ABCA3基因的应用的制作方法

本发明属于基因诊断与产前基因诊断的相关技术领域，具体涉及ATP连接盒(ABC)转运子A3(ABCA3)在制备检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)基因诊断制品中的应用。发明背景先天性白内障是导致儿童低视力和致盲的常见眼病，发病率约为0.01％～0.06％，其中约50％与遗传有关，其遗传方式以常染色体显性遗传最为常见。先天性白内障可独立发生，也可作为眼部或全身综合征的伴发症状，其中12％-18％的先天性白内障患者常发生合并小角膜症状。白内障-小角膜综合征(Cataract-microcorneasyndrome,CCMC,OMIM116200)是一种先天发育异常性眼病，常累及双眼，表现为不同表型的白内障及角膜横径小于10mm，常伴发眼前节发育不良，如虹膜缺损、Peters异常、瞳孔异位及眼球震颤等，这些多发畸形常使大多数患者丧失视力，是先天性致盲的重要原因之一。并且和单纯先天性白内障相比，伴发小角膜的患者更易患青光眼，并造成不可逆转的视觉损害。目前对于CCMC治疗手段有限、致盲率很高，给全社会带来沉重的经济负担。先天性CCMC的病因及病理机制尚不清楚，目前世界上研究较少。国内外的遗传学研究结果表明该病很大程度上是由于遗传因素导致的。迄今为止，已有7个致病基因被证实(详见表1)。表1：白内障-小角膜综合征致病基因定位及克隆情况CCMC具有显著的遗传异质性，存在多个候选致病基因。到目前为止对CCMC的致病基因的了解仍然有限，迄今为止7个已知基因仅能解释不到30％的患者的发病。这已经成为CCMC的发病机制的研究以及针对病因的诊断和治疗研究的瓶颈。这种现状促使进一步去发现和了解该病新的致病基因，为后续的基因诊断、产前诊断及基因治疗提供基础。

技术实现要素：
本发明的目的是提供一种ABCA3基因在制备检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)诊断制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。申请人发现了一个4代呈常染色体显性遗传的CCMC家系，经过候选基因测序，排除了已知的7个候选基因突变致病的可能；同时，进一步对该家系的核心成员进行了外显子组测序，找到了该家系的致病基因ATP连接盒(ABC)转运子A3(ABCA3)，从而促成了本发明。本发明首先提供ABCA3基因新的用途，是在制备用于检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)诊断制品中的应用；本发明还提供一种用于检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)的引物对，所述的引物对的上下游引物序列为SEQIDNO:1-38，其引物信息如下：ABCA3-1L:AGAAATGGAAAGTGACTCCTCTSEQIDNO:1ABCA3-1R:GTCTGTGGGTTACTGGAAGTTSEQIDNO:2ABCA3-2L:AACTTCCAGTAACCCACAGACSEQIDNO:3ABCA3-2R:AGAGTGGAGTCAGAATCAAGGTSEQIDNO:4ABCA3-3L:ACCTTGATTCTGACTCCACTCTSEQIDNO:5ABCA3-3R:GAAAGAGTCCTAGCACATCAGASEQIDNO:6ABCA3-4L:AGCTTTAGCTCATTACCTTGTCSEQIDNO:7ABCA3-4R:CCTGGTCAATCAGACAGAATTASEQIDNO:8ABCA3-5L:ACATCAGAGCTGATTCTGTGACSEQIDNO:9ABCA3-5R:ATAGTTTATGTCTCCTGGATGCSEQIDNO:10ABCA3-6L:CGTACAGTGGGAGACCATCSEQIDNO:11ABCA3-6R:CACTAATCCAGTGTCTCACCTTSEQIDNO:12ABCA3-7L:GCTGGGACACTCACTATATTTCSEQIDNO:13ABCA3-7R:CTGATGAACTTCTTCTTCTTGGSEQIDNO:14ABCA3-8L:GTTCTCGTAGAAACTGCTGACTSEQIDNO:15ABCA3-8R:GTCTGAGGACCTCCAAATGSEQIDNO:16ABCA3-9L:CATTTGGAGGTCCTCAGACSEQIDNO:17ABCA3-9R:ATTGTCACATGGTCAGCATAGSEQIDNO:18ABCA3-10L:ACTCTGTCACATCTGACTTTGGSEQIDNO:19ABCA3-10R:GAGACACTGATGAGTGAGGAAASEQIDNO:20ABCA3-11L:GTGAGTCAGATACGTGCTTCTCSEQIDNO:21ABCA3-11R:CTTCCTAGAACCACACCATAACSEQIDNO:22ABCA3-12L:GTTGCACAGTACAGTCAGAGGTSEQIDNO:23ABCA3-12R:GACTGTGTCTCTCCCTCCAGSEQIDNO:24ABCA3-13L:CGCTGAGATGGTGTTAAAGSEQIDNO:25ABCA3-13R:AGAAAGCACTCAGAAACGAGTASEQIDNO:26ABCA3-14L:GTTGAGGTTCAGGTCTCTGACSEQIDNO:27ABCA3-14R:ATCTAGTGTGTCTGCTGGTTGTSEQIDNO:28ABCA3-15L:GAGGTAAAAGGCACTACAGAAGSEQIDNO:29ABCA3-15R:AACTTTGTGGTCAGAGACTTCASEQIDNO:30ABCA3-16L:CTAAATTACGCTGACTTTCCTCSEQIDNO:31ABCA3-16R:GACATAGTAAGACCCTGTCGAASEQIDNO:32ABCA3-17L:AGGAGTGACTGCTATTGACTTGSEQIDNO:33ABCA3-17R:TGTTAAGGAGTGTCCAGATGATSEQIDNO:34ABCA3-18L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGTSEQIDNO:35ABCA3-18R:CACAAAAGAAGGTGAGAGACATSEQIDNO:36ABCA3-19L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGTSEQIDNO:37ABCA3-19R:CACAAAAGAAGGTGAGAGACATSEQIDNO:38。本发明还提供一种用于检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)的试剂盒，包含有上述的引物对中的任一种或几种。