistry)研发的在线网络服务器RNAfold(参见例如A.R.格鲁伯(A.R.Gruber)等人，2008，《细胞》(Cell)106(1):23-24；以及PA卡尔(PACarr)和GM丘奇(GMChurch)，2009，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)27(12):1151-62)。一般而言，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进下列一项或多项的任何序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中的侧翼为tracr配对序列的指导序列的切除；以及(2)在靶序列处的CRISPR复合物的形成，其中该CRISPR复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配对序列。通常，互补程度是就tracr配对序列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以可以进一步对二级结构做出解释，如在该tracr序列或tracr配对序列之内的自我互补性。在一些实施例中，在进行最佳比对时，在该tracr序列与tracr配对序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。在一些实施例中，该tracr序列在长度上为约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，该tracr序列和tracr配对序列被包含在单个转录物中，使得在这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。在本发明的一个实施例中，该转录物或转录的多核苷酸序列具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施例中，该转录物具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的一个另外的实施例中，该转录物具有至多五个发夹。在发夹结构中，在该环的最终“N”和上游的序列5’的部分相应于该tracr配对序列，并且该环的序列3’的部分相应于该tracr序列。另外的包含指导序列、tracr配对序列、和tracr序列的单一多核苷酸的非限制性实例如下(列出为5’到3’)，其中“N”代表指导序列的碱基，小写字体的第一区代表tracr配对序列，且小写字体的第二区代表tracr序列，并且该最后的多聚T序列代表转录终止子：(1)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT；(4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT；(5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT；以及(6)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT。在一些实施例中，序列(1)到(3)与来自嗜热链球菌CRISPR1的Cas9结合使用。在一些实施例中，序列(4)到(6)与来自化脓链球菌CRISPR1的Cas9结合使用。在一些实施例中，该tracr序列是一个与包含该tracr配对序列的转录物分开的转录物。在一些实施例中，随后可以通过满足下列标准的任一项或全部的序列来预测候选tracrRNA：1.与同向重复同源的序列(在Geneious中搜索的具有高达18-bp错配的基序)；2.在转录方向上的预测的不依赖Rho的转录终止子的存在；以及3.在tracrRNA与同向重复之间的稳定发夹二级结构。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。在一些实施例中，嵌合的合成指导RNA(sgRNA)设计可以在同向重复与tracrRNA之间掺入至少12bp的双链体结构。为了将毒性和脱靶效应降低到最低限度，重要的是控制所递送的CRISPR酶mRNA和指导RNA的浓度。CRISPR酶mRNA和指导RNA的最佳浓度可以通过在细胞或非人类真核生物动物模型中测试不同的浓度并且使用深度测序分析在潜在的脱靶基因组座位处的修饰的范围而确定。例如，对于靶向人类基因组的EMX1基因中的5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’的指导序列，可以使用深度测序来评定在下列两个脱靶位点处的修饰水平，1：5’-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3’和2：5’-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3’。对于体内递送，应当选择产生最高的中靶修饰水平同时使脱靶修饰水平最小化的浓度。可替代地，为了将毒性水平和脱靶效应最小化，可以用一对靶向感兴趣部位的指导RNA来递送CRISPR酶切口酶mRNA(例如，具有D10A突变的化脓链球菌Cas9)。这两个指导RNA需要如下间隔开。用于最小化毒性和脱靶效应的指导序列和策略可以是如在WO2014/093622(PCT/U2013/074667)中的。该CRISPR系统有利地来源于II型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓链球菌。在本发明的优选实施例中，该CRISPR系统是一个II型CRISPR系统，并且该Cas酶是Cas9，其催化DNA切割。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、或其修饰形式。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶指导在靶序列位置处(例如在该靶序列之内和/或在该靶序列的互补物之内)的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶指导距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个、或更多个碱基对之内的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，一个载体编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得该突变的CRISPR酶缺乏切割含有一个靶序列的靶多核苷酸的一条链和两条链的能力。例如，在来自化脓链球菌的Cas9的RuvCI催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单条链)。致使Cas9为切口酶的其他突变实例包括而不限于H840A、N854A、和N863A。作为一个另外的实例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvCI、RuvCII、和RuvCIII或该HNH结构域)可以被突变为产生实质上缺乏所有DNA切割活性的突变的Cas9。在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A、或N863A突变的一者或多者相组合，以便产生实质上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施例中，当突变的CRISPR酶的DNA切割活性不到该酶的非突变形式的DNA切割活性的约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更少时，则该酶被考虑为实质上缺乏所有DNA切割活性；一个实例可以是当与非突变形式相比时突变形式的DNA切割活性为零或可忽略。在该酶不是SpCas9的情况下，可以在相应于SpCas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A，参考SpCas9；连同其他直向同源物中的相似的或相同的突变，例如SaCas9中的N580A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在其他Cas9中的相应位置处的相同取代(或这些突变的保守性取代)也是优选的。特别优选的是在SpCas9中的D10和H840。然而，在其他Cas9中，相应于SpCas9D10和H840的残基也是优选的。SpCas9的直向同源物可以用于本发明的实践中。一种Cas酶可以被鉴定为Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该Cas9酶来自或衍生自spCas9(化脓链球菌Cas9)或saCas9(金黄色葡萄球菌Cas9)。“StCas9”是指来自嗜热链球菌的野生型Cas9，其蛋白质序列在登录号G3ECR1下给出于SwissProt数据库中。类似地，化脓链球菌Cas9或spCas9在登录号Q99ZW2下被包括在SwissProt中。关于衍生，申请人意指该衍生的酶在很大程度上是基于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突变(修饰)。应当理解的是，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另外说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的II型CRISPR座位的Cas9酶。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的Cas9s，如SpCas9、SaCa9、St1Cas9等等。通过来源于化脓链球菌或Cas9或任何密切相关的Cas9的酶促作用，产生了在靶位点序列处的双链断裂，所述靶位点序列杂交到该指导序列的20个核苷酸上并且具有在该靶序列的20个核苷酸之后的原型间隔子相邻基序(PAM)序列(实例包括NGG/NRG或可以如本文所述进行确定的PAM)。经由Cas9的对于位点特异性DNA识别和切割的CRISPR活性是由该指导序列、部分杂交到该指导序列上的tracr序列以及该PAM序列定义的。该CRISPR系统的更多方面描述于卡吉诺夫(Karginov)和汉农(Hannon)的“CRISPR系统：在细菌和古细菌中的小RNA指导的防御”(TheCRISPRsystem:smallRNA-guideddefenceinbacteriaandarchaea)，《分子细胞学杂志》(MoleCell)2010，1月15日；37(1):7。II型CRISPR座位来自化脓链球菌SF370，该座位含有四个基因Cas9、Cas1、Cas2和Csn1的聚簇以及两个非编码RNA元件tracrRNA和由非重复序列的短段(间隔子，每个约30bp)间隔开的重复序列(同向重复)的特征性阵列。在此系统中，以四个连续步骤产生靶向的DNA双链断裂(DSB)。第一步，从CRISPR座位转录两个非编码RNA前-crRNA阵列和tracrRNA。第二步，将tracrRNA杂交到前-crRNA的同向重复上，然后将其加工成含有单独的间隔子序列的成熟crRNA。第三步，该成熟crRNA:tracrRNA复合物经由在crRNA的间隔子区与原型间隔子DNA之间形成异源双链体而指导Cas9到由原型间隔子和对应的PAM组成的DNA靶标。最后，Cas9介导PAM上游的靶DNA的切割，以在原型间隔子内产生DSB。由侧翼为两个同向重复(DR)的单个间隔子组成的前-crRNA阵列也被术语“tracr配对序列”所涵盖。在某些实施例中，Cas9可以组成性地存在或诱导性地存在或条件性地存在或给予或递送。Cas9优化可以用来增强功能或者用来开发新的功能，人们可以产生嵌合Cas9蛋白。并且Cas9可以用作通用的DNA结合蛋白。在一个方面，该CRISPR酶包含根据SpCas9蛋白或任何相应的直向同源物的H840A、或D10A和H840A、或D10A和N863A。Sa中的N580对应于SpCas9中的N863。因此，在一个方面，该CRISPR酶包含：根据SaCas9蛋白或任何相应的直向同源物的N580A；或根据SpCas9蛋白或任何相应的直向同源物的D10A，；以及根据SaCas9蛋白的N580A。典型地，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包含杂交到靶序列上并且与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在该靶序列中或其附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基对之内)的一条链或两条链的切割。不希望受到理论的束缚，该tracr序列(其可以包含或其组成为野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个、或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合物的一部分，如通过沿着该tracr序列的至少一部分杂交到与该指导序列可操作地连接的tracr配对序列的全部或部分上。在这种情况下，密码子优化序列的一个实例是针对在真核生物中表达优化的(例如，人类(即针对在人类中表达优化的))或针对如在本文讨论的另一种真核生物、动物或哺乳动物优化的序列；参见例如，WO2014/093622(PCT/US2013/074667)中的SaCas9人类密码子优化序列。虽然这是优选的，但是应当理解的是，其他实例也是可能的，并且针对除人类之外的宿主物种的密码子优化或针对具体器官的密码子优化是已知的。在一些实施例中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化，以便在特定的细胞如真核细胞中表达。这些真核细胞可以是特定生物的那些或来源于特定生物，如哺乳动物，包括但不限于人，或如在本文讨论的非人类真核生物或动物或哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、狗、家畜或非人类哺乳动物或灵长动物。在一些实施例中，对于人类或动物而言很可能使得他们(它们)受苦而没有任何实质性医学益处的用于修饰人类的种系遗传同一性的方法和/或用于修饰动物的遗传同一性的方法、以及还有作为这样的方法的结果的动物，可以被排除在外。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰一个核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外)被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“CodonUsageDatabase”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，中村Y.(NakamuraY.)等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态”(“CodonusagetabulatedfromtheinternationalDNAsequencedatabases:statusfortheyear2000.”)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)28：292(2000年)。用于密码子优化特定的序列以便在特定的宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，如基因制造(GeneForge)(Aptagen公司；雅各布斯(Jacobus)，PA)，也是可得的。在一些实施例中，在编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。在一些实施例中，一种载体编码包含一个或多个核定位序列(NLS)如约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS的CRISPR酶。在一些实施例中，该CRISPR酶包含在或接近于氨基端的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS，在或接近于羧基端约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS，或这些的组合(例如在氨基端的零个或至少一个或多个NLS以及在羧基端的零个或至少一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可以被选择为不依赖于其他NLS，使得在多于一个拷贝中可以存在单个NLS和/或与在一个或多个拷贝中存在一个或多个其他NLS相组合。在本发明的一个优选实施例中，该CRISPR酶包含至多6个NLS。在一些实施例中，当NLS的最近的氨基酸是在从N端或C端沿着该多肽链的约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个、或更多个氨基酸之内时，NLS可以被视为接近该N端或C端。NLS的非限制性实例包括来源于以下项的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，其具有氨基酸序列PKKKRKV；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK的核质蛋白二分NLS)；c-mycNLS，其具有氨基酸序列PAAKRVKLD或RQRRNELKRSP；hRNPA1M9NLS，其具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP和PPKKARED；人p53的序列POPKKKPL；小鼠c-ablIV的序列SALIKKKKKMAP；流感病毒NS1的序列DRLRR和PKQKKRK；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK；以及类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK。一般而言，该一个或多个NLS具有足够的强度，以便在真核细胞的核中驱动该CRISPR复合物以可检测到的量积聚。一般而言，核定位活性的强度可以驱动在该CRISPR酶中的NLS的数目、所使用的一个或多个特定的NLS、或这些因素的组合。可以通过任何适合的技术进行细胞核中积聚的检测。例如，一种检测标记可以融合到CRISPR酶上，使得细胞内的位置可以被可视化，如与检测细胞核的位置的手段(例如，对于细胞核特异的染料，如DAPI)相结合。还可以将细胞核从细胞中分离出来，然后可以通过任何适合的用于检测蛋白质的方法分析其内容物，如免疫组织化学、Western印迹或酶活性测定。如通过测定CRISPR复合物形成的作用(例如，测定在靶序列处的DNA切割或突变、或测定由于CRISPR复合物形成和/或CRISPR酶活性的影响而改变的基因表达活性)，与没有暴露于CRISPR酶或复合物、或暴露于缺乏该一个或多个NLS的CRISPR酶的对照相比较，还可以间接地确定细胞核中的积聚。本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。只有产生在这些指导序列(大于-8bp的偏移)之间具有小于8bp重叠的5’突出端的sgRNA对才能介导可检测的indel形成。重要的是，当与野生型Cas9配对时，在这些分析中使用的每个指导对于有效诱导indel是重要的，表明这些指导对的相对位置在预测双切割活性中是最重要的参数。由于Cas9n和Cas9H840A切割DNA的相对链，对于给定的sgRNA对而言，用Cas9H840A取代Cas9n已经导致该突出端类型的倒转；但是就Cas9H840A来说没有观察到indel形成，表明Cas9H840A是一种实质上缺乏所有DNA切割活性的CRISPR酶(当突变的酶的DNA切割活性不到该酶的非突变形式的DNA切割活性的约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更少时，是这样的；由此一个实例可以是当与非突变形式相比时突变形式的DNA切割活性为零或可忽略，例如，和生物化学或原核系统相对照，在真核系统中就Cas9H840A来说没有观察到indel形成)。尽管如此，将产生具有Cas9n的5’突出端的一对sgRNA原则上会相反地产生相应的3’突出端和双切口。因此，导致具有Cas9n的3’突出端产生的sgRNA对可以与另一个突变的Cas9一起使用，以产生5’突出端和双切口。因此，在一些实施例中，还提供了重组模板。重组模板可以是如本文所述的另一个载体的组分，其被包含在一个分开的载体中，或者被提供为一个分开的多核苷酸。在一些实施例中，重组模板被设计为用作在同源重组中的模板，如在被作为CRISPR复合物的一部分的CRISPR酶切开或切割的靶序列之内或在其附近。模板多核苷酸可以具有任何适合的长度，如约或多于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个、或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，该模板多核苷酸与包含该靶序列的多核苷酸的一部分互补。当进行最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸(例如约或多于约1、5、10、15、20个、或更多个核苷酸)重叠。在一些实施例中，当一个模板序列与包含靶序列的多核苷酸进行最佳比对时，该模板多核苷酸的最近的核苷酸在距离该靶序列的约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000个、或更多个核苷酸之内。在一些实施例中，将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一种或多种载体引入到宿主细胞中，使得该CRISPR系统的这些元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列可以各自可操作地连接到在分开的载体上的分开的调节元件上。或者，可以将该CRISPR系统的一个或多个RNA递送到转基因Cas9动物或哺乳动物，例如组成性地或诱导性地或条件性地表达Cas9的动物或哺乳动物；或者以其他方式表达Cas9或具有含Cas9的细胞的动物或哺乳动物，如通过向其在先给予一种或多种编码并表达体内Cas9的载体的方式。可替代地，从相同或不同调节元件表达的二个或更多个元件可以结合在单个载体中，其中提供该CRISPR系统的任何组分的一种或多种另外的载体不包括在该第一载体中。结合在单个载体中的CRISPR系统元件可以按照任何适合的取向排列，如一个元件相对于第二元件位于5’(“上游”)或3’(“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的同一条链或相对链上，并且取向为相同或相对的方向。在一些实施例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物以及该指导序列、tracr配对序列(可选地可操作地连接到该指导序列上)、和嵌入在一个或多个内含子序列之内(例如，各自在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或者全部都在单个内含子中)的tracr序列中的一者或多者的表达。在一些实施例中，该CRISPR酶、指导序列、tracr配对序列、和tracr序列可操作地连接到相同的启动子上并且从其表达。用于表达CRISPR系统的一个或多个元件的递送运载体、载体、粒子、纳米粒子、配制品及其组分是如在前述文献(如WO2014/093622(PCT/US2013/074667))中使用的。在一些实施例中，载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个插入位点)位于一种或多种载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中，载体包含在tracr配对序列的上游、并且可选地在可操作地连接到该tracr配对序列上的调节元件的下游的插入位点，使得在将指导序列插入到该插入位点中之后并且在表达时该指导序列引导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，载体包含一个或多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配对序列之间，从而允许在每个位点插入指导序列。在这样一种安排中，两种或更多种指导序列可以包含单指导序列的两个或更多个拷贝、两种或更多种不同的指导序列、或这些的组合。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体使CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20种、或更多种指导序列。在一些实施例中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多种这样的含有靶序列的载体，并且可选地将其递送到细胞中。在一些实施例中，一个载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶(如Cas蛋白)的酶编码序列上的调节元件。CRISPR酶或CRISPR酶mRNA或CRISPR指导RNA或一个或多个RNA可以分开递送；并且有利地这些中的至少一者经由纳米粒子复合物递送。可以在该指导RNA在给出时间以待CRISPR酶表达之前递送CRISPR酶mRNA。可以在给予指导RNA之前1-12小时(优选约2-6小时)给予CRISPR酶mRNA。可替代地，可以一起给予CRISPR酶mRNA和指导RNA。有利地，可以在初始给予CRISPR酶mRNA+指导RNA之后1-12小时(优选约2-6小时)给予指导RNA的第二加强剂量。为了实现基因组修饰的最有效水平，另外给予CRISPR酶mRNA和/或指导RNA可以是有用的。在一个方面，本发明提供了用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。本发明的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本发明的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)多种细胞类型中的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的CRISPR复合物在例如基因疗法、药物筛选、疾病诊断以及预后中具有广阔的应用谱。示例性CRISPR复合物包括与指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。在一个实施例中，本发明提供了一种切割靶多核苷酸的方法。该方法包括使用CRISPR复合物修饰靶多核苷酸，该CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上并且实施所述靶多核苷酸的切割。典型地，当被引入进细胞中时，本发明的CRISPR复合物在基因组序列中产生一个断裂(例如，单链或双链断裂)。例如，可以使用该方法切割细胞中的疾病基因。由该CRISPR复合物产生的断裂可以通过修复过程进行修复，如易出错的非同源末端连接(NHEJ)途径或高保真同源定向修复(HDR)。在这些修复过程期间，可以将外源多核苷酸模板引入进基因组序列中。在一些方法中，该HDR过程被用于修饰基因组序列。例如，将外源多核苷酸模板引入进细胞中，该外源多核苷酸模板包括有待整合的、侧翼为上游序列和下游序列的序列。上游和下游序列与染色体中的整合位点的任一侧都具有序列相似性。在希望的情况下，供体多核苷酸可以是DNA，例如DNA质粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体、一段线性DNA、PCR片段、裸核酸或与递送赋形剂(如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸。该外源多核苷酸模板包括有待整合的序列(例如，突变的基因)。供整合的序列可以是对细胞而言内源或外源的序列。有待整合的序列的实例包括编码蛋白质的多核苷酸或非编码RNA(例如，微小RNA)。因此，供整合的序列可以可操作地连接到一个或多个适当的控制序列上。可替代地，有待整合的序列可以提供一种调节功能。选择外源多核苷酸模板中的上游和下游序列，以促进感兴趣的染色体序列与供体多核苷酸之间的重组。该上游序列是一个与供整合的靶向位点的上游的基因组序列具有序列相似性的核酸序列。类似地，该下游序列是一个与供整合的靶向位点的染色体序列下游具有序列相似性的核酸序列。外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列可以具有75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。优选地，外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些方法中，外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约99％或100％序列一致性。上游或下游序列可以包括从约20bp至约2500bp，例如约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中，示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp或更具体地约700bp至约1000bp。在一些方法中，该外源多核苷酸模板可以进一步包括一种标记。这样的一种标记使得容易地筛选靶向的整合。适合的标记的实例包括限制性位点、荧光蛋白或选择性标记。可以使用重组技术构建本发明的外源多核苷酸模板(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，2001和奥苏贝尔(Ausubel)等人，1996)。在一种用于通过整合外源多核苷酸模板而修饰靶多核苷酸的方法中，通过CRISPR复合物将双链断裂引入进基因组序列中，经由同源重组通过外源多核苷酸模板而修复该断裂，这样使得将该模板整合进基因组中。双链断裂的存在促进模板的整合。在其他实施例中，本发明提供了一种修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。该方法包括通过使用结合到多核苷酸上的CRISPR复合物增加或降低靶多核苷酸的表达。在一些方法中，可以使靶多核苷酸失活以实施细胞中的表达的修饰。例如，当CRISPR复合物结合到细胞中的一个靶序列上时，该靶多核苷酸失活，这样使得该序列不被转录，该编码蛋白不被产生，或者该序列不会像野生型序列一样起作用。例如，可以使蛋白质或微小RNA编码序列失活，这样使得该蛋白质或微小RNA或前-微小RNA转录物不被产生。在一些方法中，可以使控制序列失活，这样使得它不再作为控制序列起作用。如在此使用，“控制序列”是指影响核酸序列的转录、翻译或可及性的任何核酸序列。控制序列的实例包括启动子、转录终止子和增强子，它们是控制序列。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，它可以是一个以异常高的水平被表达的基因；它可以是一个以异常低的水平被表达的基因。疾病相关基因还指具有一个或多个突变或直接负责或与一个或多个负责疾病的病因学的基因连锁不平衡的遗传变异的基因。转录的或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可以处于正常或异常水平。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。不希望被理论所束缚，据信该靶序列应该与PAM(原型间隔子邻近基序)相关；也就是说，与由CRISPR复合物识别的短序列相关。对PAM的精确序列和长度要求取决于使用的CRISPR酶而不同，但是PAM典型地是临近原型间隔子(也就是说，靶序列)的2-5个碱基对序列。在以下实例部分中给出PAM序列的实例，并且熟练人员将能够鉴定与给定的CRISPR酶一起使用的另外的PAM序列。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。事实上，这些取样、培养和重新引入选择跨本发明的多个方面而适用。在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括对来自人或非人类动物的细胞或细胞群进行取样，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物中。对于重新引入的细胞，特别优选的是这些细胞是干细胞。确实，在本发明的任何方面，该CRISPR复合物可以包括与杂交到靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列可以连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而可以杂交到tracr序列上。本发明涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的工程化和优化，该序列靶向例如涉及CRISPR-Cas系统及其组分的基因组干扰或基因编辑。在有利的实施例中，该Cas酶是Cas9。本发明方法的一个优点在于，该CRISPR系统最小化或避免了脱靶结合及其所产生的副作用。这是通过使用被安排为具有针对靶DNA的高度序列特异性的系统而实现的。一般意义的递送病毒递送，例如质粒、病毒递送：该CRISPR酶(例如Cas9)和/或本发明的任何RNA(例如指导RNA)可以使用任何适合的载体，例如质粒或病毒载体，如腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他病毒载体类型或其组合进行递送。Cas9以及一种或多种指导RNA可以被包装到一种或多种载体(例如，质粒或病毒载体)中。在一些实施例中，病毒(例如，质粒或病毒载体)可以例如通过肌肉注射递送到感兴趣的组织中，而有时经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行递送。这样的递送可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待递送的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如载体选择、靶细胞、生物、或组织、有待治疗的受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、给药途径、给药方式、所寻求的转化/修饰的类型，等等。这样的剂量可以进一步含有，例如，载体(水、盐水、乙醇、甘油、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油，等等)、稀释剂、药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水)、药学上可接受的赋形剂、和/或本领域已知的其他化合物。该剂型可以进一步含有一种或多种药学上可接受的盐，例如像，无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。另外，也可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、凝胶或胶凝材料、调味剂、着色剂、微球体、聚合物、悬浮剂等等。另外，也可以存在一种或多种其他常规药用成分，如防腐剂、保湿剂、悬浮剂、表面活性剂、抗氧化剂、抗结剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等等，尤其是该剂型是可复原形式时。适合的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨酯80、苯乙醇、三氯叔丁醇、山梨酸钾、抗坏血酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯酚、明胶、白蛋白和它们的组合。药学上可接受的赋形剂的彻底论述可获自《雷明顿药物科学》(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES)(马克出版公司，纽约，1991)，通过引用将其并入本文。在本文的一个实施例中，递送是经由腺病毒进行的，其可以是含有至少1x105个腺病毒载体粒子(也称为粒子单位，pu)的单次加强剂量。在本文的一个实施例中，该剂量优选地是该腺病毒载体的至少约1x106个粒子(例如，约1x106-1x1012个粒子)，更优选至少约1x107个粒子，更优选至少约1x108个粒子(例如，约1x108-1x1011个粒子或约1x108-1x1012个粒子)，并且最优选至少约1x100个粒子(例如，约1x109-1x1010个粒子或约1x109-1x1012个粒子)，或者甚至至少约1x1010个粒子(例如，约1x1010-1x1012个粒子)。可替代地，该剂量包含不多于约1x1014个粒子，优选不多于约1x1013个粒子，甚至更优选不多于约1x1012个粒子，甚至更优选不多于约1x1011个粒子，并且最优选不多于约1x1010个粒子(例如，不多于约1x109个粒子)。因此，该剂量可以含有单剂量的腺病毒载体，其具有例如，约1x106粒子单位(pu)，约2x106pu、约4x106pu、约1x107pu、约2x107pu、约4x107pu、约1x108pu、约2x108pu、约4x108pu、约1x109pu、约2x109pu、约4x109pu、约1x1010pu、约2x1010pu、约4x1010pu、约1x1011pu、约2x1011pu、约4x1011pu、约1x1012pu、约2x1012pu、或约4x1012pu的腺病毒载体。参见，例如，在2013年6月4日授权的授予纳贝尔(Nabel)等人的美国专利号8,454,972B2中的腺病毒载体(通过引用并入本文)以及在其第29栏第36-58行的剂型。在本文的一个实施例中，该腺病毒是经由多剂量递送的。在本文的一个实施例中，该递送是经由AAV进行的。用于针对人类的AAV的体内递送的治疗有效剂量被认为处于含有从约1x1010到约1x1010个功能AAV/ml溶液的从约20到约50ml的盐水溶液的范围内。该剂量可以调整以便使治疗益处相对于任何副作用的平衡。在本文的一个实施例中，AAV剂量大致处于从约1x105到1x1050个基因组AAV、从约1x108到1x1020个基因组AAV、从约1x1010到约1x1016个基因组、或约1x1011到约1x1016个基因组AAV的浓度范围内。人类剂量可以是约1x1013个基因组AAV。这样的浓度能以从约0.001ml到约100ml、约0.05到约50ml、或约10到约25ml的载体溶液进行递送。通过建立剂量反应曲线的常规试验，本领域普通技术人员可以容易地确立其他有效剂量。参见，例如，2013年3月26日授权的授予哈加(Hajjar)等人的美国专利号8,404,658B2，在第27栏第45-60行。在本文的一个实施例中，该递送是经由质粒进行的。在这样的质粒组合物中，该剂量应当是足以引出反应的质粒的量。例如，对于70kg的个体而言，在质粒组合物中的质粒DNA的适当量可以是从约0.1到约2mg，或从约1μg到约10μg。本发明的质粒通常包含(i)启动子；(ii)编码CRISPR酶的序列，可操作地连接到所述启动子；(iii)选择性标记；(iv)复制起点；以及(v)(ii)的下游的并且可操作地连接至(ii)的转录终止子。质粒还可以编码CRISPR复合物的RNA组分，但是作为替代这些中的一者或多者可以在不同载体上进行编码。本文的剂量是基于平均70kg的个体。给药频率在医学或兽医学从业者(例如医师、兽医师)或本领域熟练的科学家的范围之内。还应当指出，实验中使用的小鼠典型地是约20g并且根据小鼠实验，人们可以按比例放大到70kg的个体。在一些实施例中，本发明的RNA分子在脂质体或阳离子脂质体配制品等等中进行递送并且可以通过本领域技术人员熟知的方法进行制备。这样的方法描述于，例如，美国专利号5,593,972、5,589,466和5,580,859中，将其通过引用并入本文。已经开发了专门针对增强和改进递送siRNA到哺乳动物细胞中的递送系统，(参见，例如，沈(Shen)等人《欧洲生化学会联合会快报》(FEBSLet.)2003，539:111-114；夏(Xia)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)2002，20:1006-1010；赖希(Reich)等人，《分子视界》(Mol.Vision.)2003，9:210-216；索伦森(Sorensen)等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)2003，327:761-766；路易斯(Lewis)等人，《自然遗传学》(Nat.Gen.)2002，32:107-108以及西梅奥尼(Simeoni)等人，NAR2003，31，11:2717-2724)并且可以将其应用于本发明。最近，siRNA已经成功用于抑制灵长动物中的基因表达(参见例如托伦蒂诺(Tolentino)等人，《视网膜》(Retina)24(4):660，它也可应用于本发明。的确，RNA递送是有用的体内递送方法。有可能使用脂质体或纳米粒子将Cas9和gRNA(并且，例如，HR修复模板)递送到细胞中。因此，CRISPR酶如Cas9的递送和/或本发明的RNA的递送可以处于RNA的形式并且经由微囊泡、脂质体或纳米粒子来进行。例如，Cas9mRNA和gRNA可以被包装到脂质体粒子中用于体内递送。脂质体转染试剂例如来自生命技术公司(LifeTechnologies)的lipofectamine以及市售的其他试剂可以有效地将RNA分子递送到肝脏中。还优选的RNA递送手段包括经由纳米粒子(卓(Cho)S.、金伯格(Goldberg)M.、松(Son)S.、许(Xu)Q.、杨(Yang)F.、梅(Mei)Y.、博加特廖夫(Bogatyrev)S.、朗格(Langer)R.和安德森(Anderson)D.，“用于将小干扰RNA递送到内皮细胞的脂质样纳米粒子”(Lipid-likenanoparticlesforsmallinterferingRNAdeliverytoendothelialcells)，《先进功能材料》(AdvancedFunctionalMaterials)，19:3112-3118，2010)或外泌体(施罗德(Schroeder)A.、莱文斯(Levins)C.、科特斯(Cortez)C.、朗格(Langer)R.、和安德森(Anderson)D.，“用于siRNA递送的基于脂质的纳米治疗剂”(Lipid-basednanotherapeuticsforsiRNAdelivery)，《内科学杂志》(JournalofInternalMedicine)，267:9-21，2010，PMID:20059641)递送RNA。事实上，已经表明外泌体在递送siRNA中特别有用，其为与CRISPR系统有一些相似之处的系统。例如，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人“外泌体诱导的体外和体内siRNA递送”(“Exosome-mediateddeliveryofsiRNAinvitroandinvivo.”)《自然-实验手册》(NatProtoc.)2012年12月；7(12):2112-26.doi:10.1038/nprot.2012.131。电子版2012年11月15日描述了外泌体对于跨不同的生物屏障的药物递送是有希望的工具并且可以用于体外和体内递送siRNA。其途径在于通过转染一种包含与肽配体融合的外泌体蛋白的表达载体产生靶向外泌体。然后将这些外泌体纯化并且从转染的细胞上清液中表征，然后将RNA加载到外泌体中。根据本发明的递送或给药可以用外泌体进行，尤其是但不限于脑。维生素E(α-生育酚)可以与CRISPRCas结合并且连同高密度脂蛋白(HDL)一起递送到脑，例如以与乌诺(Uno)等人完成的用于将短干扰RNA(siRNA)递送到脑的类似方式《人类基因治疗》(HUMANGENETHERAPY)22:711-719(2011年6月)。经由用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或游离TocsiBACE或Toc-siBACE/HDL充满的并且与脑灌注试剂盒3(BrainInfusionKit3)(Alzet公司)连接的微渗透压泵(型号1007D；Alzet公司，库比蒂诺(Cupertino)，CA)灌注小鼠。将一根脑灌注导管置于在正中线的前囱的后方约0.5mm，用于灌注到背侧第三脑室中。乌诺(Uno)等人发现，通过相同的ICV灌注方法，少至3nmol的Toc-siRNA与HDL可诱导相当程度的靶减少。可以考虑结合至α-生育酚的并且与HDL共同给予靶向脑的相似剂量的CRISPRCas用于本发明，例如，可以考虑靶向脑的约3nmol到约3μmol的CRISPRCas。邹(Zou)等人(《人类基因治疗》(HUMANGENETHERAPY22:465-475(2011年4月))描述了靶向PKCγ的短发夹RNA的慢病毒介导的递送方法，其用于在大鼠脊髓中的体内基因沉默。邹(Zou)等人通过鞘内导管给予约10μl的具有1x109个转导单位(TU)/ml的滴度的重组慢病毒。在本发明中可以考虑相似剂量的在靶向脑的慢病毒载体中表达的CRISPRCas用于人类，例如，可以考虑靶向脑的在具有1x109个转导单位(TU)/ml的滴度的慢病毒中的约10-50ml的CRISPRCas。就局部递送到脑而言，这可以通过不同方式来实现。例如，材料可以例如通过注射递送到纹状体内。注射可以经由穿颅术立体定向地进行。提高NHEJ或HR效率也有助于递送。优选的是，NHEJ效率通过共表达末端加工酶(co-expressingend-processingenzyme)如Trex2而增强(杜米特拉切(Dumitrache)等人《遗传学》(Genetics)2011年8月；188(4):787-797)。优选的是，HR效率通过瞬时抑制NHEJ机构如Ku70和Ku86而增加。HR效率也可以通过共表达原核或真核同源重组酶如RecBCD、RecA而增加。一般意义的包装和启动子介导体内基因组修饰的、将Cas9编码核酸分子(例如DNA)包装到载体(例如病毒载体)中的方式包括：·为了实现NHEJ介导的基因敲除：·单病毒载体：·含有两个或更多个表达盒的载体：·启动子-Cas9编码核酸分子-终止子·启动子-gRNA1-终止子·启动子-gRNA2-终止子·启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)·双病毒载体：·含有一个用于驱动Cas9表达的表达盒的载体1·启动子-Cas9编码核酸分子-终止子·含有一个或多个用于驱动一个或多个指导RNA表达的表达盒的载体2·启动子-gRNA1-终止子·启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)·为了介导同源定向修复。·除了上述单和双病毒载体途径之外，另外的载体可以用来递送同源定向修复模板。用来驱动Cas9编码核酸分子表达的启动子可以包括：AAVITR可以用作一种启动子：这对于消除另外的启动子元件(可在载体中占用空间)的需要是有利的。空出来的另外的空间可以用来驱动另外的元件的表达(gRNA，等等)。同样，ITR活性是较弱的，因此可以用来降低由于Cas9的过表达所致的潜在毒性。对于遍存表达，可以使用以下任何启动子：CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链，等等。对于脑或其他CNS表达，可以使用启动子：用于所有神经元的突触蛋白I、用于兴奋性神经元的CaMKIIα、用于GABA能神经元的GAD67或GAD65或VGAT，等等。对于肝脏表达，人们可以使用白蛋白启动子。对于肺表达，人们可以使用SP-B。对于内皮细胞，人们可以使用ICAM。对于造血细胞，人们可以使用IFNβ或CD45。对于成骨细胞，人们可以使用OG-2。用于驱动指导RNA的启动子可以包括：PolIII启动子，如U6或H1.PolII启动子，以及用于表达gRNA的内含子盒。腺相关病毒(AAV)Cas9以及一种或多种指导RNA可以使用腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他质粒或病毒载体类型进行递送，尤其是，使用来自以下文献的配方和剂量：例如，美国专利号8,454,972(针对腺病毒的配方、剂量)、8,404,658(针对AAV的配方、剂量)和5,846,946(针对DNA质粒的配方、剂量)以及来自临床试验和关于涉及慢病毒、AAV、和腺病毒的临床试验的出版物。例如，对于AAV，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号8,454,972并且如涉及AAV的临床试验。对于腺病毒，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号8,404,658并且如涉及腺病毒的临床试验。对于质粒递送，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号5,846,946并且如涉及质粒的临床试验。剂量可以基于或推断为平均70kg的个体(例如，男性成人)，并且可以针对患者、受试者、不同重量和物种的哺乳动物进行调整。给药频率在医学或兽医学从业者(例如，医师、兽医师)的范围之内，其取决于常规因素，包括患者或受试者的年龄、性别、一般健康状况、其他状况以及着手解决的特殊状况或症状。可以将病毒载体注射到感兴趣的组织中。对于细胞类型特异性基因组修饰，Cas9的表达可以由细胞类型特异性启动子驱动。例如，肝脏特异性表达可以使用白蛋白启动子，而神经元特异性表达(例如，用于靶向CNS障碍)可以使用突触蛋白I启动子。就体内递送而言，AAV相比于其他病毒载体是有利的，这是由于两个原因：低毒性(这可以是由于纯化方法不需要细胞粒子的超速离心所致，而超速离心可能激活免疫反应)。引起插入诱变的低概率，原因在于它未整合到宿主基因组中。AAV具有4.5或4.75Kb的包装限制。这意味着Cas9以及启动子和转录终止子必须都配合在同一个病毒载体中。大于4.5或4.75Kb的构建体将导致病毒产生的显著降低。SpCas9是相当大的，其基因自身超过4.1Kb，使其难于包装到AAV中。因此本发明的实施例包括利用更短的Cas9同源物。例如：因此这些物种总体上是优选的Cas9物种。关于AAV，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或任何其组合。可以相对于有待被靶向的细胞而选择AAV；例如，可以选择用于靶向脑或神经元细胞的AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合；并且可以选择用于靶向心脏组织的AAV4。AAV8可用于递送到肝脏。本文的启动子和载体是单独优选的。就这些细胞而论(参见，格林姆(Grimm)，D.等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)82:5887-5911(2008))，某些AAV血清型的列表如下：细胞系AAV-1AAV-2AAV-3AAV-4AAV-5AAV-6AAV-8AAV-9Huh-7131002.50.00.1100.70.0HEK293251002.50.10.150.70.1海拉(HeLa)31002.00.16.710.20.1HepG2310016.70.31.750.3NDHep1A201000.21.00.110.20.091117100110.20.1170.1NDCHO100100141.433350101.0COS33100333.35.0142.00.5MeWo10100200.36.7101.00.2NIH3T3101002.92.90.3100.3NDA5491410020ND0.5100.50.1HT118020100100.10.3330.50.1单核细胞1111100NDND1251429NDND未成熟DC2500100NDND2222857NDND成熟DC2222100NDND3333333NDND慢病毒慢病毒是复杂的反转录病毒，其具有在有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞两者中感染并表达其基因的能力。最为人熟知的慢病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，其利其他病毒的包膜糖蛋白来靶向广泛范围的细胞类型。慢病毒可以制备如下。在克隆pCasES10(含有慢病毒转移质粒骨架)之后，将处于低传代数(p＝5)的HEK293FT接种在T-75烧瓶中，直到在转染之前的一天在具有10％胎牛血清而没有抗生素的DMEM中50％汇合。在20小时之后，培养基更换为OptiMEM(无血清)培养基，并且在4小时后进行转染。细胞用10μg的慢病毒转移质粒(pCasES10)和下列包装质粒转染：5μg的pMD2.G(VSV-g假型)、和7.5μg的psPAX2(gag/pol/rev/tat)。在具有阳离子脂质递送剂(50μL的Lipofectamine2000和100μl的Plus试剂)的4mLOptiMEM中进行转染。在6小时之后，培养基更换为具有10％胎牛血清的无抗生素的DMEM。这些方法在细胞培养过程中使用血清，但是不含血清的方法是优选的。慢病毒可以如下纯化。在48小时后收获病毒上清液。首先清除上清液的碎片并通过0.45μm的低蛋白结合(PVDF)滤膜进行过滤。然后将它们在超速离心机中以24,000rpm旋转2小时。将病毒沉淀重新悬浮在50μl的DMEM中在4℃过夜。然后将它们等分，并且立即在-80℃冷冻。在另一个实施例中，还考虑了基于马传染性贫血病毒(EIAV)的最小非灵长类慢病毒载体，尤其是对于眼基因疗法而言(参见，例如，巴鲁谷安(Balagaan)，《基因医学杂志》(JGeneMed)2006；8:275-285)。在另一个实施例中，还考虑了一种经由视网膜下注射用于治疗湿型的年龄相关性黄斑变性的、表达血管生成抑制蛋白(内皮抑素和血管抑素)的基于马传染性贫血病毒的慢病毒基因治疗载体(参见，例如，宾利(Binley)等人，《人类基因治疗》(HUMANGENETHERAPY)23:980-991(2012年9月))，并且这种载体可以经修饰用于本发明的CRISPR-Cas系统。在另一个实施例中，自灭活慢病毒载体可以用于和/或适合于本发明的CRISPR-Cas系统，该自灭活慢病毒载体具有靶向由HIVtat/rev共享的共有外显子的siRNA、核仁定位TAR诱饵、和抗CCR5特异性锤头状核酶(参见，例如，迪吉斯托(DiGiusto)等人(2010)《科学转化医学》(SciTranslMed)2:36ra43)。可以收集最少2.5×106个CD34+细胞/每千克患者体重，并且以2×106个细胞/ml的密度在X-VIVO15培养基中(龙沙公司(Lonza))预刺激16到20个小时，该培养基含有2μmol/L-谷氨酰胺、干细胞因子(100ng/ml)、Flt-3配体(Flt-3L)(100ng/ml)、和促血小板生成素(10ng/ml)(CellGenix公司)。可以用慢病毒以感染复数5在75-cm2的包被有纤连蛋白(25mg/cm2)(重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)，宝生物工程株式会社(TakaraBioInc.))的组织培养瓶中转导预刺激的细胞16到24小时。慢病毒载体还披露于帕金森病的治疗中，参见，例如，美国专利公开号20120295960以及美国专利号7303910和7351585。慢病毒载体还已经披露于眼病的治疗中，参见，例如，美国专利公开号20060281180、20090007284、US20110117189；US20090017543；US20070054961、US20100317109。慢病毒载体还已经披露于递送到脑中，参见，例如，美国专利公开号US20110293571；US20110293571、US20040013648、US20070025970、US20090111106和美国专利号US7259015。RNA递送RNA递送：该CRISPR酶，例如Cas9，和/或任何本发明的RNA，例如指导RNA，也可以按RNA的形式递送。可以使用体外转录产生Cas9mRNA。例如，可以使用含有下列元件的PCR盒来合成Cas9mRNA：来自β珠蛋白-polyA尾(一串120个或更多的腺嘌呤)的T7_启动子-科扎克(kozak)序列(GCCACC)-Cas9-3’UTR。该盒可以用于经由T7聚合酶的转录。也可以使用体外转录从含有T7_启动子-GG-指导RNA序列的盒来转录指导RNA。为了增强表达并且降低可能的毒性，可以例如使用假-U或5-甲基-C将CRISPR酶编码序列和/或指导RNA修饰成包括一个或多个修饰核苷。mRNA递送方法用于当前的肝脏递送是特别有希望的。关于RNA递送的许多临床工作聚焦于RNAi或反义技术，但是这些系统可以适用于递送RNA以实施本发明。应当相应地阅读以下关于RNAi等的参考文献。纳米粒子可以使用纳米粒子或脂质包膜同时递送CRISPR酶mRNA和指导RNA。