本发明还提供一种与先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)疾病相关的SNP位点,为ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393位,其碱基为G或A；本发明还提供另一种与先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)疾病相关的SNP位点,为ABCA3基因编码区域由起始密码子起第2408位，其碱基为C或T；本发明还提供另一种与先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)疾病相关的SNP位点,为ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253位，其碱基为A或T；本发明提供了ABCA3基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性CCMC疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行ABCA3基因突变位点的的快速检测。附图说明图1：ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393位SNP位点信息,其碱基为G或A。图2：ABCA3基因编码区域由起始密码子起第2408位SNP位点信息，其碱基为C或T。图3：ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253位SNP位点信息，其碱基为A或T。图4：实施例1的白内障-小角膜综合征家系内患者及正常人ABCA3测序图，其中A-C:患者；D-F:正常人。该家系中三名患者的ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393个碱基发生了杂合突变，由G突变为A，其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由C突变为T。图5：实施例2的白内障-小角膜综合征家系内患者及正常人ABCA3测序结果。A-E:患者；F-J:正常人。该家系中五名患者的ABCA3基因编码区域由起始密码子起第2408个碱基发生了杂合突变，由C突变为T，其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由G突变为A。图6：实施例3的一名白内障-小角膜综合征患者及其母亲(正常人)ABCA3测序结果。A:患者；B:正常人。该患者ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253个碱基发生了杂合突变，由A突变为T，其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由T突变为A。具体实施方式本发明的申请人在一个先天性的CCMC家系中发现ABCA3基因的突变位点，并在另一个先天性的CCMC家系及多名散发患者中证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。ABCA3属于ABC转运子家族中ABCA亚家族的成员，其基因由超过80000个核苷酸碱基组成，位于16p13.3，可转录成大约6500bp的mRNA(NM_001089)，直接翻译形成1704个氨基酸组成的蛋白质。下面对本发明进行详细的描述。一、先天性CCMC家系中发现ABCA3基因的突变位点的筛选实施例1：从先天性CCMC家系中筛选ABCA3基因的突变位点1、提取外周血基因组DNA：在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取第一个家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。加入180μLTE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。2.外显子组测序：外显子组测序(ExomeSequencing)是一种新型的基因组分析技术,只需针对全基因外显子(exon)区域的DNA即可,取该家系中3名患者的基因组DNA，由深圳华大基因科技有限公司应用NimbleGen(44Mb)targetenrichmentsystem收集人类基因组的外显子区域，应用IlluminaGenomeAnalyzerII平台对富集的外显子文库进行IlluminaGA高通量测序，共捕获了18357个目的基因中的18283(99.6％)个。将这些突变滤过4个正常人数据库：单核苷酸多态性数据库(dbSNP129,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi/),千人基因组计划(February28,2011releasesforSNPs,andFebruary16,2011releasesforindelshttp://www.1000genome.org/),Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/),及炎黄数据库，进一步筛选出3名患者共有的非同义未知突变位点106个，应用直接测序法在该家系内筛选到与致病单倍体型共分离的致病基因ABCA3，并在200例正常当地人群外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。3.直接测序法验证该家系内患者ABCA3基因的突变PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，55±3℃40se,72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。(2)反应体系：(TAKARALATaqpolymerase)应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该ABCA3引物的扩增反应。PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，该家系中三名患者的ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393个碱基发生了杂合突变，由G突变为A，其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由C突变为T(图4)，引起ABCA3蛋白第1465位由天冬氨酸突变为天冬酰胺，应用点突变预测程序SIFT(SortingIntolerantFromTolerant)预测发现，该突变导致了ABCA3蛋白功能“damaging”级的损坏，从而引起了该家系中CCMC的发生。