例如，苏X(SuX)、弗里克J(FrickeJ)、卡瓦纳DG(KavanaghDG)、欧文DJ(IrvineDJ)(“使用脂质包封的pH响应性聚合物纳米粒子的体外和体内mRNA递送”(“InvitroandinvivomRNAdeliveryusinglipid-envelopedpH-responsivepolymernanoparticles”)《分子药理学》(MolPharm.)2011年6月6；8(3):774-87.doi:10.1021/mp100390w。2011年4月1日电子版描述了生物可降解的核-壳结构纳米粒子，其具有由磷脂双层壳包封的聚(β-氨基酯)(PBAE)核。这些被开发为用于体内mRNA递送。该pH响应性PBAE被选择为促进内体破裂，而该脂质表面层被选择为使聚阳离子核的毒性最小化。因此，这些对于递送本发明的RNA是优选的。在一个实施例中，考虑了基于自组装生物粘附聚合物的纳米粒子，其可应用于肽的经口递送、肽的静脉内递送以及肽的鼻递送，均递送到脑。其他实施例，还考虑了例如疏水性药物的经口吸收和眼部递送。分子包膜技术涉及被保护并递送到疾病部位的工程化聚合物包膜(参见，例如，马萨(Mazza)M.等人，《ACS纳米》(ACSNano)，2013.7(2):1016-1026；秀(Siew)A.等人，《分子药理学》(MolPharm)，2012.9(1):14-28；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人，《控释杂志》(JContrRel)，2012.161(2):523-36；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人，《分子药理学》(MolPharm)，2012.9(6):1665-80；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人，《分子药理学》(MolPharm)，2012.9(6):1764-74；加勒特(Garrett)N.L.等人，《生物光电杂志》(JBiophotonics)，2012.5(5-6):458-68；加勒特(Garrett)N.L.等人，《拉曼光谱杂志》(JRamanSpect)，2012.43(5):681-688；阿哈默德(Ahmad)S.等人，《皇家学会界面杂志》(JRoyalSocInterface)2010.7:S423-33；乌切克布(Uchegbu)I.F.，《药物递送专家评论》(ExpertOpinDrugDeliv)，2006.3(5):629-40；曲(Qu)X.等人，《生物大分子》(Biomacromolecules)，2006.7(12):3452-9和乌切克布(Uchegbu)I.F.等人，《国际药学杂志》(IntJPharm)，2001.224:185-199)。考虑了约5mg/kg的剂量，呈单剂量或多剂量形式，这取决于靶组织。在一个实施例中，可以使用由丹·安德森实验室(DanAnderson’slab)在MIT开发的可将RNA递送到癌细胞以便使肿瘤生长停止的纳米粒子/并且或使其适用于本发明的CRISPRCas系统。具体地说，安德森实验室开发了用于新生物材料和纳米制剂的合成、纯化、表征、和配制的全自动化组合系统。参见，例如，阿拉比(Alabi)等人，《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA.)2013年8月6日；110(32):12881-6；张(Zhang)等人，《先进材料》(AdvMater.)2013年9月6日；25(33):4641-5；江(Jiang)等人，《纳米通讯》(NanoLett.)2013年3月13日；13(3):1059-64；卡拉吉安尼斯(Karagiannis)等人，《ACS纳米》(ACSNano.)2012年10月23日；6(10):8484-7；怀特海德(Whitehead)等人，《ACS纳米》(ACSNano.)2012年8月28日；6(8):6922-9和李(Lee)等人，《自然纳米技术》(NatNanotechnol.)2012年6月3日；7(6):389-93。美国专利申请20110293703涉及类脂质化合物，这些化合物在多核苷酸的给药中也是特别有用的，其可适用于递送本发明的CRISPRCas系统。在一个方面，氨基醇类脂质化合物与有待递送到细胞或受试者的药剂结合而形成微粒子、纳米粒子、脂质体、或胶束。有待通过粒子、脂质体、或胶束递送的药剂可以处于气体、液体、或固体的形式，并且该药剂可以是一种多核苷酸、蛋白质、肽、或小分子。这些氨基醇类脂质化合物可以与其他氨基醇类脂质化合物、聚合物(合成的或天然的)、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白质、脂质、等等形成粒子。然后这些粒子可以可选地与药用赋形剂结合而形成药物组合物。美国专利公开号20110293703也提供了制备氨基醇类脂质化合物的方法。使胺的一种或多种等效物与环氧化物封端化合物的一种或多种等效物在适当条件下反应而形成本发明的氨基醇类脂质化合物。在某些实施例中，胺的所有氨基基团与环氧化物封端化合物充分反应而形成叔胺。在其他实施例中，胺的所有氨基基团未与环氧化物封端化合物完全反应形成叔胺，由此生成在氨基醇类脂质化合物中的伯胺或仲胺。这些伯胺或仲胺照原样留下或者可以与另一种亲电体如一种不同的环氧化物封端化合物反应。正如本领域技术人员将理解的，胺与未过量的环氧化物封端化合物反应将产生多种不同的具有不同数目的尾部的氨基醇类脂质化合物。某些胺类可以用两个环氧化物衍生的化合物尾部将其完全功能化，而其他分子用环氧化物衍生的化合物尾部将不会被完全功能化。例如，二胺或多胺可包括离开该分子的不同氨基部分的一个、二个、三个、或四个环氧化物衍生的化合物尾部，从而产生伯胺、仲胺、和叔胺。在某些实施例中，并不是所有氨基基团都被完全功能化。在某些实施例中，使用相同类型的环氧化物封端化合物中的两种。在其他实施例中，使用两种或更多种不同的环氧化物封端化合物。氨基醇类脂质化合物的合成是用或不用溶剂进行的，并且该合成可以在范围从30℃-100℃，优选在大致50℃-90℃的较高温度下进行。可选地，可以将制备的氨基醇类脂质化合物纯化。例如，可以纯化氨基醇类脂质化合物的混合物而产生具有特定数目的、环氧化物衍生的化合物尾部的氨基醇类脂质化合物。或者，该混合物可以被纯化而产生特定的立体异构体或区域异构体。也可以使用烷基卤化物(例如，碘甲烷)或其他烷化剂将这些氨基醇类脂质化合物烷化，和/或它们可以被酰化。美国专利公开号20110293703还提供了通过发明方法制备的氨基醇类脂质化合物的文库。使用涉及液体处理器、机器人、微量滴定板、计算机、等等的高通量技术，可以制备和/或筛选这些氨基醇类脂质化合物。在某些实施例中，筛选了这些氨基醇类脂质化合物的将多核苷酸或其他药剂(例如，蛋白质、肽、小分子)转染到细胞中的能力。美国专利公开号20130302401涉及已经使用组合聚合制备的一类聚(β-氨基醇)(PBAAs)。这些发明的PBAA可以在生物技术和生物医学应用中用作涂层(如用于医疗装置或植入物的薄膜或多层薄膜的涂层)、添加剂、材料、赋形剂、生物防污剂(non-biofoulingagent)、微图像化剂(micropatterningagent)、以及细胞封装剂(cellularencapsulationagent)。当用作表面涂层时，这些PBAA在体外和体内均引出不同水平的炎症，这取决于它们的化学结构。这类材料的巨大化学多样性允许我们鉴定出体外抑制巨噬细胞激活的聚合物涂层。此外，在羧化聚苯乙烯微粒的皮下移植之后，这些涂层减少了炎症细胞的募集，并且减轻了纤维化。这些聚合物可以用来形成用于细胞封装的聚电解质复合物胶囊。本发明还可具有许多其他的生物应用，如抗微生物涂层、DNA或siRNA递送、以及干细胞组织工程。美国专利公开号20130302401的传授内容可以适用于本发明的CRISPRCas系统。在另一个实施例中，考虑了脂质纳米粒子(LNP)。抗转甲状腺素蛋白小干扰RNA已经被封装在脂质纳米粒子中并且被递送到人体内(参见，例如，科尔贺(Coelho)等人，《新英格兰医学杂志》(NEnglJMed)2013；369:819-29)，并且这样一种系统可以适用于并且应用于本发明的CRISPRCas系统。考虑到静脉内给予约0.01到约1mg/kg体重的剂量。考虑了降低输注相关反应的风险的用药，如考虑到地塞米松、对乙酰氨基酚(acetampinophen)、苯海拉明或西替利嗪、以及雷尼替丁。考虑了约0.3mg/千克的多剂量，每4周一次，五个剂量。LNP已经显示在将siRNA递送到肝脏中是高度有效的(参见，例如，塔韦内罗(Tabernero)等人，《癌症发现》(CancerDiscovery)，2013年4月，第3卷，第4期，第363-470页)，并且因此被考虑用于递送编码CRISPRCas的RNA到肝脏。考虑了6mg/kg的LNP的约四个剂量的用量，每两周一次。塔韦内罗(Tabernero)等人证明，在以0.7mg/kg给予LNP的前2个周期之后，观察到肿瘤消退，并且在6个周期结束之后，患者已经实现了部分应答，具有淋巴结转移完全消退以及肝脏肿瘤的显著萎缩。在此患者中给予40个剂量之后获得完全应答，在接受经过26个月的剂量之后其保持缓解和完全治疗。具有RCC和在用VEGF途径抑制剂进行的在先治疗之后进展的包括肾脏、肺、以及淋巴结在内的肝外部位疾病的两位患者在所有部位的疾病都保持稳定大约8到12个月，并且一位具有PNET和肝转移的患者继续在18个月(36个剂量)的延伸研究中保持疾病稳定。然而，必须将LNP的电荷考虑在内。当阳离子脂质与带负电的脂质结合时，诱导促进细胞内递送的非双层结构。由于带电荷的LNP在静脉注射之后迅速从循环中清除，开发了具有低于7的pKa值的可电离阳离子脂质(参见，例如，罗辛(Rosin)等人，《分子治疗》(MolecularTherapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。带负电荷的聚合物如RNA可以低pH值(例如，pH4)加载到LNP中，在此pH时可电离脂质展示出正电荷。然而，在生理学pH值时，LNP展现出与更长的循环时间相容的低表面电荷。已经关注了四种可电离阳离子脂质，即1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基-酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinKDMA)、以及1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)。已经表明，含有这些脂质的LNPsiRNA系统在体内肝细胞中展现出显著不同的基因沉默特性，具有根据采用因子VII基因沉默模型的DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP系列而变化的潜能(参见，例如，罗辛(Rosin)等人，《分子治疗》(MolecularTherapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。可以考虑LNP或者在LNP中的或与LNP相关的CRISPR-CasRNA的1μg/ml的剂量，尤其是对于含有DLinKC2-DMA的配制品而言。LNP的制备和CRISPRCas封装可以使用/和或改编自罗辛(Rosin)等人的《分子治疗》(MolecularTherapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。阳离子脂质1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinK-DMA)、1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)、(3-o-[2″-(甲氧基聚乙二醇2000)琥珀酰]-1,2-二肉豆蔻酰基-sn-二醇(PEG-S-DMG)、以及R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-C-DOMG)可以由Tekmira制药公司(TekmiraPharmaceuticals)(温哥华，加拿大)提供或者合成。胆固醇可以购自西格玛公司(圣路易斯，密苏里州)。特异性CRISPRCasRNA可以封装在含有DLinDAP、DLinDMA、DLinK-DMA、和DLinKC2-DMA的LNP中(阳离子脂质:DSPC:CHOL:PEGS-DMG或PEG-C-DOMG的摩尔比为40:10:40:10)。在需要时，可以结合0.2％SP-DiOC18(英杰公司，伯灵顿，加拿大)来评估细胞摄取、细胞内递送、和生物分布。通过将由阳离子脂质:DSPC:胆固醇:PEG-c-DOMG(40:10:40:10摩尔比)组成的混合物溶解在乙醇中直到最终脂质浓度为10mmol/l来进行封装。可以将脂质的这种乙醇溶液逐滴加入到pH4.0的50mmol/l柠檬酸盐中而形成多层囊泡，从而产生30％(vol/vol)乙醇的最终浓度。在使用挤出机(北方脂质公司(NorthernLipids)，温哥华，加拿大)通过两个重叠的80nmNuclepore聚碳酸酯滤膜挤出多层囊泡之后，可以形成大的单层囊泡。可以通过如下步骤实现封装：将溶解在含有30％乙醇(vol/vol)的pH4.0的50mmol/l柠檬酸盐中的2mg/ml的RNA逐滴加入到挤出的形成的大单层囊泡中，并且在31℃孵育30分钟，伴随持续混合直到最终的RNA/脂质重量比为0.06/1(wt/wt)。通过使用Spectra/Por2再生纤维素透析膜在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水中(PBS)透析16小时进行乙醇的去除以及配制缓冲液的中和。使用NICOMP370型粒径分析仪、囊泡/强度模式、以及高斯拟合，通过动态光散射，可以测定纳米粒子粒径分布(Nicomp粒径分析仪公司，圣巴巴拉市，加利福尼亚州)。对于所有三个LNP系统的粒径可以是约70nm的直径。可以通过使用VivaPureDMiniH柱(赛多利斯斯泰迪生物技术公司(SartoriusStedimBiotech))从分析前后收集的样品中去除游离RNA来确定RNA封装效率。从洗脱的纳米粒子提取封装的RNA并且将其在260nm定量。通过使用来自美国瓦克化学公司(WakoChemicalsUSA)(里士满(Richmond)，弗吉尼亚州)的胆固醇E酶法测定法测量囊泡中的胆固醇含量，确定了RNA与脂质的比率。与本文关于LNP和PEG脂质的讨论结合，聚乙二醇化的脂质体或LNP同样适于递送CRISPR-Cas系统或其组分。大LNP的制备可以使用/和或改编自罗辛(Rosin)等人的《分子治疗》(MolecularTherapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月。可以在含有50:10:38.5的摩尔比的DLinKC2-DMA、DSPC、和胆固醇的乙醇中制备脂质预混物溶液(20.4mg/ml总脂质浓度)。可以按照0.75:1的摩尔比(乙酸钠:DLinKC2-DMA)将乙酸钠添加到脂质预混物中。随后可以通过将该混合物与1.85倍体积的柠檬酸盐缓冲液(10mmol/l，pH3.0)在剧烈搅拌下合并而使脂质水合，从而导致在含有35％的在水性缓冲液中的自发脂质体形成。可以在37℃孵育该脂质体溶液以允许粒径的时间依赖性增加。可以通过动态光散射(纳米粒径电位分析仪(ZetasizerNanoZS)，马尔文仪器公司(MalvernInstruments)，乌斯特郡(Worcestershire)，英国)在孵育的不同时间去除等分试样以研究脂质体大小的变化。一旦实现所希望的粒径，可以将水性PEG脂质溶液(储备溶液＝在35％(vol/vol)乙醇中的10mg/mlPEG-DMG)添加到该脂质体混合物中，以便产生3.5％总脂质的最终PEG摩尔浓度。在添加PEG-脂质之后，这些脂质体应该其大小，有效抑制进一步生长。然后以大约1:10(wt:wt)的RNA与总脂质比率将RNA添加到空脂质体，然后在37℃孵育30分钟以形成加载的LNP。随后将该混合物在PBS中透析过夜，并且用0.45-μm的注射器过滤器。球形核酸(SNATM)构建体和其他纳米粒子(尤其是金纳米粒子)也被考虑为将CRISPR-Cas系统递送到预期靶标的手段。重要数据表明，基于核酸功能化的金纳米粒子的AuraSense治疗性球形核酸(SNATM)构建体是有用的。可以与本文的教导结合使用的文献包括：卡特勒(Cutler)人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2011133:9254-9257，郝(Hao)等人，Small.20117:3158-3162，张(Zhang)等人，《ACS纳米》(ACSNano.)20115:6962-6970，卡特勒(Cutler)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2012134:1376-1391，杨(Young)等人，《纳米通讯》(NanoLett.)201212:3867-71，郑(Zheng)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)2012109:11975-80，米尔金(Mirkin)，《纳米医学》(Nanomedicine)20127:635-638张(Zhang)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2012134:16488-1691，因特劳布(Weintraub)，《自然》(Nature)2013495:S14-S16，崔(Choi)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)2013110(19):7625-7630，詹森(Jensen)等人，《科学转化医学》(SciTranslMed)5，209ra152(2013)以及米尔金(Mirkin)等人，Small,10:186-192。具有RNA的自组装纳米粒子可以用被聚乙二醇化的聚乙烯亚胺(PEI)构建，其中Arg-Gly-Asp(RGD)肽配体附接在聚乙二醇(PEG)的远端。例如，这一系统已经被用作靶向表达整合素的肿瘤新血管系统和递送抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)表达以及由此实现抑制肿瘤血管发生的siRNA的手段(参见，例如，施弗勒斯(Schiffelers)等人，《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)，2004，第32卷，第19期)。通过将等体积的阳离子聚合物水溶液和核酸水溶液混合从而产生在2到6范围上的可电离氮(聚合物)相比磷酸盐(核酸)的净摩尔过量，从而制备纳米束。在阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致聚复合物的形成，其具有约100nm的平均粒径分布，此后称为纳米束。设想了CRISPRCas的约100到200mg的剂量，用于施弗勒斯(Schiffelers)等人的自组装纳米粒子中的递送。巴特利特(Bartlett)等人的纳米束(PNAS，2007年9月25日，第104卷，第39期)也可以应用于本发明。通过将等体积的阳离子聚合物水溶液和核酸水溶液混合从而产生在2到6范围上的可电离氮(聚合物)相比磷酸盐(核酸)的净摩尔过量，从而制备巴特利特(Bartlett)等人的纳米束。在阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致聚复合物的形成，其具有约100nm的平均粒径分布，此后称为纳米束。巴特利特(Bartlett)等人的DOTA-siRNA合成如下：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHSester)订购自Macrocyclics公司(达拉斯(Dallas)，德克萨斯州)。将碳酸盐缓冲液(pH9)中的具有100倍摩尔过量的DOTA-NHS-酯的胺修饰的RNA有义链加入到微量离心管中。通过在室温搅拌4小时使这些内容物反应。将该DOTA-RNA有义缀合物用乙醇沉淀，重新悬浮在水中，并且退火到未修饰的反义链上而产生DOTA-siRNA。所有液体用Chelex-100(Bio-Rad，赫库斯(Hercules)，加利福尼亚州)预处理，以便去除微量金属污染物。通过使用含有环糊精的聚阳离子可以形成Tf靶向和非靶向的siRNA纳米粒子。典型地，纳米粒子以3(+/-)的进料比和0.5g/升的siRNA浓度在水中形成。用Tf(金刚烷-PEG-Tf)修饰在靶向纳米粒子表面上的百分之一的金刚烷-PEG分子。将纳米粒子悬浮在用于注射的5％(wt/vol)的葡萄糖载体溶液中。戴维斯(Davis)等人(《自然》，第464卷，2010年4月15日)使用靶向的纳米粒子递送系统进行了RNA临床试验(临床试验登记号NCT00689065)。在21天周期的第1、3、8和10天通过30分钟的静脉输注对患有标准护理治疗难治的实体癌的患者给予靶向纳米粒子剂量。这些纳米粒子包含合成递送系统，该系统含有：(1)线性的、基于环糊精的聚合物(CDP)，(2)展示在纳米粒子的外部上的用于接合癌细胞表面上的TF受体(TFR)的人转铁蛋白蛋白(TF)靶向配体，(3)亲水聚合物(用来促进在生物流体中的纳米粒子稳定性的聚乙二醇(PEG))，以及(4)被设计为降低RRM2(在临床中使用的序列，先前表示为siR2B+5)表达的siRNA。TFR已经久为所知在恶性细胞中被下调，并且RRM2是一种确立的抗癌靶标。已经显示这些纳米粒子(临床版本表示为CALAA-01)在非人类灵长动物中的多剂量研究中良好耐受。虽然已经通过脂质体递送向患有慢性粒细胞白血病的单一患者给予了siRNA，但是戴维斯等人的临床试验是初期人类试验，该试验用一个靶向的递送系统全身性地递送siRNA并且治疗患有实体癌的患者。为了确定该靶向的递送系统是否能够将功能性siRNA有效递送到人类肿瘤，戴维斯等人研究了来自三个不同的剂量组群的三位患者的活组织检查；患者A、B和C均患有转移性黑素瘤并且分别接受了18、24和30mgm-2siRNA的CALAA-01剂量。还可以针对本发明的CRISPRCas系统考虑相似的剂量。用含有一种线性的基于环糊精的聚合物(CDP)、一种展示在纳米粒子的外部上的用于接合癌细胞表面上的TF受体(TFR)的人转铁蛋白(TF)靶向配体和/或一种亲水聚合物(例如，用来促进在生物流体中的纳米粒子稳定性的聚乙二醇(PEG))的纳米粒子，可以实现本发明的递送。粒子递送系统和/或配制品：已知一些类型的粒子递送系统和/或配制品在不同种类的生物医学应用中是有用的。总体上，粒子被定义为小物体，该物体在其运输和特性方面以整体单元表现。将粒子根据直径进一步分类。粗粒子覆盖2,500与10,000纳米之间的范围。细粒子的尺寸在100与2,500纳米之间。超细粒子、或纳米粒子的大小通常是在1和100纳米之间。100-nm极限的基础是以下事实：使粒子区分于大块材料的新颖特性典型地是在100nm之下的临界长度规模下显现的。如在此所使用的，粒子递送系统/配制品被定义为任何包括根据本发明的粒子的生物学递送系统/配制品。根据本发明的粒子是任何具有小于100微米(μm)的最大尺寸(例如直径)的实体。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于10μm的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于2000纳米(nm)的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于1000纳米(nm)的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、或100nm的最大尺寸。典型地，本发明的粒子具有500nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有250nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有200nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有150nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有100nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在本发明的一些实施例中使用更小的粒子(例如，具有50nm或更小的最大尺寸)。在一些实施例中，本发明的粒子具有范围在25nm与200nm之间的最大尺寸。粒子表征(包括，例如表征形态、尺寸、等)是使用各种不同的技术进行的。通用技术是电子显微术(TEM、SEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、X-射线光电子光谱法(XPS)、粉末X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、紫外-可见光谱法、双偏振干涉法以及核磁共振(NMR)。表征(尺寸测量)可以针对天然粒子(即预加载)或在加载负荷物(在此负荷物指代例如CRISPR-Cas系统的一种或多种组分，例如CRISPR酶或mRNA或指导RNA、或其任何组合，并且可以包括另外的载体和/或赋形剂)后进行，以提供具有最适大小的粒子以用于任何本发明的体外、离体和/或体内施用的递送。在某些优选实施例中，粒子尺寸(例如，直径)表征是基于使用动态激光散射(DLS)的测量。可提及的是美国专利号8,709,843；美国专利号6,007,845；美国专利号5,855,913；美国专利号5,985,309；美国专利号5,543,158；以及詹姆斯(James)E.达尔曼(Dahlman)和卡门巴尔内斯(CarmenBarnes)等人在《自然纳米技术》(NatureNanotechnology)(2014)的公开物，在线公开于2014年5月11日，doi:10.1038/nnano.2014.84，以上文献涉及粒子、制造和使用它们的方法及其测量。在本发明的范围内的粒子递送系统可以按任何形式提供，包括但不限于固体、半固体、乳液、或胶体粒子。这样可以将在此描述的任何递送系统，包括但不限于例如基于脂质的系统、脂质体、胶束、微泡、外泌体、或基因枪，提供为在本发明的范围内的粒子递送系统。纳米粒子就本发明而言，优选的是使用纳米粒子或脂质包膜递送CRISPR复合物的一种或多种组分例如CRISPR酶或mRNA或指导RNA。其他递送系统或载体可以结合本发明的纳米粒子方面使用。通常，“纳米粒子”是指任何具有小于1000nm的直径的粒子。在某些优选实施例中，本发明的纳米粒子具有500nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有范围在25nm与200nm之间的最大尺寸。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有100nm或更小的最大尺寸。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有范围在35nm与60nm之间的最大尺寸。包含于本发明中的纳米粒子可以提供为不同形式，例如提供为固体纳米粒子(例如，金属如银、金、铁、钛，非金属，基于脂质的固体，聚合物)、纳米粒子悬浮液、或其组合。可以制备金属纳米粒子、介电纳米粒子和半导体纳米粒子连同混合结构(例如，核-壳纳米粒子)。由半导体材料制成的纳米粒子也可以经量子点标记，如果它们足够小(典型地低于10nm)使得电子能级的量子化发生的话。此类纳米级粒子作为药物载体或成像剂用于生物医学应用中，并且可以被适配为用于本发明中的相似目的。半-固体和软纳米粒子已经制造出，并且是在本发明的范围内。具有半-固体性质的原型纳米粒子是脂质体。各种类型的脂质体纳米粒子目前在临床上用作用于抗癌药物和疫苗的递送系统。一半亲水并且另一半疏水的纳米粒子称为杰那斯(Janus)粒子，并且对于稳定乳液是特别有效的。它们可以在水/油界面处自组装，并且充当固体表面活性剂。美国专利号8,709,843(通过引用并入本文)提供了用于将包含治疗剂的粒子靶向递送至组织、细胞和细胞内隔室的药物递送系统。本发明提供了包含聚合物的靶向粒子，该聚合物缀合至表面活性剂、亲水聚合物或脂类。通过引用并入本文的美国专利号6,007,845提供了以下粒子，这些粒子具有多嵌段共聚物的核，该多嵌段共聚物是通过将多官能化合物与一种或多种疏水聚合物和一种或多种亲水聚合物共价连接而形成的，并且这些粒子包含生物活性材料。通过引用并入本文的美国专利号5,855,913提供了具有空气动力学上轻的粒子的微粒组合物，这些空气动力学上轻的粒子具有小于0.4g/cm3的振实密度，其平均直径在5μm与30μm之间，将表面活性剂结合在其表面以用于将药物递送至肺部系统。通过引用并入本文的美国专利号5,985,309提供了以下粒子，这些粒子结合表面活性剂和/或带正电或负电的治疗剂或诊断剂和相反电荷带电分子的亲水或疏水复合物，以用于递送至肺部系统。通过引用并入本文的美国专利号5,543,158提供了生物可降解的可注射纳米粒子，这些可注射纳米粒子具有生物可降解的固体核，该固体核在表面上包含生物活性材料和聚(亚烷基二醇)部分。通过引用结合在此的WO2012135025(也公开为US20120251560)描述了缀合的聚乙烯亚胺(PEI)聚合物和缀合的氮杂-大环化合物(统称为“缀合的微脂体(lipomer)”或“微脂体”)。在某些实施例中，可设想此类缀合的微脂体可以在CRISPR-Cas系统的背景下使用，以实现体外、离体和体内基因组干扰以修饰基因表达，包括调节蛋白表达。在一个实施例中，该纳米粒子可以是环氧化物-修饰的脂质-聚合物，有利地为7C1(参见，例如詹姆斯(James)E.达尔曼(Dahlman)和卡门巴尔内斯(CarmenBarnes)等人在《自然纳米技术》(NatureNanotechnology)(2014)的公开物，在线公开于2014年5月11日，doi:10.1038/nnano.2014.84)。C71是通过使C15环氧化物终止的脂质与PEI600以14:1摩尔比进行反应来合成，并且与C14PEG2000配制以产生在PBS溶液中稳定持续至少40天的纳米粒子(直径在35与60nm之间)。可以利用环氧化物-修饰的脂质-聚合物将本发明的CRISPR-Cas系统递送至肺部细胞、心血管细胞或肾细胞，然而本领域的技术人员可以调适该系统以递送到其他靶器官。设想了从约0.05至约0.6mg/kg的剂量范围。还设想了经数天或数周的剂量，其中总剂量为约2mg/kg。外泌体外泌体是转运RNA和蛋白质的并且可以向脑和其他靶器官中递送RNA的内源纳米囊泡。为了降低免疫原性，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人(2011，《自然生物技术》29:341)使用了用于外泌体产生的自我衍生的树突细胞。通过将树突细胞工程化为表达Lamp2b(一种外泌体膜蛋白，融合到神经元特异性RVG肽上)而实现了靶向脑。通过电穿孔使纯化的外泌体加载外源RNA。静脉注射的RVG靶向的外泌体特异性地将GAPDHsiRNA递送到脑中的神经元、小胶质细胞、少突神经胶质细胞，导致特异性的基因敲除。预暴露于RVG外泌体未减弱敲低，并且在其他组织中未观察到非特异性摄取。通过BACE1的强的mRNA(60％)和蛋白质(62％)敲低证明了外泌体介导的siRNA递送的治疗潜能，BACE1是一种阿尔茨海默病中的治疗靶标。为了获得免疫惰性的外泌体池，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人收获了来自具有同源主要组织相容性复合体(MHC)单体型的近交C57BL/6小鼠的骨髓。由于未成熟树突细胞产生大量的缺乏T细胞激活剂如MHC-II和CD86的外泌体，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人选择具有粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的树突细胞持续7天。次日，使用良好建立的超速离心方案从培养上清从纯化外泌体。这些产生的外泌体在物理上是同质的，具有直径为80nm的粒径分布峰，正如通过纳米粒子跟踪分析(NTA)和电子显微镜检查所测定。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人获得了6-12μg的外泌体(基于蛋白质浓度测量的)/每106个细胞。其次，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人研究了使用适用于纳米级应用的穿孔方案给修饰的外泌体加载外源负荷的可能性。由于电穿孔对于纳米级的膜粒子尚未良好表征，使用非特异性Cy5标记的RNA用于电穿孔方案的经验优化。在外泌体超速离心和溶解之后测定了封装的RNA的量。在400V和125μF的电穿孔导致RNA的最好保留并且用于所有的后续实验。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)向正常C57BL/6小鼠给予被包封在150μg的RVG外泌体中的150μg的每种BACE1siRNA并且将敲低效率与四个对照进行比较：未处理的小鼠、仅仅用RVG外泌体注射的小鼠，用与一种体内阳离子脂质体试剂络合的BACE1siRNA注射的小鼠、以及用与RVG-9R络合的BACE1siRNA注射的小鼠，该RVG肽与静电结合到siRNA上的9个D-精氨酸缀合。在给药之后3天，分析皮层组织样品，并且在siRNA-RVG-9R处理的和siRNARVG外泌体处理的小鼠中均观察到显著的蛋白质敲低(45％，P<0.05，相对于62％，P<0.01)，这是由于显著的BACE1mRNA水平降低(分别为66％[+或-]15％，P<0.001以及61％[+或-]13％，P<0.01)。而且，申请人证明了在RVG-外泌体处理的动物中在总[β]-淀粉样蛋白1-42水平上的显著降低(55％，P<0.05)，其中β淀粉样蛋白为一种在阿尔茨海默病理学中的淀粉样斑块的主要成分。所观察到的降低大于在心室内注射BACE1抑制剂之后的正常小鼠中证明的β淀粉样蛋白1-40降低。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)在BACE1切割产物上进行了5'-cDNA末端快速扩增(RACE)，其提供了经由siRNA的RNAi介导的敲低的证据。最后，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人通过评定IL-6、IP-10、TNFα和IFN-α血清浓度研究了RNA-RVG外泌体是否诱导了体内免疫反应。在外泌体处理之后，类似于与有力地刺激IL-6分泌的siRNA-RVG-9R相反的siRNA转染试剂处理，登记了在所有细胞因子上的非显著性变化，证实了该外泌体处理的免疫惰性属性。假定外泌体仅仅封装20％的siRNA，用RVG-外泌体递送比RVG-9R递送显得更有效，因为用少五倍的siRNA实现了相当的mRNA敲低和更好的蛋白质敲低，而没有相应水平的免疫刺激。这个实验证明了RVG-外泌体技术的治疗潜力，其潜在地适合于与神经退行性疾病相关的基因的长期沉默。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人的外泌体递送系统可以用于将本发明的CRISPR-Cas系统递送至治疗靶标，尤其是神经退行性疾病。对于本发明可以考虑封装在约100到1000mg的RVG外泌体中的约100到1000mg的CRISPRCas的剂量。艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人(《自然－实验手册》(NatureProtocols)7,2112-2126(2012))披露了可以如何利用来源于培养的细胞的外泌体用于体外和体内递送RNA。这个方案首先描述了通过转染一种包含与肽配体融合的外泌体蛋白的表达载体的靶向外泌体的产生。其次，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人解释了如何纯化和表征来自转染的细胞上清液的外泌体。接着，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人详述了将RNA加载到外泌体中的关键步骤。最后，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人概述了如何使用外泌体有效体外递送RNA以及体内递送到小鼠脑中。还提供了预期结果的实例，其中外泌体介导的RNA递送通过功能分析和成像而评估。整个方案进行约3周。根据本发明的递送或给药可以使用从自我衍生的树突细胞产生的外泌体来进行。根据本文的教导，这可以在本发明的实践中采用。在另一个实施例中，考虑了瓦尔格伦(Wahlgren)等人的血浆外泌体(《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)，2012年，第40卷，第17期，e130)。外泌体是由包括树突细胞(DC)、B细胞、T细胞、肥大细胞、上皮细胞和肿瘤细胞在内的许多细胞类型产生的纳米囊泡(30-90nm大小)。这些囊泡通过晚期核内体的向内出芽而形成，并且然后在与质膜融合后释放到细胞外环境中。由于外泌体天然地在细胞之间运送RNA，这种特性在基因治疗中可以是有用的，并且根据本披露可以用于本发明的实践中。来自血浆的外泌体可以通过如下制备：在900g离心血沉棕黄层持续20分钟以便分离血浆，之后收获细胞上清液，在300g离心10分钟以便去除细胞，并且在16500g离心30分钟，之后通过0.22mm过滤器进行过滤。通过在120000g超速离心70分钟使外泌体沉淀。根据在RNAi人/小鼠启动试剂盒(Quiagen，希尔顿(Hilden)，德国)中的制造商的说明进行siRNA到外泌体中的化学转染。siRNA以终浓度2mmol/ml添加到100mlPBS中。在加入HiPerFect转染试剂之后，将该混合物在室温下孵育10分钟。为了去除过量的胶束，使用醛/硫酸盐乳胶珠再分离外泌体。可以类似于siRNA进行CRISPRCas到外泌体中的化学转染。外泌体可以与从健康供体的外周血中分离的单核细胞和淋巴细胞共培养。因此，可以考虑的是，可以将含有CRISPR的外泌体引入人单核细胞和淋巴细胞中并且以自体方式再引入。因此，可以使用血浆外泌体进行根据本发明的递送或给药。脂质体可以用脂质体进行根据本发明的递送或给药。脂质体是球形囊泡结构，其组成为围绕内部水性区室的单层或多层脂质双层以及相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层。脂质体作为药物递送载体受到了相当的重视，因为它们是生物相容、无毒的，可以递送亲水和亲脂性药物分子，包护它们的负荷物免于被血浆酶降解，并且运送它们的负荷跨过生物膜和血脑屏障(BBB)(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(JournalofDrugDelivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以从几种不同类型的脂质制造脂质体；然而，磷脂最常用来产生作为药物载体的脂质体。虽然当脂质膜与一种水性溶液混合时脂质体形成是自发的，但也可通过使用一个均质机、超声发生器、或挤出设备以振摇的形式施加力使其加速(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(JournalofDrugDelivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以将几种其他的添加剂添加到脂质体，以便修饰其结构和特性。例如，可以将胆固醇或鞘磷脂添加到脂质体混合物中，以便帮助稳定脂质体结构并且防止脂质体内部负荷物的泄漏。此外，从氢化卵磷脂酰胆碱或卵磷脂酰胆碱、胆固醇、和磷酸二鲸蜡脂制备脂质体，并且脂质体的平均囊泡大小被调整到约50至100nm。(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(JournalofDrugDelivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。脂质体配制品可以主要由天然磷脂和脂质如1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷酯构成。由于这种配制品仅仅由磷脂组成，脂质体配制品已经遇到了许多挑战，其中之一是在血浆中的不稳定性。已经作出战胜这些挑战的若干尝试，特别是在脂质膜的处理方面。这些尝试之一集中于胆固醇的处理。将胆固醇添加到常规配制品中减缓了封装的生物活性化合物到血浆中的迅速释放，或者添加1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加稳定性(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(JournalofDrugDelivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。在一个特别有利的实施例中，特洛伊木马(TrojanHorse)脂质体(也称为分子木马)是令人希望的并且方案可见于http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long。这些粒子允许转基因在血管内注射之后递送到整个脑。不受到限制，表面结合有特异性抗体的中性脂质粒子允许经由胞吞作用跨过血脑屏障。申请人假定利用特洛伊木马脂质体将核酸酶的CRISPR家族经由血管内注射递送到脑，这将允许全脑转基因动物，而不需要胚胎操作。对于在脂质体中的体内给药，可以考虑约1-5g的DNA或RNA。在另一个实施例中，该CRISPRCas系统可以在脂质体中给药，如一种稳定的核酸-脂质粒子(SNALP)(参见，例如，莫里西(Morrissey)等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)，第23卷，第8期，2005年8月)。考虑了约1、3或5mg/kg/天的靶向SNALP中的特异性CRISPRCas的每日静脉注射。日治疗可以经过约三天，然后每周治疗持续约五周。在另一个实施例中，还考虑了通过以约1或2.5mg/kg的剂量静脉注射给药的封装有特异性CRISPRCas的SNALP(参见，例如，齐默尔曼(Zimmerman)等人，《自然通讯》(NatureLetters)，第441卷，2006年5月4日)。该SNALP配制品可含有以-1,2:40:10:48的摩尔百分比的脂质3-N-[(w甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻氧基-丙胺(PEG-C-DMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇，(参见，例如，齐默尔曼(Zimmerman)等人，《自然通讯》(NatureLetters)，第441卷，2006年5月4日)。在另一个实施例中，已经证明稳定的核酸-脂质粒子(SNALP)将分子有效递送到高度血管化的HepG2-衍生的肝脏肿瘤，但是不递送到血管化不良的HCT-116衍生的肝脏肿瘤(参见，例如，李(Li)，《基因疗法》(GeneTherapy)(2012)19，775-780)。可以通过如下制备这些SNALP脂质体：使用25:1的脂质/siRNA比率和48/40/10/2的胆固醇/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA的摩尔比，用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和siRNA配制D-Lin-DMA和PEG-C-DMA。生成的SNALP脂质体在大小上为约80-100nm。在又另一个实施例中，SNALP可以包含合成胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(AvantiPolarLipids公司，阿拉巴斯特(Alabaster)，阿拉巴马州，美国)、3-N-[(w-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基胺、和阳离子的1,2-二亚油基氧基-3-N,N二甲基氨基丙烷(参见，例如，盖斯伯特(Geisbert)等人，《柳叶刀》(Lancet)2010；375:1896-905)。例如可以考虑静脉推注给予约2mg/kg总CRISPRCas/剂的剂量。在又另一个实施例中，SNALP可以包含合成胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC；AvantiPolarLipids公司)、PEG-cDMA以及1,2-二亚油基氧基-3-(N；N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMA)(参见，例如，贾奇(Judge)，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)119:661-673(2009))。用于体内研究的配制品可包含约9:1的最终脂质/RNA质量比。已经由阿尔尼拉姆制药公司(AlnylamPharmaceuticals)的巴洛斯(Barros)和格罗布(Gollob)评论了RNAi纳米药物的安全性(参见，例如，《先进药物递送评论》(AdvancedDrugDeliveryReviews)64(2012)1730-1737)。稳定的核酸脂质粒子(SNALP)由四种不同的脂质构成-一种在低pH时为阳离子的可电离脂质(DLinDMA)、一种中性辅助脂质、胆固醇、和一种可扩散的聚乙二醇(PEG)-脂质。该粒子直径大约为80nm并且在生理pH时是电中性的。在配制过程中，该可电离脂质用于在粒子形成过程中使脂质与阴离子RNA缩合。当在渐增的酸性内体条件下带正电荷时，该可电离的脂质还介导了SNALP与内体膜的融合，从而使得能够将RNA释放到细胞质中。该PEG-脂质在配制过程中使该粒子稳定并且减少聚集，随后提供中性的亲水性外部，以改进药代动力学特性。到目前为止，已经使用具有RNA的SNALP配制品开始两个临床项目。Tekmira制药公司最近完成了SNALP-ApoB在具有增高的LDL胆固醇的成年志愿者中的I期单剂量研究。ApoB主要在肝脏和空肠中表达，并且对于VLDL和LDL的组装和分泌是必需的。十七位受试者接受了SNALP-ApoB的单剂量(跨7个剂量水平的剂量递增)。没有肝脏毒性(预期为基于临床前研究的潜在剂量限制性毒性)的证据。处于最高剂量的(两位中的)一位受试者经历了与免疫系统刺激一致的流感样症状，于是做出结束该试验的决定。阿尔尼拉姆制药公司(AlnylamPharmaceuticals)已经类似地推出了ALN-TTR01，其采用上述SNALP技术并且靶向突变体和野生型TTR的肝细胞产生，从而治疗TTR淀粉样变性(ATTR)。已经描述了三个ATTR综合征：家族性淀粉样多发性神经病变(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)—两者均由TTR中的常染色体显性突变引起；以及由野生型TTR引起的老年全身性淀粉样变性(SSA)。最近在具有ATTR的患者中完成了ALN-TTR01的安慰剂对照单剂量递增I期试验。向31位患者(23位用研究药物，8位用安慰剂)在0.01到1.0mg/kg(基于siRNA)的剂量范围内以15分钟静脉内输注给予ALN-TTR01。治疗耐受良好，其中在肝功能试验中没有显著增加。在≥0.4mg/kg时在23位患者的3位中注意到输注相关反应；对所有患者均做出减慢输注速率的反应并且所有患者继续参与研究。在处于1mg/kg的最高剂量(如根据临床前和NHP研究预期的)的两位患者中注意到血清细胞因子IL-6、IP-10和IL-1ra的最小与瞬时升高。在1mg/kg时观察到ALN-TTR01的预期药理效应，即，血清TTR的降低。在又另一个实施例中，可以通过将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质以40:10:40:10的摩尔比分别溶解在例如乙醇中来制作SNALP(参见，森普尔(Semple)等人，《自然生物技术》(NatureNiotechnology)，第28卷，第2期，2010年2月，第172-177页)。将该脂质混合物添加到水性缓冲液中(50mM柠檬酸盐，pH4)，混合至最终的乙醇和脂质浓度分别为30％(vol/vol)和6.1mg/ml，允许在22℃平衡2分钟，然后挤出。使用Lipex挤出仪(北方脂质公司(NorthernLipids))，在22℃将水合脂质通过两层80nm孔径大小的过滤器(Nuclepore)直到获得70-90nm直径的囊泡时为止，正如通过动态光散射分析测定的。这大致需要1-3次通过。将该siRNA(溶解在50mM柠檬酸盐中，pH为4的含有30％乙醇的水溶液)以约5ml/min的速率在混合下添加到预平衡的(35℃)囊泡中。在达到0.06(wt/wt)的最终靶siRNA/脂质比率之后，将该混合物在35℃另外孵育30分钟，以允许囊泡重组和该siRNA的封装。然后去除乙醇并且通过透析或切向流渗滤用PBS(155mMNaCl、3mMNa2HPO4、1mMKH2PO4，pH7.5)替换外部缓冲液。使用控制的逐步稀释法工艺将siRNA封装在SNALP中。KC2-SNALP的脂质组分为以57.1:7.1:34.3:1.4的摩尔比使用的DLin-KC2-DMA(阳离子脂质)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC；AvantiPolarLipids公司)、合成胆固醇(西格玛公司)和PEG-C-DMA。在形成加载的粒子后，将SNALP在PBS中透析并且在使用之前通过0.2μm的滤膜消毒过滤。平均粒径为75-85nm，并且将90％-95％的siRNA封装在脂质粒子内。用于体内测试的在配制品中的最终siRNA/脂质比率是大约0.15(wt/wt)。在使用之前即刻将含有因子VIIsiRNA的LNP-siRNA系统在无菌PBS中稀释到适当浓度，并且通过侧尾静脉以10ml/kg的总体积静脉内给药。这种方法和这些递送系统可以类推到本发明的CRISPRCas系统。其他脂质其他阳离子脂质，如氨基脂质2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)可以例如类似于SiRNA地用来封装CRISPRCas系统或其组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子(参见，例如，加雅拉曼(Jayaraman)，《德国应用化学》(Angew.Chem.Int.Ed.)2012，51，8529-8533)，并且因此可以在本发明的实践中采用。可以考虑具有下列脂质组成的预成型囊泡：分别处于摩尔比40/10/40/10的氨基脂质、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、胆固醇和(R)-2,3-双(十八烷氧基)丙基-1-(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基碳酸酯(PEG-脂质)，以及大约0.05(w/w)的FVIIsiRNA/总脂质比率。为了确保在70-90nm范围内的窄粒径分布以及0.11±0.04(n＝56)的低多分散性指数，可以在添加CRISPRCasRNA之前将粒子通过80nm的膜挤出达三次。可以使用含有高度有效的氨基脂质16的粒子，其中四种脂质组分16、DSPC、胆固醇和PEG-脂质的摩尔比(50/10/38.5/1.5)可以被进一步优化，以增强体内活性。迈克尔SD科尔曼(MichaelSDKormann)等人(“在小鼠中递送化学修饰的mRNA之后治疗蛋白的表达”(“ExpressionoftherapeuticproteinsafterdeliveryofchemicallymodifiedmRNAinmice”)：《自然生物技术》(NatureBiotechnology)，第29卷，第154-157页，(2011))描述了脂质包膜用于递送RNA的用途。脂质包膜的用途在本发明中也是优选的。在另一个实施例中，脂质可以与本发明的CRISPRCas系统配制在一起而形成脂质纳米粒子(LNP)。脂质包括但不限于，DLin-KC2-DMA4、C12-200和辅助脂质二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG，可以使用自发囊泡形成程序将其与CRISPRCas而不是siRNA一起配制(参见，例如，Novobrantseva，《分子治疗-核酸》(MolecularTherapy-NucleicAcids)(2012)1，e4；doi:10.1038/mtna.2011.3)。组分摩尔比可以是约50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG)。在DLin-KC2-DMA和C12-200脂质纳米粒子(LNP)的情况下，最终脂质:siRNA重量比可以分别是约12:1和9:1。配制品可以具有约80nm的平均粒径，具有>90％的包覆效率。可以考虑3mg/kg的剂量。Tekmira公司在美国和国外具有一组针对LNP和LNP配制品的不同方面的大约95个同族专利(参见，例如，美国专利号7,982,027；7,799,565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,915,399；8,236,943和7,838,658以及欧洲专利号1766035；1519714；1781593和1664316)，所有这些专利均可用于和/或适用于本发明。该CRISPRCas系统或其组分或对其进行编码一个或多个核酸分子可以封装在PLGA微球中进行递送，例如进一步描述于美国公开申请20130252281和20130245107以及20130244279(转让给ModernaTherapeutics公司)中，其涉及包含修饰的核酸分子的组合物的配制品方面，所述核酸分子可以编码蛋白质、蛋白质前体、或该蛋白质或蛋白质前体的部分或完全加工形式。该配制品具有50:10:38.5:1.5-3.0(阳离子脂质:融合脂质:胆固醇:PEG脂质)的摩尔比。该PEG脂质可以选自，但不限于PEG-c-DOMG、PEG-DMG。该融合脂质可以是DSPC。还参见，施鲁姆(Schrum)等人，“工程化核酸的递送和配制”(DeliveryandFormulationofEngineeredNucleicAcids)，美国公开申请20120251618。Nanomerics公司的技术着手解决针对广泛治疗学的生物利用度挑战，包括基于低分子量疏水药物、肽以及核酸(质粒、siRNA、miRNA)的治疗学。该技术已经证明了明显优势的特异性的给药途径包括口服途径、跨血脑屏障的运送、向实体瘤以及眼部的递送。参见，例如，马萨(Mazza)等人，2013，《ACS纳米》(ACSNano.)2013年2月26日；7(2):1016-26；乌切克布(Uchegbu)和秀(Siew)，2013，《制药科学杂志》(JPharmSci.)102(2):305-10和拉拉特萨(Lalatsa)等人，2012，《控释杂志》(JControlRelease)，2012年7月20日；161(2):523-36。美国专利公开号20050019923描述了用于向哺乳动物身体递送生物活性分子例如多核苷酸分子、肽和多肽和/或药剂的阳离子树状聚合物。这些树状聚合物适合于将生物活性分子的递送靶向到例如肝、脾、肺、肾或心脏(或甚至脑)。树状聚合物是从简单的支化单体单元以逐步方式制备的3维大分子，其性质和功能性可以容易地进行控制和改变。经由向多功能核(发散式合成法)或朝向多功能核(收敛式合成法)重复加成结构单元(buildingblocks)而合成树状聚合物，并且结构单元的3维壳的各次加成导致更高级别的树状聚合物的形成。聚丙烯亚胺树状聚合物从二氨基丁烷核开始，通过对伯胺的丙烯腈的双迈克尔加成反应向其上添加两倍数目的氨基基团，继之为腈的氢化。这导致氨基基团的加倍。聚丙烯亚胺树状聚合物含有100％的可质子化氮以及高达64个末端氨基基团(5级，DAB64)。可质子化基团常常为能够在中性pH时接受质子的胺基。树状聚合物作为基因递送剂的用途在很大程度上集中于聚酰胺-胺和含磷化合物的用途，其中胺/酰胺的混合物或N--P(O2)S分别作为缀合单元，没有报道关于更低级别的聚丙烯亚胺树状聚合物用于基因递送的用途的工作。还研究了作为pH敏感的控制释放系统的聚丙烯亚胺树状聚合物，其用于药物递送以及当被外周氨基酸基团化学修饰时用于它们的客体分子的封装。还研究了聚丙烯亚胺树状聚合物的细胞毒性和与DNA的相互作用以及DAB64的转染效力。美国专利公开号20050019923是基于与早期报道相反的观察：阳离子树状聚合物例如聚丙烯亚胺树状聚合物展示出适当的特性，如，特异性靶向和低毒性，其用于在生物活性分子如基因材料的靶向递送中使用。另外，阳离子树状聚合物的衍生物也展示出适当的用于生物活性分子的靶向递送的特性。还参见，《生物活性聚合物》(BioactivePolymers)、美国公开申请20080267903，其披露了不同的聚合物，包括阳离子聚胺聚合物和树枝状聚合物，其显示具有抗增殖活性，并且因此可用于治疗其特征为不希望的细胞增殖的失调，如新生物和肿瘤、炎性失调(包括自身免疫性失调)、银屑病和动脉粥样硬化。这些聚合物可以作为活性剂单独使用、或者作为其他治疗剂(如药物分子或用于基因治疗的核酸)的递送载体。