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。通过上述的分析，证明ABCA3基因可以用来检测患者是否具有潜在患CCMC的危险。通过将检测者的ABCA3基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。根据ABCA3的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：ABCA3-1L:AGAAATGGAAAGTGACTCCTCTABCA3-1R:GTCTGTGGGTTACTGGAAGTTABCA3-2L:AACTTCCAGTAACCCACAGACABCA3-2R:AGAGTGGAGTCAGAATCAAGGTABCA3-3L:ACCTTGATTCTGACTCCACTCTABCA3-3R:GAAAGAGTCCTAGCACATCAGAABCA3-4L:AGCTTTAGCTCATTACCTTGTCABCA3-4R:CCTGGTCAATCAGACAGAATTAABCA3-5L:ACATCAGAGCTGATTCTGTGACABCA3-5R:ATAGTTTATGTCTCCTGGATGCABCA3-6L:CGTACAGTGGGAGACCATCABCA3-6R:CACTAATCCAGTGTCTCACCTTABCA3-7L:GCTGGGACACTCACTATATTTCABCA3-7R:CTGATGAACTTCTTCTTCTTGGABCA3-8L:GTTCTCGTAGAAACTGCTGACTABCA3-8R:GTCTGAGGACCTCCAAATGABCA3-9L:CATTTGGAGGTCCTCAGACABCA3-9R:ATTGTCACATGGTCAGCATAGABCA3-10L:ACTCTGTCACATCTGACTTTGGABCA3-10R:GAGACACTGATGAGTGAGGAAAABCA3-11L:GTGAGTCAGATACGTGCTTCTCABCA3-11R:CTTCCTAGAACCACACCATAACABCA3-12L:GTTGCACAGTACAGTCAGAGGTABCA3-12R:GACTGTGTCTCTCCCTCCAGABCA3-13L:CGCTGAGATGGTGTTAAAGABCA3-13R:AGAAAGCACTCAGAAACGAGTAABCA3-14L:GTTGAGGTTCAGGTCTCTGACABCA3-14R:ATCTAGTGTGTCTGCTGGTTGTABCA3-15L:GAGGTAAAAGGCACTACAGAAGABCA3-15R:AACTTTGTGGTCAGAGACTTCAABCA3-16L:CTAAATTACGCTGACTTTCCTCABCA3-16R:GACATAGTAAGACCCTGTCGAAABCA3-17L:AGGAGTGACTGCTATTGACTTGABCA3-17R:TGTTAAGGAGTGTCCAGATGATABCA3-18L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGTABCA3-18R:CACAAAAGAAGGTGAGAGACATABCA3-19L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGTABCA3-19R:CACAAAAGAAGGTGAGAGACAT分别应用上述的每一对引物进行ABCA3基因的检测。实施例2：从另一个先天性CCMC家系中筛选ABCA3基因的突变位点1.提取外周血基因组DNA：应用实施例1中说述的常规酚氯仿法从家系内各成员外周血中提取基因组DNA。2.PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，55±3℃40se,72℃60sec，30-35cycle；72℃10min。(2)反应体系：(TAKARALATaqpolymerase)应用该反应体系分别进行每名患者的基因组DNA模板分别与ABCA3基因的19对引物的扩增反应。3.PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对家系内患者的基因组DNA模板分别与ABCA3基因的19对引物的扩增产物进行测序，结果表明该家系中五名患者的ABCA3基因编码区域由起始密码子起第2408个碱基发生了杂合突变，由C突变为T，其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由G突变为A(图5)，引起ABCA3蛋白第803位由苏氨酸突变为甲硫氨酸，应用点突变预测程序SIFT预测发现，该突变导致了ABCA3蛋白功能“damaging”级的损坏，从而引起了该家系中CCMC的发生。重复结果证明了该位点的真实性。并在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。实施例3：从另2名先天性散发CCMC患者中筛选ABCA3基因的突变位点收集散发CCMC患者：在山东省眼科研究所暨青岛眼科医院共收集2例诊断明确的CCMC散发患者。提取外周血基因组DNA：分别抽取2例散发CCMC患者的外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，应用实施例1中说述的常规酚氯仿法从家系内各成员外周血中提取基因组DNA。PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，55±3℃40se,72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。(2)反应体系：(TAKARALATaqpolymerase)应用该反应体系分别进行每名患者的基因组DNA模板分别与ABCA3基因的19对引物的扩增反应。PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对每名患者的基因组DNA模板分别与ABCA3基因的19对引物的扩增产物进行测序，在2名散发患者中均检测到了ABCA3基因的杂合突变：ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253个碱基发生了杂合突变，由A突变为T，其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变，由T突变为A(图6)，引起ABCA3蛋白第1418位由天门冬酰胺突变为异亮氨酸，应用点突变预测程序SIFT预测发现，该突变导致了ABCA3蛋白功能“damaging”级的损坏，从而引起了患者CCMC的发生。并在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。