在这样的情况下，这些聚合物自身固有的抗肿瘤活性可以补足有待递送的药剂的活性。这些专利公开的披露可以与本文针对一种或多种CRISPRCas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子的教导结合使用。超电荷蛋白超电荷蛋白是一类具有非常高的正或负理论净电荷的工程化的或天然存在的蛋白质并且可以用于递送一种或多种CRISPRCas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。超负电荷蛋白和超正电荷蛋白两者都展示出显著的抵抗热诱导或化学诱导的聚集的能力。超正电荷蛋白还能够渗透哺乳动物细胞。使负荷物与这些蛋白质结合，如质粒DNA、RNA、或其他蛋白质，可使得这些大分子到体外和体内的哺乳动物细胞中的功能递送成为可能。刘大卫实验室(DavidLiu’slab)在2007年报道了超电荷蛋白的建立和表征(劳伦斯(Lawrence)等人，2007，《美国化学会志》(JournaloftheAmericanChemicalSociety)129，10110-10112)。RNA和质粒DNA到哺乳动物细胞中的非病毒递送对于研究和治疗应用都是有价值的(阿肯克(Akinc)等人，2010，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)26，561-569)。纯化的+36GFP蛋白(或其他超正电荷蛋白)与RNA在适当的无血清培养基中混合并且允许在添加到细胞中之前复合。在这个阶段的血清的包含将会抑制超电荷蛋白-RNA复合物的形成和降低治疗效果。已经发现以下方案对于多种细胞系是有效的(麦克诺顿(McNaughton)等人，2009，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106，6111-6116)。然而，应当进行改变蛋白质和RNA剂量的先导实验来优化用于特异性细胞系的程序。(1)在治疗前一天，以1x105个细胞/孔铺板于48孔板中。(2)在治疗当天，在无血清的培养基中稀释纯化的+36GFP蛋白直到终浓度200nM。添加RNA到50nM的终浓度。涡旋混合并且在室温孵育10分钟。(3)在孵育过程中，抽吸培养基离开细胞并且再次用PBS洗涤。(4)在孵育+36GFP和siRNA之后，向细胞加入蛋白质-RNA复合物。(5)将细胞与复合物在37℃孵育4小时。(6)在孵育之后，抽出培养基并且用20U/mL的肝素PBS洗涤三次。用含血清培养基另外孵育细胞48小时或更长，这取决于用于活性的试验。(7)通过免疫印迹、qPCR、表型分析、或其他适当的方法分析细胞。刘大卫实验室(DavidLiu’slab)已经进一步发现+36GFP在一些列细胞中是一种有效的质粒递送试剂。由于质粒DNA是一种比siRNA大的负荷物，有效复合质粒需要成比例地更大的+36GFP蛋白。为了有效质粒递送，申请人已经开发了一种带有C末端HA2肽标签的+36GFP变体，这种肽是一种已知的从流感病毒血凝素蛋白衍生的内体破坏肽。下列方案在多种细胞中是有效的，但是如上所述，建议针对特异性细胞系和递送应用优化质粒DNA的超电荷蛋白的剂量。(1)在治疗前一天，以1x105/孔铺板于48孔板中。(2)在治疗当天，在无血清的培养基中稀释纯化的GFP蛋白直到终浓度2mM。加入1mg的质粒DNA。涡旋混合并且在室温孵育10分钟。(3)在孵育过程中，抽吸培养基离开细胞并且再次用PBS洗涤。(4)在孵育GFP和质粒DNA之后，向细胞轻轻加入蛋白质-DNA复合物。(5)将细胞与复合物在37℃孵育4小时。(6)在孵育之后，抽出培养基并且用PBS洗涤。在含血清培养基中孵育细胞，并且另外孵育24-48小时。(7)在适当时分析质粒递送(例如，通过质粒驱动的基因表达)。还参见，例如，麦克诺顿(McNaughton)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106，6111-6116(2009)；克罗尼肯(Cronican)等人，《ACS化学生物学》(ACSChemicalBiology)5，747-752(2010)；克罗尼肯(Cronican)等人，《化学与生物学》(Chemistry&Biology)18，833-838(2011)；汤普森(Thompson)等人，《酶学方法》(MethodsinEnzymology)503，293-319(2012)；汤普森(Thompson)D.B.等人，《化学与生物学》(Chemistry&Biology)19(7)，831-843(2012)。超电荷蛋白的这些方法可以使用和/或适用于本发明的CRISPRCas系统的递送。吕博士(Dr.Lui)以及与本文的教导结合的本文的文献的这些系统可以用于递送一种或多种CRISPRCas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。可植入装置在另一个实施例中，还考虑可植入装置用于递送该CRISPRCas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。例如，美国专利公开20110195123披露了一种可植入医用装置，其局部地并且在延长的时期内洗脱药物，包括几种类型的这种装置、实施的治疗方式和植入方法。该装置包含聚合物基材，例如，用作装置主体的基质、以及药物，并且在一些情况下包含另外的支架材料，如金属或另外的聚合物，以及增强可见度和成像的材料。可植入递送装置在提供局部的并且在延长的时期内的释放方面可以是有利的，其中药物直接释放到患病区域的细胞外基质(ECM)，所述患病区域如肿瘤、炎症、退化，或用于针对症状的目的，或者释放到受损的平滑肌细胞，或者用于预防。如上文披露的，一类药物是RNA，并且这个系统可以用于和/或适用于本发明的CRISPRCas系统。在一些实施例中，植入方式为用于包括近距离放射疗法和针吸活组织检查在内的其他治疗的、当今开发和使用的现有植入程序。在这样的情况下，在本发明中描述的新植入物的尺寸类似于初始植入物。典型地在相同的治疗程序中植物很少的装置。正如在美国专利公开20110195123中所述，提供了一种药物递送可植入或可插入系统，包括适用于空腔例如腹腔和/或其中药物递送系统未被锚定或附接的任何其他类型的给药，其包含生物稳定的和/或可降解的和/或生物可吸收的聚合物基材，其可以例如可选地是一种基质。应当指出的是术语“插入”也包括植入。该药物递送系统优选地被实施为如美国专利公开20110195123中描述的“装填器(Loder)”。聚合物或多种聚合物是生物相容的，其结合一种药剂和/或多种药剂，使得药剂以控制的速率释放，其中该聚合物基材如基质的总体积，例如在一些实施例中是可选地并且优选地不大于容许达到该药剂的治疗水平的最大体积。作为非限制性实例，这样的体积优选在0.1m3至1000mm3的范围内，正如该药剂负荷的体积所要求的。该装填器可选地是更大的，例如当结合有一个其大小由功能性决定的装置时，例如而不限于，膝关节、宫内节育环或子宫颈环等等。在一些实施例中，该药物递送系统(用于递送该组合物)被设计为优选地采用可降解聚合物，其中主要释放机制是本体溶蚀(Bulkerosion)；或者在一些实施例中，使用了不可降解的、或缓慢降解的聚合物，其中主要释放机制是扩散而不是本体溶蚀，使得外部部分用作膜，而其内部部分用作储药池，该储药池在延长的时期内(例如从约一周到约几个月)实际上不受环境的影响。还可以可选地使用具有不同释放机制的不同聚合物的组合。在总药物释放期的重要时段期间，在表面处的浓度梯度优选地被维持有效地恒定，并且因此扩散速率是有效地恒定的(称为“零模式”扩散)。关于术语“恒定”，它意指优选地维持在治疗效果的低阈值以上的扩散速率，但是可以仍然可选地具有初期突释的特征和/或可以波动，例如增加和降低到一定程度。该扩散速率优选地被如此维持一个延长的时期，并且它被考虑为相对于一定的水平是恒定的，以便优化治疗有效期，例如该有效沉默期。该药物递送系统可选地并且优选地被设计为保护基于核苷酸的治疗剂免于降解，而不论化学性质或由于受试者体内的酶和其他因素的攻击。如描述于美国专利公开20110195123中的该药物递送系统可选地与传感和/或激活器具相关联，这些器具通过激活和/或加速/减速的无创和/或微创方法在该装置的植入之时和/或之后被操作，例如可选地包括但不限于热力加热和冷却、激光束和超声波，包括聚焦超声和/或RF(射频)方法或装置。根据美国专利公开20110195123的以下实施例，用于局部递送的部位可以可选地包括其特征为高度异常的细胞增殖、受到抑制的细胞凋亡的靶部位，包括肿瘤、活动性和/或慢性炎症和感染，包括自身免疫性疾病状态、退化组织(包括肌肉和神经组织)、慢性疼痛、退行性部位，以及用于增强组织再生的骨折位置以及其他伤口位置，以及损伤的心肌、平滑肌和横纹肌。用于植入该组合物的部位、或靶部位，优选地其特征为用于靶向局部递送的足够小的半径、面积和/或体积。例如，该靶部位可选地具有在从约0.1mm到约5cm范围内的直径。该靶部位的位置优选地针对最大治疗效力而选择。例如，该药物递送系统的组合物(可选地与如上所述的用于植入的装置一起)可选地并且优选地被植入在肿瘤环境或与之相关的血供之内或者附近。例如该组合物(可选地与该装置一起)可选地植入在胰脏、前列腺、乳房、肝脏之内或附近，通过乳头，在血管系统之内，等等。靶位置可选地选自下组，该组由以下各项组成(仅仅作为非限制性实例，因为可选地在身体内的任何部位可以适合于植入装填器)：1.在退行性部位的脑，像在帕金森病或阿尔茨海默病中的基底神经节、白质和灰质；2.如在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的情况下的脊柱；3.预防HPV感染的子宫颈；4.活动性或慢性炎性关节；5.在银屑病情况下的真皮；6.用于止痛作用的交感神经部位和感觉神经部位；7.骨内植入；8.急性和慢性感染部位；9.阴道内；10.耳内--听觉系统、内耳的迷路、前庭系统；11.气管内；12.心内；冠状动脉、心外膜；13.膀胱；14.胆道系统；15.实质组织，包括且不限于肾脏、肝脏、脾脏；16.淋巴结；17.唾液腺；18.牙龈；19.关节内(进入关节)；20.眼内；21.脑组织；22.脑室；23.空腔，包括腹腔(例如但不限于，卵巢癌)；24.食管内以及25.直肠内。可选地，该系统(例如含有该组合物的装置)的插入与向在该靶部位和该部位附近的ECM注射材料有关，从而影响该靶部位和这个部位附近的ECM中的局部pH和/或温度和/或影响该药物的扩散和/或药物动力学的其他生物因素。可选地，根据一些实施例，所述药剂的释放可以与传感和/或激活器具相关联，这些器具通过激活和/或加速/减速的无创和/或微创方法和/或别的方法在插入之前和/或之时和/或之后被操作，所述方法包括激光束、放射、热力加热和冷却、和超声波，包括聚焦超声和/或RF(射频)方法或装置、以及化学激活剂。根据美国专利公开20110195123的其他实施例，该药物优选地包括RNA，例如，对于局限性癌症情况，在乳房、胰脏、脑、肾脏、膀胱、肺、以及前列腺中，如下文所述。尽管用RNAi进行示例，但是许多药物可适用封装在装填器中，并且可以与本发明结合使用，只要这样的药物可以被装填器底物(例如像基质)封装即可，并且这个系统可以用于和/或适用于递送本发明的CRISPRCas系统。作为特殊应用的另一个实例，神经肌肉退行性疾病由于异常基因表达而发生。RNA的局部递送可以具有干扰这样的异常基因表达的治疗特性。包括小分子药物和大分子在内的抗凋亡、抗炎和抗退行性药物的局部递送也可以可选地是治疗性的。在这样的情况下，该装填器用于以恒定速率和/或通过单独植入的专用装置延长释放。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPRCas系统。作为特殊应用的又另一个实例，用基因修饰剂治疗精神和认知障碍。基因敲低是治疗选项。向中枢神经系统部位局部递送药剂的装填器是对于精神和认知障碍的治疗选项，这些精神和认知障碍包括但不限于，精神病、双极性疾病、神经性障碍和行为疾病(behavioralmaladies)。这些装填器也可以在特定脑部位进行植入时局部递送包括小分子药物和大分子的药物。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPRCas系统。作为特殊应用的另一个实例，在局部部位的先天性和/或适应性免疫介质的沉默使得能够预防器官移植排斥。用植入到移植器官和/或植入部位的装填器局部递送RNA和免疫调节试剂致使经由排斥性免疫细胞(如针对移植器官而被激活的CD8)的局部免疫抑制。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPRCas系统。作为特殊应用的另一个实例，包括VEGF和血管生成素及其他在内的血管生长因子对于新血管形成是必需的。这些因子、肽、肽模拟物的局部递送或抑制它们的阻遏物是一种重要的治疗模式；使阻遏物沉默以及用装填器局部递送刺激血管发生的这些因子、肽、大分子和小分子药物对于周围血管疾病、全身性血管疾病和心血管疾病是治疗性的。插入的方法，如植入，可以可选地已用于其他类型的组织植入和/或用于组织取样，可选地在这样的方法中没有修改，或者可替代地可选地仅仅具有非重点修改。这样的方法可选地包括但不限于，近距离放射治疗方法、活组织检查、用和/或不用超声的内窥镜检查如ERCP、进入脑组织的立体定向法、腹腔镜检查，包括用腹腔镜进入关节、腹腔器官、膀胱壁和体腔的植入。患者特异性筛选方法靶向核苷酸(例如三核苷酸重复)的CRISPR-Cas系统可以用于针对此类重复的存在对患者或患者样品进行筛选。这些重复可以是该CRISPR-Cas系统的RNA的靶标，并且如果被该CRISPR-Cas系统结合至其上，则可以检测到该结合，以由此指示存在这样一个重复。因此，CRISPR-Cas系统可以用于针对该重复的存在对患者或患者样品进行筛选。然后可以向该患者给予一种或多种适合的化合物以解决该病症；或者，可以向该患者给予CRISPR-Cas系统，该系统结合到并且引起插入、缺失或突变并且减轻该病症。核酸、氨基酸和蛋白质、调节序列、载体等核酸、氨基酸和蛋白质：本发明使用核酸结合靶TDNA序列。这是有利的，因为产生核酸比产生蛋白质容易且价廉得多，并且特异性可以根据其中寻求同源性的拉伸长度而变化。例如多指的复杂3-D复杂定位是不需要的。术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用。它们是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。该术语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构，参见，例如，埃克斯坦(Eckstein)，1991；巴塞加(Baserga)等人，1992；米利根(Milligan)，1993；WO97/03211；WO96/39154；马塔(Mata)，1997；施特劳斯-绍库普(Strauss-Soukup)，1997；和扎姆斯塔(Samstag)，1996。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。如本文所用的术语“野生型”是本领域技术人员所理解的术语，并且表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征。“野生型”可以是基线。如本文所用的术语“变体”应当被理解为表示具有衍生自在自然界中存在的模式的性质的展示。术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表面人工的参与。这些术语，当指核酸分子或多肽时，表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。如本文使用的对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。严格条件的非限制性实例描述于蒂森(Tijssen)(1993)的《生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交》(LaboratoryTechniquesInBiochemistryAndMolecularBiology-HybridizationWithNucleicAcidProbes)，第I部分，第二章，“杂交原理概述和核酸探针分析策略”(“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassay”)，爱思唯尔(Elsevier)，纽约。在提及一个多核苷酸序列时，那么也设想了互补的或部分互补的序列。能够在高严格条件下杂交到参考序列上的这些序列是优选的。通常，为了使杂交率最大化，选择了相对低严格性的杂交条件：低于热熔点(Tm)约20℃到25℃。Tm是50％的特异性靶序列在具有规定的离子强度和pH的溶液中杂交到完全互补的探针上的温度。通常，为了要求杂交序列的至少约85％的核苷酸互补性，高严格洗涤条件被选择为低于Tm约5℃到15℃。为了要求杂交序列的至少约70％的核苷酸互补性，中等严格洗涤条件被选择为低于Tm约15℃到30℃。高容许(极低严格性)洗涤条件可以低至在Tm之下50℃，从而允许在杂交序列之间的高水平错配。本领域技术人员将认识到，在杂交和洗涤阶段中的其他物理和化学参数也可以改变，从而影响来自在靶序列与探针序列之间的特定同源性水平的可检测杂交信号的结果。优选的高严格条件包括在50％甲酰胺、5×SSC、和1％SDS中在42℃孵育，或者在5×SSC和1％SDS中在65℃孵育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃洗涤。“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成一种复合物的反应，该复合物经由这些核苷酸残基之间的碱基的氢键键合而稳定化。氢键键合可以借助于沃森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式而发生。该复合物可包含形成一个双链体的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自我杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛的过程(如PCR的开始、或经由一种酶的多核苷酸的切割)中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补物”。如本文使用的，术语“基因组座位(locus)”或“座位(locus)”(复数是座位(loci))是在染色体上的基因或DNA序列的特定位置。“基因”是指编码多肽或RNA链的DNA或RNA的段(stretch)，其在生物中发挥功能作用并且因此是活生物体遗传的分子单元。出于本发明的目的，可以考虑包括调节基因产物的产生的区域的基因，而不论这样的调节序列是否接近编码和/或转录的序列。因此，基因包括而不必限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、复制起点、核基质附着位点和座位控制区。如本文使用的“基因组座位的表达”或“基因表达”是藉此在功能性基因产物的合成中使用来自基因的信息的过程。基因表达的产物常常是蛋白质，但是在非蛋白质编码基因如rRNA基因或tRNA基因中，产物是功能性RNA。基因表达的过程由所有已知的生物利用-产生功能性产物以便存活的真核生物(包括多细胞生物)、原核生物(细菌和古细菌)以及病毒。如本文使用的基因或核酸的“表达”不仅涵盖细胞基因表达，而且涵盖在克隆系统中或在任何其他背景下的一个或多个核酸的转录和翻译。如本文使用的“表达”是指藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵，如与标记组分的缀合。如本文使用的术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。如本文使用的，术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可以独立于该蛋白质链的其余部分而存在并且起作用的蛋白质序列的一部分。正如在本发明的多个方面中所描述，序列一致性与序列同源性有关。可以通过肉眼、更通常地借助于可得的序列比较程序来进行同源性比较。这些可商购的计算机程序可以计算在两个或更多个序列之间的同源性的百分比(％)并且还可以计算由两个或更多个氨基酸或核酸序列共享的序列一致性。在一些优选的实施例中，本文描述的dTALE的封端区具有与本文提供的封端区氨基酸序列至少95％一致性或共享一致性的序列。可以通过本领域已知的许多计算机程序(例如BLAST或FASTA等等)来生成序列同源性。用于进行这样的比对的适合的计算机程序是GCG威斯康星Bestfit软件包(威斯康星大学，美国；德弗罗(Devereux)等人，1984，《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST软件包(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，出处同上-第18章)、FASTA(阿尔丘尔(Atschul)等人，1990，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，403-410)以及GENEWORKS系列比较工具。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，出处同上，7-58页到7-60页)。然而，优选使用GCGBestfit程序。可以计算在连续序列上的序列同源性百分比(％)，即，将一个序列与另一个序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸或核苷酸与另一个序列中的相应氨基酸或核苷酸直接进行比较，一次比较一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，这样的无空位比对仅仅在较少数目的残基上进行。虽然这是一种非常简单和一致的方法，但是它未能考虑的是，例如，在其他方面完全相同的序列对中，一个插入或缺失可以引起随后的氨基酸残基被排除在比对之外，因此当进行全局比对时可能导致在同源性％上的大幅降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生考虑到可能的插入和缺失的优化比对，而没有过度地使总体同源性或一致性评分不利。这是通过在序列比对中插入“空位”来实现的，以便试图将局部同源性或一致性最大化。然而，这些更复杂的方法向出现在该比对中的每个空位分配“空位罚分”，从而对于相同数目的一致的氨基酸而言，具有尽可能少的空位的序列比对-反映了在这两个比较的序列之间的更高关联性-可以比具有许多空位者实现更高的得分。“亲合空位成本”(“Affinitygapcosts”)典型地用于对空位的存在要求相对高的成本并对空位中的每个后续残基施加较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然将产生具有更少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种序列比较软件时优选使用默认值。例如当使用GCG威斯康星Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分为对于每个空位的-12，以及对于每个延伸的-4。因此计算最大同源性％首先要求产生最佳比对，考虑空位罚分。用于进行这样的比对的适合的计算机程序是GCG威斯康星Bestfit软件包(德弗罗(Devereux)等人，1984，《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)12p387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST软件包(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999《精编分子生物学实验指南》(ShortProtocolsinMolecularBiology)，第4次编辑-第18章)、FASTA(阿尔丘尔(Altschul)等人，1990《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol)403-410)以及GENEWORKS系列比较工具。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，《精编分子生物学实验指南》(ShortProtocolsinMolecularBiology)，7-58页到7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCGBestfit程序。一种新的工具，称为BLAST2序列，也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》(FEMSMicrobiolLett.)1999174(2):247-50；《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》1999177(1):187-8以及在国立卫生研究院的网址的国家生物技术信息中心的网址)。虽然最终同源性％可以按照一致性进行测量，但是比对过程自身典型地不是基于全或无配对比较(all-or-nothingpaircomparison)。相反，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaledsimilarityscorematrix)，基于化学相似性或进化距离对各个成对比较评分。通常使用的这种矩阵的实例为BLOSUM62矩阵-BLAST系列程序的默认矩阵。GCG威斯康星程序通常使用公开的默认值或自定义符号比较表(更多细节详见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其他软件情况下的默认矩阵，如BLOSUM62。可替代地，可以基于类似于CLUSTAL(希金斯DG(HigginsDG)和夏普PM(SharpPM)(1988)，《基因》(Gene)73(1)，237-244)的一种算法，使用在DNASISTM(日立软件公司(HitachiSoftware))中的多重比对特征来计算同源性百分比。一旦软件已经产生最佳比对，就有可能计算同源性％，优选序列一致性％。软件典型地这样进行，作为序列比较的一部分，并且产生数字结果。这些序列也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并生成功能上等同的物质。可以基于氨基酸特性(如残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或两亲性)的相似性做出有意氨基酸取代，并且因此它在将氨基酸集合成官能团中是有用的。可以仅仅基于氨基酸的侧链特性将它们集合在一起。然而，包括突变数据同样是更有用的。出于结构原因，如此衍生的氨基酸的集合很有可能是保守性的。这些集合可以被描述为文氏图形式(Venndiagram)(利文斯敦C.D.(LivingstoneC.D.)和巴顿G.J.(BartonG.J.)(1993)“蛋白质序列比对：用于残基保守些的分级分析的策略”(“Proteinsequencealignments:astrategyforthehierarchicalanalysisofresidueconservation”)《生物科学计算应用》(Comput.Appl.Biosci).9:745-756)(泰勒(Taylor)W.R.(1986)“氨基酸保守性的分类”(“Theclassificationofaminoacidconservation”)《理论生物学杂志》(J.Theor.Biol.)119；205-218)。例如可以根据下表做出保守性取代，该表描述了普遍接受的氨基酸的文氏图分组。本发明的实施例包括可包含同源取代(本文使用取代和置换两者来表示现有氨基酸残基或核苷酸与替代残基和核苷酸之间的互换)的序列(多核苷酸或多肽两者)，该同源取代，即，在氨基酸的情况下发生同类取代(like-for-likesubstitution)，如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性。也可以发生非同源取代，即，从一类残基到另一类残基，或者可替代地涉及包含非天然氨基酸如鸟氨酸(在下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(在下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(在下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(如甘氨酸或β-丙氨酸)之外的烷基基团，如甲基、乙基或丙基基团。一个另外的变化形式，其涉及处于类肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在，也是本领域技术人员熟知的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备处于该类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如西蒙RJ(SimonRJ)等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和豪威尔DC(HorwellDC)，《生物技术趋势》(TrendsBiotechnol.)(1995)13(4)，132-134。出于本发明的目的，扩增意指利用引物和聚合酶的能够以合理的保真度复制靶序列的任何方法。可以通过天然或重组DNA聚合酶，如TaqGoldTM、T7DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段以及逆转录酶进行扩增。一种优选的扩增方法是PCR。在某些方面，本发明涉及载体。如本文使用的，“载体”是一种允许或促进一个实体从一个环境转移到另一个环境中的工具。它是一种复制子，如质粒、噬菌体、或粘粒，另一个DNA片段可以插入其中，从而引起该插入的片段的复制。通常，当与适当的控制元件关联时，一种载体能够复制。一般而言，术语“载体”是指一种核酸分子，其能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒(AAV))的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达栽体通常是质粒形式。重组表达载体可包含处于适合于在宿主细胞中的核酸表达的形式的本发明的核酸，这意味着这些重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节元件，所述调节元件可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。关于重组和克隆方法，提及2004年9月2日以US2004-0171156A1公开的美国专利申请10/815,730，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。本发明的多个方面涉及用于嵌合的RNA与Cas9的双顺反子载体。用于嵌合的RNA与Cas9的双顺反子表达载体是优选的。一般而言并且特别地，在这个实施例中，Cas9优选由CBh启动子驱动。嵌合RNA可以优选地由PolIII启动子(如U6启动子)驱动。理想地，将这两者结合。嵌合的指导RNA典型地由20bp指导序列(N)组成并且这可以接合到tracr序列上(从下链的第一个“U”到该转录物的结尾)。该tracr序列可以在如指示的不同位置被截短。指导序列和tracr序列被该tracr配对序列隔开，该tracr配对序列可以是GUUUUAGAGCUA。这之后可以是如所示的环序列GAAA。这两者都是优选的实例。申请人已经通过SURVEYOR测定证明了在人EMX1和PVALB座位处的Cas9介导的indel。ChiRNA由其“+n”标志指示，并且crRNA是指指导序列和tracr序列被表达为分开的转录物的杂交体RNA。贯穿本申请，嵌合RNA也可以被称为单指导、或合成指导RNA(sgRNA)。该环优选地是GAAA，但是并并限于这个序列或者实际上在长度上仅仅为4bp。实际上，用于在发夹结构中使用的优选环形成序列在长度上为四个核苷酸，并且最优选地具有序列GAAA。然而，可以使用更长或更短的环序列，正如可替代的序列。这些序列优选地包括三联体(例如，AAA)、和另外的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例包括CAAA和AAAG。在实践在此披露的任何方法中，可以经由本领域已知的一种或多种方法将适合的载体引入进细胞或胚胎中，这些方法包括但不限于，显微注射、电穿孔、声致穿孔、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状聚合物转染、热休克转染、核转染、磁转染、脂转染、刺穿转染(impalefection)、光学转染、专有剂增强的核酸摄取以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒或人工病毒体进行递送。在一些方法中，通过显微注射将该载体引入进胚胎中。可以将这个或这些载体显微注射进胚胎的细胞核或细胞质中。在一些方法中，通过核转染将这个或这些载体引入进细胞中。术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。这样的调节序列例如描述于戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY)185，学术出版社(AcademicPress)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)中。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个polIII启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个polIII启动子)、一个或多个polII启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个polII启动子)、一个或多个polI启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个polI启动子)、或其组合。polIII启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。polII启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(可选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(可选地具有CMV增强子)[参见，例如，波沙特(Boshart)等人，《细胞》(Cell)41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子以及EF1α启动子。还被术语“调节元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段(《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)转录物、蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白，等等)。关于调节序列，提及美国专利申请10/491,026，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。关于启动子，提及PCT公开WO2011/028929和美国申请12/511,940，这些专利的内容通过引用以其全文并入本文。载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物、蛋白质、或酶)。例如，CRISPR转录物可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel(戈德尔)，《基因表达技术：酶学方法》(GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY)185，学术出版社(AcademicPress)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶来转录和翻译。载体可以被引入原核生物或原核细胞中并且在其中增殖。在一些实施例中，原核生物用来扩增有待引入真核细胞中的载体的多个拷贝，或者作为有待引入真核细胞中的载体的产生中的中间载体(例如，扩增质粒作为病毒载体包装系统的一部分)。在一些实施例中，原核生物用来扩增一个载体的多个拷贝并且表达一种或多种核酸，如提供用于递送到宿主细胞或宿主生物中的一种或多种蛋白质的来源。蛋白质在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。融合载体将多个氨基酸添加到在其中编码的蛋白质上，如该重组蛋白的氨基端上。这样的融合载体可以用于一个或多个目的，如：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在亲和纯化中充当配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白切割位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶以及肠激酶。示例性融合表达载体包括pGEX(发玛西亚生物技术有限公司(PharmaciaBiotechInc)；史密斯和约翰逊，1988.《基因》(Gene)67:31-40)、pMAL(纽英伦生物技术公司(NewEnglandBiolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass.))以及pRIT5(发玛西亚公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至靶重组蛋白。适合的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(阿姆兰(Amrann)等人，(1988)《基因》(Gene)69:301-315)以及pET11d(斯图迪尔(Studier)等人，《基因表达技术：酶学方法》(GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY)185，学术出版社(AcademicPress)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990)60-89)。在一些实施例中，载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒中表达的载体的实例包括pYepSec1(巴尔戴利(Baldari)等人，1987，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBOJ)6:229-234)、pMFa(库尔坚(Kurjan)和赫斯库伍特兹(Herskowitz)，1982，《细胞》(Cell)30:933-943)、pJRY88(舒尔茨(Schultz)等人，1987，《基因》(Gene)54:113-123)、pYES2(英杰公司(InvitrogenCorporation)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(Calif))、以及picZ(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。在一些实施例中，使用杆状病毒载体，载体驱动昆虫细胞中的蛋白质表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3:2156-2165)和pVL系列(拉克瑙(Lucklow)和萨莫斯(Summers)，1989，《病毒学》(Virology)170:31-39)。在一些实施例中，使用哺乳动物表达载体，载体能够驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(锡德(Seed)，1987，《自然》(Nature)329:840)和pMT2PC(考夫曼(Kaufman)等人，1987，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBOJ.)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能典型地由一个或多个调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40、以及本文所述和本领域已知的其他病毒。对于用于原核细胞和真核细胞两者的其他适合的表达系统参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人的《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：ALaboratoryManual.)(第2版)的第16和第17章，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约，1989。在一些实施例中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异型调节元件来表达核酸)。组织特异型调节元件是本领域中已知的。适合的组织特异型启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性的；平克特(Pinkert)等人，1987.《基因发育》(GenesDev.)1:268-277)，淋巴特异性启动子(卡里曼(Calame)和伊顿(Eaton)，1988.《免疫学进展》(Adv.Immunol)43:235-275)，特别是T细胞受体的启动子(维纳图(Winoto)和巴尔迪莫(Baltimore)，1989.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBOJ.)8:729-733)和免疫球蛋白(巴纳吉(Baneiji)等人，1983.《细胞》(Cell)33:729-740；奎恩(Queen)和巴尔迪莫(Baltimore)，1983.《细胞》(Cell)33:741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；伯恩(Byrne)和鲁德尔(Ruddle)，1989.《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.SciUSA)86:5473-5477)，胰腺特异性启动子(艾德兰德(Edlund)等人，1985.《科学》(Science)230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育型调节启动子，例如，鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子凯赛尔((Kessel)和格鲁斯(Gruss)，1990.《科学》(Science)249:374-379)和α-甲胎蛋白启动子(卡姆皮斯(Campes)和蒂尔曼(Tilghman)，1989.《基因发育》(GenesDev.)3:537-546)。关于这些原核和真核载体，提及美国专利6,750,059，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。本发明的其他实施例可涉及病毒载体的使用，关于它提及美国专利申请13/092,085，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。组织特异型调节元件是本领域中已知的，并且在这个方面提及美国专利7,776,321，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，调节元件可操作地连接至CRISPR系统的一个或多个元件，从而驱动该CRISPR系统的这一个或多个元件的表达。一般而言，CRISPR(规律间隔成簇短回文重复)，也称为SPIDR(SPacer间隔开的同向重复)，构成通常对于特定细菌物种而言特异性的DNA基因座的家族。该CRISPR座位包含在大肠杆菌中被识别的间隔开的短序列重复(SSR)的一个不同类(石野(Ishino)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，169:5429-5433[1987]；和中田(Nakata)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，171:3553-3556[1989])、以及相关基因。类似的间隔开的SSR已经鉴定于地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、化脓链球菌、鱼腥藻属、和结核分枝杆菌中(参见，格鲁恩(Groenen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，10:1057-1065[1993]；霍(Hoe)等人，《新发感染性疾病》(Emerg.Infect.Dis.)，5:254-263[1999]；马斯波尔(Masepohl)等人，《生物化学与生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)1307:26-30[1996]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》，17:85-93[1995])。这些CRISPR座位典型地不同于其他SSR的重复结构，这些重复已被称为规律间隔的短重复(SRSR)(詹森(Janssen)等人，《OMICS：整合生物学杂志》(OMICSJ.Integ.Biol.)，6:23-33[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，36:244-246[2000])。一般而言，这些重复是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定长度的独特间插序列规律地间隔开(莫吉卡(Mojica)等人，[2000]，同上)。虽然重复序列在菌株之间是高度保守的，许多间隔开的重复和这些间隔区的序列一般在菌株与菌株之间不同(冯·埃姆登(vanEmbden)等人,《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，182:2393-2401[2000])。已经在40种以上的原核生物中鉴定出CRISPR座位(参见，例如，詹森(Janssen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，43:1565-1575[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，[2005])，包括但不限于：气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、古球菌属(Archaeoglobus)、盐盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、焦球菌属(Pyrococcus)、嗜酸菌属(Picrophilus)、热原体属(Thermoplasma)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产水菌属(Aquifex)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弓菌属(Azarcus)、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、类杆菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文菌属(Erwinia)、埃希菌属(Escherichia)、军团杆菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、发光细菌属(Photobacterium)、沙门菌属(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)以及栖热袍菌属(Thermotoga)。在一些实施例中，该CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除了该CRISPR酶之外的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及可选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到CRISPR酶上的蛋白质结构域的实例包括但不限于，表位标签、报告基因序列、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、以包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以融合到编码一种蛋白质或蛋白质片段的基因序列上，所述蛋白质或蛋白质片段结合DNA分子或结合其他细胞分子，其包括，但不限于，麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、LexADNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4DNA结合结构域融合物、以及单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域描述于US20110059502中，通过引用将其并入本文。在一些实施例中，使用标记的CRISPR酶来鉴定靶序列的位置。在一些实施例中，CRISPR酶可以形成可诱导系统的组分。该系统的诱导性质将允许该系统利用一种能量形式对基因编辑或基因表达进行时空控制。该能量形式可以包括但不限于，电磁辐射、声能、化学能和热能。可诱导系统的实例包括四环素诱导型启动子(Tet-开或Tet-关)、小分子双杂交体转录激活系统(FKBP、ABA等)或光可诱导系统(光敏素、LOV结构域或隐花色素)。在一个实施例中，该CRISPR酶可以是以序列特异性方式指导转录活性的变化的光诱导的转录效应因子(LITE)的一部分。光的组分可以包括CRISPR酶、光响应细胞色素异二聚体(例如，来自拟南芥)、以及转录激活/抑制结构域。诱导型DNA结合蛋白和关于使用它们的方法的其他实例提供在US61/736465和US61/721,283中，特此通过引用以其全文并入。除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODSINENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2：实用方法》(PCR2:APRACTICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMALCELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。修饰靶标在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括对来自人或非人类动物的细胞或细胞群进行取样，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物中。对于重新引入的细胞，特别优选的是这些细胞是干细胞。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交或可杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交或可杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。事实上，这些取样、培养和重新引入选择跨本发明的多个方面而适用。确实，在本发明的任何方面，该CRISPR复合物可以包括与杂交或可杂交到靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列可以连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而可以杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。试剂盒在一个方面，本发明提供了以下试剂盒，这些试剂盒包含披露于以上方法和组合物中的元件中的任何一个或多个。元件可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子或管。在一些实施例中，该试剂盒包括一种或多种语言，例如多于一种语言的说明书。在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于在利用在此描述的元件中的一种或多种的方法中使用的试剂。试剂可以被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒可以提供一种或多种反应或存储缓冲液。可以按在具体测定中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的pH。在一些实施例中，该试剂盒包括一个或多个寡核苷酸，该一个或多个寡核苷酸对应于一个用于插入进载体中的指导序列，以便可操作地连接该指导序列和一个调节元件。在一些实施例中，该试剂盒包括同源重组模板多核苷酸。在一些实施例中，该试剂盒包括在此描述的载体中的一个或多个和/或在此描述的多核苷酸中的一个或多个。该试剂盒可以有利地允许提供本发明的系统的所有元件。CRISPR酶mRNA和指导RNA也可以单独递送CRISPR酶mRNA和指导RNA。可以在该指导RNA在给出时间以待CRISPR酶表达之前递送CRISPR酶mRNA。可以在给予指导RNA之前1-12小时(优选约2-6小时)给予CRISPR酶mRNA。可替代地，可以一起给予CRISPR酶mRNA和指导RNA。有利地，可以在初始给予CRISPR酶mRNA+指导RNA之后1-12小时(优选约2-6小时)给予指导RNA的第二加强剂量。为了实现基因组修饰的最有效水平，另外给予CRISPR酶mRNA和/或指导RNA可以是有用的。为了将毒性和脱靶效应最小化，重要的是控制所递送的CRISPR酶mRNA和指导RNA的浓度。CRISPR酶mRNA和指导RNA的最佳浓度可以通过在细胞或动物模型中测试不同的浓度并且使用深度测序分析在潜在的脱靶基因组座位处的修饰的范围而确定。例如，对于靶向人类基因组的EMX1基因中的5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’的指导序列，可以使用深度测序来评定在下列两个脱靶位点处的修饰水平，1：5’-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3’和2：5’-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3’。对于体内递送，应当选择产生最高的中靶修饰水平同时使脱靶修饰水平最小化的浓度。CRISPR-Cas9的结晶和晶体结构的表征：本发明的晶体可以通过蛋白质结晶学的技术(包括分批、液桥、透析、蒸汽扩散和悬滴法)获得。通常，本发明的晶体通过将基本上纯的CRISPR-Cas9和它所结合的核酸分子以刚好低于沉淀所需的浓度溶解于含有沉淀剂的水性缓冲液中来生长。通过受控蒸发去除水，以产生沉淀条件，维持沉淀条件直至晶体生长停止。晶体的用途、晶体结构和原子结构坐标：CRISPR酶晶体并且特别是由其获得的原子结构坐标具有多种多样的用途。晶体和结构坐标特别有用于鉴定与CRISPR-Cas9结合的化合物(核酸分子)以及可以与具体化合物(核酸分子)结合的CRISPR-Cas9。因此，本文描述的结构坐标可以在确定另外的合成的或突变的CRISPR-Cas9、Cas9、切口酶、结合结构域的晶体结构中用作定相模型。如在本文引用的材料中提供与核酸分子复合的CRISPR-Cas9的晶体结构为本领域的技术人员提供了对CRISPR-Cas9的作用机制的详细了解。这种了解提供了用于设计修饰的CRISPR-Cas9的手段，如通过向其附接官能团(如阻遏物或激活因子)。虽然人们可以将官能团(如阻遏物或激活因子)附接至CRISPR-Cas9的N末端或C末端，但是晶体结构证明N末端似乎被遮蔽或隐藏，而C末端更易于为官能团(如阻遏物或激活因子)获得。此外，晶体结构证明大约在CRISPR-Cas9(化脓链球菌)的残基534-676之间存在挠性环，该环适于附接官能团(如激活因子或阻遏物)。附接可以经由接头，例如挠性甘氨酸-丝氨酸(GlyGlyGlySer)或(GGGS)3，或者刚性α-螺旋接头如(Ala(GluAlaAlaAlaLys)Ala)。除挠性环之外，还存在核酸酶或H3区域、H2区域和螺旋区域。所谓“螺旋(helix)”或“螺旋的(helical)”意指如本领域已知的螺旋，包括但不限于α-螺旋。另外，术语螺旋或螺旋的还可以用于指示具有N-末端转角的c-末端螺旋元件。提供与核酸分子复合的CRISPR-Cas9的晶体结构允许药物或化合物发现、鉴定和设计可以与CRISPR-Cas9结合的化合物的新颖方法，并且因此本发明提供了在诊断、治疗或预防多细胞生物的病症或疾病中有用的工具，这些多细胞生物是例如藻类、植物、无脊椎动物、鱼、两栖动物、爬行动物、禽类、哺乳动物；例如家养植物、动物(例如，生产动物如猪、牛、鸡；伴侣动物如猫、犬、啮齿动物(兔、沙鼠、仓鼠)；实验动物如小鼠、大鼠)以及人类。因此，本发明涉及合理设计CRISPR-Cas9复合物的基于计算机的方法。这种合理设计可以包括：提供CRISPR-Cas9复合物的结构，如通过在本文引用的材料中的一些或全部(例如结构的至少2个或更多个，例如至少5个，有利地至少10个，更有利地至少50个并且甚至更有利地至少100个原子)坐标所限定的；提供希望的核酸分子的结构，就所希望的CRISPR-Cas9复合物而言；并且使如通过在本文引用的材料中的一些或全部坐标所限定的CRISPR-Cas9复合物的结构与希望的核酸分子匹配，在所述匹配中包括获得如通过在本文引用的材料中的一些或全部坐标所限定的CRISPR-Cas9复合物的一种或多种推定修饰，用于使所述希望的核酸分子约束涉及希望的核酸分子的一种或多种CRISPR-Cas9复合物。该方法或该方法的匹配可以使用CRISPR-Cas9复合物的感兴趣的原子的坐标，如通过在本文引用的材料中的一些或全部坐标所限定的，这些坐标在活性位点或结合区附近(例如结构的至少2个或更多个，例如至少5个，有利地至少10个，更有利地至少50个并且甚至更有利地至少100个原子)，以便在活性位点或结合区附近建模。这些坐标可以用于限定空间，然后针对希望的或候选核酸分子对所述空间进行“经由计算机模拟”筛选。因此，本发明提供了合理设计CRISPR-Cas9复合物的基于计算机的方法。该方法可以包括：提供在本文引用的材料的至少两个原子的坐标(“选定的坐标”)；提供候选或希望的核酸分子的结构；并且使候选物的结构与选定的坐标匹配。以这种方式，熟练人员还可以匹配官能团和候选或希望的核酸分子。例如，提供CRISPR-Cas9复合物的结构，如通过在本文引用的材料中的一些或全部(例如结构的至少2个或更多个，例如至少5个，有利地至少10个，更有利地至少50个并且甚至更有利地至少100个原子)坐标所限定的；提供希望的核酸分子的结构，就所希望的CRISPR-Cas9复合物而言；使如通过在本文引用的材料中的一些或全部坐标所限定的CRISPR-Cas9复合物的结构与希望的核酸分子匹配，在所述匹配中包括获得如通过在本文引用的材料中的一些或全部坐标所限定的CRISPR-Cas9复合物的一种或多种推定修饰，用于使所述希望的核酸分子约束涉及希望的核酸分子的一种或多种CRISPR-Cas9复合物；选择一种或多种推定匹配CRISPR-Cas9-希望的核酸分子复合物，使这样一种或多种推定匹配CRISPR-Cas9-希望的核酸分子复合物与官能团(例如，激活因子、阻遏物)匹配，例如就用于安放官能团的位置(例如，挠性环内的位置)和/或用于产生安放官能团的位置的这一种或多种推定匹配CRISPR-Cas9-希望的核酸分子复合物的推定修饰而言。如所述的，可以使用在本文引用的材料中的坐标实践本发明，这些坐标在活性位点或结合区的附近；并且因此，本发明的方法可以采用CRISPR-Cas9复合物的感兴趣的子结构域。可以使用结构域或子结构域的坐标实践本发明的方法的。这些方法可以可选地包括由“经由计算机模拟”输出合成候选或希望的核酸分子和/或CRISPR-Cas9系统，并且测试与结合至“湿式(wet)”或实际的候选或希望的核酸分子上的“湿式”或实际的CRISPR-Cas9系统连接的“湿式”或实际的官能团的结合和/或活性。这些方法可以包括由“经由计算机模拟”输出合成CRISPR-Cas9系统(包括官能团)，并且测试与结合至体内的“湿式”或实际的候选或希望的核酸分子上的“湿式”或实际的CRISPR-Cas9系统连接的“湿式”或实际的官能团的结合和/或活性，例如使包括来自“经由计算机模拟”输出的官能团的“湿式”或实际的CRISPR-Cas9系统与含有希望或候选核酸分子的细胞接触。这些方法可以包括观察细胞或含有该细胞的生物的希望的反应，例如症状或病症或疾病的减少。提供候选核酸分子的结构的步骤可以涉及通过计算机筛选含有核酸分子数据(例如，关于病症或疾病的此类数据)的数据库来选择化合物。候选核酸分子的结合的3-D描述符可以衍生自来源于来自在本文引用的材料的CRISPR-Cas9复合物或其结构域或区域的构造和化学性质的几何和功能约束。实际上，描述符可以是本文的CRISPR-Cas9复合物晶体结构的一种或多种虚拟修饰类型，用于将CRISPR-Cas9结合至候选或希望的核酸分子。然后可以使用描述符来探询核酸分子数据库，以确定该数据库的与该描述符具有推定的良好绑定的那些核酸分子。然后可以使用具有推定的良好绑定的描述符和核酸分子进行本文的“湿式”步骤。“匹配(fitting)”可以意指通过自动或半自动手段确定候选物的至少一个原子与CRISPR-Cas9复合物的至少一个原子之间的相互作用并且计算这样一种相互作用稳定的程度。相互作用可以包括由电荷、空间因素等引起的吸引、排斥。“子结构域”可以意指二级结构的至少一个(例如，一个、两个、三个或四个)完整元件。CRISPR-Cas9的具体区域或结构域包括在本文引用的材料中鉴定的那些。CRISPR-cas9(化脓链球菌Cas9)复合物的三维结构的确定为与CRISPR-cas9(例如，化脓链球菌Cas9)结合的新的且特异性的核酸分子的设计以及新的CRISPR-Cas9系统的设计提供了基础，如通过修饰CRISPR-Cas9系统以与不同核酸分子结合的方式，通过修饰CRISPR-Cas9系统以使其与任何一个或多个不同官能团连接的方式，这些官能团可以彼此相互作用、与CRISPR-Cas9(例如，提供自我激活和/或自我终止功能的诱导型系统)相互作用、与核酸分子(例如，官能团可以是可选自下组的调节或功能结构域，该组由以下各项组成：转录阻遏物、转录激活因子、核酸酶结构域、DNA甲基转移酶、蛋白乙酰转移酶、蛋白脱乙酰酶、蛋白甲基转移酶、蛋白脱氨酶、蛋白激酶以及蛋白磷酸酶；并且，在一些方面，功能结构域是表观遗传调节剂；参见例如，张(Zhang)等人，美国专利号8,507,272，并且再次指出的是它和本文引用的所有文献以及本文引用的所有申请文献特此通过引用并入本文)相互作用，通过修饰Cas9的方式，通过新颖切口酶的方式。的确，与此一起，CRISPR-Cas9(化脓链球菌Cas9)晶体结构具有众多用途。例如，通过了解CRISPR-Cas9(化脓链球菌Cas9)晶体结构的三维结构，可以使用计算机建模程序来设计或鉴定预期与可能的或确认的位点(如结合位点)相互作用的不同分子或者CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)的其他结构或功能特征。可以通过使用计算机建模(使用对接程序)检査潜在结合的化合物(“结合物(binder)”)。对接程序是已知的；例如GRAM、DOCK或AUTODOCK(参见沃尔特斯(Walters)等人《今日药物发现》(DrugDiscoveryToday)，第3卷，第4期(1998)，160-178；和邓恩布拉克(Dunbrack)等人《折叠与设计》(FoldingandDesign)2(1997)，27-42)。这种程序可以包括潜在结合物的计算机匹配，以确定该潜在结合物的形状和化学结构在多大程度上与CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)绑定。可以进行CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)的活性位点或结合位点的计算机辅助手动检查。程序(如GRID(P.戈德福德(Goodford)，《药物化学杂志》(J.Med.Chem)，1985，28，849-57)-一种确定具有不同官能团的分子之间的可能相互作用位点的程序)还可以用于分析活性位点或结合位点以预测结合化合物的部分结构。计算机程序可以用于估计例如以下两种结合配偶体的吸引、排斥或位阻，CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)和候选核酸分子或者核酸分子和候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)；并且与此一一起，CRISPR-Cas9晶体结构(化脓链球菌Cas9)允许此类方法。通常，匹配越紧，位阻越小，并且吸引力越大，潜在的结合物越有效，因为这些特性与较紧的结合常数一致。此外，候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)的设计越具特异性，越可能的是它也将不与脱靶分子相互作用。并且，本发明允许“湿式”方法。例如，在一个方面，本发明涉及用于确定候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)的结合至该候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)的结合物(例如，靶核酸分子)的结构的方法，所述方法包括(a)提供根据本发明的候选CRISPR-Cas9系统(化脓链球菌Cas9)的第一晶体或候选物候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)的第二晶体，(b)使该第一晶体或第二晶体与所述结合物在可以形成复合物的条件下接触；并且(c)确定所述候选物(例如，CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9))或CRISPR-Cas9系统(化脓链球菌Cas9)复合物的结构。第二晶体可以具有在本文讨论的基本上相同的坐标，然而由于CRISPR-Cas9系统的次要变化(例如，来自作为例如化脓链球菌Cas9与作为化脓链球菌Cas9的这样一种系统的Cas9，其中“例如化脓链球菌Cas9”指示该Cas9是Cas9并且可以属于或来源于化脓链球菌或其直向同源物)，该晶体可以按不同的空间群形成。代替或除“经由计算机模拟”方法之外，本发明进一步涉及其他“湿式”方法，包括结合物(例如，靶核酸分子)和候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)、或候选结合物(例如，靶核酸分子)和CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)、或候选结合物(例如，靶核酸分子)和候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)的高通量筛选(前述一种或多种CRISPR-Cas9系统具有或不具有一个或多个官能团)，以便选择具有结合活性的化合物。可以对那些显示出结合活性的结合物和CRISPR-Cas9系统进行选择并且进一步用具有本文的结构的CRISPR-Cas9晶体进行结晶，例如通过共结晶或通过浸泡，用于X-射线分析。出于多种目的(例如，针对重叠区域)，可以将所得X射线结构与本文引用的材料的结构进行比较。已经通过基于本文的结合物和CRISPR-Cas9对的晶体结构数据对具有有利的匹配特性(例如，预测的强吸引)的那些进行确定而设计、鉴定或选择了可能的结合物和CRISPR-Cas9系统对，然后可以通过“湿式”方法筛选这些可能的对的活性。因此，在一个方面，本发明可以涉及：获得或合成这些可能的对；并且使结合物(例如，靶核酸分子)和候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)接触、或使候选结合物(例如，靶核酸分子)和CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)接触、或使候选结合物(例如，靶核酸分子)和候选CRISPR-Cas9系统(例如，化脓链球菌Cas9)接触(前述一种或多种CRISPR-Cas9系统具有或不具有一个或多个官能团)，以便确定结合能力。在后一步中，接触有利地在确定功能的条件下。代替或除进行这样一种测定之外，本发明可以包括：由一种或多种复合物的所述接触和分析获得或合成这一种或多种复合物，例如通过X射线衍射或NMR或其他手段，以便确定结合或相互作用的能力。然后可以获得关于结合的详细结构信息，并且根据这个信息，可以对候选CRISPR-Cas9系统或其组分的结构或功能进行调节。可以重复和再次重复这些步骤，如必要的话。可替代地或另外地，来自或在前述方法中的潜在CRISPR-Cas9系统可以与核酸分子一起在体内，包括但不限于通过向生物(包括非人类动物和人类)给予的方式，以便确定或确认功能，包括是否由其导致了希望的结果(例如，症状的减少、治疗)。本发明进一步涉及通过使用本文引用的材料的结构坐标确定具有未知结构的一种或多种CRISPR-cas系统或复合物的三维结构的方法。例如，如果提供了具有未知晶体结构的CRISPR-cas系统或复合物的X射线晶体或NMR光谱数据，则如在本文引用的材料中限定的CRISPR-Cas9复合物的结构可以用于解释该数据，以便通过如在X射线晶体学的情况下的定相建模等技术提供未知系统或复合物的可能结构。因此，本发明可以涉及：将具有未知晶体结构的CRISPR-cas系统或复合物的表示与具有本文的晶体结构的CRISPR-cas(9)系统和复合物的类似表示进行比对，以匹配同源或类似区域(例如，同源或类似序列)；基于如在本文引用的材料中限定的相应的区域(例如，序列)的结构，为具有未知晶体结构的CRISPR-cas系统或复合物的匹配的同源或类似区域(例如，序列)的结构建模；并且，确定基本上保留了所述匹配的同源区域的结构的未知晶体结构的构象(例如考虑到，应当形成有利的相互作用，这样使得形成低能量构象)。就氨基酸而言，“同源区域”描述了例如相同的或具有类似的(例如脂肪族、芳香族、极性、带负电荷或带正电荷的)侧链化学基团的两个序列中的氨基酸残基。就核酸分子而言，同源区域可以包括至少85％或86％或87％或88％或89％或90％或91％或92％或93％或94％或95％或96％或97％或98％或99％的同源性或一致性。相同和类似区域有时被本领域的普通技术人员分别描述为“不变的”和“保守的”。有利地，通过计算机建模进行第一和第三步骤。同源建模是本领域的普通技术人员熟知的一项技术(参见例如，格里尔(Greer)，《科学》(Science)第228卷(1985)1055；和布伦代尔(Blundell)等人《欧洲生物化学杂志》(EurJBiochem)第172卷(1988)，513)。在本文引用的材料中的CRISPR-Cas9晶体结构的保守区和具有未知晶体结构的CRISPR-cas系统的保守区的计算机有助于预测和确定具有未知晶体结构的CRISPR-cas系统的晶体结构。仍进一步地，本发明的采用经由计算机模拟的CRISPR-Cas9晶体结构的方面同样可以应用于通过使用本文的CRISPR-Cas9晶体结构限定的新的CRISPR-cas晶体结构。以这种方式，可以获得CRISPR-cas晶体结构的文库。因此本发明提供了有理的CRISPR-cas系统设计。例如，已经通过本文描述的方法确定了CRISPR-cas系统或复合物的构象或晶体结构，这样一种构象可以用于本文的基于计算机的方法中，用于确定晶体结构仍未知的其他CRISPR-cas系统或复合物的构象或晶体结构。来自所有这些晶体结构的数据可以在数据库中，并且本文的方法可以通过使本文涉及的晶体结构或其部分相对于文库中的一种或多种晶体结构而在此进行的比较而更稳健。本发明进一步包括旨在产生CRISPR-cas系统或复合物的结构和/或进行其合理设计的系统(如计算机系统)。该系统可以含有：根据本文引用的材料或由其衍生(例如通过建模)的原子坐标数据，所述数据限定了CRISPR-cas系统或复合物或其至少一各结构域或子结构域的三维结构，或针对其的结构因子数据，所述结构因子数据可衍生自本文引用的材料的原子坐标数据。本发明还涉及具有以下项的计算机可读介质：根据本文引用的材料或由其衍生(例如通过同源建模)的原子坐标数据，所述数据限定了CRISPR-cas系统或复合物或其至少一各结构域或子结构域的三维结构，或针对其的结构因子数据，所述结构因子数据可衍生自本文引用的材料的原子坐标数据。“计算机可读介质”是指可以由计算机直接读取和访问的任何介质，并且包括但不限于：磁存储介质；光存储介质；电存储介质；云存储以及这些类别的混合型。通过提供此类计算机可读介质，可以常规访问原子坐标数据用于建模或其他“经由计算机模拟”方法。本发明进一步包括通过提供对此类计算机可读介质的访问营商的方法，例如在订购的基础上，经由互联网或全球通信/计算机网络；或者，在订购的基础上，该计算机系统可以供用户使用。“计算机系统”是指用于分析本发明的原子坐标数据的硬件装置、软件装置和数据存储装置。本发明的基于计算机的系统的最低硬件装置包括中央处理器(CPU)、输入装置、输出装置以及数据存储装置。合意地，提供显示器或监测器用于可视化结构数据。本发明进一步包括传输在本文描述的任何方法或其步骤中获得的信息或本文描述的任何信息的方法，例如经由电信、电话、大众通讯、大众媒体、图像(presentation)、互联网，电子邮件等。可以对本发明的晶体结构进行分析以产生CRISPR-cas系统或复合物的一张或多张傅立叶电子密度图；有利地，三维结构是如通过根据本文引用的材料的原子坐标所限定的。可以基于X射线衍射图计算傅立叶电子密度图。然后可以将这些图用于确定结合或其他相互作用的方面。可以使用已知程序计算电子密度图，如来自CCP4计算机包(协同计算项目(CollaborativeComputingProject)，第4期.CCP4套件：用于蛋白质晶体学的项目(TheCCP4Suite:ProgramsforProteinCrystallography)，《晶体学报》(ActaCrystallographica)，D50，1994，760-763)的那些。用于图可视化和模型建立，可以使用程序如“QUANTA”(1994，圣地亚哥，加利福尼亚州：分子模拟(MolecularSimulations)，琼斯(Jones)等人，《晶体学学报》(ActaCrystallographyA47)(1991)，110-119)。本文引用的材料给出了CRISPR-Cas9(化脓链球菌)的原子坐标数据，并且列出了每个原子(通过唯一编号)；每个氨基酸残基的化学元素及其位置(如通过电子密度图和抗体序列比较确定的)，元素所在的氨基酸残基，链标识符，残基的编号，相对于晶轴限定了对应原子的原子位置(以埃计)的坐标(例如、X、Y、Z)，原子在对应位置中的占位，“B”，负责原子围绕其原子中心移动的各向同性位移参数(以埃2计)以及原子序数。在本发明的具体实施例中，CRISPR-Cas9系统或该CRISPR-Cas9的组分的晶体结构的构象变化提供了关于蛋白质结构区域相对于对CRISPR-Cas系统功能而言重要的核苷酸(RNA或DNA)结构区域的挠性或移动的重要且关键的信息。针对作为本发明中的CRISPR酶的Cas9(例如化脓链球菌Cas9)提供的结构信息可以用于进一步工程化和优化CRISPR-Cas系统并且这也可以被外推用于探询其他CRISPR酶系统中的结构-功能关系，特别是其他II型CRISPR酶或Cas9直向同源物中的结构-功能关系。本发明的一个方面涉及分辨率下的与sgRNA及其靶DNA复合的化脓链球菌Cas9的晶体结构。该结构揭示了由靶识别和核酸酶叶片组成的两叶片构造，其将sgRNA:DNA双链体容纳在它们的界面处的带正电荷的凹槽中。识别叶片对于sgRNA和DNA结合是至关重要的，并且核酸酶叶片包含HNH和RuvC核酸酶结构域，这些结构域适合地被定位为分别用于靶DNA的互补和非互补链的切割。本文提供的这种高分辨结构和功能分析阐明了通过Cas9靶向RNA指导的DNA的分子机制，并且提供了用于产生优化的CRISPR-Cas系统及其组分的丰富信息。晶体结构可以提供用于理解通过Cas9进行的RNA指导的DNA靶向的分子机制的步骤。本文的结构和功能分析为合理工程化基于Cas9的基因组调节技术提供了有用的舞台，并且可以提供关于Cas9介导的靶DNA上的PAM序列识别或sgRNA:DNA双链体之间的错配耐受性的指导。本发明的方面还涉及截短突变体，例如化脓链球菌Cas9截短突变体可以促进将Cas9包装到尺寸受约束的病毒载体中用于体内和治疗应用。类似地，PAM相互作用(PI)结构域的未来工程化可以允许对PAM特异性编程，改善靶位点识别保真性，并且增加Cas9基因组工程化平台的多能性。本文提供的结构信息允许探询CRISPR酶(例如Cas9)与sgRNA(或嵌合RNA)和靶DNA的相互作用，从而允许工程化或改变或产生该CRISPR酶的模块化或多部分组分，以获得整个CRISPR-Cas系统的新的功能性或者以优化整个CRISPR-Cas系统的功能性。模块化或多部分CRISPR酶(例如SpCas9融合构建体)还允许产生可以被进一步优化的诱导型CRISPR-Cas系统。诱导型CRISPR-Cas系统的方面描述在提交于2013年7月21日并且于2014年1月30日作为PCT公开WO2014018423A2而公开的标题为“诱导型DNA结合蛋白和基因组干扰工具及其应用(INDUCIBLEDNABINDINGPROTEINSANDGENOMEPERTURBATIONTOOLSANDAPPLICATIONSTHEREOF)”的PCT申请PCT/US2013/051418中，将其内容通过引用以其全文并入本文。在一个方面，本发明提供了非天然存在的或工程化的CRISPR-Cas系统，该系统可以包含至少一种开关，其中所述CRISPR-Cas系统的活性通过与至少一种诱导物能量源(就该开关而言)接触进行控制。在本发明的一个实施例中，就至少一种开关而言的或所述CRISPR-Cas系统的活性的控制可以被激活、增强、终止或抑制。与至少一种诱导物能量源接触可以产生第一效应和第二效应。第一效应可以是以下项中的一者或多者：核输入、核输出、次级组分(如效应分子)的募集、(蛋白质、DNA或RNA)的构象变化、切割、负荷物(如装笼的分子或辅因子)的释放、缔合或解离。第二效应可以是以下项中的一者或多者：就至少一种开关而言的或所述CRISPR-Cas系统的活性的控制的激活、增强、终止或抑制。在一个实施例中，第一效应和第二效应可以一连串地发生。在本发明的另一个方面，该CRISPR-Cas系统可以进一步包含至少一个或多个核定位信号(NLS)、核输出信号(NES)、功能结构域、挠性接头、突变、缺失、改变或截短。这一个或多个NLS、NES或功能结构域可以被条件性地激活或失活。在另一个实施例中，该突变可以是以下项中的一者或多者：转录因子同源区中的突变、DNA结合结构域中的突变(如突变碱性螺旋环螺旋的碱性残基)、内源NLS中的突变或内源NES中的突变。本发明包括，该诱导物能量源可以是热、超声波、电磁能或化学品。在本发明的一个优选实施例中，该诱导物能量源可以是抗生素、小分子、激素、激素衍生物、类固醇或类固醇衍生物。在一个更优选的实施例中，该诱导物能量源可以是脱落酸(ABA)、多西环素(DOX)、cumate、雷帕霉素、4-羟基他莫西芬(4OHT)、雌激素或蜕皮激素。本发明提供了至少一种开关可以选自下组，该组由以下各项组成：基于抗生素的诱导型系统、基于电磁能的诱导型系统、基于小分子的诱导型系统、基于核受体的诱导系统以及基于激素的诱导型系统。在一个更优选的实施例中，该至少一种开关可以选自下组，该组由以下各项组成：四环素(Tet)/DOX诱导型系统、光诱导型系统、ABA诱导型系统、cumate阻遏物/操纵子系统、4OHT/雌激素诱导型系统、基于蜕皮激素的诱导型系统以及FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导型系统。如在本申请中所详述的控制方面涉及至少一种或多种开关。如在本文使用的术语“开关(switch)”是指以协调方式起作用以影响变化的系统或一组组分，涵盖生物功能的所有方面，如该功能的激活、抑制、增强或终止。在一个方面，术语开关涵盖遗传开关，这些遗传开关包含基因调节蛋白的基础组分和这些蛋白识别的特异性DNA序列。在一个方面，开关涉及在基因调节中使用的诱导型和抑制型系统。一般而言，诱导型系统可以是关闭的，除非存在允许基因表达的某种分子(称为诱导物)。该分子被说成“诱导表达”。它发生的方式取决于控制机制以及细胞类型差异。抑制型系统是开启的，除非存在抑制基因表达的某种分子(称为辅阻遏物(corepressor))。该分子被说成“抑制表达”。它发生的方式取决于控制机制以及细胞类型差异。如在本文使用的术语“诱导型(inducible)”可以包括开关的所有方面，不论涉及的分子机制如何。因此，如由本发明所包括的开关可以包括但不限于基于抗生素的诱导型系统、基于电磁能的诱导型系统、基于小分子的诱导型系统、基于核受体的诱导系统以及基于激素的诱导型系统。在优选实施例中，该开关可以是四环素(Tet)/DOX诱导型系统、光诱导型系统、脱落酸(ABA)诱导型系统、cumate阻遏物/操纵子系统、4OHT/雌激素诱导型系统、基于蜕皮激素的诱导型系统或FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导型系统。CasLITE被设计成以时间和空间精确方式调节或改变单独内源基因的表达。如在CasLITE中所用的CRISPR-Cas系统可以被设计成与感兴趣的基因的启动子序列结合以改变基因表达。CRISPR酶可以被一分为二，其中一半融合至隐花色素异二聚体(隐花色素-2或CIB1)的一半，同时剩余的隐花色素配偶体融合至CRISPR酶的另一半。在一些方面，转录效应子结构域也可以被包括在CasLITE系统中。效应子结构域可以是激活因子(如VP16、VP64或p65)或阻遏物(如KRAB、EnR或SID)。在LITE的未刺激状态下，一半CRISPR酶-隐花色素2蛋白定位至感兴趣的基因的启动子，但是不结合至该CIB1-效应蛋白。在用蓝色光谱的光刺激LITE后，隐花色素-2被激活，经历构象变化并且露出其结合结构域。CIB1进而结合至隐花色素-2，从而使CRISPR酶的第二个一半定位至感兴趣的基因的启动子区并且启动基因组编辑，这可以引起基因过表达或沉默。LITE的方面进一步描述于刘(Liu)，H等人，《科学》(Science)，2008和肯尼迪(Kennedy)M等人，《自然方法》(NatureMethods)2010中，将其内容通过引用以其全文并入本文。可以在物种、强度、机制、持续时间、尺寸或任何数量的其他参数的基础上选择可以进一步调节功能的激活因子和阻遏物结构域。优选的效应子结构域包括但不限于转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰酶结构域、组蛋白脱乙酰酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活因子结构域、核定位信号结构域、转录蛋白募集结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域或抗体呈递结构域。也存在若干不同方式来产生化学诱导型系统：1.可通过脱落酸(ABA)诱导的基于ABI-PYL的系统(参见例如网址stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/sigtrans；4/164/rs2)，2.可通过雷帕霉素(或基于雷帕霉素的相关化学品)诱导的基于FKBP-FRB的系统(参见例如网址nature.com/nmeth/journal/v2/n6/full/nmeth763.html)，3.可通过赤霉素(GA)诱导的基于GID1-GAI的系统(参见例如网址nature.com/nchembio/journal/v8/n5/full/nchembio.922.html)。由本发明所考虑的另一种系统是基于亚细胞定位变化的化学诱导型系统。申请人还包括被工程化为靶向感兴趣的基因组座位的诱导型CRISPR-Cas系统，其中该Cas酶被分成两个融合构建体，所述构建体被进一步连接至化学或能量敏感型蛋白的不同部分。当化学或能量传递物与该化学或能量敏感型蛋白结合时，这种化学或能量敏感型蛋白将导致Cas酶的任一半的亚细胞定位变化(即将Cas酶的任一半从细胞质运输到细胞的细胞核)。融合构建体从一个亚细胞区室或细胞器(在其中由于缺乏重构的CRISPR-Cas系统的底物，其活性被封存)向另一个亚细胞区室或细胞器(在其中存在该底物)的这种运输允许这些组分聚集在一起并且重构功能活性并且然后与其希望的底物(即哺乳动物细胞核中的基因组DNA)相接触并且导致靶基因表达的激活或抑制。考虑了其他诱导型系统，如但不限于通过以下项进行调节：重金属[梅奥(Mayo)KE等人，《细胞》(Cell)1982，29:99-108；塞尔(Searle)PF等人，《分子细胞生物学》(MolCellBiol)1985，5:1480-1489和布林斯特(Brinster)RL等人，《自然》(Nature)(伦敦)1982，296:39-42]，类固醇激素[海因斯(Hynes)NE等人，《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA)1981，78:2038-2042；克罗克(Klock)G等人，《自然》(伦敦)1987，329:734-736和李(Lee)F等人，《自然》(伦敦)1981，294:228-232.]，热休克[努尔(Nouer)L：热休克反应(HeatShockResponse).博卡拉顿，佛罗里达州：CRC；1991]以及其他已经开发的试剂[穆立克(Mullick)A、马西(Massie)B：基因表达的转录、翻译和控制(Transcription,translationandthecontrolofgeneexpression).在由斯皮尔(Speir)RE.编辑的细胞技术百科全书(EncyclopediaofCellTechnology)中，威利出版社(Wiley)；2000:1140-1164和富塞内格尔(Fussenegger)M，.《生物技术进展》(BiotechnolProg)2001，17:1-51]。然而，这些诱导型哺乳动物启动子存在局限，如诱导物(热休克、重金属、糖皮质激素等)的“关闭”状态的“泄漏(leakiness)”和多效效应。已经提出了昆虫激素(蜕皮激素)在减少哺乳动物细胞中的细胞过程干扰的尝试中的用途[努(No)D等人，《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA)1996，93:3346-3351]。另一种极好的系统使用雷帕霉素作为诱导物[里维拉(Rivera)VM等人，《自然医学》(NatMed)1996，2:1028-1032]，但是雷帕霉素作为免疫抑制剂的作用将其用途主要局限于体内并且因此必须找到用于控制基因表达的生物惰性化合物[赛斯(Saez)E等人，《美国国家科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA)2000，97:14512-14517]。现在将通过以下非限制性实例进一步描述本发明。实例以下实例出于说明本发明的不同实施例的目的而给出并且并不意在以任何方式限制本发明。本发明实例连同在此描述的方法目前代表优选的实施例，是示例性的，并且并不旨在限制本发明的范围。涵盖在如由权利要求书的范围所定义的本发明的精神内的在此的变化以及其他用途是本领域普通技术人员可以想到的。实例1：基于化脓链球菌Cas9晶体结构来工程化模块化或或多部分诱导型CRISPR-Cas系统晶体结构信息(描述于以下美国临时申请：提交于2013年12月12日的61/915,251、提交于2014年1月22日的61/930,214、提交于2014年4月15日的61/980,012；和尼氏玛素(Nishimasu)等人，“与指导RNA和靶DNA复合的Cas9的晶体结构(CrystalStructureofCas9inComplexwithGuideRNAandTargetDNA)”，《细胞》(Cell)156(5):935-949，DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001(2014)，其各自并且全部通过引用并入本文)提供了用于截短和产生可以被掺入诱导型CRISPR-Cas系统中的模块化或多部分CRISPR酶的结构信息。具体而言，提供了化脓链球菌Cas9(SpCas9)的结构信息并且这可以被外推用于其他Cas9直向同源物或其他II型CRISPR酶。将一组化学诱导型Cas9构建为双组分系统，其中Cas9蛋白的一部分融合至FKBP，并且剩余部分融合至FRB(例如FKBP-Cas9(氨基酸1-1098)，FRB-Cas(1099-1368))(一系列潜在融合构建体可以从图1中确定)。在不存在化学诱导的情况下，两种诱导型Cas9组分的共转染没有催化活性，但是可以使用雷帕霉素[5nM至10μM]诱导这些组分的功能组装。通过吉布森组装产生SpCas9融合构建体。简言之，通过PCR扩增产生SpCas9、FKBP和FRB片段。将来自PX330的密码子优化的SpCas9用作SpCas9的模板并且将pTB005用作FKBP和FRB的模板，如图2中所指示的。将NLS、15个氨基酸接头和20bp吉布森同源侧的序列掺入PCR引物中(图3)。将SpCas9PCR片段和FKBP或FRBPCR片段在吉布森组装试剂中与载体骨架孵育1小时。载体骨架制备自用Age1和EcoR1切割的PX330并且用Fast-AP进行处理(所有酶都来自赛默科技公司(ThermoScientific))(图2)。如上所述的产生无NLS的FRB-Cas9融合段，除了没有在引物中掺入NLS序列之外(图4)。通过吉布森组装产生NES-FRB-Cas9融合段。简言之，将NESultramer(图4)退火并且在吉布森组装试剂中与Age1切割的无NLS的FRB-Cas9融合质粒孵育1小时。经测序的经验证的克隆被用于转染到HEK293FT细胞中：将HEK细胞用100ng的每种SpCas9-FKBP和SPCas9-FRB以及100ng的靶向EMX1的sgRNA指导物转染。为了诱导SpCas9组装，将细胞在转染后立即用1μm雷帕霉素处理并且每24小时添加新的雷帕霉素。未处理的转染细胞被用作对照。转染后72小时收获细胞并且通过SURVEYOR测定评估靶向的EMX1座位处的indel形成(图5)。实例2：用于条件型基因组编辑和转录调节的分离Cas9构造CRISPR-Cas是一种微生物适应性免疫系统，它提供针对外源DNA的保护1。RNA指导的内切核酸酶Cas9已经被改编成用于在哺乳动物细胞和动物模型中进行基因组编辑的工具2。使用嵌合单个指导RNA(sgRNA)3，Cas9可以用于促进哺乳动物细胞中的有效基因组编辑4，5。此外，采用无催化活性的Cas的策略可以将效应蛋白引导至基因组靶标6-9，以实现转录调节。这里，申请人证明，可以通过被分成两个片段并且使用用于受控重组装的雷帕霉素敏感型二聚化结构域使得Cas9成为化学可诱导的，以介导基因组编辑和转录调节。为了开发分离Cas9系统，申请人基于与sgRNA和互补靶DNA复合的Cas9的晶体结构鉴定了十一个潜在的分离位点10。五个位点位于非结构化区域中并且六个位点位于蛋白质表面上(图6A和图8A)。将所得C-末端和N-末端Cas9片段分别融合至哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)的FK506结合蛋白12(FKBP)和FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域11上(图8B和图6B)。申请人通过使用先前验证的sgRNA靶向人类胚肾293FT(HEK293FT)细胞中的EMX1座位测试了所有十一个分离-Cas9组4。使用SURVEYOR核酸酶测定，申请人能够在用雷帕霉素处理的细胞中检测由所有分离-Cas9组介导的插入/缺失(indel)突变。此外，还可以在不存在雷帕霉素的情况下检测到中等水平的indel(图8C-D)。观察到的背景活性不是由于单独分离段的残余核酸酶活性，因为使用SURVEYOR这些段在没有其对应物的情况下都不显示出可检测水平的indel(数据未示出)。使用一小组缺乏二聚化结构域的分离-Cas9，申请人发现Cas9分离片段在细胞中可以自动组装(图8E-G)，这解释了观察到的背景活性。确立分离-Cas9系统中的背景活性是由于Cas9的自发自动组装之后，申请人假设保持每个Cas9片段在空间上分开可以减少背景活性12。为了将Cas9(N)-FRB片段螯合在细胞质中，在细胞质中它不太可能与核定位的Cas9(C)-FKBP片段二聚化，申请人将Cas9(N)-FRB上的两个核定位序列(NLS)替换为来自人类蛋白酪氨酸激酶213的单个核输出序列(NES)(Cas9(N)-FRB-NES)。在雷帕霉素的存在下，Cas9(N)-FRB-NES与Cas9(C)-FKBP-2xNLS二聚化，以重构完整的Cas9蛋白，其将核运输平衡转向核输入并且允许DNA靶向(图6C-D)。申请人用分离-4和分离-5对这个策略进行了测试(图6A)，其展现出高水平的活性(图8D)，并且发现单个NES足以将背景活性降到SURVEYOR测定的检出限之下(图6E)。申请人的数据显示，Cas9-FRB/FKBP分离片段在细胞内的空间螯合与雷帕霉素激活的二聚化组合允许Cas9核酸酶的诱导型激活。高剂量的Cas9可以加重脱靶(OT)序列处的indel频率，这些序列展现出与指导链的几个错配14。此类序列是尤其敏感的，如果错配是非连续的和/或在指导物的种子区外的话4，14，15。随时间的推移，伴随组成性地表达的Cas9观察到OT位点处的indel积累16。申请人理解Cas9活性的时间控制可以用于降低长期表达实验中的剂量并且因此与组成型活性的Cas9相比，产生减少的脱靶indel。为此，申请人产生了分离-Cas9慢病毒构建体，类似于分离-5的lentiCRISPR质粒16(lenti分离-Cas9分离-5的LSC-5)(图6F)。两个分离段以及嘌呤霉素抗性基因(puro)都处于延长因子1α短(EFS)启动子的控制下。将HEK293FT细胞以≤0.3的MOI进行转导并且用嘌呤霉素进行选择持续5天。转导之后4周通过深度测序对Wt-Cas9转导的HEK293FT细胞进行分析，而6周之后对LSC-5转导的细胞进行分析，将用200nM雷帕霉素进行12天连续处理考虑在内(图6G)。在用携带wt-Cas9和先前验证的靶向EMX1的sgRNA4两者的慢病毒转导的细胞中，申请人检测到中靶位点处的约95％的indel以及四个验证的脱靶位点(OT-1至4)处的突变17。相比之下，在12天雷帕霉素处理之后，用LSC-5转导的细胞中的中靶indel频率是约43％。在未处理的细胞中，在LSC-5与对照样品之间没有检测到EMX1中靶indel的显著性差异。此外，在用LSC-5转导的细胞中没有检测到OTindel的显著增加，无论雷帕霉素处理如何(单因素方差分析，p>0.9999)。这些数据证明，分离Cas9的稳定的、低拷贝表达可以用于在靶向的座位处诱导实质性indel而不在脱靶位点处引起显著的突变。此外，Cas9的核酸酶活性可以变为无活性的，而不干扰DNA结合能力。所得催化方面无活性的(dead)Cas9(dCas9)可以用于将反式激活结构域运输到靶向的座位中7。申请人试图表明分离-Cas9构造可以应用于dCas9，以介导诱导型转录激活。为此，申请人克隆了在FRB融合物(dCas9(N)-FRB-2xNES)中具有D10A点突变并且在FKBP融合物中具有N863A点突变的分离-4片段并且添加了VP64反式激活结构域至Cas9(C)-FKBP-2xNLS中(dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64)(图7A)。这些片段将重构无催化活性的Cas9-VP64融合物(dCas9-VP6)。申请人使用四个先前验证的sgRNA7/基因在HEK293FT细胞中通过激活ASCL1、MYOD1或IL1RN测试了分离dCas9-VP64的可诱导性。转染后将细胞用雷帕霉素处理24小时并且维持在200nM雷帕霉素中，直至在转染后48小时时收获RNA。与未转染的HEK293FT相比，可以使用所有三个基因的定量实时PCR(qPCR)检测到mRNA水平的显著增加(单因素方差分析，ASCL1p<0.0001，MYOD1p<0.0001，IL1RNp<0.0001)(图7B)。与雷帕霉素诱导的细胞相比背景活性是低的(+雷帕霉素/-雷帕霉素比率，ASCL1＝77，MYOD1＝29，IL1RN＝649)并且与未转染的细胞相比不显著(单因素方差分析，p>0.99)。因此，在雷帕霉素的存在下通过分离dCas9-VP64诱导转录激活。为了测试在撤去雷帕霉素后转录激活是否可逆，申请人激活了HEK293FT细胞中的ASCL1表达和N2A细胞中的Neurog2表达(图7C)。转染后将细胞用雷帕霉素处理24小时。2小时后撤去雷帕霉素或每24小时进行替换以便连续诱导。在雷帕霉素处理后2、6、12、24和72小时时收获细胞并且通过qPCR分析mRNA水平。在整个研究过程中ASCL1和Neurog2水平增加，其中在连续雷帕霉素处理和2小时处理之间没有显著性差异(相关系数，ASCL1＝1，Neurog2＝1)。申请人证明，Cas9可以被分成两个不同的片段，当使用化学诱导被聚回到一起时其重构功能性全长Cas9核酸酶。分离的Cas9构造可用于多种应用。例如，分离Cas9允许通过将每个片段放在不同的组织特异性启动子之下而将Cas9活性限制在交叉的细胞群的遗传策略。另外，不同的化学诱导型二聚化结构域(如APA18和赤霉素19)还可以用来产生一系列融合到不同调节结构域上的诱导型Cas9，以构建合成的转录网络。材料与方法分离-Cas9的设计和构建通过吉布森组装克隆20(来自新英格兰生物实验室(NewEnglandBiolabs)的吉布森预混合剂)产生单独的分离-Cas9质粒。简言之，单独的分离-Cas9段PCR扩增自PX330并且FKBP/FRB段扩增自gBlocks基因片段(整合DNA技术公司(IntegratedDNATechnologies))。用如下引物通过PCR引入吉布森同源物、甘氨酸-丝氨酸接头、P2A、NLS和/或NES序列：(引物名称引物序列(5’至3’))分离1-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGGCGTTGATGGGGTTTTCCT分离2-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGAAGTTGCTCTTGAAGTTGG分离3-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCTCGGTGTTCACTCTCAGGA分离4-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTCTCATTCCCTCGGTCACGT分离5-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCTCGATTTTCTTGAAGTAGTCC分离6-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGGACACCTGGGCTTTCTGGA分离7-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCAGCTTAGGGTACTTTTTGA分离8-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGCCGTTGGCCAGGGTAATCT分离9-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGTTCCTCTTGGGCAGGATAG分离10-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCTTGCCCTTTTCCACTTTGGCC分离11-FRB-2xNLS反向AGGCCCTCGTGCCACATCTCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCTTCAGCTTCTCATAGTGGC分离1-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGAGCGGCGTGGACGCCAAGGC分离2-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGACCTGGCCGAGGATGCCAA分离3-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGATCACCAAGGCCCCCCTGAG分离4-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGG分离5-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGTGCTTCGACTCCGTGGAAAT分离6-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCCAGGGCGATAGCCTGCA分离7-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGAAAGCGAGTTCGTGTACGG分离8-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGAGATCCGGAAGCGGCCTCT分离9-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGAGCGATAAGCTGATCGCCAG分离10-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTG分离11-FKBP-2xNLS正向TGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGCTCGGGCTCCCCCGAGGATAATGAPX3302xNLS正向ATCACTTTTTTTCAGGTTGGACCGGTGCCACCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGPX330反向CTAGAGCTCGCTGATCAGCCFRB正向GAGATGTGGCACGAGGGCCTFRB2xNLS反向GGCTGATCAGCGAGCTCTAGGAATTCTTACTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTTTTCGTGGCCGCCGGCCTTTTCTGCTTGCTGATTCTTCTGAFKBP2xNLS正向ATCACTTTTTTTCAGGTTGGACCGGTATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGGCGTGCAGGTGGAGACCATFKBP反向CTCCAGCTTCAGCAGCTCCAPX330无NLS正向ATCACTTTTTTTCAGGTTGGACCGGTGCCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCFRBNES反向GGCTGATCAGCGAGCTCTAGgaattcttaGAGGATTAAGCTAGCTAAATCTAGCTGCTTGCTGATTCTTCTGA使用先前产生的分离-Cas9段作为PCR模板通过吉布森组装产生LSC-5。用D10A、N863A突变Cas9作为PCR模板产生反式激活的分离dCas9-VP64并且购买作为gBlocks基因片段(整合DNA技术公司)的具有吉布森同源性的VP64。细胞培养、转染和雷帕霉素处理。在37℃下，伴随5％CO2孵育，将人类胚肾293FT(HEK293FT)细胞系(生命技术公司(LifeTechnologies))和小鼠Neuro2a(N2a)细胞系(西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich))维持在补充有10％FBS(海可隆公司(HyClone))、2mMGlutaMAX(生命技术公司)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’sMedium，DMEM)中。在转染前24h将HEK293FT细胞接种到24孔板(康宁公司(Corning))上。遵循制造商推荐的方案，使用Lipofectamine2000(生命技术公司)在80％-90％汇合率时转染细胞。对于24孔平板的每个孔，使用总共500ngDNA。对于分离-Cas9转染，使用200ng的FKBP-Cas9和200ng的FRB-Cas9+100ng的U6-sgRNAPCR产物。对于wt-Cas9，使用200ngPx330和200ngpUC19+100ng的U6-sgRNAPCR产物。对于转录激活，针对4种携带指导物的质粒中的每者，转染200ng的FKBP-Cas9和200ng的FRB-Cas9+25ng。用200nM雷帕霉素(艾碧康公司(Abcam))诱导分离-Cas9二聚化。每24h用含有200nM雷帕霉素的新鲜培养基替换含有雷帕霉素的培养基，除非另外指出。用于基因组修饰的SURVEYOR核酸酶测定。如上所述的，用DNA转染HEK293FT细胞。转染后，在基因组DNA提取之前，将细胞在37℃下孵育72h。遵循制造商的方案，使用QuickExtractDNA提取溶液(Epicentre)提取基因组DNA。简言之，将沉淀的细胞重悬于QuickExtract溶液中并且在65℃下孵育15min、在68℃下孵育15min，并且在98℃下孵育10min。用如下靶位点和引物PCR扩增在每个基因的CRISPR靶位点侧翼的基因组区域：用于产生SURVEYOR-测定和下一代测序的扩增子的引物。引物名称引物序列(5'-3’)SUV901CCATCCCCTTCTGTGAATGTSUV902GGAGATTGGAGACACGGAGANGSEMX1.3正向GGAGGACAAAGTACAAACGGCNGSEMX1.3反向ATCGATGTCCTCCCCATTGGNGSOT-1正向TGGGAGAGAGACCCCTTCTTNGSOT-1反向TCCTGCTCTCACTTAGACTTTCTCNGSOT-2正向GACATTCCTCCTGAGGGAAAANGSOT-2反向GATAAAATGTATTCCTTCTCACCATTCNGSOT-3正向CCAGACTCAGTAAAGCCTGGANGSOT-3反向TGGCCCCAGTCTCTCTTCTANGSOT-4正向CACGGCCTTTGCAAATAGAGNGSOT-4反向CATGACTTGGCCTTTGTAGGA遵循制造商的方案，使用QiaQuickSpin柱(凯杰公司(Qiagen))纯化产物。将总共200ng的纯化的PCR产物与1μl10×TaqDNA聚合酶PCR缓冲液(Enzymatics公司)和超纯水混合，至终体积为10μl，并且使其经受重退火过程，以允许形成异源双链体：95℃持续10min，以-2℃/s从95℃降至85℃，以-0.25℃/s从85℃降至25℃，并且在25℃保持1min。重退火后，遵循制造商推荐的方案，将产物用SURVEYOR核酸酶和SURVEYOR增强子S(转基因组学公司(Transgenomics))进行处理，并且在4％-20％NovexTBE聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司)上进行分析。将凝胶用SYBRGoldDNA染色剂(生命技术公司)染色30min并用GelDoc凝胶成像系统(伯乐公司(Bio-rad))成像。基于相对条带强度进行量化。通过式100×(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2)确定Indel百分比，其中a是未消化的PCR产物的积分强度，而b和c是每个切割产物的积分强度。深度测序以评估靶向特异性。在基因组DNA提取之前，将铺板于24孔板的HEK293FT细胞用Cas9质粒DNA和sgRNAPCR盒转染72小时。通过融合PCR方法以将亿明达P5适配子连同独特的样品特异性条形码附接至靶扩增子14，用如下引物扩增侧翼EMX1或脱靶的CRISPR靶位点的基因组区域：用于指导Cas9结合的指导物。引物名称指导序列(5'-3’)EMX1GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAASCL1指导物1GCAGCCGCTCGCTGCAGCAGASCL1指导物2ATGGAGAGTTTGCAAGGAGCASCL1指导物3GGCTGGGTGTCCCATTGAAAASCL1指导物4TGTTTATTCAGCCGGGAGTCMYOD1指导物1GGGCCCCTGCGGCCACCCCGMYOD1指导物2GAGGTTTGGAAAGGGCGTGCMYOD1指导物3GCCTGGGCTCCGGGGCGTTTMYOD1指导物4CCTCCCTCCCTGCCCGGTAGIL1RN指导物1TTGTACTCTCTGAGGTGCTCIL1RN指导物2TACGCAGATAAGAACCAGTTIL1RN指导物3GCATCAAGTCAGCCATCAGCIL1RN指导物4TGAGTCACCCTCCTGGAAACNeurog2指导物1TGGTTCAGTGGCTGCGTGTCNeurog2指导物2ATACGATGAAAAGAATAAGCNeurog2指导物3GGGGGAGAGGGACTAAAGAANeurog2指导物4CGGCTTTAACTGGAGTGCCT遵循制造商推荐的方案，使用QiaQuickSpin柱(凯杰公司)通过凝胶提取纯化PCR产物。将带条形码并纯化的DNA样品通过Quant-iTPicoGreendsDNA测定试剂盒或Qubit2.0荧光计(生命技术公司)定量并且以等摩尔比率汇集。然后用亿明达MiSeq个人测序仪(生命技术公司)对测序文库进行测序。测序数据分析以及indel检测。将MiSeq读数通过至少30的平均Phred质量(Q得分)连同与条形码以及扩增子正向引物匹配的完美序列过滤。如在Pythondifflib模块中所实施的，通过针对包括靶位点的上游和下游30nt的座位序列(总共80bp)进行拉特克利夫-欧博谢尔普(Ratcliff-Obershelp)字符串比较来分析来自中靶和脱靶座位的读数。解析所得编辑操作，并且如果发现插入或缺失操作，则将读数计数为indel。如果其比对的部分落到MiSeq读数本身外或如果多于五个碱基未被调用，则所分析的靶区被舍弃。相对基因表达的pPCR分析。根据制造商的说明使用RNeasy试剂盒(凯杰公司)提取RNA并且使用qScript(广达生物系统公司(QuantaBiosystems))对1μg的RNA/样品进行逆转录。使用对靶向的基因具有特异性的TaqMan探针并且将GAPDH用作内源对照(生命技术公司)，通过逆转录和定量PCR(qPCR)测量相对mRNA水平，其中TaqMan探针的ID如下：TaqMan探针ID使用ΔΔCt分析来获得相对于经受200nM雷帕霉素的未转染细胞的倍数变化。结果示于如本文讨论的图6、7和8中。实例2的参考文献1.巴郎镐(Barrangou)，R.&马拉菲尼(Marraffini)，L.A.CRISPR-Cas系统：升级到获得性免疫的原核生物(CRISPR-Cassystems:Prokaryotesupgradetoadaptiveimmunity).《分子细胞》(Molecularcell)54，234-244(2014)。2.徐(Hsu)，P.D.、兰德(Lander)，E.S.&张(Zhang)，F.用于基因组工程的CRISPR-Cas9的发展和应用(DevelopmentandapplicationsofCRISPR-Cas9forgenomeengineering).《细胞》(Cell)157，1262-1278(2014)。3.季聂克(Jinek)，M.等人，在自适应细菌免疫中的可编程双重-RNA-引导DNA核酸内切酶(Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity).《科学》(Science)(纽约，N.Y.)337，816-821(2012)。4.丛(Cong)，L.等人，使用CRISPR/Cas系统进行的多元基因组工程化(MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems).《科学》(Science)(纽约，N.Y.)339，819-823(2013)。5.玛丽(Mali)，P.等人，经由Cas9进行RNA-指导的人类基因组工程化(RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9).《科学》(Science)339，823-826(2013)。6.马埃德尔(Maeder)，M.L.等人，CRISPRRNA指导的内源性人类基因的激活(CRISPRRNA-guidedactivationofendogenoushumangenes).《自然方法》(Naturemethods)10，977-979(2013)。7.佩雷斯-皮涅拉(Perez-Pinera)，P.等人.通过基于CRISPR-Cas9的转录因子进行的RNA指导的基因激活(RNA-guidedgeneactivationbyCRISPR-Cas9-basedtranscriptionfactors).《自然方法》(Naturemethods)10，973-976(2013)。8.齐(Qi)，L.S.等人，改变CRISPR作为RNA-指导的平台以用于基因表达的序列特异性控制.《细胞》(Cell)152，1173-1183(2013)。9.吉尔伯特(Gilbert)，L.A.等人.真核生物中的CR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